FI106965B - Uusia biologisia menetelmiä 7-ACA:n ja 7-ADAC:n valmistamiseksi - Google Patents

Description

106965

Uusia biologisia menetelmiä 7-ACA:n ja 7-ADAC:n valmistamiseksi

Keksinnön tausta 5 1. Keksinnön kenttä Tämän keksinnön alana ovat synteesimenetelmät kaupallisten kefalosporiiniantibioottien valmistamiseksi, joita on nykyisin olemassa merkittävä määrä; nämä terapeuttiset aineet ovat nyt neljännessä sukupolvessaan. Kau- 10 pallisissa kefalosporiineissa esiintyvät monet erilaiset sivuketjut ja kefalösporiinien huomattava kaupallinen merkitys ovat tehneet yhä tärkeämmäksi saavuttaa taloudellisempia ja tehokkaita menetelmiä avainasemassa olevien välituotteiden valmistamiseksi, jotka mahdollistavat eri- 15 laisten kefalösporiinien helpon synteesin.

Yksi näistä avainasemassa olevista välituotteista on 7-aminokefalosporaanihappo (7-ACA), joka voidaan esittää seuraavalla kaavalla: 20 H2N-rfSs| o^NYSh3

COOH

25. 7-ACA:ta tuotetaan nykyisin kefalosporiini C:stä.

·;· Itse kefalosporiini C on fermentaatiotuote, joka on lähes «·«· .*·*. kaikkien nykyisin markkinoilla olevien kefalösporiinien ♦ lähtökohtana. Synteettinen käsittely näiden erilaisten kaupallisten kefalösporiinien tuottamiseksi lähtee kuiten- • · 30 kin useimmissa tapauksissa pohjimmiltaan 7-aminokefalospo- *;* raanihaposta, joka täytyy johtaa kefalosporiini C:stä loh- • ♦ :.*·· kaisemalla 7-aminoadipoyylisivuketju. Tyypillisiin kaupal lisiin kefalosporiineihin, jotka on johdettu synteettisesti 7-ACA:sta ja joissa on siten 3-asetyylioksimetyleenisi- • 106965 2 vuketju, kuuluvat kefotaksiimi, kefaloglysiini, kefalotii-ni ja kefapirilni.

Yksi toinen avainasemassa olava välituote on 7-ami-nodeasetyylikefalosporaanihappo (7-ADAC), joka voidaan 5 esittää seuraavalla kaavalla: ^-ί-Λ

O

10 COOH

7-ADAC:tä tuotetaan nykyisin myös kefalosporiini C:stä poistamalla 7-D-a-aminoadipoyylisivuketju yhdistettynä 3-asetyylioksimetyleenisivuketjun muuttamiseen 3-hyd-roksimetyyliryhmäksi. 7-ADAC on käyttökelpoinen välituote-15 yhdiste muunnettuja substituentteja C-3-asemassa sisältävien kefalosporiinien synteesissä.

Alalla nykyisin käytettävä menetelmä 7-aminoadipo-yylisivuketjun lohkaisemiseksi on kemiallinen. Imino-halo-genidiperusmenetelmä vaatii 7-aminoadipoyylisivuketjun 20 amino- ja karboksyyliryhmien suojaamista, ja nykyisin käytetään muutamaa menetelmää tämän tekemiseksi. Nykyisin .''! käytössä olevalla kemiallisella lohkaisumenetelmällä on

< C C

kuitenkin vakavia haittapuolia. Niihin kuuluvat vaatimuk-; “ set, jotka liittyvät monivaiheiseen ja monimutkaiseen me- < < i * i 25 nettelyyn, äärimmäisen mataliin toimintalämpötiloihin, kalliisiin reagensseihin, prosessin sivutuotteiden merkit- • · · V : täviin määriin, jotka johtavat jätteenkäsittelyongelmiin, ja hyvin epäpuhtaan lähtömateriaalin puhdistukseen ennen ···** kemiallisen käsittelyn alkamista. Niinpä on jatkuvasti .*·*. 30 etsitty mikrobiologista tai fermentatiivista menetelmää, • · · jolla saavutettaisiin kefalosporiini C:n entsymaattinen • · · *· deasylointi 7-aminokefalosporaanihapoksi taloudellisemmin • *« kuin nykyisin käytössä olevalla kemiallisella menetelmäl- .y. ia.

e < (

< I

* 4 t 4 4 3 106965 Tämä menestyksellisen mikrobiologisen menetelmän etisiminen on kuitenkin osoittautunut suurelta osin tuloksettomaksi. Kuten kirjallisuudesta käy ilmi, tämä on seurausta kefalosporiini C:n aminoadipoyylisivuketjun raken-5 teestä ja erityisesti stereokemiallisista ominaisuuksista, sillä penisilliini on deasyloitu menestyksellisesti entsy-maattisella lohkaisulla käyttämällä monien mikro-organismien tuottamaa penisilliiniasylaasia. Kirjallisuudessa esitetyt raportit kefalosporiini C:n menetyksellisestä 10 yksivaiheisesta entsymaattisesta deasylaatiosta ovat sen sijaan usein mahdottomia toistaa tai johtavat vain hyvin vähäisiin saantoihin.

Niinpä tämän keksinnön alueena on avainasemassa olevan kefalosporiinivälituotteen, 7-ACA:n, valmistus ja 15 tarkemmin määriteltynä biologiset menetelmät 7-ACA:n valmistamiseksi .

Tähän asti menestyksellisen biologisen prosessin etsiminen 7-ACA:n valmistamiseksi on osoittautunut suurelta osin tuloksettomaksi, varmuudella kaupallista suuruus-20 luokkaa olevan prosessin suhteen. Vaikka on esimerkiksi ollut mahdollista valmistaa 6-aminopenisillaanihappoa (6-APA) penisilliini G:n suoralla fermentoinnilla ja/tai ent- • · a • '.· symaattisella käsittelyllä, jolloin jäljelle jää vain tar- i a ve laajentaa rengasta 7-ADCA:n saamiseksi, on havaittu, 25 että Cephalosporium- ja Streptomyces-entsyymit, jotka te- ··· kevät renkaan laajennuksen näiden mikro-organismien nor- • · · · maaleilla metaboliateillä, eivät ikävä kyllä hyväksy 6-APA:ta substraatiksi. Nämä entsyymit, joita kutsutaan >#ic. alalla yhteisnimellä DAOCS- tai ekspandaasientyymi, määri- • ♦ ... 30 tellään entsyymeiksi, jotka katalysoivat penisilliinityyp- • · pisissä molekyyleissä esiintyvien penaamirengasrakenteiden • · i.*·· laajentumista kef-3-eemirenkaiksi, jollaisia esiintyy ke- falosporiineissa. Jäljempänä näistä entsyymeistä käytetään t ’ · t yhteisnimitystä "ekspandaasientsyymi".

• « · • a t« · 4 106965

Yksi substraatti, jolla ekspandaasientsyymi toimii, on penisilliini N, josta saadaan renkaan laajennuksen ja hydroksylaation jälkeen deasetyylikefalosporaanihappoa (DAC). Tällöin on tarpeen vain lohkaista (D)-a-aminoadipo-5 lyylisivuketju 7-ADAC:n saamiseksi, mutta tämä sivuketju on osoittautunut itsepintaisen vastustuskykyiseksi entsy-maattisen lohkaisun suhteen ja tulokseksi saadaan vain hyväksyttävää pienempiä saantoja.

Tämän keksinnön mukaisesti on ollut mahdollista 10 saavuttaa tehokas biologinen menetelmä, jonka yhteydessä tuotetaan suuria määriä penisilliiniyhdistettä (jossa on adipoyylisivuketju) uudella fermentointimenettelyllä, joka mainittu pensilliiniyhdiste on hyväksyttävä yhdiste eks-pandaasientsyymin kannalta, jota tuottaa in situ sama, 15 penisilliiniyhdistettä tuottava mikro-organismi, joka on transformoitu mainittua ekspandaasientsyymiä tuottavaksi. Tämä ekspandaasientsyymi toimii sitten penisilliiniyhdis-teen renkaan laajentajana ja antaa tulokseksi kefalospo-riiniyhdistettä suurella saannolla.

20 Ekspandaasientsyymin in situ -vaikutuksen kautta tuotetussa adipoyyli-7-ADCA:ssa on 3-metyylisivuketju (-CH3), kun taas 7-ACA:ssa, lopputuotteessa, on 3-asetyyli-oksimetyylisivuketju [-CH20C(0)CH3]. 3-metyylisivuketjun muuttamiseksi 3-asetyylioksimetyylisivuketjuksi tuotetaan < 25 tämän keksinnön mukaisesti eksapandaasiaktiivisuuden li- säksi in situ myös kahta muuta entsyymiaktiivisuutta. Nämä ovat, järjestyksessä, eräs hydroksylaasi ja eräs asetyyli- • · · transferääsi, ja molemmat ovat sellaisten geenien ilmenty-mistuotteita, joilla penisilliiniyhdistettä tuottava mik- * * 30 ro-organismi on myös transformoitu. Hydroksylaasientsyymi ...* muuttaa adipoyyli-7-ADCA:n 3-metyylisivuketjun 3-hydroksi- « ·*·,· metyyliksi, ja asetyylitransferaasientsyymi muuttaa 3-hyd- » · roksimetyylisivuketjun 7-ACA:m 3-asetyylioksimetyylisivu-ketjuksi.

4 · « C ( 5 106965 Tärkeää on, että tämän keksinnön keksinnön mukaisen menetelmän viimeisessä ratkaisevassa vaiheessa penisillii-niyhdisteen, nyt kefalosporiiniyhdisteen, sivuketju on poistettavissa eräällä toisella entsyymijärjestelmällä 5 yllättävän suurella saannolla. Tämän ainutlaatuisen, keksinnön muodostavan biologisen kokonaismenetelmän odottamattomana tuloksena on 7-ACA:n tuottaminen yllättävän suurella saannolla ja riittävän taloudellisesti, jotta menetelmä edustaisi järkevää vaihtoehtoa nykyisin käytössä 10 oleville kemiallisille ja biokemiallisille valmistusmenetelmille.

2. Tekniikan tason lyhyt kuvaus Tämän keksinnön mukainen uusi biologinen menetelmä tarjoaa ainutlaatuisen ja yllättävän tehokkaan menetelmän 15 7-ACA:n valmistamiseksi, joka on taloudellisesti kilpailukykyinen vaihtoehto nykyiselle kemialliselle synteesille. Alalla tehdyt jatkuvat yritykset saada aikaan tällainen uusi biologinen menetelmä ovat epäonnistuneet toistuvasti. Julkaisussa EP-A 0 422 790 esitetään esimerkiksi DNA, joka 20 koodittaa Aspergillus nidulansin isopenisilliini N:asyyli-CoA-asyylitransferaasiaktiivisuutta, ja sen käyttö hyödyllisten kefalosporiinien muodostamiseksi penisilliiniä tuottavissa sienissä, mitä ei ole toteutettu aiemmin tällä ; < alalla. Tämän kuvataan kuitenkin tapahtuvan rikkomalla tai 25 syrjäyttämällä asyylitransferaasigeeni ja lisäämällä tämän ··· ohella kefalosporiinia tuottavista organismeista peräisin ·«·« olevia epimeraasi- ja ekspandaasientsyymejä koodittavia geenejä; lisäksi ei ilmeisestikään saavuteta käyttökel-t#><>. poista transformaatio- ja ilmentymistulosta. Lisäksi vaik- • c .c 30 ka tranformaatio olisi onnistunut, se ei olisi silti ollut • · "· käyttökelpoinen tämän keksinnön tarkoituksiin, sillä jäi- • · */·· jellä olisi edelleen D-a-aminoadipoyylisivuketjun poista- mistapaa koskeva ongelma. Mainitunlainen alalla tehty epä-onnistunut yritys saada aikaan merkittäviä tuloksia kau- *.* 35 pallisten kefalosporiinivälituotteiden valmistuksessa pe- « · * · • · · 6 106965 nisilliiniä tuottavista sieniviljelmistä on täydellinen vastakohta tämän keksinnön mukaisella menetelmällä saavutetuille tuloksille.

Biologisen prosessin ensimmäinen entsymaattinen 5 vaihe on tämän keksinnön mukaisessa menetelmässä adipoyy-li-6-APA:n renkaan laajennus, joka toteutetaan ekspandaa-sientsyymin avulla, joka on P. chrysogenum -ei-rekombi-nantti-isännän transformointiin käytetyn ekspandaasigeenin ilmentymistuote. Mainitunlaisen ekspandaasientsyymin käytit) tö on tutkittu alalla. Cantwell et ai. [Curr Genet 17 (1990) 213 - 221] ovat esimerkiksi ehdottaneet biologista menetelmää 7-ADCA:n valmistamiseksi tekemällä renkaan laajennus pensilliini V:lle, mitä seuraa tuloksena oleva de-asetoksikefalosporiini V:n entsymaattinen hydrolyysi 7-15 ADCA:n muodostamiseksi. Tämä ehdotus perustuu S. clavuli-gerus -peräisen kloonatun penisilliini N -ekspandaasigeenin (cefE) saatavuuteen [Kovacevic et ai., J. Bacteriol. 171 (1989) 754 - 760; Ingolia et ai., US-patenttijulkaisu 5 070 020. Koska tämä ekspandaasi toimii penisilliini 20 N:llä, luonnollisella substraatillaan, mutta ei penisilliini V:llä, tämä ehdotus vaatii kuitenkin geeniteknistä käsittelyä muunnetun ekspandaasigeenin tuottamiseksi, joka < Pystyy aikaansaamaan penisilliini V:n renkaan laajennuk- < i '< set. Cantwell et ai. eivät ole kuitenkaan saaneet aikaan ‘:r ; 25 tarvittavaa muunnosta, ja he ovat onnistuneet vain trans- ··· formoimaan Penlcillium chrysogenumin Streptomyces clavuli- • · · ·

gerus -peräisellä cefE-geenillä ja saamaan aikaan DAOCS

« (ekspandaasi) -entsyymin vähäisen tuotannon.

<><t· Tätä ekspandaasientsyymiä on tutkittu paljon alalla • · ... 30 sekä aktiivisuutensa että geenisekvenssinsä suhteen. US- • · *”* patenttijulkaisujen 4 510 246 ja 4 536 476 (Wolfe) mukaan ♦ ♦ J/·· on esimerkiksi eristetty erillisiä syklaasi-, epimeraasi- ja renkaanlaajennusentsyymejä prokaryoottisten B-laktaamia tuottavien organismien, Streptomyces clavuligerus mukaan < « · 35 luettuna, soluttomasta uutteesta, ja saatu stabiileja ent-

« « I

7 106965 syymireagensseja. Dotzlaf [US-patenttijulkaisu 5 082 772 (EP-A 0 366 354] kuvaa S. clavuligerus -peräistä eristettyä ja puhdistettua ekspandaasientsyymiä, joka on karakterisoitu mm. terminaalisen ryhmän ja aminohappokoostumuksen 5 suhteen ja jonka moolimassan ilmoitetaan olevan noin 34 600 daltöniä. Tämä on kuitenkin ristiriidassa moolimassan 29 000 kanssa, joka on ilmoitettu US-patenttijulkaisussa 4 536 476 samalta entsyymiltä näyttävälle tuotteelle. Julkaisussa EP-A 0 233 715 kuvataan S. clavuligerusis-10 ta saadun ekspandaasigeenin eristämistä ja endonukleaasi-restriktiokarttaa ja rekombinanttiekspandaasia koodittavan DNA:n ilmentymistä (jonka tuloksena on aktiivinen ekspan-daasientsyymi) S. clavuligerus -kannassa, jolta puuttuu kyky tuottaa kefalosporiinia. Ingolia et ai. [US-patentti-15 julkaisu 5 070 020 (EP-A 0 341 892)] kuvaavat S. clavuli-gerusista saatua ekspandaasientsyymiä koodattavaa DNA-sek-venssiä ja erään P. chrysogenum -kannan transformointia ilmentymisvektorilla, joka sisältää mainitun DNA-sekvens-sin, jolloin saadaan aikaan ekspandaasientsyymituotanto. 20 Vaikka ehdotetaan, että tämä entsyymi on käyttökelpoinen muiden substraattien kuin penisilliini N:n laajentamiseen, mainitunlaisesta laajennuksesta ei ole olemassa todellisia ; osoituksia.

( c < “ Edellä kuvattu työ on kohdistunut prokaryoottisesta 25 S. clavuligerusista peräisin olevaan ekspandaasientsyy- ··· miin. Entsyymiä, jolla on ilmeisesti sama renkaanlaajen- • · · · nusaktiivisuus, tuottavat myös eukaryoottisen Cephalospo-rium acremoniumin (josta käytetään myös nimeä Acremonium <t<t. chrysogenum) kannat. Mainitunlaisissa kannoissa ekspandaa- • · ... 30 siaktiivisuus on kuitenkin kaksitoimisen geenin (cefEF) • « 1 *;* ilmentymistuote, joka geeni koodittaa myös DACS (hydroksy- ♦ · J/·· laasi) -aktiivisuutta, jonka luonnollisena tehtävänä on muuttaa ekspandaasientsyymin deasetoksikefalosporaanihappo (DAOC) -tuote deasetyylikefalosporiini C:ksi (DAC:ksi).

4 « · !,! 35 Tämän ilmentymisen tuloksena on yksi mutta kaksitoiminen 4 ·

t C

4 4 4 p 106965 ekspandaasi-hydroksylaasientsyymi. Vaikka on tehty yrityksiä näiden kahden geenituotteen aktiivisuuksien erottamiseksi, ei yksikään yritys ole vielä onnistunut. Julkaisussa EP-A 0 281 391 kuvataan esimerkiksi C. acremonium ATCC 5 11550:sta saadun DAOCS-DACS-geenin eristämistä ja DNA-sek- venssin identifiointia samoin kuin vastaavaan entsyymin aminohapposekvenssiä. Eräs Penicillium -kanta transformoidaan, ja se tuottaa entsyymiä, mutta yritettyä penisilliini G:n ja V:n muuttamista vastaaviksi kefalosporiineiksi 10 ei ole milloinkaan näytetty toteen. Huolimatta ehdotuksesta, jonka mukaan geenitekniset menetelmät tarjoavat helpon keinon DAOCS:ää koodattavan geneettisen informaation erottamiseksi DACS:ää koodittavasta ja niiden saattamiseksi ilmentymään, todellisia näyttöjä mainitunlaisesta erotuk-15 sesta ei esitetä.

C. acremoniumin DAOCS-DACS (ekspandaasi-hydroksy-laasi) -entsyymiä on myös tutkittu paljon alalla, sekä aktiivisuutensa että geenisekvenssinsä ominaisuuksien suhteen. US-patenttijulkaisujen 4 178 210, 4 248 966 ja 20 4 307 192 (Demain) mukaan esimerkiksi käsitellään erilai sia penisilliinityyppisiä lähtömateriaaleja soluttomalla < C. acremonium -uutteella, joka epimeroi ja laajentaa ren- < c . V gasta, niin että saadaan kefalosporiiniantibioottituote.

< I

; ’*· Wu-Kuang Yeh (US-patenttijulkaisu 4 753 881) kuvaa C.

25 acremonium -entsyymin isoelektristä pistettä, moolimasso- ··· ja, aminohapporyhmiä, hydroksylaasiaktiivisuuden ja • · · · .*·*· ekspandaasiaktiivisuuden suhdetta ja peptidifragmentteja.

Alalla on kuvattu myös C. acremoniumin asetyyli- (#<t; transferaasientsyymin aktiivisuutta, tunnusmerkillisiä • · ... 30 ominaisuuksia, restriktiokartoitusta ja nukleotidi- ja

**· aminohapposekvenssejä. Katso esimerkiksi julkaisut EP-A

:/.: 0 437 378 ja EP-A 0 450 758.

Edellä käsitelty tekniikan taso koskee vain yhtä • \ puolta tästä keksinnöstä, ts. erään P. chrysogenum -kannan « * · M 35 transformointia geeneillä, jotka koodittavat ekspandaasi-• · • · • « · 9 106965 ja ekspandaasi-hydroksylaasientsyymejä ja mainittujen entsyymien tuotannon aikaansaantia. Alalla on kuitenkin käytetty tuotettuja entsyymejä vain penisilliini N;n, ei penisilliini G:n eikä V:n, renkaan laajentamiseen. Tässäkin 5 tapauksessa penisilliini N:ssä on 7-asemassa sivuketju, jota ei pystytä lohkaisemaan entsymaattisesti, niin että jäljelle jää vapaa aminoryhmä. Tämä keksintö perustuu yllättävään havaintoon, että eräs P. chrysogenvm -kanta pystyy tehokkaasti lisäämään adipoyylisivuketjun, in situ 10 tuotettu ekspandaasientsyymi pystyy käyttämään tätä yhdistettä tehokkaasti substraattina renkaan laajentamiseen adipoyyli-7-ADCA:n tuottamiseksi, hydroksylaasi- ja ase-tyylitransferaasientsyymit, joita myös tuotetaan in situ, pystyvät käyttämään adipoyyli-7-ADCA:ta substraattina 7-15 ACA:n 3-asetoksimetyylisivuketjun tuottamiseksi ja adipo-yylisivuketju pystytään sitten poistamaan tehokkaasti vielä yhden muun entsyymin avulla, jolloin saadaan 7-ACA. Vaikka erilaisia eristettyjä keksinnön mukaisia fragmentteja voidaan löytää tekniikan tasoa kuvaavasta kirjalli-20 suudesta, ei ole ehdotettu niiden yhdistämistä tämän keksinnön mukaisella menetelmällä saavutettujen odottamatto- t mien tulosten aikaansaamiseksi.

i i · ; *,· Esimerkiksi 6-adipoyylipenisillaanihapon tuottami- • '·< nen on alalla tunnettua; katso Ballio, A. et ai., Nature ""i 25 185 (1960) 97 - 99. Alalla on tunnettua myös 6-adipoyyli- ··· penisillaanihapon entsymaattinen laajentaminen, mutta vain • · · · in vitro; katso Baldwin et ai., Tetrahedron 43 (1987) 3009 - 3014; julkaisu EP-A 0 268 343. Adipoyylisivuketju- tti#. jen entsymaattinen lohkaisu on myös alalla tunnettua; kat- • » ... 30 so esimerkiksi Matsuda et ai., J. Bact. 169 (1987) • · *:·* 5815 - 5820.

