JP3845735B2 - Ｃｄ４０ｌアンタゴニストを有効成分とする天疱瘡治療剤 - Google Patents
Ｃｄ４０ｌアンタゴニストを有効成分とする天疱瘡治療剤 Download PDFInfo
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Description
【０００１】
本発明は、天疱瘡を発症した患者に対し、ＣＤ４０Ｌアンタゴニストを投与し天疱瘡を治療する治療剤、及び天疱瘡の再燃が予想される患者に対し、ＣＤ４０Ｌアンタゴニストを予防的に投与し天疱瘡の発症を予防する予防剤に関する。
【０００２】
天疱瘡は、デスモゾームに存在するカドヘリン型の細胞接着因子であるデスモグレイン（Ｄｓｇ）に対する自己抗体により誘導されることが解明されている（Amagai, M. et al., Cell, 67, 869-877, 1991）。Ｄｓｇには、Ｄｓｇ１，Ｄｓｇ２，Ｄｓｇ３のアイソタイプが存在するが、Ｄｓｇ２が単層上皮・心臓などを含めたデスモゾームを有する全ての組織に発現しているのに対し、Ｄｓｇ１とＤｓｇ３は重層扁平上皮のみに発現が認められる。
【０００３】
天疱瘡は尋常性天疱瘡（pemphigus vulgaris：ＰＶ）と落葉状天疱瘡（pempigus foliaceus：ＰＦ）に大別され、ＰＶは更に粘膜が主に侵される粘膜優位型と、粘膜のみならず皮膚まで広範囲に病変が認められる粘膜皮膚型とに分類される。抗Ｄｓｇ３抗体が陽性の患者では粘膜優位型ＰＶ、Ｄｓｇ１抗体が陽性の患者ではＰＦ、抗Ｄｓｇ１抗体・抗Ｄｓｇ３抗体が共に陽性の患者では粘膜皮膚型ＰＦとして臨床型が現れる（天谷ら、実験医学Vol.19 No.5（増刊）2001）。
【０００４】
天疱瘡の治療は、非特異的な免疫抑制剤、多くはステロイド剤によりなされているが、抗原と臨床症状の関連が明確となっている天疱瘡においては、より特異的な免疫抑制療法が求められた。
【０００５】
本発明の課題は、ヒトグリオーマ等の癌の診断や治療に有用な癌抑制遺伝子あるいは癌遺伝子を同定し、ヒトグリオーマ等の癌の診断方法や診断薬、ヒトグリオーマ等の癌の治療方法や治療薬を提供することにある。
【０００６】
他方、分子レベルでクローニングされている細胞表面分子ＣＤ４０は未成熟および成熟Ｂリンパ球の表面上で同定されており、抗体と結合したときにＢ細胞の増殖を誘導することが知られている（Eur. J. Immunol., 19, 1463-1467, 1989、J. Immunol., 140, 1425-1430, 1988、J. Immunol., 142, 4144-4152, 1989）。また、ＣＤ４０のリガンドであるＣＤ４０Ｌもまた分子レベルでクローニングされており（Nature, 357, 80-82, 1992、J. Exp. Med., 175, 1091-1101, 1992、EMBO J., 11, 4313-4319, 1992）、ＣＤ４０Ｌ遺伝子でトランスフェクトされ細胞表面上にＣＤ４０Ｌタンパク質を発現する細胞はＢ細胞の増殖を誘導することができ、他のシグナル系とともに抗体の産生を誘導することができることも知られている（Nature, 357, 80-82, 1992）。そして、Ｂ細胞の活性化を阻害して液性免疫を抑制するため、Ｂ細胞を活性化するＴ細胞上のＣＤ４０ＬとＢ細胞上のＣＤ４０との間のインビボ相互作用を阻害するアンタゴニスト、例えば抗ＣＤ４０Ｌ抗体を投与して、液性免疫を抑制することも知られている（特許第２８４０１３１号、特許第３００７９７７号、第２９７４４１５号、第２９９１４９９号）。しかし、かかる免疫抑制方法が自己免疫疾患である天疱瘡に有効であることは知られておらず、確認もされていなかった。
【０００７】
本発明の課題は、天疱瘡を発症した患者に対しＣＤ４０Ｌアンタゴニストを投与して、天疱瘡を治療する治療剤、及びＣＤ４０Ｌアンタゴニストを予防的に投与して、天疱瘡の発症を予防する予防剤を開発することにある。
【０００８】
本発明者らは、ＰＶ抗原であるＤｓｇ３に対する抗体産生を誘導し、天疱瘡を発症するモデル動物を作製することを試みた。しかし野生型マウスに免疫したのでは、Ｄｓｇ３に対する免疫寛容が成立しているため、持続的にＤｓｇ３に対する抗体を産生させることが難しかった。そこで、Ｄｓｇ３に対する免疫寛容が成立していないＤｓｇ３ノックアウトマウスＤｓｇ３−／−を組換えＤｓｇ３で免疫し、その脾細胞を成熟したＴ及びＢ細胞を持たない免疫不全マウスＲａｇ２−／−に移植した（Amagai M., et al., J. Clin. Invest., 105, 625-631, 2000）。
移植後４〜７日後に、移植したマウスの血中にＤｓｇ３に対するＩｇＧ抗体の産生が認められ、抗体産生は６ヶ月以上に亘り持続した。そしてマウスの皮膚・口腔粘膜・食道などの重層扁平上皮の細胞膜にはＤｓｇ３抗体の沈着が確認され、更に表皮および粘膜上皮の細胞間接着が障害されて、天疱瘡に特徴的な基底層直上での裂隙形成が、口腔粘膜・食道上部に認められた。作製されたマウスは、臨床的・病理学的・免疫学的に天疱瘡の特徴的な所見を有するモデルマウスであると結論された。（Ｄｓｇ３で免疫していないＤｓｇ３−／−マウス脾臓細胞でも天疱瘡を発症することを確認している。）
