NO322391B1 - Anvendelse av en gp39-antagonist ved fremstilling av et medikament egnet til behandling av ikke-B-lymfocytt-mediert vevsdestruksjon assosiert med multippel sklerose. - Google Patents

Description

Autoimmune sykdommer erkarakterisert vedat et individs immunsystem angriper individets egne vev. Autoimmune sykdommer resulterer normalt i nedbryting av immunsystemets toleranse for dets egne antigener. De spesifikke antigen gjenkjent av immunsystemet i de ulike autoimmune sykdommer kan foreligge systematisk eller de kan være organspesi-fikke. F.eks. er systemisk lupus-erthematosus (SLE)karakterisert vednærvær av autoantistoffer for DNA, ribonukleo-proteiner, histoner og andre molekyler som ikke er organ-spesifikke. Andre autoimmune sykdommer erkarakterisert vedødeleggelsen av for det meste ett organ. Slike autoimmune sykdommer innbefatter type I diabetes, hvori de insulinpro-duserende p-celler i de Langerhanske øyene i pankreas øde-legges.

I noen autoimmune sykdommer inntreffer vevsødeleggelse primært som følge av produksjon av høye mengder autoantistoffer. Slike sykdommer innbefatter revmatisk artritt,karakterisert vedødeleggelsen av vevsbrusk og inflammasjon av synovium. Pasienter med revmatisk artritt har en oppsamling av immunkomplekser i deres ledd, hvilke dannes ved assosiasjon av autoantistoffer mot Fc-delen av IgG- og IgG-molekyler. Disse immunkompleks aktiverer komplementkaskaden som resulterer i vevsødeleggelse. Myasthenia gravis, en sykdom med progressiv muskelsvekkelse, forårsakes ved produksjon av autoantistoffer som er reaktive mot acetylkolinresepto-rene i motorendeplatene i nevromuskulære forbindelser.

I andre autoimmune sykdommer synes ikke vevsødeleggelse å primært være mediert ved produksjon av autoantistoffer, men snarere ved autoreaktive T-lymfocytter. F.eks. kan eksperimentell allergisk encefalomyelitt (EAE), en dyremodell for multippel sklerose og som erkarakterisert veddemyelinering i hjernen og ryggmargen, induseres i naive dyr ved overføring av CD4+T-celler fra tidligere syke dyr. Således er det generelt antatt at EAE representerer en T-celle-mediert autoimmun sykdom, snarere enn en B-celle-mediert au toimmun sykdom (Ben-Nun, Aa. Et al. (1981) Eur. J. Immunol. 11, 195).

Multippel sklerose (MS) er en vanlig demyeliniserende sykdom i hjernen og ryggmargen. Det er en progressiv sykdom som erkarakterisert vedremisjoner og forverringer av nev-rologisk dysfunksjon som påvirker ulike regioner i det sentrale nervesystem. Sykdommens symptomer stammer fra et fokus av inflammatorisk demyelinering, hvilket senere danner et arr, som opptrer som en «plakk» i den hvite materie i hjernen, hjernestammen eller ryggmargen. I øyeblikket finnes ingen definitiv diagnostisk test tilgjengelig for MS, og diagnoser og behandlinger formuleres basert på slike faktorer som grad av pasientens symptomer og/eller pasientens alder ved utbruddstidspunktet for forverring av den nevrologiske dysfunksjon.

Pasienter med MS har typisk blitt behandlet med steroider med det for øye å enten sende pasienten tilbake til remi-sjon eller å nedsette sykdommens progresjon i pasienten. Andre medikamenter har blitt anvendt for å behandle spesielle symptomer ved sykdommen, f.eks. muskelrelakserende midler. Ny utvikling i behandling tilgjengelig for MS innbefatter administrasjon av beta-interferon. Beta-interferon har vist i noen grad å kunne nedsette sykdommens progresjon. Imidlertid er det fortsatt et behov for effektive behandlinger av MS.

Fra en artikkel i Research in Immunology, vol. 145, nr 3, mars 1994, Paris, Frankrike, s. 200-205 (Durie et al.) er det kjent administrering av anti-gp39 monoklonale antistoffer til mus for å blokkere interaksjonen til T-celle gp39 med dens reseptor/ligand på overflaten av B-celler for å hindre utvikling av EAE og som en dyremodell på multippel sklerose.

Fra Journal of Nevroimmunology, vol. 54, nr. 1-2, 1994, Amsterdam, Nederland, s. 175 XP00057831 (J. Laman et al.) er det kjent behandling og hindring av videre utvikling av EAE i mus ved bruk av anti gp39 antistoff.

WO 9428912 Al omhandler behandling av immunsykdommer som multippel sklerose ved å bruke anti CD28 antistoff og WO 9506481 Al beskriver induksjon av antigenspesifikk T-celle-toleranse ved administrering av monoklonale antistoff som binder spesifikt til T-celleoverflatereseptoren gp39.

Oppsummering av oppfinnelsen

Bakgrunnen for den foreliggende oppfinnelsen er behandling (terapeutisk eller profylaktisk) av en T-cellemediert autoimmun forstyrrelse, så som multippel sklerose. Således an-går foreliggende oppfinnelse anvendelse av en gp39-antagonist for fremstilling av et medikament til behandling av ikke-B-lymfocyttmediert vevsdestruksjon assosiert med multippel sklerose hvor gp39-antagonisten er et anti-gp39-antistbff eller et fragment derav, en oppløselig form av gå39-ligand eller et oppløselig fusjonsprotein av en gå39-ligand som angitt i krav 1.