• ·

Adipoyylisivuketjuila on seuraava rakenne: COOH-(CH2)4-CO-; kaksi sivuketjua, joilla on hyvin saman-kaltainen rakenne, ovat glutaryyliryhmä, jonka kaava on « « · .M 35 C00H-(CH2)3-C0-, ja (D)-a-aminoadipoyyliryhmä, jonka kaava « · « · · 10 106965 on COOH-CH(NH2)-(CH2)3-CO-. Glutaryylisivuketjujen entsy-maattinen lohkaisu on alalla tunnettua. Katso esimerkiksi Shibuya et ai., Agric. Biol. Chem. 45 (1981) 1561 - 1567 ja US-patenttijulkaisu 3 960 662; Matsuda ja Komatsu, J.

5 Bact. 163 (1985) 1222 - 1228; Matsuda et ai., J. Bact. 169 (1987) 5815 - 5820; julkaisu JP 53-086 084 (1978, Banyu Pharmaceutical Co. Ltd); julkaisu JP 52-128 293 (1977, Banyu Pharmaceutical Co. Ltd). Myös julkaisussa EPA-A 0 453 048 kuvataan menetelmiä Pseudomonas SY-77-l:n tuot-10 tämän glutaryyliasylaasin adipolyylinlohkaisuaktiivisuuden parantamiseksi. Tehtäessä aminohapposubstituointeja tietyissä alfa-alayksikön asemissa on havaittu 3 - 5 kertaa suurempi adipolyyliryhmän lohkaisunopeus (adipoyyliserii-nistä). Tulisi huomata, että vaikka julkaisussa EP-A 15 0 453 048 ilmeisestikin esitetään asylaasi, jolla on pa rannettu aktiivisuus adipoyylisivuketjujen suhteen, siinä ei kuvata tapoja (kemiallisia tai tässä hakemuksessa kuvatun prosessin kanssa millään tavoin analogisen biologisen prosessin kautta toteutettavia), jolla voitaisiin ensinnä-20 kin muodostaa adipoyylikefalosporiinia.

Kun läsnä on (D)-a-aminoadipoyylisivuketju, on c alalla tunnettua poistaa ensin aminoryhmä entsymaattises- f .· ( ! ti, lyhentää sivuketjua (D)-aminoghappo-oksidaasilla, jol- ; v loin jäljelle jää glutaryyli (GL-7) -sivuketju, ja poistaa 25 glutaryylisivuketju toisella entsyymillä (glutaryyliasy- ··· laasilla). Tällaista kaksivaiheista lohkaisua kuvataan ·· · · • '•‘j julkaisuissa US-patentti julkaisu 3 960 662 (Matsuda et ai.); EP-A 0 275 901; JP 61-218 057 (1988, Komatsu, Asahi tctc· Chemical Industry Co.); W0 90/12110 (1990, Wong, Biopure • o .c^ 30 Corp.); EP-A 0 436 355 [Isogai et ai., myös Bio/Technology Τ’ 9 (1991) 188 - 191].

• · ·.*·; On myös alalla tunnettua tehdä (D)-a-adipoyylisivu- ketjun yksivaiheinen lohkaisu, erityisesti käyttämällä > yhdistelmä-DNA-tekniikkaa. Katso esimerkiksi seuraavat 35 julkaisut; « i « i (il 11 106965 yksivaiheinen (D)-α-aminoadipoyylisivuketjun loh-kaisu: JP 53-94 093 (Meiji, Pseudomonas sp. BN-188); JP 52-143 289 (= US-patenttijulkaisu 4 141 790, 5 Meiji, Aspergillus sp.);

US-patenttijulkaisu 4 774 179 (Asahi 1988, Pseudomonas sp. SE-83 ja SE-495) = JP 61-21 097 ja JP

61-152 286; FR-patenttijulkaisu 2 241 557 (Aries 1975, Bacillus 10 cereus var fluorescens); JP 52-082 791 (Toyo Jozo 1977, Bacillus megaterium NRRL B 5385); EP-A 0 321 849 (Hoechst, Pseudomonas, Bacillus sub-tilis, Y -glutamyylitranspeptidaasi); 15 EP-A 0 322 032, EP-A 0 405 846 ja US-patenttijul kaisu 5 104 800 (Merck Bacillus megaterium); EP-A 0 283 218 ja US-patentti julkaisu 4 981 789 (Merck, Arthrobacter viscosus).

Yksivaiheinen rekombinanttimenetelmä; Ceph C -» 7-20 ACA: JP 60-110 292 (Asahi 1985, Comamonas, rekombinant-ti- E. coli, joka sisältää Comamonas sp. SY-77-l:stä peräisin olevan geenin, yksivaiheinen muuttaminen); JP 61-152-286 (Asahi 1986, Pseudomonas, rekombi-25 nantti- E. coli, joka sisältää Pseudomonas sp. SE83:sta « · · ·1·1· peräisin olevan geenin, geenisekvessejä kuvattu ja esitet- • · ;·. ty niitä koskevia patenttivaatimuksia, yksivaiheista mene- telmää koskevia patenttivaatimuksia esitetty jo US-patent- • 1 tijulkaisussa 4 774 179); ".2, 30 JP 63-74 488 (Asahi 1988, Trigonopsis variabilis, • ♦ ♦ *** ’ Comamonas, D-aminohappo-oksidaasin ja GL-7-ACA-asylaasira- kenteen tuottaminen rekombinantti- E. colissa)i ' 1 EP-A 0 475 652 (Fujisawa, kefalosporiini C -asylaa- *...· si ja sen tuottaminen yhdistelmä-DNA-tekniikalla).

t t « « t # « « · · « · « « « • · ♦ « « « · · « · · · « · • · 2 • · · 12 106965

Alalla tunnetaan 7-ADAC:n valmistusmenetelmien eri puolia. Katso esimerkiksi US-patenttijulkaisu 3 304 236 ja 3 972 774 (Eli Lilly & Co.); EP-A 0 454 478 (Shionogi & Co., Ltd.); julkaistu JP-patenttihakemus 04 53 499 (Shio-5 nogi & Co., Ltd.).

Viittaus avoinna olevaan rinnakkaishakemukseen

Viittaamme avoinna olevaan rinnakkaishakemukseen sarjanumero 07/933 469, joka on jätetty 28. elokuuta 1992 (asiamiehen tapausnumero 18532IA) ja jossa esitetään bio-10 loginen menetelmä 7-ADCA:n valmistamiseksi, joka perustuu ekspandaasientsyymiaktiivisuuden tuottamiseen P. chrysoge-num -transformantissa samalla tavalla kuin tässä kuvatussa biologisessa menetelmässä 7-ADAC:n ja 7-ACA:n valmistamiseksi. Tässä biologisessa menetelmässä hyödynnetään kui-15 tenkin lisätransformointeja lisäentsyymiaktiivisuuksien tuottamiseksi, jotta saavutetaan täysin erilainen rekombi-nantin metaboliatie, joka johtaa erilaisiin lopputuotteisiin, joista yhtäkään ei ehdoteta avoinna olevassa rinnak-kaishakemuksessa. Jotta helpotetaan tämän keksinnön mukai-20 sen menetelmän ja edellä käsitellyissä tekniikan tasoa kuvaavissa viitteissä esitettyjen tietojen ymmärtämistä, esitetään heti seuraavaksi adipoyyli-6-APA:han, dipoyyli-7-ADCA:han, adipoyyli-7-ACA:han ja 7-ACA:han johtavien metaboliateiden eri vaiheet, välituotteet ja kyseiset . : 25 transformaatiot toteuttavat entsyymit.

• · · * 1 · • · • · • e « c * · • e c · · • ♦ r « · · « e o * c c « « · « « « I « « « · • · · « · « · • · · • · • · » • · » • · · · • · • · • · · 13 106965 L-alfa-aminoadipiinihappo + L-kysteiini + L-valiini 5

ACV-SYNTETAASI

ejoc. n P

10 (L) . H2N I 7^1 λ—N 7

O ' / COOH

LLD-ACV n 15 ISOPENISILLIINI N -SYNTETAASI (IPNS} 20

O H

HOCXX II I

>νν-Ν\/\/3 CL) H2N' I f PCH3 ·..·' 25 N-^

O COOH

• · • ♦ • · • ♦ ♦

ISOPENISILLIINI N

CIPN) • · · ·

O'- 30 IPN-AMIDOLYAASI

< < I C ( « I · · « · • · • · · 14 106965

ASYYLI-CoA: 6-APA

e ASYYLITRANSFERAASI

o ,

FENYYLIASETYYLI-CoA

0X COOH

PENISILLIINI G 15

O H

HXXX II I r„ ΑΑ/“-Νν-^\/Η3 CL) H2N r-f T-ch3 20 4—N-\

O COOH

ISOPENISILLIINI N CIPN) • · · • « • t · • · · • · · • · • · • · • · · * · • · e • · · · • · · • o · • * · « « « « · « · « « • · · • · · • « 15 106965

ISOPENISILLIIN N

(IPN)

5 IPN-EPIMERAASI

’ CD) 10

„ OH FENYYLIASETYYLI-CoA

2 \ 11 1 OH

XA/-NV_/ 3 Y]

15 θ/ COOH

PENISILLIINI N

20 PENISILLIINI N

-ESPANDAASI

1 ’ • « · • · · • » · • * • « • · • · • «· « • c « r o * · · 9 * < · • * ·

• « C

• · • · · * · · • · • · • · · • · · « · • ·

«M

16 106965 ' ™· IVvi-ϊ^

COOH

f 15 DEASETOKSIKEFALOS-

PORAANIHAPPO

(DAOC) 20

DADC-3'-HYDROKSYLAASI

<r « • t • · · • · · • « ♦ ♦ • · • · · * • « C r ~ • ··> t r « • · · • O · • « « « < < f · • · M· • · • · · • 1 · • · · · • · 17 106965 CD) «2n\ m ? 5 o Y ch2oh

COOH

10 DEASETOKSIKEFALOS-PORAANIHAPPO (DÄC) 15 ’ DAC-ASETYYLI-* TRANSFERAASI .

'1 20 :::? 25 CD) Π ? · j·· o v o y ch,occh3

• 30 - I

:·* ‘ COOH

KEFALOSPORIINI C

r r t < < * t i « «

« I

< < < a · ·

• « « a « t M

4 4 4 18 106965

Keksinnön yhteenveto Tämä keksintö koskee uutta biologista menetelmää 7-aminodeasetyylikefalosporaanihapon (7-ADAC:n) valmistamiseksi, joka menetelmä käsittää seuraavat vaiheet: 5 1) pidetään yllä isopenisilliini N:ää tuottavaa

Penicilliim chrysogenum -kantaa sen kasvun ylläpitoon kykenevässä kasvualustassa ja lisätään mainittuun kasvualustaan adipaattiravintoa, joka käsittää yhtä tai useampaa adipiinihapon tai sen suolojen ja estereiden joukosta, 10 joita mainittu Penicillium chrysogenum -kanta pystyy assimiloimaan ja hyödyntämään adipoyyli-6-aminopenisillaaniha-pon (adipoyyli-6-APA:n) tuottamiseksi, jolloin syntyy mainittua adipoyyli-6-APA:ta; 2) toteutetaan seuraavat entsymaattiset muuttamiset 15 vastaavan geenin in situ -ilmentymisen kautta: a) laajennetaan adipoyyli-6-APA:n rengasta in situ, niin että muodostuu adipoyyli-7-aminodeasetoksikefalospo- raanihappoa (adipoyyli-7-ADCA:ta) ekspandaasientsyymin vaikutuksesta, jolloin mainittu P. chrysogenum -kanta on 20 transformoitu DNA:11a, joka koodittaa ekspandaasientsyymi- aktiivisuutta, jolla on kyky hyväksyä mainittu adipoyyli- 6-APA substraatiksi, jolloin kyseisen DNA:n ilmentymisen seurauksena mainitun kannan tuottaman mainitun adipoyyli- 6-APA:n rengas tulee sen jälkeen myös laajennetuksi in 25 situ, niin että muodostuu adipoyyli-7-ADCA:ta; jv. b) hydroksyloidaan adipoyyli-7-ADCA:n 3-metyylisi- • · j. ‘ vuketju in situ, niin että syntyy adipoyyli-7-aminodease- ' . tyylikefalosporaanihappoa (adipoyyli-7-ADAC:tä) hydroksy- laasientsyymin vaikutuksesta, jolloin mainittu P. chryso- ··<1 30 genum -kanta on transformoitu DNA:11a, joka koodittaa hyd- ··· V · roksylaasientsyymiaktiivisuutta, jolla on kyky hyväksyä mainittu adipoyyli-7-ADCA substraatiksi, jolloin kyseisen DNA:n ilmentymisen seurauksena mainitun kannan tuottama "1: mainittu adipoyyli-7-ADCA tulee sen jälkeen myös hydroksy- « i » , 35 loiduksi in situ, niin että muodostuu adipoyyli-7-ADAC: tä; «Il « 1 « « « I | <

« I

« I

< « I

« · « « « « · « « 4 « · < · « · « · · 106965 3) saatetaan mainittu adipoyyli-7-ADAC kosketukseen adipoyyliamidaasin kanssa, jolloin adipoyylisivuketju poistuu ja muodostuu 7-ADAC-tuote; eristetään sitten mainittu tuote.

5 Tämä keksintö koskee lisäksi uutta biologista mene telmää 7-aminokefalosporaanihapon (7-ACA:n) valmistamiseksi, joka menetelmä käsittää seuraavat vaiheet: 1) pidetään yllä isopenisilliini N:ää tuottavaa Penicillium chrysogenum -kantaa sen kasvun ylläpitoon ky- 10 kenevässä kasvualustassa ja lisätään mainittuun kasvualustaan adipaattiravintoa, joka käsittää yhtä tai useampaa adipiinihapon tai sen suolojen ja estereiden joukosta, joita mainittu Penicillium chrysogenum -kanta pystyy assimiloimaan ja hyödyntämään adipoyyli-6-aminopenisillaaniha-15 pon (adipoyyli-6-APA:n) tuottamiseksi, jolloin syntyy mainittua adipoyyli-6-APA:ta; 2) toteutetaan seuraavat entsymaattiset muuttamiset vastaavan geenin in situ -ilmentymisen kautta: a) laajennetaan adipoyyli-6-APA:n rengasta in situ, 20 niin että muodostuu adipoyyli-7-aminodeasetoksikefalospo-raanihappoa (adipoyyli-7-ADCA:ta) ekspandaasientsyymin vaikutuksesta, jolloin mainittu P. chrysogenum -kanta on transformoitu DNA:11a, joka koodittaa ekspandaasientsyymi-aktiivisuutta, jolla on kyky hyväksyä mainittu adipoyyli-25 6-APA substraatiksi, jolloin kyseisen DNA:n ilmentymisen « ( « seurauksena mainitun kannan tuottaman mainitun adipoyyli- • · :·. 6-APA:n rengas tulee sen jälkeen myös laajennetuksi in • · · situ, niin että muodostuu adipoyyli-7-ADCA:ta; « · . b) hydroksyloidaan adipoyyli-7-ADCA:n 3-metyylisi- « o ( ·**· 30 vuketju in situ, niin että syntyy adipoyyli-7-aminodease- • « · *·1 1 tyylikefalosporaanihappoa (adipoyyli-7-ADAC:tä) hydroksy- laasientsyymin vaikutuksesta, jolloin mainittu P. chryso- '·"· genum -kanta on transformoitu DNA:11a, joka koodittaa hyd- • · « *t>>! roksylaasientsyymiaktiivisuutta, jolla on kyky hyväksyä : 35 mainittu adipoyyli-7-ADCA substraatiksi, jolloin kyseisen M »f • · IM • · • · • · « · « « · « · · • · • · · • · • · • · « 20 106965 DNA:n ilmentymisen seurauksena mainitun kannan tuottama mainittu adipoyyli-7-ADCA tulee sen jälkeen myös hydroksy-loiduksi in situ, niin että muodostuu adipoyyli-7-ADAC:tä; c) asetyloidaan adipoyyli-7-ADAC in situ, niin että 5 muodostuu adipoyyli-7-aminokefalosporaanihappoa (adipoyy-li-7-ACA:ta) asetyylitransferaasientsyymin vaikutuksesta, jolloin mainittu P. chrysogenum -kanta on transformoitu DNA: 11a, joka koodittaa asetyylitransferaasientsyymiaktii-visuutta, jolla on kyky hyväksyä mainittu adipoyyli-7-ADAC 10 substraatiksi, jolloin kyseisen DNA:n ilmentymisen seurauksena mainitun kannan tuottama mainittu adipoyyli-7-ADAC tulee sen jälkeen myös asetyloiduksi in situ, niin että muodostuu adipoyyli-7-ACA:ta; 3) saatetaan mainittu adipoyyli-7-ACA kosketukseen 15 adipoyyliamidaasin kanssa, jolloin adipoyylisivuketju poistuu ja muodostuu 7-ACA-tuote; eristetään sitten mainittu tuote.

Seuraavilla termeillä on tässä käytettyinä seuraa-vat merkitykset: 20 "7-ACA" tarkoittaa 3-[(asetoyylioksi)metyyli]-7- amino-8-okso-5-tia-l-atsabisyklo[4.2.0]okt-2-eeni-2-kar-boksyylihappoa; "adipoyyli-6-APA" tarkoittaa [2S-(2a,5a,6S)]-3,3-dimetyyli-7-okso-6-[(heksaani-1,6-dioyyli)amino]-4-tia-l-25 atsabisyklo[3.2.0]heptaani-2-karboksyylihappoa; « « · "adipoyyli-7-ADCA" tarkoittaa 3-metyyli-7-[ (heksaa- • · ;·. ni-l,6-dioyyli)amino]-3-metyyli-8-okso-5-tia-l-atsabisyk- • «· lo[4.2.0] okt - 2 - eeni - 2 - karboksyy 1 ihappoa; C (k , "adipoyyli-7-ADAC" tarkoittaa 3-hydroksimetyyli-7- 30 [(heksaani-1,6-dioyyli)amino]-3-metyyli-8-okso-5-tia-l- • · · *·1 ‘ atsabisyklo[4.2.0]okt-2-eeni-2-karboksyylihappoa.

Tämä keksintö koskee erityisesti uusia biologisia « menetelmiä edellä mainittujen 7-aminodeasetyylikefalospo- • « · *t<>! raanihapon (7-ADAC:n) ja 7-aminokefalosporaanihapon (7- ,·] : 35 ACA:n) valmistamiseksi, joissa adipaattiravinto on dinat- • »i • ·

• M

• · • · <1 · · · • 1 · • « I « 1 « « · • » • · « · · 21 106965 riumadipaatti, ekspandaasiensyymi-, hydroksylaasientsyymi-ja asetyylitransferaasientsyymiaktiivisuuksia koodattavat DNA:t ovat kaikki peräisin Cephalosporium acremoniumista ja adipoyyliasylaasi on peräisin Pseudomonas-lajista.

5 Tämä keksintö koskee lisäksi yhdistelmä-DNA-ilmen- tymisvektoreita, jotka käsittävät Cephalosporium acremoniumista peräisin olevaa DNA:ta, joka koodittaa ekspandaa-si-, hydroksylaasi- ja asetyylitransferaasientsyymiaktii-visuuksia, ja promoottoreja, jotka ohjaavat mainittuja 10 entsyymejä koodittavien geenien ilmentymistä, ja jotka vektorit käsittävät plasmideja pPEN/CEPH-1, pPENCACT ja pTS-8, kuten kuvataan jäljempänä.

Tämä keksintö koskee lisäksi Penicillium chrysoge-num -isäntäsoluja, jotka on transformoitu yhdistelmä-DNA-15 ilmentymisvektoreilla, jotka käsittävät Cephalosporium acremoniumista peräisin olevaa DNA:ta, joka koodittaa eks-pandaasi-, hydroksylaasi- ja asetyylitransferaasientsyymi-aktiivisuuksia, ja mainitun entsyymejä koodittavan DNA:n ilmentymistä ohjaavan promoottorin, joka käsittää Penicil-20 lium chrysogenumin IPNS-geenin promoottorin. Tämä keksintö koskee erityisesti Penicillium chrysogenum -isäntäsoluja, jotka on transformoitu yhdistelmä-DNA-ilmentymisvektoreil-la, jotka käsittävät plasmideja pPEN/CEPH-1, pPenCACT ja pTS-8, kuten kuvataan jäljempänä.