【０００９】
本発明者は、本天疱瘡病態モデルマウスにＣＤ４０Ｌアンタゴニスト、抗ＣＤ４０Ｌ抗体を予防的に投与することにより抗Ｄｓｇ３抗体産生を完全に抑制し、天疱瘡に伴う表皮及び粘膜病変を防止できることを見出した。更に、発症後に抗ＣＤ４０Ｌ抗体を投与した場合にも、抗Ｄｓｇ３抗体産生の抑制に効果を示し、一部のマウスでは表現型も改善されることが明らかとなり、ＣＤ４０Ｌアンタゴニストを天疱瘡治療剤及び予防剤として使用するという本発明を完成するに到った。
【００１０】
Ｔ細胞表面上の接触依存性のヘルパーエフェクター機能を媒体する受容体ＣＤ４０Ｌと、抗原提示細胞表面上の受容体ＣＤ４０との間の相互作用を阻害する薬剤は、進行中の免疫反応に抗原特異的に免疫寛容を誘導できることから、非特異的な免疫抑制剤に代わる、天疱瘡の根本的治療薬となることが予想される。
【００１１】
すなわち本発明は、抗ＣＤ４０Ｌ抗体を有効成分とする天疱瘡予防剤に関する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
本発明の種々の側面を以下の項目について詳細に説明する。
１．ＣＤ４０Ｌアンタゴニスト：Ｔ細胞表面上の接触依存性のヘルパーエフェクター機能を媒体する受容体ＣＤ４０Ｌと、抗原提示細胞表面上の受容体ＣＤ４０との間の相互作用を阻害する薬剤をＣＤ４０Ｌアンタゴニストと定義する。ＣＤ４０Ｌアンタゴニストには、ＣＤ４０Ｌと相互作用する薬剤のみならず、ＣＤ４０と相互作用する薬剤も含まれるものである。ＣＤ４０ＬアンタゴニストはＣＤ４０Ｌに対して向けられた抗体（例えばＣＤ４０Ｌに対するモノクローナル抗体）、ＣＤ４０Ｌに対して向けられた抗体のフラグメント（例えばＦａｂ又は（Ｆａｂ´）２フラグメント）、キメラ抗体又はヒト化抗体、可溶性（soluble）ＣＤ４０又は可溶性ＣＤ４０Ｌ及びそれらのフラグメント、又はその他のＣＤ４０ＬとＣＤ４０との相互作用を阻害する化合物であってよい。
【００１３】
ＣＤ４０Ｌアゴニストの、ＣＤ４０ＬとＣＤ４０との相互作用を阻害する性質は、例えば、標識可溶性ＣＤ４０の活性化ヘルパーＴ細胞への結合を抑制するか否かにより判定することができる。標識可溶性ＣＤ４０は、可溶性ＣＤ４０を、例えば特開平６−２２００９６号公報の実施例１の方法により作製し、適当な標識物質、例えば蛍光物質、放射性同位元素等により標識することにより調整できる。標識可溶性ＣＤ４０の活性化ヘルパーＴ細胞への結合の評価は、例えば蛍光標識した可溶性ＣＤ４０を用いて、ＦＡＣＳにより行うことができる。
【００１４】
２．抗ＣＤ４０Ｌ抗体：哺乳動物（例えばマウス、ハムスター又はウサギ）は、該哺乳動物において免疫応答を引き起こす免疫原の形態のＣＤ４０Ｌ蛋白質又は蛋白質断片（例えばペプチド断片）で免疫することができる。
ＣＤ４０Ｌ蛋白質はＣＤ４０Ｌ ｃＤＮＡ（Armitage et al., Nature, 357, 80-82, 1992、 Hollembaugh et al., EMBO J., 11, 4313-4319, 1992）を組み込んだ発現ベクターを宿主細胞、例えば細菌又は哺乳類細胞株中で発現させ、培養液から標準的な方法に従ってＣＤ４０Ｌ蛋白質を精製することができる。また、例えばＧＳＴ等との融合蛋白質として発現させ、ＧＳＴとの融合蛋白質の場合はグルタチオンカラムにより精製しても構わない。ＣＤ４０ＬペプチドはＣＤ４０Ｌのアミノ酸配列（ Armitage et al., Nature, 357, 80-82, 1992、 Hollembaugh et al., EMBO J., 11, 4313-4319, 1992）に基づき、公知の方法（例えば、F-moc又はT-boc化学合成）により合成することができ、合成されたペプチドは適当な担体、例えばＫＬＨと結合させることで免疫原性を高めることも許される。
【００１５】
精製されたＣＤ４０Ｌ蛋白質又はペプチド断片をアジュバントと共に免疫後、抗血清を得ることができ、所望なら抗血清からポリクローナル抗体を単離することができる。また、モノクローナル抗体を産生するには、抗体産生細胞（リンパ球）を免疫動物より回収し、標準的な細胞融合法によりミエローマ細胞と融合させて細胞を不死化し、ハイブリドーマ細胞を得る。かかる技術は当該技術分野では確立された方法であり、適当なマニュアル（Harlow et al, Antibodies: A Laboratory Mannual, 1998, Cold Spring Harbor Laboratory）に準じて行うことができる。更に、モノクローナル抗体はヒトモノクローナル抗体を産生するためのヒトＢ細胞ハイブリドーマ法（Kozbar et al., Immunol. Today, 4, 72, 1983）、EBV-ハイブリドーマ法（Cole et al., Monoclonal Antibody in Cancer Therapy, 1985, Allen R. Bliss, Inc., pages 77-96）、コンビナトリアル抗体ライブラリーのスクリーニング（Huse et al., Science, 246, 1275, 1989）等他の方法により作製しても良い。