Kort beskrivelse av figurene

Figur 1 er en grafisk representasjon av DAS-enheter målt daglig i mus injisert dag 0 med 75 ug (Panel A) eller 300 fig (Panel B) PLP-peptid med et anti-gp39 antistoff (svarte søyler) eller med PBS (grå søyler), hvilken representasjon viser at anti-gp39 administrasjon forebygger utviklingen av eksperimentell allergisk encefalomyelitt EAE. Figur 2 er en grafisk representasjon av prosent suppresjon av EAE-induksjon i mus injisert med PLP-peptid dag 0 og ytterligere injisert med anti-gp39 antistoff (svarte søyler) eller PBS (grå søyler) dag 0, 2 og 6, eller på dag 4, 6 og 8, eller på dag 7, 9 og 11, hvilken representasjon viser at administrasjon av anti-gp39 etter induksjon av sykdom signifikant forebygger EAE. Figur 3 er en grafisk representasjon av DAS-enheter målt daglig i mus transplantert med donormiltceller fra mus injisert med PLP-peptid og anti-gp39 antistoffer (svarte søy-ler) eller med donorceller fra mus injisert med PLP-peptid alene (grå søyler) og injisert med PLP-peptid.

Detaljert beskrivelse av oppfinnelsen

Den foreliggende oppfinnelse vedrører anvendelse av en gp39-antagonist som angitt ovenfor for fremstilling av et medikament til behandling av ikke-B-lymfocyttmediert vevsdestruksjon assosiert med multippel sklerose. Sykdommen behandles ved å administrere en antagonist til en reseptor på overflaten av T-celler som medierer kontaktavhengig T-cellehjelpereffektorfunksjon.

Som definert heri, er «molekyl eller reseptor som medierer kontaktavhengig hjelpereffektorfunksjoner» en som er uttrykt på en Th-celle og virker med en ligand på en effek-torcelle (f.eks. en B-celle), hvori interaksjonen av reseptoren og liganden er nødvendig for generasjon av en effek-torcellerespons (f.eks. B-celleaktivering). I tillegg til å være involvert i effektorcelleresponser, er det funnet at et slikt molekyl er involvert i T-cellens respons på antigen.

Reseptoren på overflaten av T-cellen som medierer kontaktavhengig hjelpereffektorfunksjoner er gp39. Antagonisten er et molekyl som inhiberer interaksjonen mellom gp39 og dets ligand på en celle som presenterer antigen for T-cellen. En spesielt foretrukket gp39-antagonist er et anti-gp39-antistoff. Alternativt er gp39-antagonisten en løselig form av en gp39-ligand, f.eks. løselig CD40.

Oppfinnelsen er basert i det minste på observasjonen at administrasjonen av anti-gp39-antistoff til mus forebygger induksjon av EAE og reverserer sykdommen i dyr med EAE. Det er således funnet at et middel som inhiberer interaksjonen mellom gp39 og en T-celle med dets ligand(er) på andre celler er effektiv, både profylaktisk og terapeutisk, ved behandling av en typisk T-cellemediert autoimmun sykdom. Dette resultat er overraskende i lys av tidligere studier som har tilskrevet gp39 en primær rolle i regulering av B-celle responser. Det at det er funnet at anti-gp39-antistoff er effektive ved behandling av T-cellemediert autoimmun sykdom danner basis for den foreliggende oppfinnelse.

T- cellemedierte autoimmune sykdommer

Termen «autoimmun forstyrrelse» er ment å innbefatte forstyrrelser hvori et individs immunsystem reagerer på autoantigen, slik at signifikant vevs- eller celleødeleggelse opptrer i individet. Benevnelsen «autoantigen» er ment å innbefatte ethvert antigen i individet som gjenkjennes ved individets immunsystem. Benevnelsen «autoantigen» og «selv-antigen» anvendes om hverandre heri. Benevnelsen «selv» som anvendt heri, er ment å bety enhver komponent i individet og innbefatter molekyler, celler og organer. Autoantigener kan være peptider, nukleinsyrer eller andre biologiske substanser. Benevnelsen «T-cellemediert autoimmun forstyrrelse» er ment å innbefatte autoimmune sykdommer hvori reak-sjonen på selv primært innbefatter cellemedierte immunmekanismer, i motsetning til humorale immunmekanismer. Således kan medikamenter fremstilt ved anvendelsen ifølge oppfinnelsen brukes til behandlinger av autoimmune forstyrrelser hvori vevsødeleggelse primært medieres gjennom aktiverte T-celler og immunceller som ikke er B-lymfocytter. Imidlertid kan de autoimmune forstyrrelser værekarakterisertved nærvær av autoantistoffer. F.eks. er EAE, en T-celle-mediert autoimmun forstyrrelse som er hyppig assosiert med nærvær av autoantistoffer for komponenter i det sentrale nervesystem, så som myelin basisk protein. Ikke-begrensende eksempler på T-cellemediert autoimmun forstyrrelse innbefatter multippel sklerose, EAE, diabetes type 1, oophoritis og tyreoiditt.

gp3 9- antagonister

I medikamenter fremstilt ved anvendelsen ifølge oppfinnelsen inkluderes en gp39-antagonist for å forstyrre interaksjonen mellom gp39 på T-celler og en gp39-ligand på anti-genpresenterende celler, så som B-celler, og derved forebygge, lindre eller forbedre forstyrrelsen. En gp39-antagonist er definert som et molekyl som forstyrrer denne interaksjon. Som beskrevet mer detaljert under, kan gp39-antagonisten være et antistoff rettet mot gp39 (f.eks. et monoklonalt antistoff mot gp39), et fragment eller derivat av et antistoff rettet mot gp39 (f.eks. Fab eller F(ab)'2-fragmenter, kimeriske antistoffer eller humaniserte antistoffer) , løselige former av en gp39-ligand (f.eks. CD40), løselige former av et fusjonsprotein av en gp39-ligand (f.eks. CD40lg), eller farmasøytiske midler som avbryter eller forstyrrer gp39-CD40-interaksjon.