25 Tämä keksintö koskee vielä lisäksi menetelmää Peni- ti* JV. cillium chrysogenum -rekombinantti-isäntäsolujen viljele- • · miseksi geenien ilmentymisen kannalta sopivissa olosuh- • »· t#,,j teissä, jolloin mainitut rekombinantti-isäntäsolut käsit- « o . tävät yhdistelmä-DNA-ilmentymisvektoreita, jotka käsittä- ***; 30 vät Cephalosporium acremoniumista peräisin olevaa DNA:ta, • · » *·' “ joka koodittaa ekspandaasi-, hydroksylaasi- ja asetyyli- transferaasientsyymiaktiivisuuksia, ja mainitun entsyymejä 1 koodittavan DNA:n ilmentymistä ohjaavan promoottorin, joka c c t ‘tJts käsittää Penicillium chrysogenumin IPNS-geenin promootto- t ; 35 rin. Tämä keksintö koskee erityisesti menetelmää Penicil-

< CC

♦ I I

« « I <

UI

• < · « · t « * * * « «41 « · « « 4 · * 106965 22

Hum chrysogenum -rekombinantti-isäntäsolujen viljelemiseksi geenien ilmentymisen kannalta sopivissa olosuhteissa, jolloin mainitut rekombinantti-isäntäsolut käsittävät yhdistelmä-DNA-ilmentymisvektoreita, jotka käsittävät 5 plasmideja pPEN/CEPH-1, pPENCACT ja pTS-8, kuten kuvataan jäljempänä.

Keksinnön yksityiskohtainen kuvaus Tämä keksinnön tärkeimpänä puolena uusi biologinen menetelmä 7-aminokefalosporaanihapon (7-ACA:n) ja 7-amino-10 deasetyylikefalosporaanihapon (7-ADAC:n), synteettisten kaupallisten kefalosporiinien valmistuksessa avainasemassa olevien välituotteiden, valmistamiseksi, jotka välituotteet voidaan esittää seuraavilla rakennekaavoilla: 15 H2N-TYSV1

COOH COOH

Kefalosporiiniytimen lisäksi 7-ACA:n tunnusmerkillisiä 20 piirteitä ovat 7-aminoryhmä ja 3-asetyylioksimetyyliryhmä (eli useammin käytetyltä nimeltään 3-asetoksimetyyliryh-mä). 7-aminoryhmä on ryhmä, joka voidaan muuttaa miten #***; moneksi tahansa johdannaissivuketjuksi ja muodostaa siten perustan erilaisten kaupallisten kefalosporiinien synteti- • i :·. 25 soinnille. 3-asetyylioksimetyyliryhmä muutetaan usein jok- • · · sikin muuksi sivuketjuksi kaupallisen kefalosporiinin syn-tetisoimiseksi.

« e c ··*' Tämän keksinnön mukaisen menetelmän 7-ACA-lopputuo- *»' ’ tetta ja adipoyyli-7-ACA-välituotetta voidaan verrata ke- 30 falosporiini C:hen, erääseen toiseen kefalosporiiniväli- c tuotteeseen, joka voidaan esittää seuraavalla rakannekaa-·”*; valla: CD) H2N>N^^C-H2N-|--r^Svi

35 hooc ^ S

: V: O γ CH2OCCH3

COOH

• ♦ ♦ 106965 23 Tämän välituotteen ollessa kyseessä 7-(D)-a-adipoyylisivu-ketju ei sovellu synteettiseen johdannaisen valmistukseen, ja se täytyy lohkaista hyväksyttävän 7-aminoryhmän aikaansaamiseksi. 7-(D)-a-adipoyylisivuketju on ikävä kyllä aina 5 osoittautunut vaikeaksi poistaa sekä kemiallisin että biokemiallisin keinoin.

Määritelmät Käytettyinä tässä selityksessä ja erityisesti osassa, jonka otsikkona on Edullisten suoritusmuotojen kuvaus, 10 seuraavilla termeillä on seuraava merkitys: 7-ACA 7-aminokefalosporaanihappo 7-ADAC 7-aminodeasetyylikefalosporaanihappo 7-ADCA 7-aminodeasetoksikefalosporaanihappo 6-APA 6-aminopenisillaanihappo 15 DAOC deasetoksikefalosporaanihappo DAOCS DAOC-syntetaasi

DAC deasetyylikefalosporiini C

DACS DAC-syntetaasi IPNS isopenisilliini N -syntetaasi 20 Tris Tris[hydroksimetyyli]aminometaani EDTA etyleenidiamiinitetraetikkahappo DEPC dietyylipyrikarbonaatti .,. TE Tris-EDTA-puskuri < SSC suolaa (natriumkloridia) ja natriumsit-

• I

• ·1 25 raattia sisältävä puskuri • » • 2 SDS natriumdodekyylisulfaatti PEG polyeteeniglykoli.

Penicillium chrysogenum -viljelmä :1Γ: Tämän keksinnön mukaisen menetelmän ensimmäinen « 30 vaihe käsittää vaiheen, jossa pidetään yllä isopenisillii-....: ni N:ää tuottavaa Penicillium chrysogenum -kantaa sen kas- .···. vun ylläpitoon kykenevässä kasvualustassa ja lisätään mai- nittuun kasvualustaan adipaattiravintoa, joka käsittää • '« yhtä tai useampaa adipiinihapon tai sen suolojen ja este- « « « 35 reiden joukosta, joita mainittu Penicillium chrysogenum • · • « · • « · • · · · • « « · 2 « · · 106965 24 -kanta pystyy assimiloimaan ja hyödyntämään adipoyyli-6-APA:n tuottamiseksi. Adipaattiravinto voidaan lisätä kasvualustaan P. chrysogenumilla tehdyn inkokuloinnin jälkeen, mutta on edullista, että sitä on läsnä kasvualustas-5 sa jo inokulointihetkellä.

Muut suvut kuin Penicillium, esimerkiksi Aspergillus nidulans, samoin kuin muut Penicillium-suvun lajit chrysogrenum-lajin ohella tuottavat isopenisilliini N:ää. Kaikki isopenisilliini N:ää runsaimmin tuottavat kannat on 10 kuitenkin kehitetty hyvin tunnetuin kannanjalostusmenetel-min chrysogenum-lajista. Siten tämä keksintö on käytännöl-lisyysnäkökohtien valossa rajoitettu Penicillium chrysoge-num -kantoihin, vaikka sen sovellettavuus muihin lajeihin on ilmeistä. Mikä tahansa tallennettu Penicillium chryso-15 genum -kanta tai muu julkisesti saatavissa oleva mainitunlaisen kannan lähde on sopiva lähtökohta tämän keksinnön mukaisen menetelmä toteuttamiselle.

Kasvualusta, jolla on kyky pitää yllä isopenisilliini N:ää tuottavan Penicillium chrysogenum -kannan kas-20 vua, on tyyppiä, jonka pitäisi olla hyvin tuttu ammattimiehelle. Viljely toteutettaisiin esimerkiksi aerobisella uppofermentoinmenetelmällä ja käytettävä kasvualusta va-... littaisiin joukosta saatavissa olevia sopivia alustoja.

Tyypillisissä kasvualustoissa käytetään hiililähteitä, : ·“ 25 kuten sakkaroosia, glukoosia ja tärkkelystä; typpilähtei-< < : ** tä, kuten soijajauhoa ja -suurimoita, puuvillansiemenöl- jyä, maapähkinäjauhoa ja eri aminohappoja ja niiden seok-tt1«1 siä ja peptoneja. Tuotantoa koskevissa vaatimuksissa ko- ;T: rostetaan saantoa ja eristämisen helppoutta, ja siten 30 edullisia alustoja mainitunlaisiin tilanteisiin voivat olla alustat, joissa on melassia hiililähteenä ja soija-.···, jauhoa ja aminohappoja typpilähteenä.

Kasvualustaan lisätään yleensä epäorgaanisia ravin-

I I

*. 1 1: tosuoloja, ja niihin kuuluvat suolat, joilla on kyky antaa i ♦ · 35 seuraavia ionikomponentteja: natriumia, kaliumia, ammoniu- • · · • 1 « • · M • · • · 106965 25 mia, kalsiumia, fosfaattia, sulfaattia, kloridia, bromi-dia, nitraattia, karbonaattia, rauta(II):a, rauta(III):a, magnesiumia, mangaania jne. Myäs hivenaineet ovat tavallisesti välttämättömiä Penicillium chrysogenumin kasvulle, 5 kehittymiselle ja metabolialle, ja niitä voidaan lisätä suoraan kasvualustaan, ellei niitä ole jo tullut mukaan pääasiassa kasvualustan muiden aineosien epäpuhtauksina.

Penicillium chrysogenum -kantoja voidaan viljellä laitteissa, joiden tilavuus on pieni, kuten 1 l:n ravis-10 tuspulloissa, kun halutaan tuottaa vain pieniä määriä adi-poyyli-7-ACA:ta ja loppujen lopuksi 7-ACA:ta. Kun halutaan suurempia määriä adipoyyli-7-ACA:ta, käytetään kuitenkin suuria fermentointisäiliöitä aerobisissa uppofermentointi-olosuhteissa.

15 Toteutettaessa suurimittainen adipoyyli-7-ACA:n valmistus, pidetään Penicillium chrysogenum -kannan itiöitä yllä agarvinopinnalla. Vinopinnalta peräisin olevia itiöitä käytetään pienitilavuuksisen vegetatiivisen alustan inokulointiin. Vegetatiivista alustaa inkuboidaan sa-20 kean, tuoreen, aktiivisesti kasvavan mikro-organismiviljelmän tuottamiseksi. Tätä vegetatiivista kasvustoa käytetään sitten suurimittaiseen fermentointiin käytettävän ... alustan inokulaattina. Tietyissä tapauksissa voi olla toi- • > vottavaa sisällyttää vielä yksi vegetatiivinen lisäalusta • · « ' 25 käytettäväksi fermentointialustan inokulaattina. Tällaisia ; ** toisen vaiheen vegetatiivisia alustoja käytetään yleises- ·*’· ti, kun fermetointialustan tilavuus on merkittävästi suu- ..*** rempi kuin ensimmäisen vegetatiivisen alustan. Tällä ta- : valla mikro-organismin itiöitä viljellään ensin pienessä 30 tilavuudessa vegetatiivista alustaa, niin että saadaan •j··j inokulaatti tilavuudeltaan suurempaa vegetatiivista alus- .···. taa varten. Tilavuudeltaan suurempi vegetatiivinen alusta antaa sitten riittävän mikro-organismipitoisuuden käymisen '· *·* käynnistämiseksi nopeasti suuressa fermentointisäiliössä.

« 4 · 35 Vegetatiivisella alustalla voi olla sama koostumus kuin « « 4 I | • · • · « « · « · 106965 26 fermentointialustalla, tai se voi sisältää lisäaineosia mikro-organismien kasvun ja kehityksen edistämiseksi pienimittaisessa viljelyssä.

Tämän keksinnön mukaisen menetelmän yhteydessä käy-5 tettäviä Penicilliim chrysogenum -kantoja viljellään tehokkaimmin suunnilleen lämpötilassa 20 - 30 °C, mutta optimaalisia saantoja saadaan lämpötilan ollessa noin 22 - 28 °C, edullisesti noin 25 °C.

Adipoyyli-7-AVA:n maksimituotanto tapahtuu, kun 10 Penicilliim chrysogenum -kantaa viljellään suurissa säiliöissä noin 10 - 30, edullisesti 15 - 25 vuorokautta. Tehtäessä viljely pienissä laitteissa, kuten 250 ml:n ravis-tuspulloissa, mikro-organismin kasvu on kuitenkin nopeampaa ja se tuottaa adipoyyli-7-ACA:ta lyhyemmässä ajassa, 15 esimerkiksi 4-15, usein 5-7 vuorokaudessa.

Jos loppu-pH saavuttaa tai ylittää arvon 8,0 suurissa fermentointisäiliöissä, voi adipoyyli-7-ACA:n saanto heikentyä. Tällaisissa tilanteissa on toivottavaa seurata kasvualustan pH:ta koko fermentoinnin ajan. Jos käy ilmi, 20 että pH saavuttaa mainitunlaisia tasoja ennen adipoyyli-7-ACA:n maksimituotannon tapahtumista, pH:ta voidaan säätää kätevästi alaspäin lisäämällä fermentointialustaan sopivaa ... happoa tai puskurointiainetta.

Adipoyyli-7-ACA:n tuotantoa voidaan seurata testaa-

* » I

25 maila fermentointilieminäytteitä kromatografisesti.

« · * ’* Kuten useimpien aerobisten uppofermentointien yh- * * teydessä, kasvualustan läpi johdetaan steriiliä ilmaa ..li* Penicillium chrysogenum -kannan tehokkaamman kasvun ja « « « J.i · adipoyyli-7-ACA:n kohonneen tuotannon aikaansaamiseksi.

30 Kasvualustan läpi pakotettavan ilman tilavuus on tavalli- ·;··« sesti vähintään noin 0,2 kertaa kasvualustan tilavuus il- .***. maa minuutissa. Suuremmalla ilmansyöttönopeudella voi kui- / , tenkin usein olla suotuisa vaikutus adipoyyli-7-ACA:n tuo- ‘ * ' · tantoon.

< < « r t t < « « 106965 27

Penicilliim chrysogenim -kanta tuottaa adipoyyli- 7-ACA:n lisäksi tyypillisesti monia sivu- ja metabolia-tuotteita. Koska jotkut näistä ovat pysymättömiä happamis-sa olosuhteissa, on otettaessa talteen adipoyyli-7-ACA 5 fermentointialustasta toivottavaa pitää koko fermentointi-lientä happamassa pH:ssa lyhyen aikaa joidenkin tuotteen ohessa syntyneiden epäpuhtauksien tuhoamiseksi. Adipoyyli-7-ACA-fermentointituote otetaan talteen siten käsitellystä, suodatetusta fermentointiliemestä ja se voidaan mah-10 dollisesti erottaa fermentointialustan muista komponenteista kromatografisesti ioninvaihtohartsilla ja lisäpuh-distaa tarvittaessa kromatografisesti ennen myöhempää vaihetta, adipoyylisivuketjun entsymaattista lohkaisua. On myös mahdollista tehdä mainitunlainen ionivaihtokromato-15 grafiaerotus sivuketjun lohkaisun toteuttamisen jälkeen.

Yksi tärkeimmistä sivutuotteista, joka merkitsee erotuson-gelmia, on adipoyyli-6-APA, ja tämä sivutuote on mahdollista hajottaa kemiallisesti tai entsymaattisesti erotuksen helpottamiseksi. Suodatetulle fermentointiliemelle 20 toteutetaan ensin alustava puhdistusmenettely, joka voi sisältää alku-uuton veteen sekoittumattomalla orgaanisella liuotteella, kuten n-butanolilla tai amyyliasetaatilla, epäpuhtauksien poistamiseksi. Uutettu liemi voidaan sitten jatkopuhdistaa alustavasti käsittelemällä kromatografises- : 25 ti aktiivihiilellä.

« I

: *·· Adipaattiravinnon lisäys

Muodostettaessa fermentointiviljelmä Penicilliim chrysogenxmla varten edellä kuvatulla tavalla, ts. ennen inokulointia, lisätään edullisesti adipaattiravintoa fer- • 30 mentointikasvualustan muihin aineosiin. Adipaattiravinto voidaan mahdollisesti lisätä jollakin hetkellä inokuloin- • · .···. nin jälkeen, esimerkiksi 1, 2 ja/tai 3 vuorokauden kulut- tua inokuloinnista. Adipaattiravinto määritellään yhdeksi tai useammaksi adipiinihapon tai adipiinihapposuolojen tai 35 -estereiden joukosta, joita viljeltävä Penicilliim chryso- < t e t * « I « i ( ( t 106965 28 genum -kanta pystyy assimiloimaan ja hyödyntämään adipoyy-li-6-APA:n tuottamiseksi. Adipiinihappoa ja sen suoloja ja estereitä voidaan käyttää yksinään tai minä tahansa yhdistelminä. Dinatriumsuola on edullinen, vaikka kaliumsuolat 5 ja natriumia sisältävät sekasuolat olisivat myös sopivia. Metyyliesteriä voitaisiin käyttää, mutta etyyliesteri on veteen liukenematon. Adipiinihapon suolan tai esterin täytyy olla sellainen, että Penicillium chrysogenum -kanta pystyy assimiloimaan ja hyödyntämään sitä adipoyyli-6-10 APAtn tuottamiseksi. Itse adipiinihappo saattaisi esimerkiksi olla sopiva, vaikka se on veteen liukenematonta, jos asianmukaisissa pH-olosuhteissa muodostuu assimiloitavissa oleva suola.

Sopivat ekspandaasi- ja/tai hydroksylaasientsyymit 15 Penicillium chrysogenum -kanta, jota on viljelty ja jolle on annettu edellä kuvatun kaltaista adipaattiravin-toa, niin että se tuottaa adipoyyli-6-APA:ta, on myös kanta, joka on transformoitu ekspandaasi- ja hydroksylaasi-entsyymiaktiivisuuksia koodattavalla DNA:11a, minkä jäl-20 keen tämän DNA:n ilmentymisen seurauksena mainitulle adi-poyyli-6-APA:lie tapahtuu in situ renkaan laajentuminen, jolloin muodostuu adipoyyli-7-ADCA:ta, ja tapahtuu myös 3-... metyylisivuket jun muuttuminen 3-hydroksimetyylisivuket j uk- si.

« « I

·' 25 Adipaattiravinnon läsnä ollessa viljelty Penicil- « « • ** liian chrysogenum tuottaa adipoyyli-6-APA: ta solunsisäises- * 1 ti. Kyseisessä solunsisäisessä ympäristössä, ts. in situ, ..1·1 myös ekspandaasi- ja hydroksylaasientsyymiaktiivisuuksia « « « V : koodittava DNA ilmentyy transformoidussa Penicillium chry- 30 sogenumissa, minkä jälkeen nämä entsyymit toimivat sub- ·;··· straattina olevalla adipoyyli-6-APA: 11a ja saavat aikaan .**·. sen renkaan laajennuksen, niin että muodostuu adipoyyli-7- « « « / > ADCA:ta, joka sitten hydroksyloituu adipoyyli-7-ADAC:ksi *· 1·1 (adipoyyli-7-aminodeasetyylikefalosporaanihapoksi ) .

• · • · · « « « « · ♦ · ♦ » « · ♦ « · • ♦ • · · 106965 29 Tämän keksinnön mukaisen uuden biologisen menetelmän piiriin kuuluu edellä kuvattua tyyppiä olevan Penicil-lium chrysogenum -kannan transformointi millä tahansa eks-pandaasi- ja hydroksylaasientsyymiaktiivisuuksia kooditta-5 valla DNA:11a, minkä jälkeen kyseisen DNA:n ilmentymisen seurauksena adipoyyli-6-APA:lle tapahtuu in situ renkaan laajentuminen, jolloin muodostuu adipoyyli-7-ADCA:ta, ja sitten hydroksylaatio, jolloin muodostuu adipoyyli-7-ADAC:ta. Niinpä DNA:n, jolla Penicillium chrysogenum 10 transformoidaan, tulee ilmentyä entsyymeinä, joilla ei ole pelkästään ekspandaasientsyymiaktiivisuutta sanan alalla käytetyssä merkityksessä, ts. kykyä tehdä isopenisilliini N: lie renkaan laajennus DAOC:ksi, vaan myös kyky tehdä adipoyyli-6-APA:lle renkaan laajennus adipoyyli-7-15 ADCA:ksi. Lisäksi hydroksylaasientsyymillä tulee olla kyky hydroksyloida adipoyyli-7-ADCA adipoyyli-7-ADAC:ksi.

Kahta vaihtoehtoista lähestymistapaa pidetään sopivina keksinnön suoja-alan piirissä olevina suoritusmuotoina sen suhteen, millä tavoin ekspandaasi- ja hydroksylaa-20 sientsyymiaktiivisuudet saadaan aikaan. Toisessa suoritusmuodossa, joka on edullinen, ekspandaasi- ja hydroksylaa-sitoiminnot toteuttaa aktiivisuus, joka on Cephalosporium ... acremoniumiin yhden, tosin käytännöllisesti katsoen kaksi- • · toimisen, P. chrysogenumin transformointiin käytetyn gee- • · « 25 nin ilmentymistuote. Tätä geeniä, jonka ilmentyminen saa • · • ” aikaan sekä ekspandaasi- että hydroksylaasiaktiivisuuden, ’ * kutsutaan tässä ekspandaasi-hydroksylaasigeeniksi ja vas- taavaa geeni tuotetta ekspandaasi-hydroksylaasientsyy- ··· : m(e)iksi. Kun P. chrysogenum transformoidaan Cephalospo- 30 rium acremoniumista peräisin olevalla ekspandaasi-hydrok-·;··! sylaasiaktiivisuutta koodittavalla DNA: 11a, tämän aktiivi- .**·. suuden ilmenemistä ohjaa yksi promoottorisekvessi, mikä • · « / _ osoittaa yhden geenin läsnäolon.