【００１６】
本明細書における抗体は、ＣＤ４０Ｌと特異的に結合する抗体のフラグメント、例えばＦａｂ又は（Ｆａｂ´）２フラグメントをも包含するものである。
ヒト以外の動物、例えばマウスを免疫動物として作製されたマウスモノクローナル抗体は、ヒトに投与した場合異種蛋白質として認識されて、モノクローナル抗体に対する免疫応答を生じさせてしまうことが多い。この問題点を回避する一つの方法はキメラ抗体、すなわち抗原結合領域がマウスモノクローナル抗体由来、それ以外の領域がヒト抗体由来の抗体である。本発明における抗体はキメラ抗体も含むものである。キメラ抗体としては、抗原結合領域としてマウスモノクローナル抗体の可変領域全体を使ったキメラ抗体（Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81, 6851, 1985、Takeda et al., Nature, 314, 452, 1985）、また抗原結合領域としてヒト由来のフレームワーク領域とマウスモノクローナル抗体由来の超可変領域を組み合わせて使ったキメラ抗体（Teng et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80, 7308-12, 1983、 Kozbar et al., Immunol. Today, 4, 7279, 1983）が挙げられるが、本発明はこれに限定されるものではない。
【００１７】
本発明の天疱瘡治療剤は、天疱瘡の患者に投与できる。また、本発明の天疱瘡予防剤は、天疱瘡の発症の予防のために、天疱瘡の発症が予想される患者に対して投与できる。
本発明の天疱瘡治療剤及び天疱瘡予防剤の投与は、注射（皮下、静脈など）など常法により行うことができる。
【００１８】
天疱瘡治療剤及び天疱瘡予防剤の形態は、投与方法により適宜選択され、例えば、注射用途に適した医薬組成物としては、滅菌水溶液（水溶性の場合）または分散液および滅菌注射溶液または分散液を即座に調整するための滅菌粉末を挙げることができる。注射用途に適した医薬組成物はいずれの場合においても滅菌されていなければならず、容易な注射器操作が可能な程度に流体でなければならない。該組成物は製造及び貯蔵条件下で安定でなければならず、細菌や真菌などの混入微生物の作用から保護されていなけれなならない。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、及びポリエチレングリコールなど）、およびこれらの適当な混合物を含む媒体であるかあるいは分散媒体であってよい。適当な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングをしようすることによって、分散液の場合は必要な粒径を維持することによって、および界面活性剤を使用することによって維持することができる。微生物の作用からの保護は、種々の抗菌剤及び抗真菌剤、たとえばパラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールなどにより行うことができる。多くの場合等張剤、例えば糖、ポリアルコール、例えばマンニトール、ソルビトール、塩化ナトリウムなどが組成物中に含まれているのが好ましいであろう。注射用組成物の持続吸収は、吸収を遅らせる薬剤、例えばモノステアリン酸アルミニウムやゼラチンなどを組成物中に配合することにより行うことができる。
【００１９】
注射用溶液の調整は、必要なら上記成分の１またはその組合せとともに所要量の活性化合物（ＣＤ４０Ｌアンタゴニスト等）を適当な溶媒中に配合し、ついで滅菌濾過することにより行うことができる。一般に分散液の調整は、基本的な分散媒体と上記から選ばれた必要な他の成分を含む滅菌媒体中に活性化合物を配合することにより行う。滅菌注射溶液調整のための滅菌粉末の場合は、好ましい調整法は真空乾燥及び凍結乾燥であり、これにより活性成分と前もって滅菌濾過した所望の追加成分との粉末が得られる。
【００２０】
天疱瘡治療剤の投与量は、天疱瘡を治療するのに十分な量であり、患者の年齢、性差、薬剤に関する感受性、投与方法、疾患の履歴などにより変化し得る。また天疱瘡予防剤の投与量は、天疱瘡を予防するのに十分な量であり、患者の年齢、性差、薬剤に関する感受性、投与方法、疾患の履歴などにより変化し得る。
【００２１】
本発明を下記実施例により更に詳しく説明するが、本発明はこれに限られるものではない。
