JPH11507058A - Ｔ細胞媒介性自己免疫疾患の治療 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 多発性硬化症および他のＴ細胞媒介性自己免疫疾患の治療方法を開示する。該方法は、抗ｇｐ３９抗体などの接触依存性ヘルパーエフェクター機能を媒介するＴ細胞表面上の受容体に対するアンタゴニストを治療的および予防的有効量にて被験者に投与することを含む。

Description

【発明の詳細な説明】 Ｔ細胞媒介性自己免疫疾患の治療発明の背景 自己免疫疾患は、個体の免疫系のそれ自身の組織に対する攻撃を特徴とする。 自己免疫疾患は通常、自身の抗原に対する免疫系の寛容性の低下に起因する。種 々の自己免疫疾患において免疫系によって認識される特異的抗原には、全身的に 存在するものか、または臓器特異的なものの両方の可能性がある。たとえば、全 身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）は、臓器特異的でないＤＮＡ、リボ核タンパク 質、ヒストンおよび他の分子に対する自己抗体の存在を特徴とする。他の自己免 疫疾患は、主としてひとつの臓器が破壊されることを特徴とする。このような自 己免疫疾患としては、Ｉ型糖尿病が挙げられ、この疾患においては、膵臓のラン ゲルハンス島のインスリン産生β細胞が破壊される。 自己免疫疾患では、自己抗体が高濃度で産生されることの結果として一次的に 組織破壊が起こるものもある。このような疾患としては、関節軟骨の破壊および 滑膜の炎症を特徴とするリューマチ性関節炎が挙げられる。リューマチ性関節炎 の患者においては、患者の関節に、ＩｇＧ分子およびＩｇＧのＦｃ部分に対する 自己抗体の結合によって形成される免疫複合体が蓄積される。これらの免疫複合 体は、補体カスケードを活性化し、その結果、組織が損傷を受ける。進行性の筋 肉弱化疾患である重症筋無力症は、神経筋接合部の運動終板にあるアセチルコリ ン受容体に反応する自己抗体の産生によって起こる。 他の自己免疫疾患においては、組織破壊は、自己抗体の産生によって一次的に 媒介されるようには思われず、むしろ自己反応性Ｔリンパ球によって媒介される ものと思われる。たとえば、多発性硬化症の実験動物モデルであり、脳および脊 髄における脱髄を特徴とする実験的アレルギー性脳脊髄炎（ＥＡＥ）は、該疾患 を発症している動物由来のＣＤ４＋Ｔ細胞を移入することによって誘発すること ができる。したがって、ＥＡＥは、Ｔ細胞媒介性自己免疫疾患であるというより もむしろＢ細胞媒介性自己免疫疾患であると一般的に考えられる［ベン−ナン,A らの（１９８１）、Eur．J．Immunol.、１１、１９５］。 多発性硬化症（ＭＳ）は、脳および脊髄の不定の脱髄性疾患である。該疾患は 、中枢神経系の様々な領域に影響を及ぼす神経学的機能不全の緩解と再燃を特徴 とする進行性の疾患である。該疾患の症状は、後に大脳白質、脳幹または脊髄に おいて“プラーク”として現れる瘢痕を形成する炎症性の病巣に起因する。現在 、ＭＳに適用しうる決定的な診断試験および診断薬はなく、神経学的機能不全の 再燃の徴候時における患者の症状の範囲および／または患者の年齢などのファク ターに基づいて治療養生法が処方されている。 ＭＳの患者は代表的に、患者を緩解に至らしめるかまたは疾患の進行を遅延化 させることを目標としてステロイドで治療されている。疾患の特定の症状を治療 するために、たとえば筋弛緩薬などの他の薬物も用いられている。ＭＳに適用し うる治療における最近の発達としては、βインターフェロンの投与が挙げられる 。βインターフェロンは、該疾患の進行を遅延化させることにおいてある程度の 成果を披露している。しかしながら、依然として、ＭＳに対する効果的な治療法 が必要とされている。発明の要約 本発明は、多発性硬化症などのＴ細胞媒介性自己免疫疾患の（治療的および予 防的）処置方法に関する。該方法は、接触依存性ヘルパーエフェクター機能を媒 介するＴ細胞表面上の受容体に対するアンタゴニストを、治療的または予防的有 効量にて被験者に投与することを特徴とする。好ましい具体例において、投与さ れるアンタゴニストは、Ｔ細胞受容体ｇｐ３９に特異的に結合する抗体またはそ のフラグメントである。図面の簡単な説明 図１は、第０日に７５μｇ（パネルＡ）または３００μｇ（パネルＢ）のＰＬ Ｐペプチドを抗ｇｐ３９抗体（黒線）またはＰＢＳ（灰線）とともに注入された マウスにおいて毎日測定されたＤＡＳ単位のグラフであり、抗ｇｐ３９の投与が 、実験的アレルギー性脳脊髄炎（ＥＡＥ）の進行を予防することを示している。 図２は、第０日にＰＬＰペプチドを注入され、次いで第０、２および６日、ま たは第４、６および８日、または第７、９および１１日に抗ｇｐ３９抗体（黒線 ）またはＰＢＳ（灰線）をさらに注入されたマウスにおけるＥＡＥ誘発の抑制パ ーセントのグラフであり、疾患誘発後の抗ｇｐ３９の投与が、ＥＡＥを有意に妨 げることを示している。 図３は、ＰＬＰペプチドおよび抗ｇｐ３９抗体を注入されたマウス由来のドナ ー脾臓細胞（黒線）またはＰＬＰペプチド単独を注入されたマウス由来のドナー 細胞（灰線）を移植され、次いでＰＬＰペプチドを注入されたマウスにおいて毎 日測定されたＤＡＳ単位のグラフである。発明の詳細な記載 本発明は、多発性硬化症などのＴ細胞媒介性自己免疫疾患の治療方法に関する 。