• · ♦ ’· Tämän keksinnön vaihtoehtoisessa suoritusmuodossa, 35 joka on yhtä sopiva, transformoidaan P. chrysogenum -isän- • · « · f < * * · * i · < 4 « < « so 106965 tä DNA:11a, joka koodittaa ekspandaasi- ja hydroksylaasi-aktiivisuuksia erillisinä geeneinä eikä yhtenä ekspandaa-si-hydroksylaasigeeninä. Tulisi huomata, että erillisiä ekspandaasi- ja hydroksylaasigeenejä ja niiden koodittamia 5 vastaavia entsyymiaktiivisuuksia esiintyy prokaryoottisis-sa mikro-organismeissa, kuten S. clavuligerusissa, eikä eukaryoottisissa mikro-organismeissa, kuten C. acremoniu-mlssa, joissa on kooditettuna yksi ekspandaasi-hydroksy-laasigeeni ja -entsyymi, kuten edellä mainittiin.

10 Prokaryoottisen hydroksylaasientsyymin sekvenssiä ja sitä koodittavia nukleotideja samoin kuin keinoja mainitun entsyymin eristämiseksi kuvaavat Kovacevic et ai. [J. Bacteriol. 173(1) (1991) 398 - 400 ja julkaisu EP-A 0 465 189]. Kuten ammattimies ymmärtänee, hydroksylaasi-15 sekvenssin perusteella on mahdollista syntetisoida hyvin tunnetuin manuaalisin menetelmin tai automaatistetuilla DNA-syntetisoijilla hydroksylaasientsyymiä koodittava DNA. DNA-yhdistettä tai vaihtoehtoisia samaa hydroksylaasiami-nohapposekvessiä tai sen hydroksylaasiaktiivisuudeltaan 20 vastaavia fragmentteja tai johdannaisia koodittavia sekvenssejä voidaan puolestaa käyttää pohjana erilaisten kloonaus- ja ilmentymisvektorien valmistamiseksi promoot- ... tori- ja muihin säätelysekvensseihin yhdistettyinä, joilla • vektoreilla on sitten mahdollista transformoida P. chryso- » · « j ·' 25 genum -isäntä hydroksylaasientsyymin tuottamiseksi ja si-• · ' ** ten tämän keksinnön mukaisen menetelmän toteuttamiseksi.

On myös mahdollista käyttää DNA-yhdistettä koettimena, ..*·* jolla tutkitaan genomikirjastoa tai käyttökelpoista hyd- :]Γ: roksylaasientsyymiä mahdollisesti sisältävää ehdokaskantaa 30 homologisten sekvenssien identifioimiseksi hybridisäätiön ....; kautta. Siten mahdollisesti identifioidun oletetun hydrok- .···. sylaasin aktiiivisuus voidaa varmistaa käyttämällä tämän **" keksinnön mukaisen menetelmän todellista adipoyyli-7-ADCA- « « • · · *· ’·* substraattia ja eristämällä sen hydroksylaatiotuote 35 HPLC: llä.

« « • « · • · · « · II· • « I · 106965 31

Kun käytetään keksinnön tätä suoritusmuotoa, ts. yhtä geeniä, joka koodittaa vain hydroksylaasiaktiivisuut-ta, on välttämätöntä hankkia erikseen myös DNA, joka koodittaa ekspandaasientsyymiaktiivisuutta, niin että P.

5 chrysogenum voidaan transformoida sopivalla ilmentymisvek-torilla, joka mahdollistaa ekspandaasitoiminnan tuottamisen in situ, niin että saadaan aikaan tämän keksinnön mukaisen menetelmän renkaanlaajennusvaihe. Tunnetaan monia ekspandaasientsyymejä, ja sivuketjujen samankaltaisuuden 10 perusteella ajatellaan, että monet ekspandaasientsyymit toimivat tämän keksinnön mukaisen uuden biologisen menetelmän yhteydessä.

Tämän keksinnön muut käyttökelpoiset suoritusmuodot perustuvat siihen, että DNA:ta, joka koodittaa useampaa 15 kuin yhtä ekspandaasi- ja/tai useampaa kuin yhtä hydroksy-laasiaktiivisuutta, voidaan käyttää P. chrysogenum -ei-rekombinattikannan transformointiin. Mainitunlaisten suoritusmuotojen avulla on mahdollista saada aikaan parantunut ekspandaasi- ja/tao hydroksylaasiaktiivisuus, koska 20 entsymaattista proteiinia syntyy suurempia määriä.

Tekniikan tasoa kuvaavassa osassa on jo mainittu, että Streptomyces clavuligerus ATCC 27064:stä peräisin oleva ekspandaasientsyymi on sekventoitu täydellisesti < samoin kuin karakterisoitu endonukleaasirestriktiokartoi- • « t j' ·' 25 tuksella. S. clavuligerus NRRL 3585:stä peräisin olevalla • · ί ** entsyymillä, joka näyttäisi olevan sama entsyymi, on kui- tenkin raportoitu oleva erilainen moolimassa, mutta sitä ,,*·* ei ole sekventoitu. Kuten on myös kuvattu tekniikan tasoa

:T: käsittelevässä osassa, Cephalosporium acremonium ATCC

30 11550 :sta peräisin olevan DAOCS-DACS-entsyymi on myös sek- ventoitu [Samson et ai., Bio/Technology 5 (1987) 1207 -.···. 1214 ja julkaisu EP-A 0281 391].

Nämä tekniikan tason mukaisesti jo identifioidut

• 4 V

• · · *· ’·’ ekspandaasientsyymit ovat käyttökelpoisia tämän keksinnön a t« 35 mukaisessa uudessa biologisessa menetelmässä. Muut vielä a · • · * • « · a · «at « · · a a « 32 106965 identifioimattomat ekspandaasientsyymit, jotka ovat peräisin eri S. clavuligerus tai C. acremonium -kannoista tai jopa eri sukujen mikro-organismeista, voivat myös osoittautua soveltuviksi tämän keksinnön mukaisen uuden biolo-5 gisen menetelmän toteuttamiseen. Menettelyt tällaisten uusien mikro-organismikantojen ja -sukujen identifioimiseksi ja oletettujen ekspandaasientsyymien eristämiseksi ja sen toteamiseksi, että ne soveltuvat käytettäviksi tämän keksinnön mukaisessa menetelmässä, ovat yksinkertaisia 10 ja ammattimiehen taitojen piirissä. Ehdokkaina olevien uusien käyttökelpoisten mikro-organismikantojen ja -sukujen seulonta voidaan tehdä luotettavasti ja toistettavasti lisäämällä mainittuja uutteita adipoyyli-6-APA-substraat-tiin tunnettujen DAOCS-kofaktoreiden läsnä ollessa, joihin 15 kuuluvat rauta (Fe21 2) -ionit, askorbaatti, a-ketoglutaraat-ti ja adenosiinitrifosfaatti (ATP). Adopyyli-6-APA:ta voidaan valmistaa riittäviä määriä antamalla adipaattiravin-toa transformoimattomalle Penicillium chrysogenumille jäljempänä yksityiskohtaisesti kuvattua tapaa vastaavalla 20 tavalla. Haluttua ekspandaasi (tai ekspandaasi-hydroksy-laasi) -entsyymiä on läsnä, jos muodostuu adipoyyli-7-ADCArta ja/tai adipoyyli-7-ADAC:tä, joiden läsnäolo voi-... daan detektoida kromatografisesti.

On myös mahdollista muodostaa, hyvin tunnettuja *' 25 yhdistelmä-DNA-menetelmiä käyttämällä, DNA-koettimia, jot- • · ka perustuvat esimerkiksi S. clavuligerusista tai C. acre- * ’ moniumista peräisin olevien ekspandaasigeenien nukleotidi- * sekvensseihin, tämän keksinnön mukaisessa menetelmässä • · « V · käytettäväksi soveltuvaa ekspandaasia todennäköisesti 30 tuottavan mikro-organismiehdokkaan DNA-sisällön tutkimista ····· varten.

.3. Ekspandaasi-, hydroksylaasi- ja ekspandaasi-hydrok- , sylaasientsyymien potentiaaliset lähteet • ♦ « ’· 1·1 Kuten jo mainittiin, ekspandaasientsyymit ovat ent- • « 35 syymejä, jotka katalysoivat penaamirengasrakenteiden (joi- • « * # « • » · • · · · 2 • φ « · 3

Ml 106965 33 ta esiintyy penisilliinityyppisissä molekyyleissä) laajenemista kef-3-eemirenkaiksi (jollaisia esiintyy kefalospo-riineissa). Mikä tahansa organismi, joka tuottaa kefeemi-renkaan sisältäviä moetaboliatuotteita, on siksi ekspan-5 daasia koodittavan DNA:n potentiaalinen lähde. Samoin mikä tahansa organismi, joka tuottaa 3-hydroksimetyyliryhmän sisältäviä kefalosporiineja, on hydroksylaasia (tai eks-pandaasia-hydroksylaasia) koodittavan DNA:n potentiaalinen lähde. Seuraavassa luetellaan esimerkkejä mainitunlaisista 10 organismeista, mutta tämä luettelo on ainoastaan esimerkinomainen eikä sitä tule pitää kattavana:

Sienet

Cephalosporixm acremonium Cephalosporlum sp.

15 Emericellopsis

Paecilomyces Scopulariosis Diheterospora Spiroidium 20 Άnoxiopsis

Aktinomyseetat Streptomyces clavuligerus ... S. lipmanii S. wadayamensis • « « • ·' 25 S. todor omens is « · * · ** S. filipinensis cephamycini S. heteromorphus ..*♦* S. panayensis S. griseus 30 S. cattleya

Nocardia lactamdurans • · .···, Muut bakteerit

Flavobacterium sp.

• « « *· *: Rlcaligenes denitrifleans • · · 35 Mycoplana huilata • « « « « • · · « % # · · « · • « i ·« 106965 34

Providencia rettgeri Lysobacter lactamgenus

Edellä lueteltujen organismien ekspandaasit ja hyd-roksylaasit ovat ainoastaan ehdokkaita jatkotutkimuksiin, 5 ja on mahdollista, etteivät ne kaikki sovellu tämän keksinnön mukaiseen uuteen menetelmään.

Ekspandaasiaktiivisuutta koodittavien DNA-fragmenttien eristäminen

Kun on detektoitu halutun ekspandaasientsyymin läs-10 näolo edellä kuvatulla tavalla, ovat menettelyt ekspandaa-sientsyymiaktiivisuutta koodittavan DNA:n eristämiseksi myös yksinkertaisia ja alalla hyvin tunnettuja. Konstruoidaan ekspandaasientsyymejä koodittavien geenien tunnettuihin sekvensseihin ja osasekvensseihin perustuvia DNA-15 koettimia, jotka hybridisoituvat eristettävän haluttua entsyymiä koodittavan DNA:n kanssa.

Mainitunlaisten koettimien konstruointi perustuu siihen, että tunnetaan ekspandaasientsyymin aminohapposekvenssi ja sitä koodittava nukleotidiemässekvenssi samoin 20 kuin kyseisen mikro-organismin suosimat kodonit. Tämän tyyppisiä tyypillisiä menettelyjä sovellettuina Streptomy-ces clavullgerus ATCC 27064:n genomi-DNA:han kuvataan jäl-,,. j empänä.

Ekspandaasientsyymiaktiivisuutta koodittavan DNA:n • 25 eristys tehdään käyttämällä yhdistelmä-DNA-tekniikassa & t i ·· hyvin tunnettuja restriktio- ja ligaatiomenettelyjä. On *·’*· välttämätöntä hankkia kyseisen mikro-organismin genomin ,,*·* endonukleaasirestriktiokartta, niin että voidaan tuottaa Γ:*: ja eristää sopiva restriktiofragmentti. S. clavullgerus in 30 ja C. acremoniumin restriktiokartat ovat jo saatavissa; ..... niinpä ensin mainitun yhteydessä käytetään restriktioent- .···. syymejä BamHI ja Sali ja elektroforeesi antaa tulokseksi < halutut fragmentit, joiden koot ovat 1,8 ja 2,2 ke (kilo- < ’i emäsparia).

<11 < I

« I

< I <

• I

• ia • · « « · « i « « I « I « I · 35 106965

Asetyylitransferaasientsyymilähteet ja mainittua aktiivisuutta koodittavien DNA-fragmenttien eristäminen C. acremoniumin DAC-asetyylitransferaasigeenin 5 kloonaus voidaan tehdä alalla hyvin tunnetuilla yhdistel-mä-DNA-menetelmillä, joita kuvataan yleisesti heti seuraavasti .

Asetyylitransferaasigeenin kloonaamiseksi täytyy ensin muodostaa C. acremoniim -mutantteja, joilta puuttuu 10 kyky muuttaa deasetyylikefalosporaanihappo (DAC) kefalo-sporiini C:ksi. Tällaisessa prosessissa altistetaan C. acremonium -solut mutageeneille, kuten N-nitrosoguanidii-nille (NTG:lie), typpihapokkeelle tai ultraviolettisäteilylle, annetaan solujen toipua sopivalla kasvualustalla ja 15 määritetään sitten esimerkiksi kromatografisesti tai biologisesti DCA:n kerääntyminen.

Kun on identifioitu sopiva mutantti, seuraava vaihe asetyylitransferaasia koodittavan geenin identifioinnissa on C. acremonium -DNA:n eristäminen kefalosporiini C:tä 20 tuottavasta kannasta. Kun on tehty pilkkominen, joko re-striktioendonukleaasilla tai mekaanisesti, sopivan kokoisiksi fragmenteiksi, DNA sisällytetään plasmidi- tai kos-miditransformaatiovektoreihin, jotka sisältävät myös sopi-

I I I

van dominoivan markkerigeenin, kuten hygromysiini- tai

« I

y, 25 fleomysiiniresitenssigeenin. Vektorin tulisi sisältää myös i « · DNA-sekvenssejä insertoidun DNA:n myöhemmän talteenoton • · . helpottamiseksi, esimerkiksi lambda(faagi)n cos-kohtia, ««« — *;;; jotka mahdollistavat kloonatun DNA:n talteenoton in vitro • · · ’·* * -pakkauksella, jota seuraa Έ. colin infektointi, joka voi- 30 daan tehdä vakiintunein menettelyin.

Asetyylitrasnferaasi'-mutanttikannan protoplastit • · · *>#>i transformoidaan sitten käyttämällä vektoreita, jotka si- X · sältävät sattumanvaraisia genomi-DNA-fragmentteja, ja va- * 1 · !./ likoidaan transformantit antibioottiresistenssin perus- • i *.* 35 teella. Transformanteista voidaan sitten määrittää kefalo- • · • · · • · · • « • « · • · • · · « 36 106965 sporiini C -tuotannon palautuminen, joka on osoitus onnistuneesta täydentämisestä vektorin sisältämällä asetyyli-transferaasigeenillä. Mutantteja, joiden epäillään sisältävät kloonattujen geenikopioita, voidaan sitten kasvat-5 taa, eristää niiden DNA ja ottaa talteen vektori-DNA edellä kuvatulla menetelmällä. Se, että vektori todella sisältää asetyylitransferaasigeenin, voidaan varmistaa tekemällä alikloonaamus E. coliin käyttämällä tavanomaisia menettelyjä ja helposti saatavissa olevia vektoreita, minkä 10 jälkeen tehdään asetyylitransferaasi'-mutantin uudelleen-transformointi. Geeni voidaan sitten eristää, sekventoida ja käsitellä tässä esitetyissä työskentelyesimerkeissä kuvatulla tavalla käyttämällä molekyyligenetiikan ammattimiesten käyttämiä rutiinimenetelmiä.

15 Noudattamalla myös alalla hyvin tunnettuja vaihto ehtoisia menettelyjä Matsuda et ai. ovat eristäneet ja sekventoineet C. acremoniimin asetyylitransferaasiaktiivi-suutta koodittavan geenin samoin kuin päätelleet itse entsyymin aminohapposekvenssin, kuten esitetään julkaisussa 20 EP-A 0 450 758. Nämä vaihtehtoiset menettelyt koostuivat asetyylitransferaasientsyymin eristämisestä, N-terminaali-sesta aminohapposekventoinnista ja entsyymin tätä osaa koodittavan nukleotidisekvenssin päättelemisestä tämän

< « I

:v. informaation perusteella. Tämän informaation perusteella 25 muodostetaan puolestaan koettimia, jotka hybridisoituvat « « t ] ^ . koko koodattavaan sekvenssiin, mikä mahdollistaa sen eris- • · . tämisen.

• · · • ·· j Penicil1ium chrysogenum -kannan transformointi • « · *·* ' Kun on saatu ekspandaasi-hydroksylaasi-, ekspandaa- 30 si- ja hydroksylaasi- ja asetyylitransferaasiaktiivisuuk- siä koodittavat DNA-fragmentit, ne voidaan sijoittaa (li- M» gatoida) plasmidiin tai muuhun ilmentymisvektoriin yhdessä : DNA-fragmenttien kanssa, jotka käsittävät promoottoreja, < Cl translaatiota aktivoivia sekvenssejä, resistenssimarkke- « * 35 reita, säätelysekvenssejä, kosmidinmuodostajia ja mitä

C I

lii c « « i «

« I

i I

37 106965 tahansa muita DNA-sekvenssejä, jotka mahdollistavat transformaation tai edistävät sitä, ohjaavat geenien ilmentymistä tuotteina ja helpottavat transformanttien eristämistä. Siten konstruoitua ilmentymisvektoria käytetään sitten 5 Penicillium chrysogenum -kannan transformaation ja ekspan-daasi-hydroksylaasi-, ekspandaasi- ja hydroksylaasi- ja asetyylitransferaasientsyymiaktiivisuuden solunsisäisen tuotannon aikaansaantiin. Menettelyt transformaation ja ilmentymisen aikaansaamiseksi ovat alalla hyvin tunnettuko ja, ja tyypillisiä mainitunlaisia menettelyjä kuvataan yksityiskohtaisesti jäljempänä.

Kuten edellä jo kuvattiin yksityiskohtaisesti, transformoitu Penicillium chrysogenum -kanta tuottaa so-lunsisäisesti ekspandaasi-hydroksylaasi-, ekspandaasi- ja 15 hydroksylaasi- ja asetyylitransferaasientsyymiaktiivisuut- ta, jotka sitten toimivat vastaavasti in situ adipoyyli-6-APA-substraatilla ja saavat aikaan sen renkaan laajentumisen adopyyli-7-ADCA:ksi ja viimeksi mainitun hydroksy-laation adipoyyli-7-ADAC:ksi, joka sitten asetyloituu adi-20 poyyli-7-ACA:ksi.

Uusi transformantti

Ne erityiset Penicillium chrysogenum -transforman- "·. tit, jotka tuottavat ekspandaasi-hydroksylaasi- ja ekspan- « « « daasi-hydroksylaasi- ynnä asetyylitransferaasigeenien koo- • c 25 dittamia aktiivisuuksia ja jotka ovat tämän keksinnön • < « [ . edullisia suoritusmuotoja, ovat uudenlaisia suhteessa tek- , niikan tasoa vastaaviin samankaltaisiin konstruktioihin, • · · •••j kuten sellaisiin, joita kuvataan julkaisuissa Cantwell et *·1 ’ ai., Current Genetics 17 (1990) 213 - 221, EP-A 0 281 391 30 ja EP-A 0 437 378. Cantwellin konstruktiossa on Streptomy-’·"· ces clavuligerusin ekspandaasigeeni sijoitettuna P. chry- sogenumin isopenisilliini N -syntetaasi (IPNS) -promootto-t-j . rin ohjauksen alaiseksi, ja se eroaa siten tämän keksinnön mukaisista rakenteista siinä suhteessa, että siitä puuttuu • · ( it • · « « « • · · • · · · * « • «

Ml ,Q 106965 38 hydroksylaasi- tai asetyylitransferaasiaktiivisuuksia koo-dittava DNA.

Ingolia et ai. kuvaavat julkaisussa EP-A 0 281 391 P. chrysogenum -transformaatiovektoreita, jotka sisältävät 5 C. acremoniumin kaksitoimista ekspandaasi-hydroksylaasi-entsyymiä koodittavan DNA:n, jonka ilmentymistä ohjaa Penicilliumin IPNS-promoottori. Yhdessä näistä rakenteista (pPS62) ekspandaasi-hydroksylaasigeeni on fuusioitu hygro-mysiinifosfotransferaasigeenin perään ja samaan lukukehyk-10 seen sen kanssa. Geenituote, hygromysiinifosfotransferääsi :ekspandaasi-hydroksylaasifuusioproteiini, eroaa tämän keksinnön mukaisesta tuotteesta, ekspandasi-hydroksylaasi-entsyymistä, joka on olennaisilta osiltaan samanlainen kuin C. acremoniumin tuottama. Toinen julkaisussa EP-A 15 0 281 391 kuvattu vektori on konstruoitu pitkällä sarjalla molekyylimanipulaatioita, mukaan luettuna synteettisten DNA-kytkijöiden käyttö. Lopullisessa rakenteessa (pPS61) käytetään Penicilliumin IPNS-promoottorin 1,2 ke:n Ncol-fragmenttia ekspandaasi-hydroksylaasigeenin ilmentymisen 20 aikaansaantiin ja Aspergillus nidulansin asetamidaasigee-niä valikointimarkkerina Penicilliumin transformaation toteamiseksi. Ekspandaasi-hydroksylaasigeenin arginiinia ja leusiinia koodittavien kodonien 9 ja vastaavasti 10 sek-venssi muutetaan CGTCTC:stä CGCCTA:ksi, mikä ei muuta koo- < · :·. 25 ditettua aminohapposekvenssiä.