以下の実施例で使用した抗ＣＤ４０Ｌ抗体ＭＲ１（Noelle et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89, 6550-54, 1992）は、ハムスターで作製したマウスＣＤ４０Ｌに対するモノクローナル抗体でPharMingen社より入手可能（Catalog No.：PM-09020D or PM-09021D）である。またMR1産生細胞は、American Type Culture Collection （ＡＴＣＣ）より入手可能である（ＡＴＣＣ No.：HB-11048）。
使用したＤｓｇ３−／−マウスはThe Jackson Laboratory, Bar Harbor, Maine, USAより、Ｒａｇ２−／−２マウスはTacnin Farms, Germantown, New York, USAより入手可能である。
また実施例中で組換えＤｓｇ３（ｒＤｓｇ３）は、マウスＤｓｇ３（GenBank U86016）の細胞外ドメインを配列番号１及び２に記載の配列のプライマーを用いたＰＣＲにより増幅し、Amagai M., et al., J. Clin. Invest., 94, 59-67, 1994に記載の方法に従って作製した。抗体価は、Amagai M., et al., J. Clin. Invest., 105, 625-631, 2000に記載されたＥＬＩＳＡ法により測定した。
【００２２】
［実施例１］天疱瘡病態モデルマウスの作製
Amagaiらの方法（Amagai M., et al., J. Clin. Invest., 105, 625-631, 2000）に準じて、天疱瘡病態モデルマウスを作製した。
ｒＤｓｇ３で免疫したＤｓｇ３−／−マウスをエーテル麻酔下で屠殺し脾臓を摘出した。脾臓細胞を無菌的に調整し、１×１０８／ｍｌにＰＢＳに懸濁後、０．５ｍｌ（細胞数として ５×１０７個）をＲａｇ２−／−マウス尾静脈に静脈内投与した。
移植後４〜７日後に、移植したマウスの血中にＤｓｇ３に対するＩｇＧ抗体の産生が認められ、抗体産生は６ヶ月以上に亘り持続した。そしてマウスの皮膚・口腔粘膜・食道などの重層扁平上皮の細胞膜にはＤｓｇ３抗体の沈着が確認され、更に表皮および粘膜上皮の細胞間接着が障害されて、天疱瘡に特徴的な基底層直上での裂隙形成が、口腔粘膜・食道上部に認められた。
【００２３】
［実施例２］ＭＲ１抗体投与による天疱瘡の予防効果
ＭＲ１抗体を予防的に投与し、Ｄｓｇ３に対する免疫応答が惹起される時にＣＤ４０Ｌを存在させた場合、移入した脾臓細胞にＤｓｇ３に対して免疫寛容が誘導できるかどうかを検討した。
Ｄｓｇ３−／−マウス脾細胞移植の２日前および移植後０、２、４、７日にＭＲ１抗体とコントロールハムスターＩｇＧを５００μｇずつレシピエントマウス（Ｒａｇ２−／−マウス）の腹腔内に投与した（ｎ＝５）。
移植１４日後にコントロール群では抗Ｄｓｇ３抗体産生を確認したが、ＭＲ１を投与したマウスでは、６６日間の観察期間を通じて明らかな抗体産生および表現型を全く認めなかった（図１）。またコントロール群では体重減少、休止期脱毛および病理組織学的にＰＶに特徴的な基底層直上の棘融解を認めたが、ＭＲ１を投与群では、体重減少は見られず、ＰＶの症状も観察されなかった。ＭＲ−１抗体には、明らかなＰＶ予防効果が見られた。
【００２４】
［実施例３］ＭＲ１抗体投与による天疱瘡の治療効果
Ｄｓｇ３−／−マウスの脾臓細胞を導入し、Ｄｓｇ３−／−に対する抗体を産生してＰＶの発症が見られるマウスに対して、ＭＲ−１抗体を投与し、治療効果が見られるかどうかを検討した。
免疫していないＤｓｇ３−／−マウスの脾臓細胞を導入したレシピエントマウス（Ｒａｇ２−／−マウス）に、ＭＲ１とハムスターＩｇＧを、脾臓細胞移植後７週間後から、１ｍｇずつ週２回６週間に亘り計１２回投与した（ｎ＝１０）。通常の抗体価の変動をみるために無治療のＰＶモデルマウスも同時に観察した（ｎ＝５）。
投与開始後、０、２、４及び６週目に採血し、Ｄｓｇ３に対する抗体価を測定した。投与前に抗体価が高く（＞２０００倍の抗体titerを示すマウス）、投与中に死亡してしまったマウスを除き、更に治療効果の見込めない投与前から抗体価が低かったマウス（＜１００倍の抗体titerを示すマウス）を除いて統計処理した。図２に示す通り、ＭＲ１抗体投与群では、投与前の３０％まで抗体価が低下したが、コントロール群には抗体価の低下が見られなかった。この間、一部のマウスではＰＶの改善が認められたが、両群の間で、ＰＶの症状に有意な差は観察されなかった。
【産業上の利用可能性】
【００２５】
ｇ３９アンタゴニストの投与により、抗Ｄｓｇ抗体の産生が抑制され、天疱瘡に伴う表皮及び粘膜病変が改善されていることが確認されて、ＣＤ４０Ｌアンタゴニストが天疱瘡の根本的な治療剤及び予防剤となりうることが示された。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】ＭＲ１抗体投与による天疱瘡の予防効果を示す図である。
【図２】ＭＲ１抗体投与による天疱瘡の治療効果を示す図である。
【配列表】
SEQUENCE LISTING
<110> KEIO UNIVERSITY
EISAI CO., LTD.