接触依存性ヘルパーエフェクター機能を媒介するＴ細胞表面上の受容体に対す るアンタゴニストを投与することによって該疾患を治療する。 本明細書中、“接触依存性ヘルパーエフェクター機能を媒介する分子または受 容体”とは、Ｔｈ細胞において発現され、エフェクター細胞（Ｂ細胞など）上の リガンドと相互作用するものであり、エフェクター細胞応答（Ｂ細胞活性化など ）を引き起こすには、このような受容体とリガンドの相互作用が必要である。エ フェクター細胞応答に必要であることに加えて、このような分子が、抗原に対す るＴ細胞応答において必要であることが発見されている。 好ましい具体例において、接触依存性ヘルパーエフェクター機能を媒介するＴ 細胞表面上の受容体はｇｐ３９である。この具体例において、アンタゴニストは ｇｐ３９とＴ細胞に抗原を提示する細胞上のそのリガンドとの相互作用を阻害す る分子である。特に好ましいｇｐ３９アンタゴニストは抗ｇｐ３９抗体である。 別の態様において、ｇｐ３９アンタゴニストは、ＣＤ４０などの可溶性形態のｇ ｐ３９リガンドである。 本発明方法は、抗ｇｐ３９抗体のマウスへの投与が、ＥＡＥの誘発を予防し、 ＥＡＥを発症している動物において該疾患を逆転するという知見に少なくとも部 分的に基づいている。したがって、Ｔ細胞上のｇｐ３９と他の細胞上のリガンド の相互作用を阻害する作用剤が、典型的なＴ細胞媒介性自己免疫疾患の治療にお いて、予防的および治療的に有効であることが発見されている。ｇｐ３９はＢ細 胞応答の調節において一次的役割をもつものであるとみなす先行研究を考慮する と、この結果は驚くべきことである。抗ｇｐ３９抗体がＴ細胞媒介性自己免疫疾 患の治療において有効であるという発見が、本発明の基盤である。本発明にした がって、抗ｇｐ３９抗体の効果に模擬する効果を有する作用剤を投与することに よって、多発性硬化症などのＴ細胞媒介性自己免疫疾患をもつ被験者が治療され る。Ｔ細胞媒介性自己免疫疾患 語句“自己免疫疾患”とは、患者の免疫系が自己抗原に作用し、その結果、重 篤な組織または細胞破壊が患者に起こる疾患を意味する。語句“自己抗原”とは 、患者の免疫系によって認識される患者の抗原のいずれをも意味する。語句“自 己抗原(autoantigen)”および“自己抗原(selg-antigen)”は、本明細書におい て互換的に使用される。本明細書中、“自己”とは、患者の構成成分のいずれを も意味し、分子、細胞および臓器が包含される。自己抗原は、ペプチド、核酸ま たは他の生物学的物質であってよい。語句“Ｔ細胞媒介性自己免疫疾患”とは、 自己に対する反応において一次的に、液性免疫メカニズムに対するものとしての 細胞媒介性免疫メカニズムを必要とする自己免疫疾患を意味する。したがって、 本発明方法は、組織破壊が、活性化Ｔ細胞およびＢリンパ球以外の免疫細胞を介 して一次的に媒介される自己免疫疾患の治療に関する。しかしながら、本発明方 法は自己に対する反応がＢ細胞以外の細胞によって一次的に媒介される自己免疫 疾患の治療を意図するものであるが、該自己免疫疾患は、自己抗体の存在を特徴 とするのものであってもよい。たとえば、本発明方法によって治療しうるＴ細胞 媒介性自己免疫疾患であるＥＡＥは、ミエリン塩基性タンパク質などの中枢神経 系の構成成分に対する自己抗体の存在をしばしば伴う。本発明方法によって治療 しうるＴ細胞媒介性自己免疫疾患の非制限的な例として、多発性硬化症、ＥＡＥ 、Ｉ型糖尿病、卵巣炎および甲状腺炎が挙げられる。ｇｐ３９アンタゴニスト ： 本発明にしたがって、ｇｐ３９アンタゴニストを被験者に投与し、Ｔ細胞上の ｇｐ３９とＢ細胞などの抗原提示細胞上のリガンドとの相互作用を妨害すること によって疾患を予防、軽減、改善する。ｇｐ３９アンタゴニストとは、この相互 作用を妨害する分子として定義される。以下に詳述するように、ｇｐ３９アンタ ゴニストは、ｇｐ３９に対して向けられた抗体（たとえば、ｇｐ３９に対するモ ノクローナル抗体）、ｇｐ３９に対して向けられた抗体のフラグメントまたは誘 導体(たとえば、ＦａｂまたはＦ(ａｂ')２フラグメント、キメラ抗体またはヒト 化抗体)、可溶性形態のｇｐ３９リガンド(たとえば、可溶性ＣＤ４０)、可溶性 形態のｇｐ３９リガンドの融合タンパク質(たとえば、可溶性ＣＤ４０Ｉｇ)、ま たはｇｐ３９−ＣＤ４０相互作用を破壊または妨害する薬剤であってよい。Ａ．抗体 抗ｇｐ３９抗体を作成するために、哺乳動物（たとえば、マウス、ハムスター 、またはウサギ）は、該哺乳動物において抗体応答を引き起こす免疫原の形態の ｇｐ３９タンパク質またはタンパク質断片（たとえば、ペプチド断片）で免疫す ることができる。その表面にｇｐ３９を発現する細胞もまた免疫原として用いる ことができる。他の免疫原としては、精製したｇｐ３９タンパク質またはタンパ ク質断片が挙げられる。ｇｐ３９の精製は、標準精製法によりｇｐ３９発現細胞 から行うことができる。たとえば、ｇｐ３９ｃＤＮＡ（アーミテージら、Ｎatur e、３５７：８０〜８２（１９９２）；レーダーマンら、Ｊ．Ｅxp.Ｍed.、１７ ５：１０９１〜１１０１（１９９２）；ホレンバウら、ＥＭＢＯ Ｊ.、１１：４ ３１３〜４３１９（１９９２））を宿主細胞、たとえば細菌または哺乳動物細胞 株中で発現させ、細胞培養液から標準法に従ってｇｐ３９タンパク質を精製する ことができる。