I I I

..... Tämän keksinnön mukaisessa rakenteessa 1,2 ke:n • ·

NcoI-IPNS-promoottorifragmentti on fuusioitu ekspandaasi-hydroksylaasigeeniin muuttamatta luontaista ekspandaasi- • · · *·’ hydroksylaasigeenisekvenssiä. Tämän keksinnön mukaisessa 30 rakenteessa käytetyssä IPNS-promoottorissa on kaksi eril- « *·’1· listä neljän emäksen kahdentumista luontaiseen promootto- • · · *,..ί riin nähden, toinen Sali-kohdassa 760 ep (emäsparia) ATG- : aloituskodonin edellä ja toinen Xbal-kohdassa 5 emäsparia aloituskodonin edellä 5'-pään transloitumattoman esisek- • · « « · · • · · • « · • · • · · » · * · > · · 106965 39 venssin sisällä. Nämä muutokset eivät vaikuta ekspandaasi-hydroksylaasigeenin voimakkaaseen ilmentymiseen.

Vektoreiden yhtenä lisäerona ovat käytettävät vali-kointimarkkerit. Julkaisussa EP-A 0 281 391 kuvatuissa 5 rakenteissa käytetään asetamidaasia ja hygromysiiniä vali-kointimarkkereina. Ne ovat eri markkereita kuin tämän keksinnön yhteydessä Penicllliuminille käytettävässä ekspan-daasi-hydroksylaasi-transformaatiovektorissa (pPEN/CEPH-1), joka sisältää fleomysiiniresistenssimarkkerin. Peni-10 cillium chrysogenum -kannalle, joka on transformoitu vektorilla pPEN/CEPH-1 ja jolla on kyky tuottaa ekspandaasi-hydroksylaasiaktiivisuutta, on annettu nimeksi PC200. Sen taksonomisiin piirteiisiin kuuluvat tyypillisesti laajasti leviävien, väriltään sinivihreiden - vihreiden, sileän 15 samettimaisten, keltaisia pisaroita sisältävien pesäkkeiden tuotanto; keltainen, agariin diffusoituva kääntöpuoli; haarautuneet, kaikilta osiltaan sileät konidioiden päät; soikeat - pallomaiset 3 - 4 pm:n pituiset konidiot. P. chrysogenumin kannalta hyväksyttävissä viljelyolosuhteissa 20 käytetään kiinteää alustaa, joka käsittää 1,5 % (paino/ti-lavuus) laktoosimonohydraattia; 0,5 til-% maissiuutetta; 0,5 % (paino/tilavuus) peptonia; 0,4 % (paino/tilavuus) “·. NaCl:a; 0,05 % (paino/tilavuus) MgS04*H20:a; 0,06 % (pai- no/tilavuus) KH2P04:a; 0,0005 % (paino/tilavuus) ' 25 FeCl3·6H20:a; 0,0002 % (paino/tilavuus) CuS04*5H20:a ja * « t * . 3,0 % (paino/tilavuus) agaria 1 litrassa tislattua vettä, pH 4,8. Edellä kuvattu ja PC200:ksi nimetty P. chrysogenum • · · ···! on talletettu the American Type Culture Collectioniin • · · :.* · (ATCC), 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20582, 30 saantinumerolla ATCC 74186 (talletuspäivämäärä 23.

*:·*: syyskuuta 1992).

·”*; Tämä keksinnön mukainen toinen uusi Penicillium * · » .* . chrysogenum -transformantti, jolla on kyky tuottaa adipo- • · · yyli-7-ACA: ta, tuottaa sekä ekspandaasi-hydroksylaasi- • * 35 että asetyylitransferaasiaktiivisuutta sen ansiosta, että « · « « · · • · • · • · · 106965 40 se on transformoitu yhdellä vektorilla (pTS-8), joka käsittää näitä molempia entsyymejä koodittavaa DNA:ta. Siten tämä vektori eroaa julkaisussa EP-A 0 437 378 mainituista Penicillium-transformaatiovektoreista, jotka käsittävät C.

5 acremonium -asetyylitransferaasia koodittavaa DNA:ta joko yksinään tai yhdistettynä DNA-sekvenssiin, joka koodittaa mutanttiekspandaasi-hydroksylaasipolypeptidiä.Rakenteessa pTS-8 ekspandaasi-hydroksylaasigeenin ja asetyylitransfe-raasigeenin ilmentymistä ohjaavat erilliset kopiot P. 10 chrysogenimin IPNS-promoottorista; kolmatta kopiota IPNS-promoottorista käytetään ohjaamaan valikointimarkkerina käytettävän fleomysiiniresistenssigeenin transskriptiota.

Tämä keksinnön yhdessä vaihtoehtoisessa suoritusmuodossa ekspandaasi-hydroksylaasi- ja asetyylitransferaa-15 sigeenit voidaan sisällyttää erillisiin vektoreihin ja viedä Penicillium-isäntäkantaan peräkkäin. Se, missä järjestyksessä ekspandaasi-hydroksylaasi- ja asetyylitransfe-raasientsyymiaktiivisuuksia koodittavat DNA-fragmentit viedään Penicxllium-kantaan, on tärkeää vain käytännön 20 kannalta. Penicilliumin transformoinnin ekspandaasi-hyd-roksylaasigeen(e)illä tulisi edullisesti edeltää asetyyli-transferaasigeenin insertointia, sillä entsyymit toimivat in vivo tässä järjestyksessä. Ekspandaasi-hydroksylaasi- e « · :v. ilmentymistä voidaan siten seurata määrittämällä adipoyy- 25 li-7-ADAC:n tuotanto. Koska adipoyyli-7-ADAC on asetyyli- « ·« ^ transferaasientsyymin substraatti, soluun myöhemmin viedyn . asetyylitransferaasia koodittavan geenin ilmentymisen • · · •••j osoittaa adipoyyli-7-ACA:n tuotanto. Käyttämällä sopivaa • · · V ’ in vitro -asetyylitransferaasimääritystä on mahdollista 30 transformoida Penicillium ensin asetyylitransferaasigee- « *:**! nillä, varmistaa sen ilmentyminen käyttämällä kyseistä in • ”: vitro -määritystä ja edetä sitten ekspandaasi-hydroksylaa- ; sigeenin viemiseen soluun. Kumpi tahansa tie olisi siksi !..1 7-ACA:n keksinnön mukaisen valmistusmenetelmän sopiva suo- • · • · ·;· 35 ritusmuoto.

• · • · « • · · • « « « • « • · « · · 106965 41

Edullisessa suoritusmuodossa tuodaan kuitenkin kalkki kolme entsyymiaktiivisuutta soluun konstruoimalla yksi plasmidivektori, joka käsittää C. acremoniumin eks-pandaasi-hydroksylaasi- ja asetyylitransferaasiaktiivi-5 suuksia koodittavan DNA:n. Penicillixm chrysogenum -kanta, joka on transformoitu mainitunlaisella yhdellä plasmidi-vektorilla, vektorilla pTS-8, ja jolla on kyky tuottaa ekspandaasi-hydroksylaasi- ja asetyylitransferaasiaktiivi-suutta, on nimetty PC300:ksi. Sen taksonomiset piirteet 10 ovat samat kuin edellä PC200:n yhteydessä kuvatut. PC300:n kannalta hyväksyttävät viljelyolosuhteet ovat samat kuin edellä PC200:n yhteydessä kuvatut. PC300:ksi nimetty P. chrysogenum -kanta on talletettu the American Type Culture Collectioniin (ATCC), 12301 Parklawn Drive, Rockville, 15 Maryland 20582, saantinumerolla ATCC 74187 (talletuspäivä-määrä 23. syyskuuta 1992).

Se erityinen Penicillium chrysogenum, joka on transformoitu vektorilla pPenFTSO, jossa ilmenee S. clavu-ligerusin ekspandaasigeeniaktiivisuus ja joka on tämä kek-20 sinnön yksi edullinen suoritusmuoto, on uudenlainen mainitunlaisiin tekniikan tason mukaisiin konstruktioihin, kuten julkaisussa Cantwell et ai., Current Genetic 17 (1990) ,213 - 221 kuvattuun, nähden. Kummassakin konstruktiossa <11 jV. käytetään in vitro -mutageneesia promoottorin kytkemiseksi • 4 ;·. 25 ekspandaasigeeniin. Cantwellin rakenteessa käsittelyssä • t · tuodaan Ndel-kohta ekspandaasigeenin ATG:hen, joka geeni • · . ligatoidaan IPNS-promoottorin 3'-päässä olevaan Xbal-koh- • · · ·”; taan Xbal-Ndel-kytkijällä. Tämän keksinnön mukaisessa ra-

i t I

'·1 kenteessa muodostetaan Ncol-kohta ekspandaasigeenin 30 ATG:hen ja ligatoidaan se IPNS-promoottorin 3'-päässä ole- *·**: vaan Ncol-kohtaan. Tämä saa aikaan seuraavat sekvenssit • · · promoottorin ja geenin välisten liitoskohtien ympärille : näissä rakenteissa: • « < ( I « < t «

< I

· 106965 42

Xbal Ncol IPNS-promoottori 5' TCTAGACACCATGG 3' SEQ ID NO:1

Strep-ekspandaasi 5’ GTGAGAGTTGATGGAC 3' SEQ ID NO:2

Cantwell 5' TCTAGACACTATGGAC 3' SEQ ID NO:3 5 Tämän keksinnön 5' TCTAGACACCATGGAC 3' SEQ ID NO:4 mukainen

Cantwellin konstruktiossa C:n tilalla on T, kun taas tämän keksinnön mukaisessa rakenteessa C säilyy; 10 niinpä IPNS-promoottorin välittömästi ATG-aloituskodonin vieressä oleva sekvenssi sopii täsmälleen yhteen luonnossa esiintyvässä IPNS-geenissä olevan sekvenssin kanssa. On mahdollista, että tekniikan tasoa vastaava promoottori, vaikka se onkin erilainen ainoastaan yhden nukleotidiemäk-15 sen suhteen, voi johtaa heikompaan translaatiotehoon ja siten ekspandaasigeenin heikompaan ilmentymiseen.

Muita eroja on rakenteisiin sisällytetyn promoottorin tai geenin alueilla. Cantwellin rakenne sisältää IPNS-promoot-torin 5'BamHl-xbal3'-alueen, kun taas tämän keksinnön mu-20 kainen vektori sisältää kyseisen promoottorin 5'NcoI-Ncol3'-alueen [Diez et ai., J. Biol. Chem. 265 (1990) 16358 - 16365]. Tämä johtaa noin 250 ep:n lisäykseen Cant-wellin rakenteen IPNS-promoottorin 5'-päässä. Tämä alue on :v, kuitenkin IPNS-geenin edellä olevan ACV-syntetaasigeenin ;·, 25 avoimessa lukukehyksessä.

« cc

Cantwellin rakenne sisältää myös Streptomyces-gee- • « . niä ATG:stä kyseisen geenin 3'-puolella olevaan BamHI-koh- • · · taan asti, kun taas tämän keksinnön mukainen vektori si- • c r sältää kyseisen geenin ATG:sta 3'-puolella olevaan Sall-30 kohtaan ulottuvan alueen [Kovacevic et ai., J. Bacteriol. 171 (1989) 754 - 760]. Tämä johtaa noin 1000 ep:n pitui- · · seen 3' -pään lisäsekvenssiin Cantwellin rakenteeseen näh- « : den. Tämän keksinnön mukainen rakenne sisältää edelleen .·’·/ ekspandaasigeeniä edeltävän alueen ATG:n 5'-puolella ole- ♦ · • · • · · • « · • · 1 · · • · • · • · · 106965 43 van BamHI-kohtaan asti; IPNS-promoottori kuitenkin erottaa sen ekspandaasigeenin lukukehyksestä.

Tämä keksinnön mukaisen pPenFTSO-rakenteen yksi muu ero tekniikan tasoa vastaavaan nähden koskee käytettävää 5 valikointimarkkeria. Penicillium-IPNS-promoottori:fleomy-siinigeeni-fuusiotuotteen käytöllä tämän keksinnön mukaisessa rakenteessa on taipumus johtaa useiden kopioiden integraation tai voimakkaan ilmentymisen mahdollistavissa kohdissa tapahtuvan integraation valitsemiseen, ja se voi 10 siten mahdollisesti antaa tulokseksi ekspandaasigeeniä voimakkaasti ilmentävien transformanttien suuremman prosentuaalisen osuuden.

Adipoyylisivuketjun lohkaisu

Viimeisenä vaiheen tämän keksinnön mukaisessa 15 uudessa biologisessa menetelmässä on adipoyylisivuketjun lohkaisu adipoyyli-7-ADAC:stä tai adipoyyli-7-ACA:sta, mikä vaatii edeltävien vaiheiden tuotteiden käsittelyä adipoyyliamidaasientsyymillä. Kuten jo mainittiin edellä, yksi tämän keksinnön merkittävistä saavutuksista on kyky 20 toteuttaa kaikki adipoyyli-7-ADAC:n ja adipoyyli-7-ACA:n muodostumiseen johtavat vaiheet yhdessä fermentointivil-jelmässä. Tämä saavutus tarjoaa poikkeuksellisesti paran-tuneen tehon, koska välituotteita ei tarvitse eristää ja < < < ;v, puhdistaa prosessin vaiheesta toiseen. Tässä viimeisessä ·. 25 vaiheessa ei kuitenkaan ole läsnä adipoyyliamidaasientsyy- c «c mijärjestelmää, ts. sitä ei ole muodostettu in situ alku- ♦ · . peräisessä fermentointiviljelmässä P. chrysogenum -geenien ··· •”j luonnollisen eikä yhdistelmä-DNA-ilmentymisen kautta.

• · ·

Jos tämän keksinnön mukainen uusi biologinen mene-30 telmä toteutetaan panoksittain, on välttämätöntä eristää e “**· ja osittain puhdistaa ensimmäisen vaiheen tuote, ja alus- tavia menettelyjä tämän tekemiseksi on jo kuvattu edellä. /' · Tämän keksinnön mukainen menetelmä voidaan toreutic’ taa joka tapauksessa millä tahansa tavalla, joka saattaa 35 adipoyyliamidaasin tehokkaasti kosketukseen adipoyyli-7- 4 « « « · « t · « · • ♦ · Φ · • · • » · 106965 44 ADAC:n tai adipoyyli-7-ACA:n kanssa, niin että kyseisen yhdisteen entsymaattinen muuttaminen 7-ADAC:ksi tai 7-ACAiksi voi tapahtua. Tämä on termin "kosketukseen saattaminen" määritelmä laajimmassa yhteydessään. On mahdollista 5 käyttää solutonta lientä tai epäpuhdasta adipoyyli-7-ADACitä tai adipoyyli-7-ACA:ta syötevirtana ja käsitellä se panoksittain epäpuhtaalla adipoyyliamidaasiliemellä. Tämä lähestymistapa toteuttaa joitakin tehokkuusnäkökohtia, sillä se ei vaadi reagoivien aineiden olennaista puh-10 distamista aluksi. Muunnokset ovat tietenkin mahdollisia. Reagoivat aineet voidaan esimerkiksi puhdistaa mihin tahansa haluttuun puhtausasteeseen ennen saattamistaan kosketukseen toistensa kanssa. Olisi myös mahdollista toteuttaa menetelmä jatkuvana panosmenettelyn sijasta. Itse rea-15 goivien aineiden saattamista kosketukseen voidaan muuntaa eri tavoin valmistustekniikan edistysaskelien mukaisesti. Niinpä voidaan käyttää immobilisoitua entsyymiä, esimerkiksi adipoyyliasylaasia sisältävän kolonnin muodossa, jolloin adipoyyli-7-ADAC tai adipoyyli-7-ACA johdetaan 20 kolonnin läpi. Immobilisoitu entsyymi voidaan myös lisätä adipoyyli-7-ADAC- tai adipoyyli-7-ACA-liuokseen suspensiona. Tällaisten immobilisoitujen entsyymijärjestelmien tar-joamia etuja ovat entsyymin helppo talteenotto ja käyttö

4 « I

useampaan kertaan. Yksi toinen esimerkki tällaisesta vai-

* I

:·. 25 mistustekniikasta ovat kalvoreaktorit. Edullinen menetelmä • «« reagoivien aineiden saattamiseksi kosketukseen on immobi- • · , lisoitua entsyymiä sisältävän kolonnin käyttö.

• · · ***j Lohkaisuvaiheessa käyttökelpoiset adipoyyliamidaa- • * · *·* * sientsyymit 30 On olemassa joukko entsyymejä, joilla on tunnettu ’·**· spesifisyys adipoyylisivuketjujen suhteen. Tuloksia, joita on saatu kaupallisesti saatavissa olevalla (RAEV Corp.) X : adipoyyliamidaasilla, kuvataan yksityiskohtaisesti jäijem- • ·« pänä työskentelyesimerkeissä. Kirjallisuudessa on kuvattu • « 35 seitsemää muuta entsyymiä, jotka poistavat adipoyylisivu- « · * i · « · · • · • · · • · • · • · · 106965 45 ketjuja kefalosporiinityyppisistä molekyyleistä. Kuusi näistä seitsemästä entsyymistä on peräisin Pseudomonas-lajista ja seitsemäs eräästä Bacillus-lajista. Tiettyjen pseudomonadientsyymien välillä on olemassa joitakin sana-5 kaltaisuuksia, mutta kaikki seitsemän ovat jossakin määrin erilaisia fysikaalisten/biologisten ominaisuuksiensa suhteen. Niiden joitakin tunnusmerkillisiä piirteinä on koottu seuraavaan: 10 Entsyymi Viite Moolimassa noin (Pseudomonas- ja (Alayksikkö)

Bacillus-kannat) P. SU-77-1 Shibuya et ai. Ilmeisesti sama 15 (Toyo Jozo) (1981) kuin alla olevan GKl6:n P. GK16 Matsuda, Komatsu 16 000 (Asahi) (1985) 54 000 P. SE83 (acyl) Matsuda et ai. 38 200 20 (Asahi) (1987) 19 900 P. SE83 (acyll) Matsuda et ai. 25 400 (Asahi) (1987) 58 200 P. diminuta N176 Aramori et ai. 58 000 • a (Fujisawa) (1991a)* 26 000 * < ··.* 25 P. diminuta V22 Aramori et ai. ? 1 (Fujisawa) (1991a)* ?

Bacillus latero- Aramori et ai. 70 000 ·· · •;*j sporus J1 (Fuji.) (1991b)** (monomeerinen) • · · ·.* ' Pseudomonas sp. --- 16 000 30 (RAEV Corp.) 54 000 • · *Aramori et ai., J. Ferment. Bioeng. 72 (1991) 232 - 243 ·* · **Aramori et ai., J. Bacteriol. 173 (1991) 7848 - 7855 • · · ♦ » 4 · · • » * · aa· a a « * « « < a * « · « « · « · a · 4 a · 106965 46

Kaikki edellä mainitut adipoyyliamidaasientsyymit ovat käyttökelpoisia tämän keksinnön mukaisessa uudessa biologisessa menetelmässä. Muita tämän keksinnön mukaisen menetelmä yhteydessä käyttökelpoisia adipoyyliamidaaseja 5 saatetaan helposti löytää testaamalla entsyymiehdokas adi-poyyli-7-ACA:lla ja adipoyyli-7-ADAC:llä, todellisilla substraateilla, joilla niiden täytyy toimia. Positiivinen tulos antaa luotettavan ja toistettavissa olevan menetelmän sen määrittämiseksi, että entsyymiehdokas on todella 10 käyttökelpoinen tämän keksinnön mukaisessa menetelmässä. Substraatti voidaan valmistaa adipiinihappoahydridin reaktiolla 7-ACA:n kanssa käyttämällä muunnosta menettelystä, jota kuvaavat Szewczuk ja Wellman-Bednawska [Clin. Chim. Acta 84 (1978) 19 - 26]. On myös mahdollista soveltaa jul-15 kaisussa Agric. Biol. Chem 45(7) (1981) 1561 - 1567 kuvattua menetelmää, joka on tarkoitettu glutaryyli-7-ACA:n valmistukseen. Adipiinihappoanhydridiä voidaan valmistaa Albertsonin ja Lundmarkin menetelmällä, jota kuvataan julkaisussa J. Macromol. Sei. Chem. A27 (1990) 397 - 412. 7-20 ACA:ta on saatavissa muutamista kaupallisista lähteistä, mukaan luettuna Sigma Chemical Co.

Jos on toivottavaa tehdä entsyymiehdokkaiden karkea seulonta käyttämällä nopeaa kolorimetrista menetelmää, « i i adipoyyli-7-ACA-substraatti voidaan korvata kolorimetri-··.* 25 sella substraatilla, kuten adipoyyli-PABA:lla (para-amino-

• « I

bentsoehapolla) tai adipoyyli-pNA: 11a (paranitroanilii- • · . nilla). Mainitunlainen menetelmä voi olla sovellutus mene- ·· · •**j telmästä, jota kuvaavat y-glutamyyli-PABA:n suhteen Szew- *·* * czuk et ai. [Clinica Chimica Acta 84 (1978) 19 - 26]. Si- 30 vuketjun lohkaisu johtaa värin muodostavaan lajikkeeseen, 9 jonka läsnäolo ja pitoisuus on helppo määrittää käyttämäl- lä kolorimetria. Näitä ja muita sopivia kolorimetrisia ,·!; menetelmiä kuvataan yksityiskohtaisemmin julkaisuissa Ma- * «( relli, L. P., J. Pharm. Sei. 57 (1968) 2172 - 2173; Szasz, « · *;* 35 G., Clin. Chem. 15 (1969) 124 - 136; Szewczuk, A. et ai.