<120> THERAPEUTIC AGENT FOR PERMPHIGUS COMPRISING CD40L ANTAGONIST AS AN ACTIVE INGREDIENT
<130> 2003C1593
<150> JP 2002-101886
<151> 2002-04-03
<160> 2
<170> PatentIn version 3.1
<210> 1
<211> 39
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> NO.1
<400> 1
ccgagatctc ctataaatat gacctgcctc ttccctaga 39
<210> 2
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> NO.2
<400> 2
cgggtcgacc ctccaggatg actccccata 30
本発明は、天疱瘡を発症した患者に対し、ＣＤ４０Ｌアンタゴニストを投与し天疱瘡を治療する治療剤、及び天疱瘡の再燃が予想される患者に対し、ＣＤ４０Ｌアンタゴニストを予防的に投与し天疱瘡の発症を予防する予防剤に関する。
【０００２】
天疱瘡は、デスモゾームに存在するカドヘリン型の細胞接着因子であるデスモグレイン（Ｄｓｇ）に対する自己抗体により誘導されることが解明されている（Amagai, M. et al., Cell, 67, 869-877, 1991）。Ｄｓｇには、Ｄｓｇ１，Ｄｓｇ２，Ｄｓｇ３のアイソタイプが存在するが、Ｄｓｇ２が単層上皮・心臓などを含めたデスモゾームを有する全ての組織に発現しているのに対し、Ｄｓｇ１とＤｓｇ３は重層扁平上皮のみに発現が認められる。
【０００３】
天疱瘡は尋常性天疱瘡（pemphigus vulgaris：ＰＶ）と落葉状天疱瘡（pempigus foliaceus：ＰＦ）に大別され、ＰＶは更に粘膜が主に侵される粘膜優位型と、粘膜のみならず皮膚まで広範囲に病変が認められる粘膜皮膚型とに分類される。抗Ｄｓｇ３抗体が陽性の患者では粘膜優位型ＰＶ、Ｄｓｇ１抗体が陽性の患者ではＰＦ、抗Ｄｓｇ１抗体・抗Ｄｓｇ３抗体が共に陽性の患者では粘膜皮膚型ＰＦとして臨床型が現れる（天谷ら、実験医学Vol.19 No.5（増刊）2001）。
【０００４】
天疱瘡の治療は、非特異的な免疫抑制剤、多くはステロイド剤によりなされているが、抗原と臨床症状の関連が明確となっている天疱瘡においては、より特異的な免疫抑制療法が求められた。
【０００５】
本発明の課題は、ヒトグリオーマ等の癌の診断や治療に有用な癌抑制遺伝子あるいは癌遺伝子を同定し、ヒトグリオーマ等の癌の診断方法や診断薬、ヒトグリオーマ等の癌の治療方法や治療薬を提供することにある。
【０００６】
他方、分子レベルでクローニングされている細胞表面分子ＣＤ４０は未成熟および成熟Ｂリンパ球の表面上で同定されており、抗体と結合したときにＢ細胞の増殖を誘導することが知られている（Eur. J. Immunol., 19, 1463-1467, 1989、J. Immunol., 140, 1425-1430, 1988、J. Immunol., 142, 4144-4152, 1989）。また、ＣＤ４０のリガンドであるＣＤ４０Ｌもまた分子レベルでクローニングされており（Nature, 357, 80-82, 1992、J. Exp. Med., 175, 1091-1101, 1992、EMBO J., 11, 4313-4319, 1992）、ＣＤ４０Ｌ遺伝子でトランスフェクトされ細胞表面上にＣＤ４０Ｌタンパク質を発現する細胞はＢ細胞の増殖を誘導することができ、他のシグナル系とともに抗体の産生を誘導することができることも知られている（Nature, 357, 80-82, 1992）。そして、Ｂ細胞の活性化を阻害して液性免疫を抑制するため、Ｂ細胞を活性化するＴ細胞上のＣＤ４０ＬとＢ細胞上のＣＤ４０との間のインビボ相互作用を阻害するアンタゴニスト、例えば抗ＣＤ４０Ｌ抗体を投与して、液性免疫を抑制することも知られている（特許第２８４０１３１号、特許第３００７９７７号、第２９７４４１５号、第２９９１４９９号）。しかし、かかる免疫抑制方法が自己免疫疾患である天疱瘡に有効であることは知られておらず、確認もされていなかった。
【０００７】
本発明の課題は、天疱瘡を発症した患者に対しＣＤ４０Ｌアンタゴニストを投与して、天疱瘡を治療する治療剤、及びＣＤ４０Ｌアンタゴニストを予防的に投与して、天疱瘡の発症を予防する予防剤を開発することにある。
【０００８】
本発明者らは、ＰＶ抗原であるＤｓｇ３に対する抗体産生を誘導し、天疱瘡を発症するモデル動物を作製することを試みた。しかし野生型マウスに免疫したのでは、Ｄｓｇ３に対する免疫寛容が成立しているため、持続的にＤｓｇ３に対する抗体を産生させることが難しかった。そこで、Ｄｓｇ３に対する免疫寛容が成立していないＤｓｇ３ノックアウトマウスＤｓｇ３−／−を組換えＤｓｇ３で免疫し、その脾細胞を成熟したＴ及びＢ細胞を持たない免疫不全マウスＲａｇ２−／−に移植した（Amagai M., et al., J. Clin. Invest., 105, 625-631, 2000）。