ｇｐ３９ペプチドは、ｇｐ３９のアミノ酸配列（アーミテージら 、Ｎature、３５７：８０〜８２（１９９２）；レーダーマンら、Ｊ．Ｅxp.Ｍed .、１７５：１０９１〜１１０１（１９９２）；ホレンバウら、ＥＭＢＯ Ｊ.、 １１：４３１３〜４３１９（１９９２）に開示）に基づき、公知の方法（たとえ ば、Ｆ−ｍｏｃまたはＴ−ｂｏｃ化学合成）により合成することができる。タン パク質に免疫原性を付与する技術としては、担体への結合、または当該技術分野 でよく知られた他の方法が挙げられる。たとえば、タンパク質をアジュバントの 存在下 で投与することができる。免疫の進行は、血漿または血清中の抗体力価の検出に よりモニターすることができる。抗体レベルを評価するため、抗原として免疫原 を用いた標準ＥＬＩＳＡまたは他のイムノアッセイを用いることができる。 免疫後、抗血清を得ることができ、所望ならポリクローナル抗体を該血清から 単離することができる。モノクローナル抗体を産生するには、抗体産生細胞（リ ンパ球）を免疫動物から回収し、標準体細胞融合法によりミエローマ細胞と融合 させてこれら細胞を不死化し、ハイブリドーマ細胞を得る。かかる技術は当該技 術分野においてよく知られている。たとえば、コーラーおよびミルシュテインに より最初に開発されたハイブリドーマ法（Ｎature（１９７５）２５６：４９５ 〜４９７）、並びにヒトＢ細胞ハイブリドーマ法（コズバーら、Ｉmmunol.Ｔoda y（１９８３）４：７２）、ヒトモノクローナル抗体を産生するためのＥＢＶ− ハイブリドーマ法（コールら、Ｍonoclonal Ａntibodiesin Ｃancer Ｔherapy（ １９８５）（アレン・アール・ブリス、７７〜９６頁））、および結合（combin atorial）抗体ライブラリーのスクリーニング（ヒューズら、Ｓcience（１９８ ９）２４６：１２７５）などの他の方法。該タンパク質またはペプチドに特異的 に反応する抗体の産生についてハイブリドーマ細胞を免疫化学的にスクリーニン グし、モノクローナル抗体を単離することができる。 本明細書において用いる抗体なる語は、ｇｐ３９タンパク質またはそのペプチ ドまたはｇｐ３９融合タンパク質と特異的に反応するフラグメントをも包含する 。抗体は常法によりフラグメントとすることができ、全抗体について記載したの と同様にしてフラグメントを有用性についてスクリーニングすることができる。 たとえば、Ｆ(ａｂ')₂フラグメントは抗体をペプシンで処理することにより生成 させることができる。得られたＦ(ａｂ')₂フラグメントは、ジスルフィド架橋を 還元すべく処理してＦａｂ'フラグメントとすることができる。本発明の抗体は さらに、抗ｇｐ３９部分を有する２特異的分子およびキメラ分子を包含する。 非ヒト被験者において産生された抗体をヒトの治療に用いる場合には、これら 抗体は種々の程度で外来のものとして認識され、該患者において免疫応答が生じ るかもしれない。この問題を最小限に抑えまたは排除する（一般的な免疫抑制に 好ましい）一つの方法は、キメラ抗体誘導体、すなわち非ヒト動物の可変領域と ヒトの定常領域とを組み合わせた抗体分子を作製することである。キメラ抗体分 子としては、たとえば、マウス、ラットまたは他の種からの抗体の抗原結合ドメ インをヒト定常領域と組み合わせたものが挙げられる。種々のキメラ抗体の作製 法が記載されており、ｇｐ３９を認識する免疫グロブリン可変領域を含むキメラ 抗体を作製するのに用いることができる。たとえば、モリソンらＰroc.Ｎatl.Ａ cad.Ｓci.ＵＳＡ ８１：６８５１（１９８５）；タケダら、Ｎature ３１４：４ ５２（１９８５）、カビリーら、米国特許第４,８１６,５６７号；ボスら、米国 特許第４,８１６,３９７号；タナグチら、ヨーロッパ特許出願公開ＥＰ１７１４ ９６号；ヨーロッパ特許出願公開第０１７３４９４号、英国特許第ＧＢ２１７７ ０９６Ｂ号を参照。かかるキメラ抗体は、対応する非キメラ抗体に比べてヒト被 験者にける免疫原性が小さいことが期待される。 ヒトの治療目的に用いる場合、可変領域の一部、とりわけ抗原結合ドメインの 保存されたフレームワーク領域をヒト由来のものとし、超可変領域のみを非ヒト 由来のものとしたヒト可変領域キメラを作成することによって、ｇｐ３９タンパ ク質またはペプチドに特異的に反応するモノクローナル抗体またはキメラ抗体を さらにヒト化することができる。かかる改変免疫グロブリン分子は当該技術分野 で知られた幾つかの技術（たとえば、テングら、Ｐroc.Ｎatl.Ａcad.Ｓci.ＵＳ Ａ、８０：７３０８〜７３１２（１９８３）；コズバーら、Ｉmmunology Ｔoday 、４：７２７９（１９８３）；オルソンら、Ｍeth.Ｅnzymol.、９２：３〜１６ （１９８２））のいずれによっても作製することができ、ＰＣＴ公開ＷＯ９２／ ０６１９３号またはＥＰ０２３９４００号の教示に従って作成するのが好ましい 。ヒト化抗体は、たとえば、スコットジェン・リミテッド（Ｓcotgen Ｌimited ）、グレートブリテン、ミドルセックス、トゥイッケナム、ホリー・ロード２番 によって商業的に製造することができる。 ｇｐ３９タンパク質またはペプチドに対して特異的に反応する特異的抗体、ま たは抗体フラグメントの他の作製方法は、細菌中に発現された免疫グロブリン遺 伝子またはその一部をコードする発現ライブラリーをｇｐ３９タンパク質または ペプチドでスクリーニングすることである。