Antistoffer

For å fremstille anti-gp39-antistoffer, kan et pattedyr (f.eks. en mus, hamster eller kanin) immuniseres med en im-munogen form av gp39-protein eller proteinfragment (f.eks.

peptidfragment), som utløser en antistoffrespons i pattedy-ret. En celle som uttrykker gp39 på sin overflate, kan også anvendes som immunogenet. Alternative immunogener innbefatter renset gp39-protein eller proteinfragmenter. Gp39 kan

renses fra en gp39-uttrykkende celle ved standard rensetek-nikker, f.eks. kan gp39 cDNA (Armitage et al., Nature, 357:80-82 (1992); Lederman et al., J. Exp. Med., 175:1091-1101 (1992); Hollenbaugh et al., EMBO J., 11:4313-4319

(1992)) uttrykkes i en vertscelle, f.eks. bakterier eller en mammalsk-cellelinje, og gp39-protein kan renses fra cel-lekulturen ved standard teknikker. Gp39-peptider kan synte-tiseres basert på aminosyresekvensen av gp39 (beskrevet i Armitage et al., Nature, 357:80-82 (1992); Lederman et al., J. Exp. Med., 175:1091-1101 (1992); Hollenbaugh et al., EMBO J, 11:4313-4319 (1992)) ved anvendelse av kjente tek nikker (f.eks. F-moc eller T-boc kjemisk syntese). Teknikker for å tilføre et protein immunogenisitet innbefatter konjugasjon til bærere eller andre teknikker som er vel-kjent innen faget. F.eks. kan proteinet administreres i nærvær av en adjuvant. Fremskridning av immunisering kan overvåkes ved deteksjon av antistoff-titere i plasma eller serum. Standard ELISA eller annet «immunoassay» kan anvendes med immunogenet som antigen for å undersøke nivåer av antistoffer.

Etter immunisering, kan antisera beholdes, og dersom ønske-lig, kan polyklonale antistoffer isoleres fra sera. For å produsere monoklonale antistoffer kan antistoffproduserende celler (lymfocytter) høstes fra et immunisert dyr og fuse-res med myelomaceller ved standard somatiske cellefusjons-prosedyrer, hvilket immortaliserer disse cellene og gir hybridomaceller. Slike teknikker er velkjente innen faget. F.eks. hybridoma-teknikken opprinnelig utviklet av Kohler og Milstein { Nature ( 1975) 256/ 495- 497) så vel som andre teknikker så som human B-celle hybridomateknikk (Kozbar et al., Immunol. Today (1983) 4:72), EBV-hybridomateknikken for å produsere humane monoklonale antistoffer (Cole et al. Monoclonal Antibodies in Cancer Therapy (1985)(Allen R. Bliss, Inc., s 77-96), og screening av kombinatorielle an-tistof fbibliotek (Huse et al., Science (1989) 246:1275). Hybridomaceller kan "screenes" immunokjemisk for fremstilling av antistoffer spesifikt reaktive med proteinet eller peptidet og isolerte monoklonale antistoffer.

Benevnelsen antistoff som anvendt heri, er ment å innbefatte fragmenter derav som er spesifikt reaktive med et gp39-protein eller peptid derav eller gp39-fusjonsprotein. Antistoffer kan fragmenteres ved anvendelse av konvensjo-nelle teknikker, og fragmentene kan "screenes" for anvende-lighet på samme måte som beskrevet over for hele antistoffer. F.eks. kan F(ab')2-fragmenter genereres ved å behandle antistoff med pepsin. Det resulterende F(ab')2-fragment kan behandles for å redusere disulfidbroer for å produsere Fab'-fragmenter. Antistoffet som anvendes i medikamentet ifølge foreliggende oppfinnelse, er ytterligere ment å innbefatte bispesifikke og chimeriske molekyler med en anti-gp39-del.

Når antistoffer produsert i ikke-humane individ anvendes terapeutisk i mennesker, gjenkjennes de i varierende grad som fremmed, og immunrespons kan genereres i pasienten. Én tilnærmingsmåte for å minimere eller eliminere dette prob-lem, hvilket er å foretrekke fremfor generell immunosuppre-sjon, er å produsere chimeriske antistoffderivater, dvs. antistoffmolekyler som kombinerer en ikke-human variabel dyreregion og en konstant human region. Chimeriske antistoffmolekyler kan innbefatte f.eks. det antigenbindende område fra et antistoff i en mus, rotte eller andre arter, med konstante humane regioner. En rekke tilnærmingsmåter for å lage chimeriske antistoffer har blitt beskrevet og kan anvendes for å lage chimeriske antistoff inneholdende den immunoglobulinvarierende region som gjenkjenner gp39. F.eks. (Morrison et al., Proe. Nati. Acad. Sei., USA 81:6851: (1985); Takeda et al., Nature 314:452 (1985), Cabilly et al., US patent nr 4.816.567; Boss et al., US patent nr 4.816.397; Tanaguchi et al., europeisk patentpublikasjon EP 171.496; ; europeisk patentpublikasjon 173.494, UK patent GB 2177096B. Det er forventet at slike chimeriske antistoff vil være mindre immunogene i et humant individ

enn det korresponderende ikke-chimeriske antistoff.