移植後４〜７日後に、移植したマウスの血中にＤｓｇ３に対するＩｇＧ抗体の産生が認められ、抗体産生は６ヶ月以上に亘り持続した。そしてマウスの皮膚・口腔粘膜・食道などの重層扁平上皮の細胞膜にはＤｓｇ３抗体の沈着が確認され、更に表皮および粘膜上皮の細胞間接着が障害されて、天疱瘡に特徴的な基底層直上での裂隙形成が、口腔粘膜・食道上部に認められた。作製されたマウスは、臨床的・病理学的・免疫学的に天疱瘡の特徴的な所見を有するモデルマウスであると結論された。（Ｄｓｇ３で免疫していないＤｓｇ３−／−マウス脾臓細胞でも天疱瘡を発症することを確認している。）
【０００９】
本発明者は、本天疱瘡病態モデルマウスにＣＤ４０Ｌアンタゴニスト、抗ＣＤ４０Ｌ抗体を予防的に投与することにより抗Ｄｓｇ３抗体産生を完全に抑制し、天疱瘡に伴う表皮及び粘膜病変を防止できることを見出した。更に、発症後に抗ＣＤ４０Ｌ抗体を投与した場合にも、抗Ｄｓｇ３抗体産生の抑制に効果を示し、一部のマウスでは表現型も改善されることが明らかとなり、ＣＤ４０Ｌアンタゴニストを天疱瘡治療剤及び予防剤として使用するという本発明を完成するに到った。
【００１０】
Ｔ細胞表面上の接触依存性のヘルパーエフェクター機能を媒体する受容体ＣＤ４０Ｌと、抗原提示細胞表面上の受容体ＣＤ４０との間の相互作用を阻害する薬剤は、進行中の免疫反応に抗原特異的に免疫寛容を誘導できることから、非特異的な免疫抑制剤に代わる、天疱瘡の根本的治療薬となることが予想される。
【００１１】
すなわち本発明は、抗ＣＤ４０Ｌ抗体を有効成分とする天疱瘡予防剤に関する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
本発明の種々の側面を以下の項目について詳細に説明する。
１．ＣＤ４０Ｌアンタゴニスト：Ｔ細胞表面上の接触依存性のヘルパーエフェクター機能を媒体する受容体ＣＤ４０Ｌと、抗原提示細胞表面上の受容体ＣＤ４０との間の相互作用を阻害する薬剤をＣＤ４０Ｌアンタゴニストと定義する。ＣＤ４０Ｌアンタゴニストには、ＣＤ４０Ｌと相互作用する薬剤のみならず、ＣＤ４０と相互作用する薬剤も含まれるものである。ＣＤ４０ＬアンタゴニストはＣＤ４０Ｌに対して向けられた抗体（例えばＣＤ４０Ｌに対するモノクローナル抗体）、ＣＤ４０Ｌに対して向けられた抗体のフラグメント（例えばＦａｂ又は（Ｆａｂ´）２フラグメント）、キメラ抗体又はヒト化抗体、可溶性（soluble）ＣＤ４０又は可溶性ＣＤ４０Ｌ及びそれらのフラグメント、又はその他のＣＤ４０ＬとＣＤ４０との相互作用を阻害する化合物であってよい。
【００１３】
ＣＤ４０Ｌアゴニストの、ＣＤ４０ＬとＣＤ４０との相互作用を阻害する性質は、例えば、標識可溶性ＣＤ４０の活性化ヘルパーＴ細胞への結合を抑制するか否かにより判定することができる。標識可溶性ＣＤ４０は、可溶性ＣＤ４０を、例えば特開平６−２２００９６号公報の実施例１の方法により作製し、適当な標識物質、例えば蛍光物質、放射性同位元素等により標識することにより調整できる。標識可溶性ＣＤ４０の活性化ヘルパーＴ細胞への結合の評価は、例えば蛍光標識した可溶性ＣＤ４０を用いて、ＦＡＣＳにより行うことができる。
【００１４】
２．抗ＣＤ４０Ｌ抗体：哺乳動物（例えばマウス、ハムスター又はウサギ）は、該哺乳動物において免疫応答を引き起こす免疫原の形態のＣＤ４０Ｌ蛋白質又は蛋白質断片（例えばペプチド断片）で免疫することができる。
ＣＤ４０Ｌ蛋白質はＣＤ４０Ｌ ｃＤＮＡ（Armitage et al., Nature, 357, 80-82, 1992、 Hollembaugh et al., EMBO J., 11, 4313-4319, 1992）を組み込んだ発現ベクターを宿主細胞、例えば細菌又は哺乳類細胞株中で発現させ、培養液から標準的な方法に従ってＣＤ４０Ｌ蛋白質を精製することができる。また、例えばＧＳＴ等との融合蛋白質として発現させ、ＧＳＴとの融合蛋白質の場合はグルタチオンカラムにより精製しても構わない。ＣＤ４０ＬペプチドはＣＤ４０Ｌのアミノ酸配列（ Armitage et al., Nature, 357, 80-82, 1992、 Hollembaugh et al., EMBO J., 11, 4313-4319, 1992）に基づき、公知の方法（例えば、F-moc又はT-boc化学合成）により合成することができ、合成されたペプチドは適当な担体、例えばＫＬＨと結合させることで免疫原性を高めることも許される。
【００１５】
精製されたＣＤ４０Ｌ蛋白質又はペプチド断片をアジュバントと共に免疫後、抗血清を得ることができ、所望なら抗血清からポリクローナル抗体を単離することができる。また、モノクローナル抗体を産生するには、抗体産生細胞（リンパ球）を免疫動物より回収し、標準的な細胞融合法によりミエローマ細胞と融合させて細胞を不死化し、ハイブリドーマ細胞を得る。かかる技術は当該技術分野では確立された方法であり、適当なマニュアル（Harlow et al, Antibodies: A Laboratory Mannual, 1998, Cold Spring Harbor Laboratory）に準じて行うことができる。更に、モノクローナル抗体はヒトモノクローナル抗体を産生するためのヒトＢ細胞ハイブリドーマ法（Kozbar et al., Immunol. Today, 4, 72, 1983）、EBV-ハイブリドーマ法（Cole et al., Monoclonal Antibody in Cancer Therapy, 1985, Allen R. Bliss, Inc., pages 77-96）、コンビナトリアル抗体ライブラリーのスクリーニング（Huse et al., Science, 246, 1275, 1989）等他の方法により作製しても良い。