たとえば、ファージ発現ライブラリ ーを用い、完全なＦａｂフラグメント、ＶＨ領域およびＦＶ領域を細菌中で発現 させることができる。たとえば、ウォードら、Ｎature、３４１：５４４〜５４ ６：（１９８９）；ヒューズら、Ｓcience、２４６：１２７５〜１２８１（１９ ８９）；およびマッカファーティら、Ｎature、３４８：５５２〜５５４（１９ ９０）を参照。かかるライブラリーを、たとえばｇｐ３９ペプチドを用いてスク リーニングすることにより、ｇｐ３９に反応性の免疫グロブリンフラグメントを 同定することができる。別法として、ＳＣＩＤ−ｈｕマウス（ジェンファーム（ Ｇenpharm）より入手可能）を用いて抗体またはそのフラグメントを作製するこ とができる。 ヒトｇｐ３９およびマウスｇｐ３９を含むｇｐ３９に対して向けられたモノク ローナル抗体の作製方法および本発明の方法に使用するのに適したモノクローナ ル抗体については、“抗ｇｐ３９抗体およびその用途”と題するＰＣＴ国際公開 ＷＯ９５／０６６６６にさらに詳細に記載されており、この文献は本発明の参考 文献である。本発明の特に好ましい抗ヒトｇｐ３９抗体は、ハイブリドーマ２４ −３１および８９−７６によってそれぞれ産生されたｍＡｂ２４−３１および８ ９−７６である。８９−７６抗体および２４−３１抗体をそれぞれ産生する８９ −７６ハイブリドーマおよび２４−３１ハイブリドーマは、ブダペスト条約の規 定に従い、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション、パークローンドラ イブ、ロックビル、メリーランドに１９９４年９月２日に寄託してある。８９− ７６ハイブリドーマはＡＴＣＣ受託番号ＨＢ１１７１３を、２４−３１ハイブリ ドーマはＡＴＣＣ受託番号ＨＢ１１７１２を付与された。 キメラ抗体やヒト化抗体などの組換え抗ｇｐ３９抗体は、標準組換えＤＮＡ法 に従い、抗ｇｐ３９抗体をコードする核酸（たとえば、ＤＮＡ）を操作すること により作製することができる。従って、本発明の他の側面は、ｇｐ３９、とりわ けヒトｇｐ３９に反応性の免疫グロブリンＨ鎖またはＬ鎖またはその一部をコー ドする単離核酸分子に関する。該免疫グロブリンをコードする核酸は、免疫グロ ブリンのＬ鎖またはＨ鎖可変領域をコードしていてよく、Ｈ鎖またはＬ鎖の定常 領域（またはその一部）が結合していても結合していなくてもよい。かかる核酸 は、抗ヒトｇｐ３９ｍＡｂを産生する細胞（たとえば、ハイブリドーマ）から標 準法により単離することができる。たとえば、２４−３１または８９−７６ｍＡ ｂをコードする核酸は、それぞれ２４−３１ハイブリドーマまたは８９−７６ハ イブリドーマからｃＤＮＡライブラリースクリーニング、ＰＣＲ増幅その他の標 準法により単離することができる。抗ヒトｇｐ３９ｍＡｂをコードする核酸を単 離およびさらに操作した後、該核酸を発現ベクター中に組み込み、宿主細胞中に 導入して組換え形態の抗ヒトｇｐ３９抗体の発現および産生を容易にすることが できる。Ｂ．ｇｐ３９の可溶性リガンド Ｔ細胞寛容を誘導するのに用いることのできる他のｇｐ３９アンタゴニストは 、可溶性形態のｇｐ３９リガンドである。可溶性ＣＤ４０などのｇｐ３９の１価 可溶性リガンドはｇｐ３９に結合することができ、それによってｇｐ３９とＢ細 胞上のＣＤ４０との相互作用を抑制する。「可溶性」なる語は、リガンドが細胞 膜に永久的に結合していないことを示す。可溶性ｇｐ３９リガンドは、化学合成 によって、または好ましくは組換えＤＮＡ法によって、たとえば、該リガンドの 細胞外ドメインのみ（経膜ドメインおよび細胞質ドメインを欠く）を発現させる ことによって作製することができる。好ましい可溶性ｇｐ３９リガンドは可溶性 ＣＤ４０である。別の態様として、可溶性ｇｐ３９リガンドはまた融合タンパク 質の形態であってもよい。かかる融合タンパク質は、第二の分子に結合した少な くとも一部のｇｐ３９リガンドを含む。たとえば、ＣＤ４０は免疫グロブリンと の融合タンパク質（すなわち、ＣＤ４０Ｉｇ融合タンパク質）として発現させる ことができる。一つの態様において、免疫グロブリンＨ鎖、たとえばＣγ１のヒ ンジ領域、ＣＨ２領域およびＣＨ３領域に対応する配列のアミノ酸残基に結合し たＣＤ４０分子の細胞外ドメイン部分のアミノ酸残基からなる融合タンパク質を 作製してＣＤ４０Ｉｇ融合タンパク質を生成する（たとえば、リンスレイら（１ ９９１）Ｊ.Ｅxp.Ｍed.１７８３：７２１〜７３０；カポンら（１９８９）Ｎatu re ３３７、５２５〜５３１；およびカポン米国特許第５,１１６,９６４号を参 照） 。融合タンパク質は、化学合成によって、または好ましくはＣＤ４０のｃＤＮＡ に基づいて組換えＤＮＡ法によって作製することができる（スタメンコビッチら 、ＥＭＢＯ Ｊ.、８：１４０３〜１４１０（１９８９））。 本発明のアンタゴニストは、インビボの医薬投与に適した生物学的に両立しう る形態にて被験者に投与する。「インビボの医薬投与に適した生物学的に両立し うる形態」とは、該タンパク質の治療効果が毒性作用より重視されるように投与 されるアンタゴニストの形態をいう。被験者なる語は、免疫応答を引き起こしう る生物、たとえば哺乳動物を包含する。