For humane terapeutiske formål kan de monoklonale eller chimeriske antistoffer spesifikt reaktive med et gp39-protein eller -peptid, ytterligere humaniseres ved å produsere variable humane regionchimera, hvori deler av de variable regioner, spesielt de konserverte rammeregioner i det antigenbindende område, er av humant opphav, og kun de hyperva-riable regioner er av ikke-humant opphav. Slike endrede im-munoglobulinmolekyler kan lages ved anvendelse av flere

teknikker som er kjent innen faget (f.eks. Teng et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 80:7308-7312 (1983); Kozbor et

al., Immunology Today, 4:7279 (1983); Olsson et al., Meth. Enzymol., 92:3-16 (1982)), og de lages fortrinnsvis ifølge det som er beskrevet i PCT-publikasjon WO92/06193 eller EP 0239400. Humaniserte antistoff kan kommersielt produseres, f.eks. ved Scotgen Limited, 2 Holly Road, Twickenham, Middlesex, Great Britain.

En annen fremgangsmåte for å generere spesifikke antistoff, eller antistoff-fragment, som er reaktive mot et gp39-protein eller -peptid er å "screene" ekspresjonsbibliotek som koder for immunoglobulingener, eller deler derav, uttrykt i bakterie med et gp39-protein eller -peptid. F.eks. kan kom-plette Fab-fragmenter, VH-regioner og FV-regioner uttrykkes i bakterier ved anvendelse av fagekspresjonsbibliotek. Se f.eks. Ward et al., Nature, 341: 544-546 (1989); Huse et al., Science, 24 6: 1275-1281 (1989); og McCafferty et al., Nature, 348:552-554 (1990). Ved å "screene" slike bibliotek med f.eks. et gp39-peptid kan en identifisere immunoglobu-linfragmenter reaktive med gp39. Alternativt kan SCID-hu-musen (tilgjengelig fra Genpharm) anvendes for å produsere antistoffer eller fragmenter derav.

Metoder for å produsere monoklonale antistoffer rettet mot gp39, innbefatter human gp39 og mus gp39, og egnede monoklonale antistoffer for anvendelse i fremgangsmåtene ifølge oppfinnelsen er beskrevet i PCT patentsøknad nr WO 95/06666 med tittelen «Anti-gp39 Antibodies and Uses Therefor». Spesielt foretrukne anti-humane gp39-antistoffer som kan anvendes ifølge oppfinnelsen er mAbs 24-31 og 89-76, fremstilt henholdsvis ved hybridomas 24-31 og 89-76. 89-76 og 24-31 hybridomaene, fremstilt henholdsvis ved 89-76 og 24-31 antistoff ble i henhold til Budapest-konvensjonen depo-nert ved the American Type Culture Collection, Parklawn Drive, Rockville, Md., den andre september, 1994. 89-76 hybridoma ble tildelt ATCC deponeringsnummer HB11713, og 24-31 hybridoma ble tildelt ATCC deponeringssnummer HB11712. Rekombinante anti-gp39-antistoffer, så som chimeriske og humane antistoff, så som chimerahumanisert antistoff, kan fremstilles ved å manipulere nukleinsyre (f.eks. DNA) som koder for et anti-gp39-antistoff, i henhold til standard rekombinante DNA-teknikker. Den immunoglobulinkodende nukleinsyre kan kode for en variabel lett eller tung immuno-globulinkjederegion, med eller uten en forbundet konstant tung eller lett kjederegion (eller del derav). Slik nukleinsyre kan isoleres fra en celle (f.eks. hybridoma) som produserer et antihumant gp39 mAb ved standard teknikker. F.eks. kan nukleinsyre som koder for 24-31 eller 89-76 mAb, isoleres fra henholdsvis 24-31 eller 89-76 hybridoma, ved cDNA-bibliotek-"screening", PCR-amplifikasjon eller annen standard teknikk. Ytterligere kan nukleinsyre som koder for et antihuman gp39 mAb, inkorporeres i en ekspresjonsvektor og introduseres i en vertscelle for å lette ekspresjon og produksjon av rekombinante former av antihumane gp39-antistoffer.

B. Løselige ligander for gp39

Andre gp39-antagonister som kan anvendes for å indusere T-celletoleranse, er løselige former av en gp39-ligand. En monovalent løselig ligand av gp39, så som løselig CD40, hvorved interaksjon mellom gp39 og CD40 på B-celler inhibe-res. Benevnelsen «løselig» indikerer at liganden ikke er permanent assosiert med en cellemembran. En løselig gp39-ligand kan fremstilles ved kjemisk syntese, eller fortrinnsvis ved rekombinante DNA-teknikker, f.eks. ved å ut-trykke kun det ekstracellulære område (fraværende i trans-membranen og cytoplasmiske områder) av liganden. En foretrukket løselig gp39-ligand er løselig CD40. Alternativt kan en løselig gp39-ligand være i form av et fusjonsprotein. Et slik fusjonsprotein innbefatter minst en del av gp39-liganden forbundet til et andre molekyl. F.eks. kan CD40 uttrykkes som et fusjonsprotein med immunoglobulin (dvs et CD40lg-fusjonsprotein). I en utførelsesform produseres et fusjonsprotein omfattende aminosyreresiduer fra en ekstracellulær områdedel av CD40-molekylet forbundet til aminosyreresiduer av en sekvens som korresponderer til hen-gselet, CH2- og CH3-regioner i en tung immunoglobulinkjede, f.eks. Cyl, for å danne et CD40Ig-fusjonsprotein (se f.eks. Linsley et al. (1991) J. Exp. Med. 1783:721-730; Capon et al. (1989) Nature 337, 525-531; og Capon U.S. 5.116.964). Fusjonsproteinet kan fremstilles ved kjemisk syntese eller fortrinnsvis ved rekombinante DNA-teknikker basert på cDNA av CD40 (Stamenkovic et al., EMBO J., 8:1403-1410 (1989)).