【００１６】
本明細書における抗体は、ＣＤ４０Ｌと特異的に結合する抗体のフラグメント、例えばＦａｂ又は（Ｆａｂ´）２フラグメントをも包含するものである。
ヒト以外の動物、例えばマウスを免疫動物として作製されたマウスモノクローナル抗体は、ヒトに投与した場合異種蛋白質として認識されて、モノクローナル抗体に対する免疫応答を生じさせてしまうことが多い。この問題点を回避する一つの方法はキメラ抗体、すなわち抗原結合領域がマウスモノクローナル抗体由来、それ以外の領域がヒト抗体由来の抗体である。本発明における抗体はキメラ抗体も含むものである。キメラ抗体としては、抗原結合領域としてマウスモノクローナル抗体の可変領域全体を使ったキメラ抗体（Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81, 6851, 1985、Takeda et al., Nature, 314, 452, 1985）、また抗原結合領域としてヒト由来のフレームワーク領域とマウスモノクローナル抗体由来の超可変領域を組み合わせて使ったキメラ抗体（Teng et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80, 7308-12, 1983、 Kozbar et al., Immunol. Today, 4, 7279, 1983）が挙げられるが、本発明はこれに限定されるものではない。
【００１７】
本発明の天疱瘡治療剤は、天疱瘡の患者に投与できる。また、本発明の天疱瘡予防剤は、天疱瘡の発症の予防のために、天疱瘡の発症が予想される患者に対して投与できる。
本発明の天疱瘡治療剤及び天疱瘡予防剤の投与は、注射（皮下、静脈など）など常法により行うことができる。
【００１８】
天疱瘡治療剤及び天疱瘡予防剤の形態は、投与方法により適宜選択され、例えば、注射用途に適した医薬組成物としては、滅菌水溶液（水溶性の場合）または分散液および滅菌注射溶液または分散液を即座に調整するための滅菌粉末を挙げることができる。注射用途に適した医薬組成物はいずれの場合においても滅菌されていなければならず、容易な注射器操作が可能な程度に流体でなければならない。該組成物は製造及び貯蔵条件下で安定でなければならず、細菌や真菌などの混入微生物の作用から保護されていなけれなならない。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、及びポリエチレングリコールなど）、およびこれらの適当な混合物を含む媒体であるかあるいは分散媒体であってよい。適当な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングをしようすることによって、分散液の場合は必要な粒径を維持することによって、および界面活性剤を使用することによって維持することができる。微生物の作用からの保護は、種々の抗菌剤及び抗真菌剤、たとえばパラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールなどにより行うことができる。多くの場合等張剤、例えば糖、ポリアルコール、例えばマンニトール、ソルビトール、塩化ナトリウムなどが組成物中に含まれているのが好ましいであろう。注射用組成物の持続吸収は、吸収を遅らせる薬剤、例えばモノステアリン酸アルミニウムやゼラチンなどを組成物中に配合することにより行うことができる。
【００１９】
注射用溶液の調整は、必要なら上記成分の１またはその組合せとともに所要量の活性化合物（ＣＤ４０Ｌアンタゴニスト等）を適当な溶媒中に配合し、ついで滅菌濾過することにより行うことができる。一般に分散液の調整は、基本的な分散媒体と上記から選ばれた必要な他の成分を含む滅菌媒体中に活性化合物を配合することにより行う。滅菌注射溶液調整のための滅菌粉末の場合は、好ましい調整法は真空乾燥及び凍結乾燥であり、これにより活性成分と前もって滅菌濾過した所望の追加成分との粉末が得られる。
【００２０】
天疱瘡治療剤の投与量は、天疱瘡を治療するのに十分な量であり、患者の年齢、性差、薬剤に関する感受性、投与方法、疾患の履歴などにより変化し得る。また天疱瘡予防剤の投与量は、天疱瘡を予防するのに十分な量であり、患者の年齢、性差、薬剤に関する感受性、投与方法、疾患の履歴などにより変化し得る。
【００２１】
本発明を下記実施例により更に詳しく説明するが、本発明はこれに限られるものではない。
以下の実施例で使用した抗ＣＤ４０Ｌ抗体ＭＲ１（Noelle et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89, 6550-54, 1992）は、ハムスターで作製したマウスＣＤ４０Ｌに対するモノクローナル抗体でPharMingen社より入手可能（Catalog No.：PM-09020D or PM-09021D）である。またMR1産生細胞は、American Type Culture Collection （ＡＴＣＣ）より入手可能である（ＡＴＣＣ No.：HB-11048）。