« · 4 · · • · · • · « · · • · « · • « · 47 100965

Anal. Biochem. 103 (1980) 166 - 169; Reyes, F. et ai., J. Pharma. Pharmacol. 41 (1989) 136 - 137.

RAEV-entsyymin ja edellä olevassa taulukossa esitettyjen acyll- ja GK16-entsyymien N-terminaalisia amino-5 happosekvenssejä verrattiin keskenään. Vertailun tulokset esitetään seuraavassa (sulut tarkoittavat merkintöjä, jotka evät ole täysin varmoj a): RAEV - SEQ ID NO:5 10 (S) N (S) (G) A V A P G K T A N G N A L (L) L Q N (P) GK16 - SEQ ID NO:6

S N S W AVAPGKTANGNAL L LQN P

acyll - SEQ ID NO:7

S N N W AVAPGRTATGRPI L A G D P

15

Esitetyistä sekvensseistä käy ilmi, että kaikki nämä kolme peptidiä ovat sukua keskenään. Proteiinilla, jolla on edellä esitettyjen kanssa samankaltainen N-terminaalinen sekvenssi, ei välttämättä ole adipoyyliamidaasi-20 aktiivisuutta, kuten on asianlaita kannan Ärthrobacter tuottaman penisilliini G -asylaasin ollessa kyseessä. Toisaalta on olemassa adipoyyliamidaaseja, jotka ovat käyttö- t"’' kelpoisia tämän keksinnön mukaisessa menetelmässä ja joil- * < « la ei esiinny merkittävää homologiaa edellä mainitun N- t ;·.* 25 terminaalisen sekvenssin kanssa. Esimerkiksi Asahin edellä t «· ! . olevassa taulukossa esitetyillä acyl ja Fujisawan B. late- • · . rosporus JI -asylaaseilla, joilla on osoitettu olevan jon- • · · **" kin verran adipoyyli-7-ACA-aktiivisuutta, ei esiinny sek- vt· *·* * venssihomologiaa muiden edellä esitettyjen entsyymien 30 kanssa. Niinpä tämän keksinnön piirin uuden biologisen *:**J menetelmän viimeisessä vaiheessa käyttökelpoisten adipoyy- ··· liamidaasien suhteen määrää se, pystyykö entsyymi ehdokas ; lohkaisemaan sivuketjun adipoyyli-7-ACA:sta vai ei, mikä * ·» voidaan määrittää helposti ja luotettavasti, kuten edellä • · V 35 kuvattiin yksityiskohtaisesti.

« · • « « • · · « · • · · « · « · « · · 106965 48

Edullisten suoritusmuotojen kuvaus

Seuraavassa kuvataan yksityiskohtaisesti tämän keksinnön tiettyjä edullisia suoritusmuotoja, mutta nämä kuvaukset on tarkoitettu vain valaiseviksi eikä millään ta-5 voin tätä keksintöä rajoittaviksi.

Esimerkki 1

Penlcillium chrysogenumin viljelyolosuhteet Näissä menettelyissä käytettyjä Penicillivaa chryso-g emua -kantoja pidettiin yllä maljoilla, jotka sisälsivät 10 LCSB-alustaa, joka käsitti 1,5 % (paino/tilavuus) laktoo-simonohydraattia; 0,5 til-% maissiuutetta; 0,5 % (paino/tilavuus) peptonia; 0,4 % (paino/tilavuus) NaCl:a; 0,05 % (paino/tilavuus) MgS04*1120:3? 0,06 % (paino/tilavuus) KH2P04:a; 0,0005 % (paino/tilavuus) FeCl3·6H20:a; 15 0,0002 % (paino/tilavuus) CuS04*5H20:a ja 3,0 % (paino/ti lavuus) agaria 1 litrassa tislattua vettä, pH 4,8. Kun viljelmää oli kasvatettu 12 vuorokautta lämpötilassa 25 °C suhteellisen kosteuden ollessa 65 %, poistettiin yksittäisiä pesäkkeitä ja lisättiin ne lasihelmiä sisältävässä 20 kierrekorkilla varustetussa putkessa olevaan steriloituun veteen (2 ml). Kun kasvustoa oli maseroitu pyörresekoitta-malla, suspensio käytettiin riisipullojen inokulointiin. Riisipullot sisälsivät 250 ml:n pullossa 25 g pitkäjyväis-tä käsiteltyä luonnonriisiä (Uncle Ben's), jota oli pesty ·· 25 kolmin - nelinkertaisella tilavuudella tislattua vettä 7 • · * ·« . minuutin ajan, sekoitettu 30 sekunnin välein ja valutettu sitten, kunnes veden vastaanotto riisiin oli noin 25 %.

IM

··*! Kun oli viljelty 12 vuorokautta lämpötilassa 25 °C suh- *·* ’ teellisen kosteuden ollessa 65 %, itiöt huuhdottiin rii- 30 siltä steriilillä vedellä (50 ml). Itiösuspensiot käytet-tiin nesteviljelmien inokulointiin ja myös lämpötilassa ·***: 4 °C säilytettäviksi tarkoitettujen kylmäkuivattujen vil- (·' . jelmien aikaansaantiin. Itiöt lisättiin yhtä suureen tila- < *4 vuuteen liuosta, joka sisälsi 5 % kuorittua maitoa, ja

I I

35 kylmäkuivattiin steriileissä ampulleissa.

< « < « «

< € I

1 * I · i 4 9*4 106965 49

Kantojen kaksivaiheista fermentointia ravistuspul-loissa käytettiin penisilliinien tuotantoon tai myseelien tuottamisen RNA- tai DNA-lähteiksi. Ymppäysvaihe käynnistettiin lisäämällä 1·108 itiötä 500 ml:n pulloon, jossa oli 5 50 ml alustaa, joka käsitti 3,0 % (paino/tilavuus) glukoo sia; 1 % (paino/tilavuus) Pharmamediaa; 3,0 til-% maissi-uutetta; 0,2 % (paino/tilavuus) ammoniumsulfaattia, 0,5 % (paino/tilavuus) CaC03:a, 0,05 % (paino/tilavuus) vedetöntä monokaliumfosfaattia; 1,0 % (paino/tilavuus) laktoosia ja 10 1,0 % (paino/tilavuus) primaarista kuivahiivaa 1 litrassa tislattua vettä. Inkubointi tehtiin lämpötilassa 25 °C suhteellisen kosteuden ollessa 65 % pyöröravistimella amplitudilla 70 mm ja kierrostaajuudella 220 min-1. Kun oli inkuboitu 48 tuntia, käynnistettiin tuotantovaihe siirtä-15 mällä 2 ml vegetatiivista ymppäysviljelmää 500 ml:n pulloon, jossa oli 35 ml alustaa, jonka koostumus oli seuraa-va: 0,05 % (paino/tilavuus) KH2P04:a, 0,5 % (paino/tilavuus) K2S04:a, 1,0 % (paino/tilavuus) (NH4)2S04:a, 12,0 % (paino/tilavuus) laktoosia, 2,75 % (paino/tilavuus) Phar-20 mamediaa, 1,0 % (paino/tilavuus) CaC03:a (saostettua) ja 1,0 til-% laardiöljyä 1 litrassa tislattua vettä, pH 6,6. Autoklavoinnin jälkeen mutta ennen inokulointia lisättiin steriiliä 25-%:ista natriumadipaattiliuosta (pH 6,6) si-; *, \ ten, että lopulliseksi natriumadipaattipitoisuudeksi tuli ·/ 25 2,5 %. Jatkettiin sitten inkubointia inokuloinnin jälkeen t 4 4 [ . samoissa olosuhteissa kuin ymppäysvaiheessa 5-7 vuoro kautta.

··· ···· Kun tarvittiin myseelejä protoplastien muodostami- • « * *·* * seksi transformointia varten tai DNA-lähteeksi, kantaa 30 kasvatettiin 250 ml:n pullossa, joka sisälsi 50 ml täydel-listä alustaa (complete media, CM), jonka koostumus oli seuraava: 50 ml pitoisuudeltaan 20-kertaista (20X) Clut-. terbuckin suolaseosta (120 g Na2N03:a, 10,4 g KCl:a, 10,4 g

MgS04·7H20:a ja 30,4 g KH2P04:a), 2,0 ml Vogel's Trace Ele-'1' 35 ments -seosta (0,3 mol/1 sitruunahappoa, 0,2 mol/1 ZnS04:a, c < t t t < ( « t < « I I ( · « t I « · 50 106965 25 mmol/1 Fe(NH4)2(S04)2»6H20:a, 10 mmol/1 CuS04:a, 3 nunol/1 MnS04:a, 8 nunol/1 boorihappoa, 2 mmol/1 Na2Mo04 · 2H20: a), 5 g tryptonia, 5 g hiivauutetta ja 10 g glukoosia 1 litrassa tislattua vettä. Inkuboitiin lämpötilassa 25 °C pyöröravi-5 timella kierrostaaj uudella 220 min-1.

Esimerkki 2

Cephalosporium acremoninrnin viljelyolosuhteet C. acremonium -kantoja pidettiin yllä vinopinnoilla käyttämällä täydellistä alustaa, jonka koostumus oli 20 g 10 sakkaroosia, 20 g agaria, 4 g peptonia, 4 g hiivauutetta, 3 g NaN03:a, 0,5 g KH2P04:a, 0,5 g KCl:a, 0,5 g MgS0417H20:a ja 0,01 g FeS0417H20:a 1 litrassa tislattua vettä, pH 6,6. Kun oli kasvatettu 10 vuorokautta lämpötilassa 28 °C suhteellisen kosteuden ollessa 66 %, lisättiin vinopinnoille 15 6 ml steriloitua vettä ja kaavittiin kasvusto agaripinnal- ta. Tuloksena oleva suspensio siirrettiin steriiliin, la-sihelmiä sisältävään kierrekorkilla varustettuun putkeen. Kun kasvustoa oli maseroitu pyörösekoittamalla muutamia minuutteja, käytettiin 3,5 ml tuloksena olevaa suspensiota 20 nesteviljelmien inokulointiin. Tätä suspensiota käytettiin myös lämpötilassa 4 °C varastoitaviksi tarkoitettujen kylmäkuivattujen viljelmien aikaansaantiin. Maseroidun kasvuston suspensio sentrifugoitiin, pelletti suspendoitiin uudelleen 5 % kuorittua maitoa sisältävään liuokseen ja ···. 25 kylmäkuivattiin annoksina steriileissä ampulleissa.

»it

Kantojen kaksivaiheista fermentointia ravistuspul- • · loissa käytettiin kefalosporiinien tuotantoon tai mysee- • · · * . lien tuottamiseen DNA- tai RNA-lähteeksi. Ymppäysvaihe • # käynnistettiin lisämällä inokulaatti 250 ml:n pulloihin, • e · ···· 30 joista kukin sisälsi 15 ml alustaa, jonka koostumus oli ♦ · · V 1 seuraava: 5 g glukoosia, 40 g sakkaroosia, 30 g maissi- tärkkelystä, 50 g sokerijuurikasmelassia, 65 g soijajau- * hoa, 15,8 g CaS0412H20:a, 8 g ammoniumasetaattia, 5 g

CaC03:a (saostettua), 7,5 g (NH4)2S04:a, 3,5 g MgS04·7H20:a, .1 .35 1 g KH2P04:a ja 0,15 ml soijaöljyä pulloa kohden 1 litrassa * ♦ · • · « · ♦ · • · ♦ • ♦ • · · • « « • ♦ « · « · • · « · · 51 106965 tislattua vettä, pH 6,2. Inkubointi tehtiin lämpötilassa 25 °C suhteellisen kosteuden ollessa 65 % pyöröravistimellä amplitudilla 70 mm ja kierrostaajuudella 220 min"1. Kun oli inkuboitu 96 tuntia, käynnistettiin tuotantovaihe 5 siirtämällä 2 ml vegetatiivista ymppäysviljelmää 250 ml:n pulloon, jossa oli 15 ml edellä kuvattua alustaa. Inku-bointia jatkettiin vielä 96 tuntia samoissa olosuhteissa.

Kun tarvittiin myseelejä DNA-lähteeksi transformoivia varten, kantoja kasvatettiin 500 ml:n pullossa, 10 joissa oli 100 ml täydellistä alustaa, jonka koostumus oli 20 g glyserolia, 4 g peptonia, 4 g hiivauutetta, 0,5 g KH2P04:a, 0,5 g K2HP04:a, 0,5 g KCl:a, 1 g MgS04*7H20:a, 3 g NaN03:a ja 0,01 g FeS04·7H20:a 1 litrassa tislattua vettä. Inkuboitiin lämpötilassa 30 eC pyöröravistimella kierros-15 taajuudella 200 min"1.

Esimerkki 3

Penicilliumin ja Cephalosporiumin genomi-DNA:n ja kokonais-RNA:n eristäminen

Edellä kuvatulla tavalla valmistetusta 48 tuntia 20 kasvatetusta viljelmästä otettiin talteen vegetatiivinen myseelikasvusto suodattamalla juustokankaan läpi, pakastettiin nestetypessä ja kylmäkuivattiin yön yli. Kuivatut museelit jauhettiin yhdessä hiekan kanssa huhmaressa ja suspendoitiin uudelleen 25 ml:aan liuosta, joka sisälsi

1 25 100 mmol/1 LiCl:a, 50 mmol/1 EDTAa, 10 mmol/1 Trisiä, pH

• · · ;·.·. 8,0 ja 4 % SDS:a. Kun suspensio oli kuumennettu lämpöti- • · *../ laan 50 - 55 eC vesihauteessa, jonka lämpötila oli 60 °C, • · · seos uutettiin ensin Tris-liuoksella (1 mol/1, pH 8) kyl- , lästetyllä fenolilla, sitten Tris-kyllästetyn fenolin ja • · · 30 kloroformin seoksella (tilavuussuhteessa 1:1) ja sitten *.* * kloroformilla. RNA seostettiin vesifaasista lisäämällä yhtä suuri tilavuus kylmää LiCl-liuosta (6 mol/1) ja an-”“ί tamalla seoksen sitten seistä lämpötilassa -20 °C 2 - 3 • tuntia. Kun seosta oli sentrifugoitu 20 min kiihtyvyydellä / . 35 12000*G lämpötilassa 4 °C, supernatanttiin lisättiin eta- * « < · « < · « « « « * 4 4 4 4 4 4 4· 4 · 4 4 • 4 · 52 106965 nolia pitoisuudeksi 66 til-% ja sitä pidettiin lämpötilassa -20 °C 15 min DNA:n saostamiseksi. Kun oli tehty sent-rifugointi edellä kuvatulla tavalla, DNA-pelletti pestiin 70-%:isella etanolilla, kuivattiin ja suspendoitiin uudel-5 leen TE-puskuriin (1 mmol/1 Tris1HCl:a, pH 7,5, 1 mmol/1 EDTAa). DNA-pitoisuus arvioitiin vertaamalla tunnettuihin DNA-standardeihin värjättyinä etidiumbromidilla agaroosi-geelielektroforeesissa.

RNA:n uuttamiseksi kasvatettiin edellä esimerkeissä 10 1 ja 2 kuvattujen kaltaisia Penicillium chrysogenum ja

Cephalosporium acremonium -viljelmiä 96 tuntia 35 ml:ssa fermentointialustaa (fermentointiolosuhteita kuvattu edellä) lämpötilassa 25 °C pyöröravistimella kierrostaajuudella 220 min-1. Myseelit otettiin talteen alipainesuodatta-15 maila Whatman #1 -suodattimen läpi ja pestiin noin 50 ml:11a vettä. Myseelit kaavittiin välittömästi suodat-timelta, suspendoitiin uudelleen 5 ml:aan "rikkomispusku-ria" (50 mmol/1 Tris«HCl:a, pH 7,4, 150 mmol/1 NaCl:a, 5 mmol/1 EDTAa, pH 8,0, 5 % SDS:a), pakastettiin nestety-20 pessä ja kylmäkuivattiin. Kun myseelejä oli kylmäkuivattu yön yli, lisättiin 5 ml vettä, joka sisälsi 0,1 % DEPC:tä ja 5 ml Tris-liuoksella (1 mol/1, pH 8) kyllästetyn fenolin, kloroformin ja isoamyylialkoholin seosta (50:50:1), ja seoksen annettiin sulaa 20 min lämpötilassa 37 °C ra-25 vistellen. Seosta sentrifugoitiin 10 min kiihtyvyydellä • « 1 12 000»G lämpötilassa 4 °C, poistettiin sitten vesikerros * · j./ ja uutettiin se uudelleen ensin Tris-liuoksella (1 mol/1, • · · pH 8) kyllästetyn fenolin, kloroformin ja isoamyylialkoho-

• ••CO

Iin seoksella (50:50:1), toiseksi Tris-liuoksella

• C

··1« 30 (1 mol/1, pH 8) kyllästetyllä fenolilla ja kolmanneksi * kloroformilla. Yhdistettiin yhtä suuri tilavuus LiCl-liu- osta (6 mol/1) lopulliseen vesikerrokseen ja liuoksen an-nettiin olla lämpötilassa -20 °C vähintään 4 tuntia. Koko-nais-RNA pelletoitiin sentrifugoimalla 20 min kiihtyvyy- / . 35 dellä 12 000·G lämpötilassa 4 °C, pelletti liuotettiin • ·« • · • · · • · • · • · · • · • · · • · · • « · • · • · · 53 106965 0,3 ml:aan TE-puskuria ynnä 0,03 ml:aan natriumasetaatti-liuosta (3 mol/1) ja lisättiin 2,5-kertainen tilavuus etanolia RNA:n saostamiseksi uudelleen. Lopullinen pelletti liuotettiin 0,1 ml:aan TE-puskuria ja määritettiin RNA-5 pitoisuus spektrofotometrisesti mittaamalla absorbanssi aallonpituudella 260 nm.

Esimerkki 4

Cephalosporium acremonium -geenikirjaston konstruointi ja C. acremoniumin ekspandaasi-hydroksylaasi-10 ja asetyylitransferaasigeenien eristäminen C. acremoniumin ekspandaasi-hydroksylaasi-geenin eristäminen C. acremoniumin genomi-DNA pilkottiin osittain Sau3AI:llä, niin että saavutettiin keskimääräinen frag-15 menttikoko 10 - 20 ke, ja tehtiin rikastus tämän koko-alueen suhteen sentrifugoimalla pilkkomistuote NaCl-ti-heysgradientilla 5 - 20 %. Kokofraktioitua DNA:ta käytettiin C. acremonium-genomikirjaston luomiseen ligatoimalla se Λ 2001 -vektorin BamHI-kohtaan, pakkaamalla faagipar-20 tikkeleihin käyttämällä Gigapakia (Stratagene) ja infektoimalla E. coli. Tuloksena olevat pesäkkeet siirrettiin nitroselluloosaan ja seulottiin hybridisoimalla oligonukl-eotidikoettimeen, joka on komplementaarinen ekspandaasi-hydroksylaasigeenin julkaistulle 3'-päälle (Samson et ai.

"·. 25 1987). Koettimen pää leimattiin [r-32P]ATP:lla käyttämällä »»» ··.·. T4-polynukeotidikinaasia. Eristettiin positiiviset kloo- • · j./ nit, tehtiin restriktioendonukleaasikartoitus ja määritet- • · · * . tiin geenin orientaatio tekemällä Southern-täplähybridi- saatio edellä mainitun oligonukleotidin ja toinen geenin «·» •••ϊ 30 5'-päälle komplementaarisen sekvenssin kanssa.

*.1 1 C. acremoniumin asetyylitransferaasi-geenin eristä minen «

Vaikka seuraava menettely ei ole menettely, jota käytettiin asetyylitransferaasigeenin eristämiseksi jäl-/ . 35 jempänä esimerkeissä 11 ja 12 kuvattavia vektorikonstruk-

« M

• « • « · « · • · • · · « * · • ♦ · • « « · « · • · • « · 54 106965 tioita varten, ammattimies voisi käyttää sitä hyödyntämällä nykyisin saatavissa olevaa julkaistua DNA-sekvenssi-informaatiota. Edellä kuvatulla tavalla konstruoidusta C. acremonium -genomikirjastosta valitaan klooni, jossa on 5 asetyylitransferaasigeenikoodi asetyylitransferaasisek-venssille komplementaaristen synteettisten oligonukleoti-dikoettimien kanssa tapahtuvan hybridisaation perusteella, kuten kuvataan julkaisussa Matsuda et ai., Biochem. Bio-phys. Res. Commun. 182 (1992) 995 - 1001.

10 Esimerkki 5

Streptomyces clavuligezrusin viljelyolosuhteet Näissä menettelyissä käytetty Streptomyces clavuli-gerus -kanta oli ATCC 27064. Kantaa pidettiin yllä maljoilla, joiden koostumus oli 4 g hiivauutetta, 10 g mal-15 lasuutetta, 4 g glukoosia ja 20 g agaria 1 litrassa tislattua vettä, pH 7,2. Kun viljelmää oli kasvatettu 5 vuorokautta lämpötilassa 30 °C, lisättiin maljoihin 2 ml steriiliä vettä ja kasvusto kaavittiin agarpinnalta. Tuloksena oleva suspensio siirrettiin steriiliin, lasihelmiä si-20 sältävään kierrekorkilla varustettuun putkeen. Kun kasvusto oli maseroitu pyörösekoittamalla, käytettiin tuloksena oleva suspensio nesteviljelmien inokulointiin. Tätä suspensiota käytettiin myös viljelmän pysyvään varastointiin lämpötilassa -70 °C lisäämällä glyserolia loppupitoisuu-25 deksi 15 til-%.