En antagonist anvendt i medikamentene ifølge oppfinnelsen administreres til individene i en biologisk kompatibel form egnet for farmasøytisk administrasjon in vivo. Med «biologisk kompatibel form egnet for administrasjon in vivo» me-nes en form av antagonisten som skal administreres, hvori de toksiske effekter oppveies av de terapeutiske effekter av proteinet. Benevnelsen individ er ment å innbefatte le-vende organismer hvori en immunrespons kan utløses, f.eks. pattedyr. Eksempler på individ innbefatter mennesker, hun-der, katter, mus, rotter og transgene arter derav. En gp39-antagonist kan administreres i enhver farmakologisk form, alternativt i en farmasøytisk akseptabel bærer. Administrasjon av en terapeutisk aktiv mengde av antagonisten er definert som en effektiv mengde ved doser og i tidsrom som er nødvendig for å oppnå det ønskede resultat. F.eks. kan en terapeutisk aktiv mengde av en antagonist av gp39 variere i henhold til faktorer så som sykdomstilstand, alder, kjønn og individets vekt, samt antagonistens evne til å utløse en ønsket respons i individet. Doseringskurer kan tilpasses for å tilveiebringe den optimale terapeutiske respons. For eksempel kan flere oppdelte doser administreres daglig, eller dosen kan proporsjonalt reduseres som indikert ved behov gitt ved den terapeutiske situasjon.

Den aktive forbindelse (f.eks. antagonist) kan administreres på en fordelaktig måte, så som ved injeksjon (subkutan, intravenøs, osv), oral administrasjon, inhalasjon, trans-dermal applikasjon eller rektal administrasjon. Avhengig av administrasjonsruten kan den aktive forbindelse være belagt med et materiale for å beskytte forbindelsen fra virkning av enzymer, syrer eller andre naturlige betingelser som kan inaktivere forbindelsen. En foretrukket administrasjonsrute er ved intravenøs injeksjon.

For å administrere en antagonist av gp39 på annet vis enn parenteral administrasjon, kan det være nødvendig å belegge antagonisten med, eller ko-administrere antagonisten med, et materiale for å forebygge dets inaktivering. F.eks. kan antagonisten administreres til et individ i en egnet bærer-er eller diluent, ko-administreres med enzyminhibitorer eller i en egnet bærer så som liposomer. Farmasøytisk ak-septable diluenter innbefatter salin og vandige bufferløs-ninger. Enzyminhibitorer innbefatter pankreatisk trypsinin-hibitor, diisopropylfluorfosfat (DEP) og trasylol. Liposomer innbefatter vann-i-olje-i-vann-emulsjoner, samt konven-sjonelle liposomer (Strejan et al., (1984) J. Neuroimmunol 7:27).

Den aktive forbindelse kan også administreres parenteralt eller intraperitonealt. Dispersjoner kan også fremstilles i glyserol, flytende polyetylenglykoler og blandinger derav og i oljer. Under ordinære lagrings- og anvendelsesbeting-elser kan disse preparater inneholde et konserveringsmiddel for å forhindre vekst av mikroorganismer.

Farmasøytiske sammensetninger egnet for injiseringsanvend-else innbefatter sterile vandige løsninger (der hvor vann-løselig) eller dispersjoner og sterile pulvere for samtidig fremstilling av sterile injiserbare løsninger eller dispersjoner. I alle tilfeller må sammensetningen være steril og må være fluid på en slik måte at den lett kan sprøytes inn. Den må være stabil under produksjons- og lagringsbetingel-ser, og den må være konservert mot forurensende virkning av mikroorganismer så som bakterier eller sopp. Bæreren kan være et løsningsmiddel eller dispersjonsmedium inneholdende f.eks. vann, etanol, polyol (f.eks., glyserol, propylengly- kol og flytende polyetylenglykol, o.l.) og egnede blandinger derav. Den egnede fluiditet kan opprettholdes f.eks. ved anvendelse av en belegning så som lecitin, ved opprett-holdelse av den påkrevde partikkelstørrelse i tilfelle av dispersjon og ved anvendelse av surfaktanter. Forebyggelse av mikroorganismers virkning kan oppnås ved en rekke anti-bakterielle og antifungale midler, f.eks. parabener, kloro-butanol, fenol, askorbinsyre, timerosal, o.l. I mange tilfeller vil det være fordelaktig å innbefatte isotone midler, f.eks. sukker, polyalkoholer så som manitol, sorbitol, natriumklorid i sammensetningen. Forlenget absorpsjon av de injiserbare sammensetninger kan oppnås ved å innbefatte et middel som forsinker absorpsjon, f.eks. aluminium-monostea-rat og gelatin i sammensetningen.

Sterile injiserbare løsninger kan fremstilles ved å inkorporere den aktive forbindelse (f.eks. en antagonist av gp39) i påkrevd mengde i et egnet løsningsmiddel med én eller en kombinasjon av de ovenfor listede ingredienser, etter behov, etterfulgt av filtersterilisasjon. Generelt fremstilles disse løsninger ved å inkorporere den aktive forbindelse i en steril vehikkel som inneholder et basisk dispersjonsmedium og de påkrevde andre ingredienser fra de som er listet over. I tilfelle av sterile pulvere for frem-stillingen av sterile injiserbare løsninger er de foretrukne fremgangsmåter ved fremstilling vakuumtørking og fryse-tørking, hvilket gir et pulver av den aktive ingrediens (f.eks. antagonist) pluss enhver ytterligere ønsket ingrediens fra en tidligere sterilfiltrert løsning derav.