使用したＤｓｇ３−／−マウスはThe Jackson Laboratory, Bar Harbor, Maine, USAより、Ｒａｇ２−／−２マウスはTacnin Farms, Germantown, New York, USAより入手可能である。
また実施例中で組換えＤｓｇ３（ｒＤｓｇ３）は、マウスＤｓｇ３（GenBank U86016）の細胞外ドメインを配列番号１及び２に記載の配列のプライマーを用いたＰＣＲにより増幅し、Amagai M., et al., J. Clin. Invest., 94, 59-67, 1994に記載の方法に従って作製した。抗体価は、Amagai M., et al., J. Clin. Invest., 105, 625-631, 2000に記載されたＥＬＩＳＡ法により測定した。
【００２２】
［実施例１］天疱瘡病態モデルマウスの作製
Amagaiらの方法（Amagai M., et al., J. Clin. Invest., 105, 625-631, 2000）に準じて、天疱瘡病態モデルマウスを作製した。
ｒＤｓｇ３で免疫したＤｓｇ３−／−マウスをエーテル麻酔下で屠殺し脾臓を摘出した。脾臓細胞を無菌的に調整し、１×１０８／ｍｌにＰＢＳに懸濁後、０．５ｍｌ（細胞数として ５×１０７個）をＲａｇ２−／−マウス尾静脈に静脈内投与した。
移植後４〜７日後に、移植したマウスの血中にＤｓｇ３に対するＩｇＧ抗体の産生が認められ、抗体産生は６ヶ月以上に亘り持続した。そしてマウスの皮膚・口腔粘膜・食道などの重層扁平上皮の細胞膜にはＤｓｇ３抗体の沈着が確認され、更に表皮および粘膜上皮の細胞間接着が障害されて、天疱瘡に特徴的な基底層直上での裂隙形成が、口腔粘膜・食道上部に認められた。
【００２３】
［実施例２］ＭＲ１抗体投与による天疱瘡の予防効果
ＭＲ１抗体を予防的に投与し、Ｄｓｇ３に対する免疫応答が惹起される時にＣＤ４０Ｌを存在させた場合、移入した脾臓細胞にＤｓｇ３に対して免疫寛容が誘導できるかどうかを検討した。
Ｄｓｇ３−／−マウス脾細胞移植の２日前および移植後０、２、４、７日にＭＲ１抗体とコントロールハムスターＩｇＧを５００μｇずつレシピエントマウス（Ｒａｇ２−／−マウス）の腹腔内に投与した（ｎ＝５）。
移植１４日後にコントロール群では抗Ｄｓｇ３抗体産生を確認したが、ＭＲ１を投与したマウスでは、６６日間の観察期間を通じて明らかな抗体産生および表現型を全く認めなかった（図１）。またコントロール群では体重減少、休止期脱毛および病理組織学的にＰＶに特徴的な基底層直上の棘融解を認めたが、ＭＲ１を投与群では、体重減少は見られず、ＰＶの症状も観察されなかった。ＭＲ−１抗体には、明らかなＰＶ予防効果が見られた。
【００２４】
［実施例３］ＭＲ１抗体投与による天疱瘡の治療効果
Ｄｓｇ３−／−マウスの脾臓細胞を導入し、Ｄｓｇ３−／−に対する抗体を産生してＰＶの発症が見られるマウスに対して、ＭＲ−１抗体を投与し、治療効果が見られるかどうかを検討した。
免疫していないＤｓｇ３−／−マウスの脾臓細胞を導入したレシピエントマウス（Ｒａｇ２−／−マウス）に、ＭＲ１とハムスターＩｇＧを、脾臓細胞移植後７週間後から、１ｍｇずつ週２回６週間に亘り計１２回投与した（ｎ＝１０）。通常の抗体価の変動をみるために無治療のＰＶモデルマウスも同時に観察した（ｎ＝５）。
投与開始後、０、２、４及び６週目に採血し、Ｄｓｇ３に対する抗体価を測定した。投与前に抗体価が高く（＞２０００倍の抗体titerを示すマウス）、投与中に死亡してしまったマウスを除き、更に治療効果の見込めない投与前から抗体価が低かったマウス（＜１００倍の抗体titerを示すマウス）を除いて統計処理した。図２に示す通り、ＭＲ１抗体投与群では、投与前の３０％まで抗体価が低下したが、コントロール群には抗体価の低下が見られなかった。この間、一部のマウスではＰＶの改善が認められたが、両群の間で、ＰＶの症状に有意な差は観察されなかった。
【産業上の利用可能性】
【００２５】
ｇ３９アンタゴニストの投与により、抗Ｄｓｇ抗体の産生が抑制され、天疱瘡に伴う表皮及び粘膜病変が改善されていることが確認されて、ＣＤ４０Ｌアンタゴニストが天疱瘡の根本的な治療剤及び予防剤となりうることが示された。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】ＭＲ１抗体投与による天疱瘡の予防効果を示す図である。
【図２】ＭＲ１抗体投与による天疱瘡の治療効果を示す図である。
【配列表】
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EISAI CO., LTD.
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<210> 1
<211> 39
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
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