• « « IV. Kun tarvittiin myseelejä protoplastien aikaansaan- « · tiin transformointia varten tai DNA-lähteeksi, kantoja • «e kasvatettiin 1 litran pullossa, joka sisälsi 200 ml YEME-. alustaan, jonka koostumus oli 3 g hiivauutetta, 5 g pepto- ***“ 30 nia, 3 g mallasuutetta, 10 g glukoosia, 340 g sakkaroosia, • · o 1,02 g MgCl2*6H20:a, 5 g glysiiniä ja 18 g agaria 1 litrassa tislattua vettä. Inkuboitiin lämpötilassa 28 °C pyörö-' c ravistimella kierrostaajuudella 220 min"1.

< · f * t < «i < I

f I

e < ' t i l t « < « < ·

( I I

55 106965

Esimerkki 6

Streptomyces-genomi-DNA:n eristäminen

Otettiin talteen vegetatiivinen kasvusto edellä kuvatulla tavalla valmistetusta 48 tuntia kasvatetusta 5 viljelmästä sentrifugoimalla 10 min kiihtyvyydellä 22 10016. Solut suspendoitiin uudelleen 10 ml:aan TE-pus-kuria, lisättiin 10 mg lysotsyymiä ja seosta inkuboitiin 15 min lämpötilassa 30 °C. Sitten lisättiin 1 ml 20-%:ista SDS-liuosta ja heti sen jälkeen 10 ml TE:llä (pH 8) kyl-10 lästettyä fenolia ja 1,5 ml NaCl-liuosta (5 mol/1), ja seosta käänneltiin varovasti 20 minin ajan. Faasit erotettiin sentrifugoimalla 10 min kiihtyvyydellä 12 0001G, minkä jälkeen vesikerros poistettiin ja siirrettiin uuteen putkeen. Lisättiin yhtä suuri tilavuus kloroformia ja 15 seosta käänneltiin varovasti 10 minin ajan. Faasit erotettiin jälleen sentrifugoimalla 10 min kiihtyvyydellä 12 0001G ja vesikerros poistettiin ja siirrettiin uuteen putkeen. Lisättiin varovasti kaksinkertainen tilavuus isopropanolia, saostunut DNA kerättiin talteen käärimällä ja 20 liuotettiin uudelleen mahdollisimman pieneen tilavuuteen TE-puskuria. Lisättiin RNAaasi Aita loppupitoisuudeksi 20 pg/ml ja liuosta inkuboitiin lämpötilassa 50 °C 1 tunti. Sitten lisättiin proteaasi Kita loppupitoisuudeksi 100 pg/ml NaClin (100 mmol/1) ja SDSin (0,4 %) ohella ja 25 seosta inkuboitiin 1 tunti lämpötilassa 37 °C. Liuos « 4 · ;·.·. uutettiin jälleen yhtä suurella tilavuudella TEillä (pH 8) ··. kyllästettyä fenolia ja sen jälkeen vielä kloroformilla.

• ·· [ . Lopullisesta uutosta saatu DNA kerättiin käärimällä, kun • e , oli lisätty kaksinkertainen tilavuus isopropanolia, ja * t · ‘‘il 30 määritettiin pitoisuus spektrofotometrisesti käyttämällä • ♦ <1 *·1 ’ aallonpituudella 260 nm saatua absorbanssilukemaa.

e < t c » t t 1 • » * · · * « t « · « 1 · • · t · » • · • · · • · · • » · · • · • · • · · 56 106965

Esimerkki 7

Geenikirjaston muodostaminen ja Streptomyces clavuligerusin ekspandaasi- ja hydroksylaasigeenit sisältävien DNA-fragmenttien eristäminen 5 S. clavuligerusin ekspandaasigeenin eristäminen

Edellä kuvatusta menettelystä saatu Streptomyces clavuligerusin genomi-DNA pilkottiin restriktioentsyymeil- lä BamHI ja Sali. Pilkottu DNA käsiteltiin elektroforeet- tisesti 0,8-%:isella agaroosigeelillä, eluoitiin 1,8 - 2,2 10 ke:n fragmentit ja ligatoitiin ne pUC18-DNA:han, joka oli ennalta pilkottu BamHI:llä ja Sällillä. Ligaatioseoksen laimennoksia käytettiin kompetenttien JM109-solujen trans- formointiin käyttämällä elektroporaatiota (Gene Pulser,

Bio-Rad, Richmond, CA). Kompetenttien solujen preparointi 15 ja elektroporaatio-olosuhteet olivat molemmat valmistajan suositusten mukaisia. Transformaatioseos siirrostettiin LB-maljoille, jotka sisälsivät 100 pg/ml ampisilliinia ja 75 μΐ 2-%:ista X-Gal-liuosta. Kun oli inkuboitu yön yli lämpötilassa 37 °C, rekombinanttipesäkkeet identifioitiin 20 värittömän ulkonäkönsä perusteella, jonka aiheutti plasmi- divektorin beeta-galaktosidaasigeeniaktiivisuuden inakti- voituminen. Värittömät pesäkkeet poimittiin tuoreelle LB- maljalle, joka sisälsi 100 pg/ml ampisilliinia. Kun oli inkuboitu yön yli lämpötilassa 37 °C, pesäkkeet siirret- 25 tiin nitroselluloosaan ja hybridisoitiin polymeraasiketju- :·.1. reaktiolla tuotetun koettimen kanssa, joka vastasi jul- « · :·, kaistua Streptomyces clavuligerusin ekspandaasigeenin sek- • · · venssiä emäksestä 52 emäkseen 918 [Kovacevic et ai., J. c Bacteriol. 171 (1989) 754 - 760; Ingolia et ai., US-pa- M» '”· 30 tenttijulkaisu 5 070 020]. Polymeraasiketjureaktiotuotteen * t · '·1 ’ leimaus tehtiin sattumanvaraisella alukelaajennusreaktiol- la käyttämällä (32P)cCTP:tä ja Oligolabelling Kit -väli-*·1'· neistöä valmistajan ohjeiden mukaisesti (Pharmacia,

Piscataway, New Jersey). Hybridisaatioreaktio tehtiin ra- .·. ; 35 dioaktiivisesti leimatun koettimen (106 pulssia/min), for- • · • · · • « • · · * · • · · • » · · • · • · « S7 106965 mamidin (30 %), 5X SSC:n (0,15 mol/1 NaCl:a, 0,015 mol/1 natriumsitraattia, pH 7), SDS:n (0,1 %), 5X Denhardtin liuoksen (5 g fikollia, 5 g polyvinyylipyrrolidonia ja 5 g BSA:a 500 ml:aa kohden 50X varastoliuosta) ja vasikan ka-5 teenkorva-DNA:n (100 pg/ml) läsnä ollessa yön yli lämpötilassa 37 °C. Muutamat transformantit hybridisoituivat voimakkaasti koettimen kanssa. Restriktioentsyymianalyysillä vahvistettiin, että yksi pesäke sisälsi ekspandaasigeenin sisältävää vektoria, ja tälle plasmidille annettiin nimek- 10 si pFTSO-1.

S. clavuligerusin hydroksylaasigeenin eristäminen

Streptomyces clavuligerusin genomi-DNA pilkottiin osittain BamHI:llä ja ligatoitiin lambda Dash II -vektoriin, jonka toimitti Stratagene. Tuloksena oleva genomi-15 kirjasto seulottiin hybridisoimalla 30 emäksen pituisen oligonukleotidin kanssa, jonka sekvenssi oli identtinen tämän hydroksylaasigeenin julkaistun sekvenssin 30 ensimmäisen emäksen kanssa [Kovacevic ja Miller, J. Bact. 173 (1991) 398]. Southern-hybridisaatio, jossa käytettiin kah-20 desta positiivisesta faagikloonista saatua BamHI-pilkottua DNA:ta, osoitti odotetun 6 ke:n fragmentin, joka alikloo-nattiin. Tämä aliklooni antoi Kpnl-pilkkomisen jälkeen tulokseksi joukon fragmentteja, jotka sopivat yhteen hyd-roksylaasigeeniä ympäröivän alueen julkaistun restriktio-25 kartan kanssa (Kovacevic ja Miller 1991).

fc t w

Esimerkki 8 ♦ · :·. Plasmidi-DNA:n eristäminen • 1 · E. coli -viljelmiä, jotka sisälsivät kiinnostuksen • (· . kohteena olevaa plasmidia, kasvatettiin 500 ml:ssa LB- ··« 30 lientä [20 g/1 LB Broth Basea (Gibco, Paisley, Skotlan- • o · ’·1 ti)], joka sisälsi 15 pg/ml tetrasykliiniä, pyöröravisti- mella kierostaajuudella 220 min-1 12 - 16 tuntia lämpöti-lassa 37 °C. Solut pelletoitiin sentrifugoimalla 10 min kiihtyvyydellä 4 0001G lämpötilassa 4 °C. Solupelletti ,·. : 35 suspendoitiin uudelleen 18 ml:aan glukoosipuskuria • M • · • « • · • » · • « · « • · • « · 58 106965 (50 mmol/1 glukoosia, 25 mmol/1 Trisiä, pH 8,0, 10 nunol/1 EDTAa) ja lisättiin 2 ml liuosta, joka sisälsi 40 mg/ml lysotsyymiä (Sigma, St. Louis, MO) glukoosipuskurissa, sekoitettiin ja inkuboitiin seosta huoneenlämpötilassa 5 15 min. Lisättiin 40 ml juuri valmistettua liuosta, joka sisälsi 0,2 ekv/1 NaOH:a ja 1 % SDS:a, seosta pyöriteltiin varovasti ja se laitettiin jäähauteeseen 10 min:n ajaksi. Sitten lisättiin 30 ml kaliumasetaattiliuosta (5 mol/1, pH 4,8), sekoitettiin hyvin ja laitettiin tuloksena oleva 10 seos jäähauteeseen vielä 10 min:ksi. Solujäännökset pelle-toitiin sentrifugoimalla 10 min kiihtyvyydellä 4 000· G lämpötilassa 4 °C ja tuloksena oleva supernatantti suodatettiin juustokangassuodattimen läpi. Lisättiin isopropanolia (0,6-kertainen tilavuus) selkeytettyyn supernatant-15 tiin plasmidi-DNA:n saostamiseksi; sakka muodostui inku-boitaessa huoneenlämpötilassa 20 min. Plasmidi-DNA pelle-toitiin sentrifugoimalla 20 min kiihtyvyydellä 4 0001G lämpötilassa 4 °C, pestiin sitten 70-%:isella etanolilla ja kuivattiin vähän aikaa. Pelletti suspendoitiin uudel-20 leen 9 ml:aan TE-puskuria ja lisättiin sitten 10 g CsCl:a ja 0,387 ml etidiumbromidiliuosta (10 mg/ml). Tätä liuosta sentrifugoitiin 24 tuntia kiihtyvyydellä 313 100·G. Tuloksena oleva cesiumkloridigradientissa esiintyvä plasmidi-vyöhyke tehtiin näkyväksi UV-valolla, eristettiin ja pois-25 tettiin sitten etidiumbromidi käyttämällä uuttamiseen ve- :1.·. dellä kyllästettyä butanolia. Plasmidivalmisteessa oleva • · ··, CsCl poistettiin sitten dialysoimalla TE-puskuria vastaan

• M

| . ja lopuksi DNA konsentroitiin käyttämällä PEG:a (M 8000).

• « . DNA-pitoisuus määritettiin spektrofotometrisesti käyttä- • it ·1·; 30 mällä aallonpituudella 260 nm saatua absorbanssilukemaa.

• 1 · • · · t f c < # · c « • « · « « · « · · • · • · · • · • · ♦ · · · • · · • · » • · • · · • « • · »»· 59 106965

Esimerkki 9

Peniclllium-transformaatiovektorin pPenFTSO konstruointi

Fleomysiiniresistenssigeenin sisällytys 5 Konstruoitiin Penicillium-transformaatiovektori, jossa oli fleomysiiniresistenssigeeni dominoivana vali-kointimarkkeina. Tämä tehtiin eristämällä ensin 660 ep:n fragmentti, joka sisälsi fleomysiiniresistenssigeenin (Streptoalloteichus hindustanusista peräisin oleva fleomy-10 siiniin sitoutuvaa proteiinia vastaava geeni) ja joka kytkettiin myös hiivan sytokromi Cl -terminaattoriin, joka oli peräisin plasmidin pUT713 (CAYLA, Toulouse Cedex, Ranska) BamHI-Bglll-pilkkomistuotteesta, tekemällä elektroforeesi agaroosigeeleillä ja eluointi niiltä. Eristetty 15 fragmentti ligatoitiin vektorin pSELECTR 1 (Promega Corporation) BamHI-kohtaan ja geenin orientaatio määritettiin restriktioentsyymianalyysillä. Tuloksena olevassa plasmidissa esiintyvä ainutkertainen HindiII-kohta poistettiin pilkkomalla HindIII:lla, täyttämällä Klenow-poly-20 meraasilla ja uudelleenligatoimalla. Seuraavaksi insertoi-tiin 550 ep:n Pstl-fragmentti, joka sisältää lambda cos -kohdan ja mahdollistaa vektorin käytön kosmidin muodostukseen, kun siihen sisällytetään sopivan kokoisia insert-tejä. Tästä vektorista käytetään merkintää pSCP4.

25 P. chrysogenum -genomi-DNA pilkottiin osittain :v. Sau3A:lla ja käytettiin kirjaston valmistamiseen faagivek- ··. torissa lambda EMBL3. Tästä kirjastosta eristettiin isope- [nisilliini N -syntetaasi (IPNS) -geenin sisältävä klooni

• V

„ ja käytettiin sitä valmistettaessa sarja aliklooneja, • •c 30 joista yksi sisälsi 3,6 ke:n fragmentin IPNS-geenin edellä • Λ · olevasta ensimmäisestä BamHI-kohdasta kyseisen geenin jäljessä olevaan ensimmäiseen HindiII-kohtaan. Tässä alikloo- 9 nissa oleva ainutkertainen Sali-kohta poistettiin pilkko-maila Sällillä, täyttämällä yksisäikeiset päät Klenow-po- /* : 35 lymeraasillla ja tekemällä uudelleenligatointi. Seuraavak- • « · • · « « · 4 · « · » • · · • · · M· • · « · M* 60 106965 si poistettiin ainutkertainen Xbal-kohta samalla tavalla pilkkomalla Xbal:llä, täyttämällä ja uudelleenligatoimal-la. Tuloksena olevasta plasmidista käytetään merkintää pSXF-1. Geeniteknisesti muodostettu IPNS-promoottori eris-5 tettiin geelillä pSXF-l:stä 1,2 ke:n Ncol-fragmenttina ja ligatoitiin edellä kuvatun pSCP4:n Ncol-kohtaan. Restrik-tiopilkonnalla määritetty orientaatio valittiin siten, että promoottori fuusioitui fleomysiiniresistenssigeeniin ATG-aloituskodonin kohdalla. Tästä plasmidista käytetään 10 merkintää pUTZ-2.

S. clavuligerusin ekspandaasigeenin sisällyttäminen 1,645 ke:n fragmentti, joka sisälsi Streptomyces clavuligerusin ekspandaasigeenin, puhdistettiin pFTS0-l:n (vektoria kuvattu edellä) BamHI- ja Sall-pilkkomistuot-15 teestä tekemällä elektroforeesi 0,8-%:isella agaroosigee-lillä ja eluointi siltä. Eristetty fragmentti ligatoitiin vektoriin pSELECT (Promega Corporation), joka myös oli pilkottu BanHI:llä ja Sällillä. Tämä vektori nimettiin pFTS0-8:ksi. Ekspandaasigeenin ATG-aloituskodonin kohdalle 20 muodostettiin uusi Ncol-kohta pFTS0-8:n kohtaspesifisellä mutageneesilla käyttämällä Altered Sites* in vitro Muta-genesis System -järjestelmää (Promega Corporation). Muta-geneesi tehtiin valmistajan ohjeiden mukaisesti. Konstruoitiin oligonukleotidi, joka oli komplementaarinen Strep-/ 25 tomyces-ekspandaasigeenin julkaistun sekvenssin [Kovacevic et ai., Journal of Bacteriology 171 (1990) 3952 - 3958] • · ;·. ATG-aloituskodonin kohdalla olevan DNA-alueen koodittaval- • 4 · #tt#« le sekvenssille. Tämä oligonukleotidi syntetisoitiin ke- • i . maallisella syanoetyylifosforamidiittimenetelmällä (Phar-

IM

30 macia Gene Assembler -laitteisto), ja oligosekvenssi oli • · · '·* ' seuraava: t SEQ ID NO: 8 \"·* 31 CGAGAGGATCAGTGAGAGTCCATGGACACGACGG 5' .*! : 35 • « • « • i <«( • 4 · 4*5 • ♦ · * * 4 4 4 « * « 4 4 4* 61 106965

Mutageneesi varmistettiin restriktioentsyymianalyysillä. Seuraavaksi eristettiin pUTZ-2:sta 1,2 ke:n Ncol-fragmentti, joka sisälsi geeniteknisesti muodostetun P. chrysoge-num -IPNS-promoottorialueen, pilkkomalla Ncolrllä ja teke-5 mällä sitten agaroosigeelielektroforeesi. IPNS-promoottorialue ligatoitiin vektoriin pFTSO-8 uuteen Ncol-kohtaan, joka oli muodostettu mutageneesilla ekspandaasigeenin ATG-aloituskodonin kohdalle. Promoottorin orientaatio ekspan-daasigeeniä kohti todettiin restriktioentsyymianalyysillä. 10 Tämä IPNS-promoottori:ekspandaasigeeni-kokoonpano poistettiin sitten BamHI-Sali-fragmenttina ja siirrettiin edellä kuvattuun BamHI-Sall-pilkottuun Penicilliian-transformaa-tiovektoriin pUTZ-2. Lopullinen konstruktio nimettiin pPenFTSO:ksi.

15 Esimerkki 10

Penicillium-transformaatiovektorin pPEN/CEPH-1 konstruointi IPNS-prmoottorialueen sisäilytys IPNS-promoottorialue eristettiin edellä esimerkissä 20 9 kuvatusta pUTZ-2:sta pilkkomalla Xholrllä ja Smal:llä.

Vektori pUTZ-2 pilkottiin BamHI:llä ja ulkonevat päät täytettiin käyttämällä dNTP:itä ja Klenow-fragmenttia, niin että saatiin tylpät päät, pilkottiin sitten XHoI:llä ja ligatoitiin eristetty XhoI-Smal-IPNS-promoottorifragmentti 25 tähän pilkottuun vektoriin, jolloin tuloksena oli rakenne, :V, joka sisälsi kaksi IPNS-promoottorialuetta. Tämä vektori j./ nimettiin pUTS-7:ksi.

* 1» . C. acremoniumin ekspandaasi-hydroksylaasigeenin , sisällytys «·« •••j 30 Toinen IPNS-promoottorialueista eristettiin sitten • · · *.’ 1 (agaroosigeelielektroforeesilla ja eluoinnilla) pUTZ-7:stä

Xhol-Xbal-fragmenttina ja ligatoitiin Xhol-Xbal-pilkottuun '”**· vektoriin pBluescript II SK (Stratagene, La Jolla, CA).

Tälle vektorille annettiin nimeksi pIPNSp/blue.

a · « « · « · · « « ««· a · • · 444 • · 4 4« 4 I » * 1 • · · < · · · 62 106965

Cephalosporiumin ekspandaasi-hydroksylaasigeeni eristettiin (agaroosigeelielektroforeesilla ja eluoinnil-la) 1,6 ke:n HindiII-Xbal-fragmenttina yhdestä edellä identifioidusta mainitunlaisesta genomikloonista ja liga-5 toitiin HindiII-Xbal-pilkottuun vektoriin pSELECT. Ekspan- daasi-hydroksylaasigeenin ATG-aloituskodonin kohdalle muodostettiin uusi BspHI-kohta kohtaspesifisellä mutagenee-silla käyttämällä Altered Sites™ in vitro Mutagenesis System -järjestelmää (Promega Corporation). Mutageneesi 10 tehtiin valmistajan ohjeiden mukaisesti. Konstruoitiin oligonukleotidi, joka oli komplementaarinen Cefalosporium acremonixmin ekspandaasi-hydroksylaasigeenin julkaistun sekvenssin [Samson et ai., Bio/Technology 5 (marraskuu 1987)] ATG-aloituskodonin kohdalla olevan DNA-alueen koo-15 dittavalle sekvenssille. Tämä oligonukleotidi syntetisoi tiin kemiallisella syanoetyylifosforiamidiittimenetelmällä (Pharmacia Gene Assembler -laitteisto), ja oligosekvenssi oli seuraava: 20 SEQ ID NO:9 3' GTTTTGGTGTCGTAGRAGTACTGAAGGTTCCAG 5'

Mutageneesi varmistettiin restriktioentsyymianalyysillä.