Når den aktive forbindelse er passende beskyttet, som beskrevet over, kan proteinet administreres oralt, f.eks. i en inert diluent eller en assimilerbar spiselig bærer. Som anvendt heri, innbefatter «farmasøytisk akseptabel bærer» ethvert løsningsmiddel, dispersjonsmedium, belegning, anti-bakterielle og antifungale midler, isotone midler og ab-sorpsjonsforsinkende midler, o.l.. Anvendelse av slike media og midler for farmasøytisk aktive substanser er vel- kjent innen faget. Dersom et konvensjonelt medium eller middel er kompatibelt med den aktive forbindelse, kan den anvendes i de terapeutiske sammensetningene. Supplementære aktive forbindelser kan også inkorporeres i sammensetningene .

Det er spesielt fordelaktig å formulere parenterale sammensetninger i doseringsenhetsform for å lette administrasjon og ensartethet av dose. Doseringsenhetsform som anvendt heri, refererer til fysikalsk diskrete enheter egnet som enhetsdoser for pattedyr-individene som skal behandles, i-det hver enhet inneholder en forhåndsbestemt mengde av den aktive forbindelse beregnet for gi den ønskede terapeutiske effekt i assosiasjon med den påkrevde farmasøytiske bærer. Spesifikasjoner for de aktuelle doseringsenhetsformene er gitt ved og direkte avhengig av (a) de unike karakteristikker av den aktive forbindelse og den spesielle terapeutiske effekt som skal oppnås, og (b) begrensningene iboende ved blanding av en slik aktiv forbindelse for behandling av sensitivitet i individer.

Oppfinnelsen er ytterligere illustrert ved de følgende eksempler som ikke skal oppfattes å være begrensende.

EKSEMPEL 1:

EAE-forebyggelse ved anti-gp39-antistoffadministrasjon

Dette eksemplet viser at administrasjon av anti-gp39-antistoffer i mus forebygger induksjon av eksperimentell allergisk encefalomyelitt (EAE), en dyremodell for multippel sklerose.

EAE er en godtkarakterisertmodell for en T-cellemediert autoimmun sykdom og er en instruktiv modell for den humane autoimmune sykdom multippel sklerose. EAE kan induseres i mottagelige dyr, så som mus, ved å immunisere dyrene med myelin basisk protein (MBP), proteolipid protein (PLP), myelinoliogodendrocyttprotein (MOG), eller syntetiske peptider basert på sekvensene av disse myelinassosierte pro-teiner sammen med en adjuvant inneholdende pertussis-bakterier. Én til to uker etter immunisering utvikler dyrene encefalomyelitt,karakterisert vedperivaskulære infiltra-ter innholdende lymfocytter og makrofager og utviklingen av demyelinisering i hjernen og ryggmargen. Dyrene viser akutt, kronisk eller kronisk tilbakevendende paralyse. I dette eksemplet ble effekten av administrasjon av anti-gp39-antistoff på utviklingen av EAE i mottagelige mus ana-lysert .

EAE ble indusert i mottagelige mus ved subkutane injeksjo-ner (dag 0) av en emulsjon inneholdende 70 ug eller 300 ug PLP-peptid i 50 (il PBS og 25 |ig Mycobacteria tuberculosis (H37RA, Difco) i 50 ul av komplett Freuds adjuvant på to steder i de abdominale sider av mus. 200 ul Bordetella per-tussis-suspensjon (10,10<10>i 1 ml PBS) ble gitt intravenøst samtidig som peptidet, samt to dager senere. PLP-peptidet injisert i musene har en aminosyresekvens som korresponderer til aminosyreresiduer 139-151 i rotte-PLP (Dautigny et al., FEBS Lett. 188:33, 1985). PLP-peptid ble synteti-sert med f-moc beskyttede aminosyrer ifølge faststoffase-syntesemetoden (Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85:2149, 1963). Immunisering med dette peptid gir akutt utviklet EAE, som er klinisk og patologisk identisk med den indusert ved sensitivering med hele sentrale nervesystem (CNS) myelin eller med MBP (Tuohy et al., J. Immunol. 142:1523, 1989; Sobel et al., J. Neuropathol. Exp. Neurol. 49:468, 1990).

For å bestemme effekten av anti-gp39 på sykdomsforløpet ble mus injisert dag 0 med PLP-peptid, som beskrevet over, og ytterligere injisert intraperitonealt med 125 ug hamster anti-gp39 Mab (Noelle et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA 89:6550, 1992) i 200 ul PBS eller med 125 ug normale ham-sterantistoff (Serva Feinbiochemica) i 200 ul PBS (kon-trolldyr) dag 0, 2 og 4. Grad av EAE kliniske tegn ble evaluert hver dag og gradert i henhold til mildere ufør-hetsskala(DAS)-poeng: grad 0 = ingen kliniske tegn, grad 1 « halesvakhet, grad 2 = svak paraparese og ataksi i bakbena, grad 3 = alvorlig paraparese eller ataksi i bakbena, grad 4 = døende, grad 5 = død på grunn av EAE.

Figur 1 representerer sykdomsforløpet i mus injisert med 70 ug PLP-peptid (Panel A) eller med 300 fig PLP-peptid (Panel B) og behandlet med anti-gp39 eller kontrollantistoff. DAS-poeng, som reflekterer sykdommens alvor, for kontrollmus og anti-gp39-behandlede mus er gitt i henholdsvis grå og svarte søyler.