被験者の例としては、ヒト、イヌ、ネコ 、マウス、ラット、およびこれらのトランスジェニック種が挙げられる。ｇｐ３ ９アンタゴニストの投与は、任意に薬理学的に許容しうる担体中にて医薬形態で 行うことができる。治療学的に活性な量のアンタゴニストの投与とは、所望の結 果を達成するのに必要な投与量および時間にて有効な量と定義される。たとえば 、ｇｐ３９のアンタゴニストの治療学的に活性な量は、個体の疾患状態、年齢、 性および体重、および該アンタゴニストが該個体において所望の応答を引き起こ す能力に従って変わってよい。投与計画は最適の治療応答をもたらすように調節 する。たとえば、幾つかの分割投与量を毎日投与することができるし、または治 療状況の緊急性によって示されるように比例して投与量を減らしていくこともで きる。 活性化合物（たとえば、アンタゴニスト）の投与は、注射（皮下、静脈内など ）、経口投与、吸入、経皮投与、または直腸投与などの常法により行うことがで きる。投与経路に応じて、活性化合物を不活化する酵素、酸または他の天然の条 件から該化合物を保護するために該化合物を物質中にコーティングすることがで きる。好ましい投与経路は静注である。 非経口以外の投与によりｇｐ３９のアンタゴニストを投与するには、不活化を 防ぐ物質で該アンタゴニストをコーティングするかまたは該物質と該アンタゴニ ストとを同時に投与する必要がある。たとえば、アンタゴニストは、適当な担体 または希釈剤中にて、または酵素阻害剤とともにまたはリポソームなどの適当な 担体中にて一緒に投与することができる。薬理学的に許容しうる希釈剤としては 、 食塩および水性緩衝液が挙げられる。酵素阻害剤としては、膵臓トリプシンイン ヒビター、ジイソプロピルフルオロホスフェート（ＤＥＰ）およびトラシロール （trasylol）が挙げられる。リポソームとしては、水中油中水懸濁液並びに通常 のリポソーム（ストレジャンら（１９８４）Ｊ.Ｎeuroimmunol ７：２７）が挙 げられる。 活性化合物はまた、非経口または腹腔内投与することもできる。グリセロール 、液体ポリエチレングリコール、およびそれら混合物中、および油中で分散液を 調製することもできる。通常の貯蔵および使用条件では、これら調製物には微生 物の増殖を防ぐための保存剤が含まれる。 注射用途に適した医薬組成物としては、滅菌水溶液（水溶性の場合）または分 散液および滅菌注射用溶液または分散液を即座に調製するための滅菌粉末が挙げ られる。いずれの場合においても組成物は滅菌されていなければならず、容易な 注射器操作が可能な程度に流体でなければならない。該組成物は製造および貯蔵 条件下で安定でなければならず、細菌や真菌などの混入微生物の作用から保護さ れていなければならない。担体は、たとえば、水、エタノール、ポリオール（た とえば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコ ールなど）、およびこれらの適当な混合物を含む溶媒であるかまたは分散媒体で あってよい。適当な流動性は、たとえば、レシチンなどのコーティングを使用す ることによって、分散液の場合は必要な粒径を維持することによって、および界 面活性剤を使用することによって維持することができる。微生物の作用からの保 護は、種々の抗菌剤および抗真菌剤、たとえばパラベン、クロロブタノール、フ ェノール、アスコルビン酸、チメロサールなどにより行うことができる。多くの 場合、等張剤、たとえば糖、ポリアルコール、たとえばマンニトール、ソルビト ール、塩化ナトリウムなどが組成物中に含まれているのが好ましいであろう。注 射用組成物の持続吸収は、吸収を遅らせる薬剤、たとえばモノステアリン酸アル ミニウムやゼラチンなどを組成物中に配合することにより行うことができる。 滅菌注射用溶液の調製は、必要なら上記成分の１またはその組み合わせととも に所要量の活性化合物（たとえば、ｇｐ３９のアンタゴニスト）を適当な溶媒中 に配合し、ついで滅菌濾過することにより行うことができる。一般に分散液の調 製は、基本的な分散媒体と上記から選ばれた必要な他の成分を含む滅菌ビヒクル 中に活性化合物を配合することにより行う。滅菌注射溶液の調製のための滅菌粉 末の場合は、好ましい調製法は真空乾燥および凍結乾燥であり、これにより活性 成分（たとえば、アンタゴニスト）と前以て滅菌濾過した溶液からの所望の追加 成分との粉末が得られる。 上記のように活性化合物を適切に保護してある場合は、該タンパク質は、たと えば不活性な希釈剤または同化しうる食用担体とともに経口投与することができ る。本明細書において「薬理学的に許容しうる担体」とは、溶媒、分散媒体、コ ーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤などのすべてを包 含する。薬理学的に活性な物質のためのかかる媒体および剤の使用は、当該技術 分野でよく知られている。通常の媒体または剤が活性化合物と両立しない場合以 外は、治療学的組成物中に使用することができる。補助的な活性化合物を該組成 物中に配合することもできる。 投与の容易および投与量の均一さのため、単位投与剤型で非経口組成物に調合 するのが特に有利である。本明細書において単位投与剤型とは、治療すべき哺乳 動物被験者に対する単位投与量として適した物理的に区別される単位をいう。