Resultatene indikerer at dyr som har mottatt kontrollanti-stoffet utviklet EAE, mens dyr som mottok anti-gp39-antistoff ble beskyttet mot sykdomsinduksjon. For dyr som fikk kontrollantistoff, kom de første kliniske tegn på EAE til syne på dag 11. I disse dyrene var det høyeste DAS-poeng 2,33, hvilket ble observert på dag 15-22 i dyr injisert med 75 ug PLP-peptid (figur 1, Panel A, grå søyler) og 3,6 observert på dag 16-23 i dyr injisert med 300 ug PLP-peptid {figur 1, Panelt B, grå søyler). I motsetning til dette viste dyr som mottok anti-gp39-monoklonale antistoff ingen kliniske tegn etter induksjon av EAE med 75 ug PLP-peptid (figur 1, Panel A, svarte søyler) og kun mindre kliniske tegn, som fullstendig forsvant dag 31 etter induksjon av sykdom med 300 ug PLP-peptid (Figur 1, Panel B, svarte søyler).

Således inhiberte administrasjon av anti-gp39-antistoff til mus fullstendig induksjon av EAE i musene.

Induksjon av EAE ved adoptiv overføring av myelinreaktive T-celler isolert fra dyr immunisert med myelinkomponenter eller erholdt etter in vitro-aktivering med myelin-komponenter, indikerer at spesielt aktiverte T-celler er ansvarlig for utviklingen av kliniske karakteristikker etter den induktive fase. (Pettinelli and McFarlin, J. Immunol.

127:1420, 1979; Mokhtarion et al., Nature 39:356, 1984; Veen et al., J. Neuroimmunol. 21:183, 1989). Imidlertid viser eksperimentet beskrevet heri at administrasjon av anti-gp39-monoklonale antistoff forhindrer utviklingen av EAE. I kontrollgrupper ble signifikante anti-PLP-peptid-antistoffresponser observert dag 14 (absorbans 1,92) og 21 (absorbans 2,15) i dyr hvori EAE ble indusert med henholdsvis lave og høye PLP-peptiddoser. I motsetning til dette ble signifikante anti-PLP-peptidantistoffresponer i gp39-behandlede mus observert først på dag 14 og nådde platå-nivået på dag 31 (absorbans 0,928 og 40 (absorbans 1,54) i dyr som ble injisert med henholdsvis lave og høye PLP-peptiddoser. Generasjon av signifikant anti-PLP-peptid-anti-stoffresponser i anti-gp39-monoklonalt antistoffbehandlede mus ble utsatt til dag 14, hvilket indikerer at de anti-gp39-monoklonale antistoffer hadde en viss effekt på anti-stof fproduksjon.

Således viste dette eksemplet at anti-gp39 forhindrer utvikling av EAE og indikerer at anti-gp39-antistoffer kan anvendes for å behandle T-cellemedierte autoimmune sykdommer, så som multippel sklerose.

EKSEMPEL 2:

Reversering av EAE ved anti-gp39-antistoffadministrasjon

Eksempel 1 viste den inhibitoriske effekt av anti-gp39-antistoff på induksjon av EAE. Således ble det vist at immunisering av mus ved induksjonstidspunkt for sykdommen forebygget utvikling av sykdommen. Dette eksempel viser at administrasjon av antistoffet etter induksjon av sykdommen, gir regresjon av sykdommen.

I dette eksemplet ble EAE indusert i SJL/j hunnmus (10-12 uker gamle) ved injisering av en emulsjon inneholdende 150 |ig PLP-peptid fremstilt som beskrevet over. For å bestemme effekten av anti-gp39-antistoffer når de ble administrert til mus etter induksjon av sykdommen, ble mus injisert intraperitonealt med 125 ug anti-gp39-monoklonale antistoff (Noelle et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA 89:6550, 1992) i 200 ul PBS (anti-gp39-behandlede mus) eller med 200 ul PBS alene (kontrollmus) på dag 0, 2 og 4, på dag 4, 6 og 8 eller dag 7, 9 og 11. Resultatene er gitt som prosent suppresjon og er en sammenligning av de totale daglige DAS-poeng (fra dag 12-28) i anti-gp39-behandlede dyr og i kon-trolldyr.

Resultatene som er gitt i figur 2, indikerer at administrasjon av den første dose av anti-gp39-antistoff så sent som 7 dager etter injeksjon av PLP-peptid i mus resulterer i mer enn 60% suppresjon av sykdommen. Således evner anti-gp39-antistoffer å reversere eller undertrykke EAE.

Resultatene indikerer ytterligere at selv om administrasjon av en første dose antistoff kun 7 dager etter induksjon av sykdommen i mus, resulterer i signifikant suppresjon av sykdomsutviklingen, er anti-gp39-behandling noe mer effektiv når den første dose av antistoff administreres raskere etter sykdommens induksjon.

Således beskytter administrasjon av anti-gp39-antistoff til mus disse musene mot utvikling av EAE ved induksjon av sykdommen og undertrykker sykdommen i mus med EAE.

EKSEMPEL 3:

Suppresjon av EAE etter miltcelleoverføring av gp39-behandlede mus

Regulatoriske suppressor-T-celler har blitt detektert i Lewis-rotte, som har blitt gjenvunnet fra EAE (Pesoa et al., J. Neuroimmunol. 7:131, 1984) og etter oral administrasjon av myelinkomponenter (Lider et al., J. Immunol. 142:748, 1989); Hafler et al., Ann. NY Acad. Sei. 636:251, 1991). Det ble postulert av Karpus og Swanbor (J. Immunol.

143:3492, 1989) at CD4<+->suppressor-T-celler isolert fra rotter som har blitt gjenvunnet fra EAE, kan nedregulere EAE-T-effektorceller ved differensiell inhibering av lym-fokinproduksjon. I motsetning til dette er EAE-suppresjon i Lewis-rotter ved oral administrasjon av MBP mediert ved CD8<+>T-celler (Miller et al., J. Exp. Med. 174:791, 1991). For å bestemme om T-cellene i mus som har blitt beskyttet mot EAE ved administrasjon av anti-gp39-antistoff, evner å beskytte naive dyr fra EAE, ble det følgende eksempel gjen-nomført .

I dette eksemplet ble et første sett av mus injisert med 150 ug PLP-peptid og et annet sett av mus ble injisert med 150 ug PLP-peptid og anti-gp39-antistoff ifølge protokollen beskrevet i eksempel 1. Fire måneder senere ble musene av-livet ved C02-eutanasi og milten ble fjernet. Erytrocytter ble fjernet ved standard ammoniumkloridbehandling (Mishell and Shiigi, Selected Methods in Cellular Immunolgy. W.H. Freeman and Company, 1980). Celler fra individuelle milter (500 ul) ble injisert i.v. i naive 5 Gy bestrålede resipi-ent SLJ/j hunnmus (10-12 uker gamle). To dager etter celle-overføring, ble mus tilført 150 ug PLP-peptid ved intrape-ritoneal injeksjon i henhold til prosedyren beskrevet i eksempel 1, og DAS-poeng ble bestemt.

Figur 3 representerer DAS-poengene for dyrene. Resultatene viser at mus som har blitt transplantert med miltceller fra dyr initialt injisert med PLP-peptid og anti-gp39-antistoff er beskyttet mot utvikling av sykdommen, mens mus transplantert med miltceller fra dyr initialt injisert kun med PLP-peptid utvikler EAE. Ytterligere kan en når en tar med i betraktning at den estimerte halveringstid av antistoff er 12 dager, forvente at intet antistoff foreligger i milt-cellene transplantert i musene. Følgelig kan ikke den be-skyttende effekt tilført donormiltcellene fra dyr som har blitt tilført anti-gp39-antistoff forklares med nærvær av ariti-gp39-antistoff. DAS-poeng for disse mus indikerer at suppresjon av EAE i mottagermus mest sannsynlig skyldes nærværet av en T-suppressorcellepopulasjon i den overførte miltcellesuspensjon, og at denne T-suppressorcellepopulasjon effektivt underkjenner T-effektorcellepopulasjonen.

EKSEMPEL 4:

Deteksjon av gp39-positive Th-celler

Dette eksempel viser nærvær av gp39-positive celler i det sentrale nervesystem i humane individ med multippel sklerose.

Human autopsi centralnervesystem(CNS)-vev ble erholdt fra den nederlandske hjernebank, Amsterdam, Nederland. Gp39-positive celler ble detektert med et CD40lg-fusjonsprotein ifølge fremgangsmåter kjent innen faget. CNS-vevsseksjoner fra en MS-pasient og en Alzheimer's pasient ble merket med CD40Ig. I dette eksempelet ble det kun anvendt CNS-vev fra MS-pasienter hvori anti-MBP-antistoffdannende celler hadde blitt tidligere detektert. Resultatet av merkingen viser nærvær av gp39-positive celler i en 8 um koronal cerebrum-seksjon fra en MS-pasient, men ingen gp39-positive celler ble detektert i koronale cerebrumseksjoner fra Alzheimer-pasienter. Følgelig ble gp39-positive celler kun detektert i CNS-vevseksjoner fra MS-pasienter. Nærvær av gp39-posi-tive celler i CNS-vev i MS-pasienter sammen med deteksjon av anti-MBP-antistoffdannende celler i CNS-vev kun fra MS-pasienter og ikke i kontroll-CNS-vev indikerer at slike celler spiller en rolle i det patologisk angrepne CNS-vev i MS-pasienter.

I dette studie har vi vist at suppresjon av B-celleaktivering ved administrasjon av anti-gp39-Maber, kan resultere i den fullstendige forebyggelse av EAE-utvikling, avhengig av dose antigen som induserte EAE og avhengig av tidsperioden mellom EAE-induksjon og administrasjon av anti-gp39-Mab. Selv om de eksakte mekanismer ansvarlig for EAE-induksjon og utvikling derav ikke er klare, indikerer disse data at anti-gp39-antistoff kan anvendes for behandling av autoimmune sykdommer.

Ekvivalenter

Fagmannen vil forstå eller evne å konstatere at det finnes mange ekvivalenter av spesifikke utførelsesformer av oppfinnelsen beskrevet heri, ved anvendelse av kun rutine-eksperimentering.

Claims (7)

1. Anvendelse av en gp39-antagonist ved fremstilling av et medikament egnet til behandling av ikke-B-lymfocyttmediert vevsdestruksjon assosiert med multippel sklerose, hvor behandlingen utføres ved å administrere til et men-neske som har pågående multippel sklerose, etter at sykdommen er kommet i gang, en effektiv mengde av en gp39-antagonist.

2. Anvendelse ifølge krav 1, hvor antagonisten er et anti-gp39-antistoff.

3. Anvendelse ifølge krav 2, hvor anti-gp39-antistoffet er et monoklonalt antistoff.

4. Anvendelse ifølge krav 2, hvor anti-gp39-antistoffet er et anti-humant gp-39-antistoff.

5. Anvendelse ifølge krav 3, hvor det monoklonale antistoff er dannet av 89-7 6 hybridom, ATCC deponeringsnummer HB 11713 eller 24-31 hybridom, ATCC deponerigsnummer HB 11712 eller et antistoff som har de gp39-bindende karakteristika derav.

6. Anvendelse ifølge krav 3, hvor det monklonale antistoffet er et chimerisk monoklonalt antistoff.

7. Anvendelse ifølge krav 3, hvor det monoklonale antistoff er et humanisert monklonalt antistoff.