各 単位には、所要の薬理学的担体と組み合わせて所望の治療効果を奏するように計 算された前以て決定された量の活性化合物が含まれる。本発明の単位投与剤型は 、（ａ）活性化合物の独特の特性および達成しようとする特定の治療効果、およ び（ｂ）個体における治療感受性（treatment of sensitivity）のためにかかる 活性化合物を調合する際の内在する技術的制約に直接依存して個々に特定される 。 本発明を下記実施例によりさらに詳しく説明するが、本発明はこれらに限られ るものではない。本明細書中に引用した全ての参考文献、特許および公開された 特許出願の内容は参照のため本明細書中に引用される。実施例１ ： 抗ｇｐ３９抗体投与によるＥＡＥの予防 この実施例では、抗ｇｐ３９抗体のマウスへの投与が、多発性硬化症の実験動 物モデルである実験的アレルギー性脳脊髄炎（ＥＡＥ）の誘発を予防することを 実証する。 ＥＡＥは、Ｔ細胞媒介性自己免疫疾患のよく特徴付けられたモデルであり、ヒ ト自己免疫疾患である多発性硬化症のための教育的モデルである。マウスなどの 罹病性実験動物を、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）、プロテオリピドタン パク質（ＰＬＰ）、ミエリンオリゴデンドロサイトタンパク質（ＭＯＧ）または これらのミエリン関連タンパク質の配列に基づく合成ペプチドとともに百日咳菌 含有アジュバントで免疫感作することによって、ＥＡＥを誘発することができる 。免疫感作後１〜２週間で、実験動物に、リンパ球およびマクロファージ含有脈 管周囲浸潤ならびに脳および脊髄における脱髄の進行を特徴とする脳脊髄炎が発 症する。実験動物は急性、慢性または慢性再発性麻痺になる。この実施例におい ては、罹病性マウスにおいてＥＡＥの進行に対する抗ｇｐ３９抗体の投与の効果 を分析する。 第０日に、ＰＢＳ５０μｌ中の７０μｇまたは３００μｇのＰＬＰペプチドな らびに完全フロイントアジュバント５０μｌ中の結核菌（Ｈ３７ＲＡ，ディフコ （Difco））７０μｇを罹病性マウスの側腹部２カ所に皮下注入することによっ て、マウスにＥＡＥを誘発する。ペプチド投与と同時および２日後に、百日咳菌 懸濁液２００μｌ（１０．１０¹⁰／ＰＢＳ１ml）を静脈内投与する。マウスに注 入されたＰＬＰペプチドは、ラットＰＬＰの１３９番〜１５１番のアミノ酸残基 に対応するアミノ酸配列を有している（ドーティンニーら、FBLS Lett.１８８： ３３、１９８５）。ＰＬＰペプチドは、固相合成法により、ｆ−ｍｏｃ保護アミ ノ酸を用いて合成する（メリフィールド、J．Am．Soc.８５：２１４９、１９６ ３）。このペプチドによる免疫感作の結果、全中枢神経系（ＣＮＳ）ミエリンま たはＭＢＰによる感作によって誘発されるものと同一である急性ＥＡＥが発達す る（チョーヒら、J．Immunol.１４２：１５２３、１９８９；ソーベルら、J．Ne uropathol．Exp．Neurol.４９：４６８、１９９０）。 疾患の進行における抗ｇｐ３９の効果を決定するために、第０日に、上記と同 様にしてＰＬＰペプチドを注入し、さらに第０、２および４日に、ＰＢＳ２００ μｌ中のハムスター抗ｇｐ３９モノクローナル抗体１２５μｇ（ノエルら、Proc ． Acad．Sci．USA８９：６５５０、１９９２）またはＰＢＳ２００μｌ中の正常ハ ムスター抗体（セルバ・フェインビオケミカ（Serva Feinbiochemica））１２５ μｇ（コントロール動物）を腹腔内注入する。ＥＡＥの臨床的症状の重篤度を毎 日評価し、平均能力障害スケール（ＤＡＳ）にしたがって評点付けする：０点＝ 臨床的症状なし、１点＝尾の弱り、２点＝軽度の不全対麻痺および後肢の運動失 調、３点＝重度の不全対麻痺および後肢の運動失調、４点＝瀕死状態、５点＝Ｅ ＡＥによる死亡。 図１は、７０μｇのＰＬＰペプチド(パネルＡ)または３００μｇのＰＬＰペプ チド(パネルＢ)を注入され、抗ｇｐ３９抗体またはコントロール抗体で処置され たマウスにおける疾患の進行を示す。コントロールマウスおよび抗ｇｐ３９処置 マウスの疾患の重篤度を表すＤＡＳスコアをそれぞれ灰線および黒線で描く。 結果は、コントロール抗体を投与された動物はＥＡＥが進行し、抗ｇｐ３９抗 体を投与された動物は該疾患の誘発から保護されることを示している。コントロ ール抗体を投与された動物では、ＥＡＥの最初の臨床的症状は第１１日に現れる 。これらの動物において、最高のＤＡＳスコアは、７５μｇのＰＬＰペプチドを 注入された動物において第１５〜２２日に観測された２．３３（図１、パネルＡ 、灰線）および３００μｇのＰＬＰペプチドを注入された動物において第１６〜 ２３日に観測された３．６（図１、パネルＢ、灰線）である。逆に、抗ｇｐ３９ モノクローナル抗体を投与された動物は、７５μｇのＰＬＰペプチドによるＥＡ Ｅの誘発後に臨床的症状を示さず（図１、パネルＡ、黒線）、３００μｇのＰＬ Ｐペプチドによる疾患の誘発後でもわずかに臨床的症状を示すのみであり、これ も第３１日には完全に消失する（図１、パネルＢ、黒線）。 したがって、抗ｇｐ３９抗体の投与によって、マウスにおけるＥＡＥの誘発は 完全に阻害される。 ミエリン成分により免疫感作された実験動物から単離されるか、またはミエリ ン成分でインビトロにて活性化した後に得られたミエリン活性Ｔ細胞の養子移入 によるＥＡＥの誘発は、活性化Ｔ細胞が、誘発期後の臨床的特徴の進行に対して 特に応答可能であることを示している（ペッチネリおよびマクファーリン、J.Im munol.１２７：１４２０、１９７９；モクタリオンら、Nature３０９：３５６、 １９８４；ヴィーンら、J．Neuroimmunol.２１：１８３、１９８９）。しかし、 ここで述べた実験から、抗ｇｐ３９モノクローナル抗体が、ＥＡＥの進行を予防 することが示される。コントロールグループでは、少量および多量のＰＬＰペプ チド投与によってＥＡＥを誘発される実験動物において、それぞれ第１４日（吸 光度１．９２）および第２１日（吸光度２．１５）に有意な抗ＰＬＰペプチド抗 体応答が観測される。逆に、抗ｇｐ３９抗体処置動物における有意な抗ＰＬＰペ プチド抗体応答は、少量および多量のＰＬＰペプチド投与動物において、最初に 第１４日に観測され、次いで、それぞれ第３１日（吸光度０．９２８）および第 ４０日（吸光度１．５４）にプラトーレベルに達する。抗ｇｐ３９モノクローナ ル抗体処置マウスにおける有意な抗ＰＬＰペプチド抗体応答は、第１４日まで延 期され、抗ｇｐ３９モノクローナル抗体が抗体産生にある程度有効であることを 示す。 したがって、この実施例では、抗ｇｐ３９抗体がＥＡＥの発達を予防すること が実証され、抗ｇｐ３９抗体が多発性硬化症などのＴ細胞媒介性自己免疫疾患の 治療に用いうることが示される。実施例２ ： 抗ｇｐ３９抗体投与による逆転 実施例１ではＥＡＥの誘発における抗ｇｐ３９抗体の阻害効果を示した。した がって、該疾患の誘発の時点におけるマウスの免疫感作によって該疾患の発達が 予防されることが実証された。この実施例では、該疾患の誘発後の該抗体の投与 が、疾患の退行を導くことを示す。 この実施例では、前記と同様にして調製したＰＬＰペプチド１５０μｇ含有エ マルジョンの注入によって、雌性ＳＪＬ／ｊマウス（１０〜１２週齢）にＥＡＥ を誘発する。疾患の誘発後にマウスに投与する場合の抗ｇｐ３９抗体の効果を決 定するために、第０、２および４日，第４、６および８日，または第７、９およ び１１日に、ＰＢＳ２００μｌ中の抗ｇｐ３９モノクローナル抗体１２５μｇ（ ノエルら、Proc．Acad．Sci．USA８９：６５５０、１９９２）（抗ｇｐ３９処置 マウス）またはＰＢＳ２００μｌ単独（コントロール動物）をマウスに腹腔内注 入 する。結果を抑制パーセントで示し、抗ｇｐ３９処置マウスおよびコントロール 動物の毎日のＤＡＳスコア（第１２から２８日）の合計を比較する。 図２に示す結果から、ＰＬＰペプチドをマウスに注入してから７日後に抗ｇｐ ３９抗体を最初に投与すると、疾患が６０％以上抑制されることが示される。し たがって、抗ｇｐ３９抗体はＥＡＥを逆転または抑制する能力をもつ。 該結果からさらに、マウスに疾患を誘発した後の第７日のみに抗体の最初の投 与を行っても疾患の進行は有意に抑制されるけれども、抗体の最初の投与を疾患 の誘発後より早く行う方が、抗ｇｐ３９抗体処置の有効性が幾分高いことがわか る。 したがって、疾患の誘発後にマウスに抗ｇｐ３９抗体を投与することにより、 これらのマウスはＥＡＥの発達から保護され、ＥＡＥ罹患マウスにおいて疾患が 抑制される。実施例３ ： ｇｐ３９処置マウスにおける脾臓細胞移入後のＥＡＥの抑制 ＥＡＥから回復したルイスラット（ペソアら、J．Neuroimmunol.７３１：１３ １、１９８４）およびミエリン成分を経口投与された後（リダーら、J．Immunol .１４２：７４８、１９８９；ハフラーら、Ann．NY Acad．Sci.６３６：２５１ 、１９９１）のルイスラットにおいて調節サプレッサーＴ細胞が検出されている 。カルプスおよびスワンボルグ（J．Immunol.１４３：３４９２、１９８９）に よって、ＥＡＥから回復したラットから単離されたＣＤ４＋サプレッサーＴ細胞 が、リンホカイン産生の特異的阻害によってＥＡＥ Ｔエフェクター細胞をダウ ンレギュレーションしうることが仮定された。逆に、ＭＶＰの経口投与によるル イスラットにおけるＥＡＥの抑制は、ＣＤ８＋Ｔ細胞によって媒介される（ミラ ーら、J．Exp．Med.１７４：７９１、１９９１）。抗ｇｐ３９抗体の投与によっ てＥＡＥから保護されたマウスのＴ細胞がナイーブ動物をＥＡＥから保護しうる かどうかを決定するために、以下の実施例を行う。 この実施例では、実施例１に記載したプロトコルにしたがって、第１群のラッ トにＰＬＰペプチド１５０μｇを注入し、第２群のラットにＰＬＰペプチド１５ ０μｇと抗ｇｐ３９抗体を注入する。４カ月後、ＣＯ₂安楽死によりマウスを屠 殺し、脾臓を摘出する。標準的塩化アンモニウム処理によって赤血球を除去する （ミシェルおよびシイギ、Selected Methods in Cellular Immunology、Ｗ.Ｈ. フリーマンアンドカンパニー、１９８０）。個々の脾臓細胞（５００μｌ）をナ イーブ５Ｇｙ放射線照射レシピエント雌性ＳＬＪ／ｊマウス（１０〜１２週齢） に静脈内注入する。２日後、実施例１に記載の手順にしたがって細胞移入マウス にＰＬＰペプチド１５０μｇを腹腔内注入によってチャレンジさせ、ＤＡＳスコ アを決定する。 図３は、実験動物のＤＡＳスコアを示す。結果から、初めにＰＬＰペプチドお よび抗ｇｐ３９抗体を注入された実験動物由来の脾臓細胞を移植されたマウスは 疾患の発達から保護されるが、初めにＰＬＰペプチドのみを注入された実験動物 由来の脾臓細胞を移植されたマウスはＥＡＥを発達させることが実証される。さ らに、抗体の半減期が１２日間であることを考慮すると、マウスに移植された脾 臓細胞には抗体が存在しないことが予測される。したがって、ＰＬＰペプチドお よび抗ｇｐ３９抗体を投与された実験動物由来のドナー脾臓細胞によって付与さ れる保護効果は、抗ｇｐ３９抗体の存在に基づいて説明することはできない。こ れらのマウスのＤＡＳスコアは、レシピエントマウスにおけるＥＡＥの抑制が、 移植された脾臓細胞懸濁液中のサプレッサーＴ細胞集団の存在によるものという のが最も妥当であり、このＴ細胞集団がエフェクターＴ細胞集団の能力を無効に するということを示している。実施例４ ： ｇｐ３９ポジティブＴｈ細胞の検出 この実施例では、多発性硬化症を有するヒト被験者の中枢神経系におけるｇｐ ３９ポジティブ細胞の存在を実証する。 剖検したヒト中枢神経系（ＣＮＳ）組織をオランダ国アムステルダムのネーデ ルランド・ブレイン・バンクから入手する。当業界において公知の方法に従い、 ＣＤ４０−Ｉｇ融合タンパク質を用いてｇｐ３９ポジティブを検出する。ＭＳの 患者およびアルツハイマー病の患者のＣＮＳ組織切片をＣＤ４０−Ｉｇで染色す る。この実施例では、抗ＭＢＰ抗体形成細胞が予め検出されているＭＳ患者のＣ ＮＳ組織のみを用いる。染色の結果は、ＭＳ患者の８μｍの冠大脳切片中にはｇ ｐ３９ポジティブ細胞が存在するが、アルツハイマー病患者の冠大脳切片中には ｇｐ３９ポジティブ細胞が存在しないことを示している。このように、ｇｐ３９ ポジティブ細胞は、ＭＳ患者のＣＮＳ組織切片のみで検出される。ＭＳ患者のＣ ＮＳ組織にｇｐ３９ポジティブ細胞が存在すること、ＭＳ患者のＣＮＳ組織のみ に抗ＭＢＰ抗体形成細胞が検出され、コントロールＣＮＳ組織には検出されない ことから、ＭＳ患者の病気に冒された組織においてこのような細胞がひとつの役 割を演じることが示される。 この実験において、我々は、抗ｇｐ３９モノクローナル抗体を投与してＢ細胞 活性化を抑制することにより、ＥＡＥを誘発する抗原の用量およびＥＡＥ誘発か ら抗ｇｐ３９モノクローナル抗体の投与までの期間に応じて、ＥＡＥの発達を完 全に予防しうることを示した。ＥＡＥ誘発および発達にかかわる正確なメカニズ ムは明らかではないが、これらのデータは、抗ｇｐ３９抗体が自己免疫疾患の治 療に使用しうることを示している。等価物 当業者であれば、本明細書に記載された特定の本発明の具体例の多数の等価物 をルーチン実験法を用いるのみにて認識もしくは確認しうるであろう。このよう な等価物は後記請求の範囲に包含されることを企図されている。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｒ 1:91） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，Ｓ Ｚ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，Ｉ Ｌ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ， ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，Ｒ Ｕ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者 ノエル，ランドルフ・ジェイ アメリカ合衆国03745ニュー・ハンプシャ ー州 コーニッシュ、ボックス257、ルー ラル・ルート３ (72)発明者 クラーセン，エリック オランダ、エヌエル−2641デーベー・ペイ ナッカー、セリンゲンラーン４番

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．接触依存性ヘルパーエフェクター機能を媒介するＴ細胞表面上の受容体に 対するアンタゴニストを治療的および予防的有効量にて被験者に投与することを 特徴とするＴ細胞媒介性自己免疫疾患の治療方法。 ２．該Ｔ細胞媒介性自己免疫疾患が多発性硬化症、実験的アレルギー性脳脊髄 炎、Ｉ型糖尿病、卵巣炎および甲状腺炎から選ばれる請求項１に記載の方法。 ３．該Ｔ細胞媒介性自己免疫疾患が多発性硬化症である請求項１に記載の方法 。 ４．接触依存性ヘルパーエフェクター機能を媒介するＴ細胞表面上の該受容体 がｇｐ３９である請求項１に記載の方法。 ５．該アンタゴニストが抗ｇｐ３９抗体である請求項４に記載の方法。 ６．該抗ｇｐ３９抗体がモノクローナル抗体である請求項５に記載の方法。 ７．該抗ｇｐ３９抗体が抗ヒトｇｐ３９抗体である請求項５に記載の方法。 ８．該モノクローナル抗体が８９−７６ハイブリドーマ（ＡＴＣＣ受託番号Ｈ Ｂ１１７１３）または２４−３１ハイブリドーマ（ＡＴＣＣ受託番号ＨＢ１１７ １２）から産生されるか、またはそのｇｐ３９結合特性を有する抗体である請求 項６に記載の方法。 ９．該モノクローナル抗体がキメラモノクローナル抗体である請求項６に記載 の方法。 １０．該モノクローナル抗体がヒト化モノクローナル抗体である請求項６に記 載の方法。 １１．治療的有効量の抗ヒトｇｐ３９抗体を被験者に投与することを特徴とす る多発性硬化症の治療方法。