Cefalosporium acremoniumin ekspandaasi-hydroksylaasigeeni 25 eristettiin sitten (agaroosigeelielektroforeesilla ja elu- JV. oinnilla) BspHI-Xbal-fragmenttina ja ligatoitiin Ncol- ·♦. Xbal-pilkottuun vektoriin pIPNSp/blue, jota kuvattiin • *· edellä tässä esimerkissä. Tämä vektori sisälsi nyt Peni-c cilliumin IPNS-promoottorin Cefalosporium acremoniumin 30 ekspandaasi-hydroksylaasigeenin ATG:n kohdalla. Tälle vek- • f » *·* 1 torille annettiin nimeksi pIPNSp/EXP/blue. Tämä IPNS-pro- moottori:ekspandaasi-hydroksylaasi-kokoonpano pilkottiin * osittain XhoI:llä ja täydellisesti Xbaltllä, ja eristämäl- < < * ' i lä fragmentti (agaroosigeelielektroforeesilla ja eluoin- . 35 nilla) ja ligatoimalla se edellä tässä esimerkissä kuvat- • · · • · • · · • · • · • * · « • · t « i • · « • · («» • · • ♦ • > · ., 106965 63 tuun XhoI-Xbal-pilkottuun vektoriin pUTZ-2 saadaan lopullinen transformaatiovektori pPEN/CEPH-1.

Esimerkki 11

Penlcilllum-transformaatiovektorin konstruointi 5 sekä S. clavuligerusin ekspandaasi- että sen hyd- roksylaasigeenien ilmentämiseksi P. chrysogenumin β-tubuliinigeeni kloonattiin lamb-da-genomikirjastosta käyttämällä Aspergillus nigerln B-tubuliinigeeniä hybridisaatiokoettimena. 2,0 ke:n Xbal-10 HindiII-fragmentti, joka sisälsi Penicilliumin B-tubulii- nipromoottorin, ligatoitiin pSELECTin (Promega) Xbal-HindlII-kohtiin. ATG-aloituskodonin kohdalle tuotiin Ncol-kohta muuttamalla kohtaspesifisellä mutageneesilla sekvenssi AAAATGCGT sekvenssiksi ACCATGGGT. Tuloksena olevas-15 ta vektorista eristettiin geelillä 1,4 ke:n BamHI-NcoI-fragmentti ja ligatoitiin se pUTZ-2:n (kuvattu edellä) BamHI- ja Ncol-kohtiin, jolloin muodostui vektori pCI-6. P. chrysogenum -genomikloonista eristettiin geelillä 5,1 ke:n Sali-fragmentti, joka sisälsi sekä IPNS- että 20 asyylitransferaasigeenit, ja ligatoitiin se pUTZ-2:n Sali-kohtaan, jolloin syntyi pUTZ-5. IPNS-geenin 3’-terminaat-torisekvenssi eristettiin pUTZ-5 :stä pilkkomalla BamHI :llä ja HindIII:lla, minkä jälkeen eristettiin geelillä « « < «ttt? 1,3 ke:n fragmentti, joka ligatoitiin pCI-6:n (kuvattu 25 edellä) BamHI- ja Hindlll-kohtien väliin, jolloin saatiin ·*·.. pCI-13. pCI-13:n BamHI-kohdan lähellä oleva ainutkertainen

Sali-kohta poistettiin restriktiolla, Klenow-polymeraasi-täytöllä ja uudelleenligatoinnilla. Uusi Sali-kohta tuoliin tiin kyseisen BamHI-kohdan toiselle puolelle muuttamalla • « · * 30 kohtaspesifisellä mutageneesilla sekvenssi GGAAGACG sek venssiksi GGTCGACG. Ampisilliiniresistenssigeeni poistet- • · · · · tiin sitten plasmidista pilkkomalla Pvul:llä, eristämällä • · · suurempi fragmentti geelillä ja uudelleenligatoimalla, jolloin saatiin pCI-15. Lopuksi IPNS-promoottori:ekspan-35 daasigeeni-kokoonpano eristettiin pPENFTSO:sta 2,4 ke:n « · · « « « « * · • i « • * • · » # · • · « · · 64 106965

BamHI-Sall-fragmenttina ja ligatoitiin pCI-15:een, jolloin saatiin pEXP-1.

Vektorin konstruointi sekä S. clavuligerusin eks-pandaasi- että sen hydroksylaasigeenien ilmentämiseksi 5 käsittää seuraavat vaiheet. 2,9 kein Kpnl-fragmentti, joka sisältää hydroksylaasigeenin, alikloonataan pSELECTiin, niin että polykytkijässä oleva EcoRI-kohta on geenin 5'-pään vieressä. Plasmidissa oleva ainutkertainen Ncol-kohta poistetaan muuttamalla kohtaspesifisellä mutageneesilla 10 sekvenssi TCCATGGGC sekvenssiksi TCGATGGGC ja tuodaan samanaikaisesti uusi Ncol-kohta aloituskodonin kohdalle muuttamalla sekvenssi AACATGGC sekvenssiksi ACCATGGC. Koo-ditettu aminohapposekvenssi säilyy kummassakin muutoksessa. 1,0 kb:n EcoRI-NcoI-fragmentti, joka sisältää geeni-15 teknisesti muodostetun IPNS-promoottorin, eristetään geelillä pUTZ-2:sta ja ligatoidaan edellä mainitun, muunnetun hydroksylaasigeenin sisältävän vektorin EcoRI- ja Ncol-kohtien väliin. Seuraavaksi muutetaan tuloksena olevassa vektorissa oleva ainutkertainen EcoRI-kohta Hindlll-20 kohdaksi kohtaspesifisellä mutageneesilla. 5'IPNS:hydrok- sylaasi-fuusiorakenne eristetään tuloksena olevasta vektorista HinduI-fragmenttina, joka ligatoidaan sitten edellä kuvatun vektorin pEXP-1 ainutkertaiseen HindiII-kohtaan.

< i t •<t<: Lopullinen vektori sisältää ekspandaasi- ja hydroksylaasi- ; 25 geenit, joita kumpaakin ohjaa IPNS-promoottori, ja B-tubu- liinipromoottorin ohjauksessa olevan fleomysiiniresistens- ····· simarkkerin.

« o

Esimerkki 12 • · « «

Penicillium-transformaatiovektorin pPenCACT kon- • < · 30 struointi . Hygromysiiniresistenssigeenin sisällytys ΙΜ·Ι

Konstruoitiin Penicillium-transformaatiovektori, jossa oli hygromysiiniresistenssigeeni dominoivana vali-kointimarkkerina. E. colin hygromysiini B -fosfotransfe-35 raasigeeni eristettiin (agaroosigeelielektroforeesilla ja « « « « · < · « « · « « · 65 106965 eluoinnilla) 1,15 ke: n BamHI-fragmenttina vektorista pHph-1 (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN) ja ligatoitiin se BamHI-pilkottuun vektoriin mpl9. Hygromysiiniresistens-sigeenin orientaatio mpl9:ssä määritettiin RF-DNA:n rest-5 riktioentsyymianalyysillä. 5'-BamHI-kohta on lähellä hyg-romysiiniresistenssigeenin ATG-aloituskodonia. Jotta helpotetaan vaihtoehtoisen promoottorin sijoittamista tähän 5'-BamHI-kohtaan, poistettiin 3'-BamHI-kohta kohtaspesifi-sellä mutageneesilla käyttämällä Mutator™ Site Directed 10 Mutagenesis Kit -välineistöä (Stratagene, La Jolla, CA). Mutageneesi tehtiin valmistajan ohjeiden mukaan. Konstruoitiin oligonukleotidi, joka oli komplementaarinen E. colin hygromysiini B -fosfotransferaasigeenin julkaistun sekvenssin [Gritz, L. ja Davies, J., Gene 25 (1983) 179] 15 3'-BamHI-kohdan DNA-alueelle. Tämä oligonukleotidi synte tisoitiin kemiallisella syanoetyylifosforamidiittimenetel-mällä (Pharmacia Gene Assembler -laitteisto), ja oligosek-venssi oli seuraava: 20 SEQ ID NO:10 5' TACCCGGGGTTCCCGCGAACT 3'

Mutageneesi varmistettiin restriktioentsyymianalyysillä. Mutagenisoitu hygromysiiniresistenssigeeni eristettiin {'· : 25 sitten Smal-Xbal-fragmenttina (agaroosigeelielektroforee- silla ja eluoinnilla) ja ligatoitiin Smal-Xbal-pilkottuun vektoriin pUC18.

Penicillixmin IPNS-promoottori eristettiin (agaroo-sigeelielektroforeesilla ja eluoinnilla) 1,2 ke:n Ncol- « « · 30 fragmenttina Ncol-pilkotusta vektorista pUTZ-2 (vektoria , kuvattu edellä). Valmistettiin synteettisiä oligonukleoti- dikytkijöitä BamHI-kohdan muodostamiseksi IPNS-promootto- • « «.·* rifragmentin Ncol-kohdista, jotta IPNS-promoottori tulee :*·.· sijoitetuksi 5’-BamHI-kohtaan hygromysiiniresistenssigee- « · .**·. 35 nin ATG:n lähelle. Oligonukleotidit syntetisoitiin kemi- • « • · · • # · • · « · · • · • · « · · M 106965 66 allisella syanoetyylifosforiamidiittiinenetelmällä (Pharmacia Gene Assembler -laitteisto), ja oligosekvenssit olivat seuraavat: 5 SEQ ID NO:11 5f CATGAAGAAG 3' SEQ ID NO:12 3’ TTCTTCCTAG 5’ 10 Tässä sekvenssissä on tallella IPNS-promoottorin luontainen sekvenssi, mutta hygromysiinigeeniin on insertoitunut kaksi aminohappoa. Oligonukleotidit pariutettiin, fosfory-loitiin ja ligatoitiin Ncol-pilkottuun IPNS-promoottori-fragmenttiin, jolloin tuloksena oli BamHI-kohdat IPNS-pro-15 moottorin molemmissa, 5'- ja 3'-päissä. Tämä kytkijällä varustettu promoottori ligatoitiin pUC18:ssa olevaan BamHI-pilkottuun hygromysiiniresistenssigeeniin ja orientaatio varmistettiin restriktioentsyymianalyysillä. Tämä IPNS-promoottori: hygromysiiniresistenssigeeni-kokoonpano 20 eristettiin sitten (agaroosigeelielektroforeesilla ja elu-oinnilla) 2,1 ke:n XhoI-Sall-fragmenttina (Xhol-kohta sijaitsee IPNS-promoottorin 5’-päässä, ja Sali-kohta on peräisin pUC-polykytkijästä) ja ligatoitiin Sali-pilkottuun < t t tic! vektoriin pSELECT. Kokoonpanon orientaatio määritettiin 25 restriktioentsyymianalyysillä. Tämä vektori nimettiin ·1·.. pIPNS/HYG: ksi.

Cephalosporixm acremoniumin asetyylitransferaasi-geenin sisällytys

Cephalosporixjmin asetyylitransferaasigeeni eristet- • ♦ « 30 tiin genomikloonista (kuvattu edellä) 1,8 ke:n BGIII/Sall-fragmenttina agaroosigeelielektroforeesilla ja eluoinnil- ····· la. Asetyylitransferaasigeeni ligatoitiin BamHI-Sall-pil- t · kottuun vektoriin pSELECT. Jotta helpotetaan Penicillivmin :1«.· IPNS-promoottorin sijoittamista Cephalosporiumin asetyyli- « « .1·1. 35 transferaasigeenin ATG-kodonin kohdalle, muodostettiin « · · « « « « t · « · « 67 106965 uusi Ncol-kohta asetyylitransferaasigeenin ATG-kodonin kohdalle ja poistettiin rakennegeenissä oleva sisäinen Ncol-kohta kohtaspesifisellä mutageneesilla käyttämällä Altered Sites™ in vitro Mutagenesis System -järjestelmää 5 (Promega Corporation). Mutageneesi tehtiin valmistajan ohjeiden mukaisesti. Konstruoitiin oligonukleotidit, jotka olivat komplementaarisia edellä (SEQ ID NO:l ja 2) esitetyn Cephalosporlumin asetyylitransferaasigeenisekvenssin kiinnostuksen kohteina olevien DNA-alueiden koodittavalle 10 sekvenssille. Oligonukleotidisekvenssi, jota käytettiin poistamaan rakennegeenissä oleva sisäinen Ncol-kohta, oli seuraava: SEQ ID NO:13 15 3’ GTCGGCGCATCGATGGGTGGAAT 5'

Oligonukleotidisekvenssi, jota käytettiin uuden Ncol-koh-dan muodostamiseen ATG-aloituskodonin kohdalle, oli seuraava : 20 SEQ ID NO:14 3' CGCCCACCATGGCGCCTCAGAT 5' Nämä oligonukleotidit syntetisoitiin kemiallisella sya-: ‘ 25 noetyylifosforamidiittimenetelmällä (Pharmacia Gene ;1·.. Assembler -laitteisto). Mutageneesi varmistettiin res- ·:1·· triktioentsyymianalyysillä. Tämä vektori nimettiin pMUTACT:ksi.

* 1 1 ♦

PenicilUumin IPNS-promoottori eristettiin (agaroo- • i « 30 sigeelielektroforeesilla ja eluoinnilla) 1,2 ke:n Ncol- fragmenttina edellä yhdessä esimerkissä kuvatusta vekto- * · · · · rista pUTZ-2. Tämä promoottorifragmentti ligatoitiin Ncol- pilkottuun vektoriin pMUTACT, jossa IPNS-promoottori si- :1·.· joittui nyt suoraan Cephalosporium aeremoniumin asetyyli- .2·. 35 transferaasigeenin ATG-kodonin kohdalle. Promoottorin • · · • · * · · • · · · • · * · 2 • » 68 106965 orientaatio varmistettiin restriktioentsyymianalyysillä. TämälPNS-promoottori:asetyylitransferaasigeeni-kokoonpano pilkottiin XhoI:llä ja Sällillä (Xhol-kohta on IPNS-pro-moottorin 5'-päässä ja Sali-kohta on asetyylitransferaasi-5 geenin 3'-päässä) ja ligatoitiin Sali-pilkottuun vektoriin pSELECT. Fragmentin orientaatio varmistettiin restriktioentsyymianalyysillä. Tälle vektorille annettiin nimeksi pMUTACT/IPNS.

Mutageneesi, jota käytettiin aikaansaamaan uusi 10 Ncol-kohta asetyylitransferaasigeenin ATG-kodonin kohdalle, johti toisen aminohapon muuttumiseen seriinistä ala-niiniksi. Koodittavan sekvenssin pitämiseksi identtisenä luontaisen geenin kanssa tehtiin kohtaspesifinen mutageneesi käyttämällä Altered Sites™ in vitro Mutagenesis Sys-15 tern -järjestelmää. Konstruoitiin oligonukleotidi, joka oli komplementaarinen edellä (SEQ ID NO:l ja 2) esitetyn ase-tyylitransferaasigeenisekvenssin kiinnostuksen kohteena olevan DNA-alueen koodattavalle sekvenssille. Oligonukleo-tidisekvenssi, jota käytettiin toisen aminohapon muuttami-20 seen alaniinista seriiniksi, oli seuraava: SEQ ID NO:15 3' TCTAGCTAGACACCATGTCGCCTCAGAT 5' i c t : 25 Oligonukleotidi syntetisoitiin kemiallisella syano- ·*·.. etyylifosforamidiittimenetelmällä (Pharmacia Gene *;··ί Assembler -laitteisto). Mutageneesi varmistettiin DNA-sek- ventoinnilla käyttämällä ASB Seguenase Version 2.0 DNA Sequencing Kit -välineistöä (USB, Cleveland, Ohio). Sek- • · < 30 ventointialukkeet syntetisoitiin kemiallisella syanoetyy- . lifosforamidiittimenetelmällä (Pharmacia Gene Assembler ··♦ · · -laitteisto). Tälle vektorille annettiin nimeksi • ·· pMUTACT/IPNS-2.

; ; IPNS-promoottori:hygromysiiniresistenssigeeni- 35 kokoonpano poistettiin vektorista pIPNS/HYG Xbal-frag- 4 · • · · • · « · « « « • · κο 106965 69 menttina ja ligatoitiin Xbal-pilkottuun vektoriin pMUTACT/IPNS-2, jolloin saatiin lopullinen transformaatio-vektori pPenCACT. Hygromysiinikokoonpanon orientaatio määritettiin restriktioentsyymianalyysillä.

5 Esimerkki 13

PenicxZllum-transformaatiovektorin pTS-8 konstruointi sekä Cephalosporiim acremoniumin ekspandaasi-hydroksylaasigeenin että sen asetyylitransferaasi-geenin ilmentämiseksi 10 Cephalosporium acremoniumin asetyylitransferaasi- geeni eristettiin (agaroosigeelielektroforeesilla ja elu-oinnilla) 1,8 ke:n Bglll/Sali-fragmenttina genomikloonista ja ligatoitiin BamHI-Sall-pilkottuun vektoriin pSELECT (Promega Corporation). Jotta helpotetaan Penicilliumin 15 IPNS-promoottorin sijoittamista Cephalosporlumin asetyyli- transferaasigeenin ATG-kodonin kohdalle, muodostettiin uusi Ncol-kohta emäsasemassa -42 olevan ATG-kodonin kohdalle (Mathison et ai., Current Genetics, jätetty julkaistavaksi) ja poistettiin rakennegeenissä oleva sisäinen 20 Ncol-kohta kohtaspesifisellä mutageneesilla käyttämällä

Altered Sites™ in vitro Mutagenesis System -järjestelmää (Promega Corporation). Mutageneesi tehtiin valmistajan ohjeiden mukaisesti. Konstruoitiin oligonukleotidit, jotka • « « ·,,,· olivat komplementaarisia kiinnostuksen kohteina olevien < < c l \ 25 alueiden DNA-skevenssille, mutta sisälsivät muutamia muu- toksia Ncol-kohdan luomiseksi tai poistamiseksi. Rakenne-·;··· geenin sisäisen Ncol-kohdan poistamiseen käytetty oligo- .:. nukleotidi sekvenssi oli seuraava: ··«» • · · • · » • · · 30 SEQ ID NO:16 . . 3? GTCGGCGCATCGATGGGTTTGGAAT 5' ·*· ^ t <;** Oligonukleotidisekvenssi, jota käytettiin muodostamaan ; uusi NCol-kohta emäsasemassa -42 olevan ATG-kodonin koh- 35 dalle, oli seuraava: cc* < < « c 70 106965 SEQ ID NO:17 3' CTCCGATAGGGCGTGGTACCCGGCCCTACTCTTAT 5'

Oligonukleotidit syntetisoitiin kemiallisella syanoetyy-5 lifosforamidiittimenetelmällä (Pharmacia Gene Assembler -laitteisto). Molemmat mutageneesitapahtumat varmistettiin restriktioentsyymianalyysillä. Tälle vektorille annettiin nimeksi pMUTACT. Penicllliumin IPNS-promoottori eristettiin (agaroosigeelielektroforeesilla ja eluoinnilla) 10 1,2 ke:n Ncol-fragmenttina edellä kuvatusta vektorista pUTZ-2. Tämä promoottorifragmentti ligatoitiin Ncol-pil-kottuun vektoriin pMUTACT, jossa IPNS-promoottori sijoittui nyt suoraan Cephalosporiumin asetyylitransferaasigee-nin asemassa -42 olevan ATG-kodonin kohdalle. Promoottorin 15 orientaatio varmistettiin restriktioentsyymianalyysillä.

Tälle vektorille annettiin nimeksi pMUTACT/IPNS. Eristettiin (agaroosigeelielektroforeesilla ja eluoinnilla) 2,5 kein XhoI-Sall-fragmentti vektorista pMUTACT/IPNS, joka sisälsi IPNS-promoottori:asetyylitransferääsi-kokoon-20 panon, ja ligatoitiin Sali-pilkottuun vektoriin pUTZ-2 (kuvattu edellä). Tämä välituotevektori pilkottiin sitten Xbalillä ja ligatoitiin 2,1 kein Xbal-fragmentin kanssa, joka oli peräisin (edellä kuvatusta) vektorista pPEN/CEPH-\ ' 1, joka sisältää IPNS-promoottoriihydroksylaasi-kokoonpa- r ' 25 non, jolloin saatiin lopullinen transformaatiovektori i‘·.. pTS-8.

····· Esimerkki 14

Penicillixm chrysogenumin transformointi • «te

Muodostettiin protoplasteja edellä kuvatusta Peni- • · o 30 cillium chrysogenum -kannasta inokuloimalla 50 ml CM-lien- . tä 1·107 itiöllä 67 tuntia lämpötilassa 25 °C pyöröravisti- • · ·· · ]##* mella kierrostaajuudella 220 min-1. Myseelit kerättiin suo- e e dattamalla juustokangassuodattimille, siirrettiin 500 ml in pulloihin, suspendoitiin uudelleen 25 ml:aan KMPitä

« I

35 (0,7 mol/1 KClia, 0,8 mol/1 mannitolia, 0,02 mol/1 KP04:a, < I · I ·

Cl· ( < · « « C < ( ( · • < ( « 71 106965 pH 6,3), joka sisälsi 100 mg Novozyme 234:ää (Novo Bio-labs, Bagsvaerd, Tanska) ja inkuboitiin lämpötilassa 30 °C kierrostaajuudella 100 min-1. Sferoplastit erotettiin suodattamalla juustokangas/lasivillasuodattimien läpi ja pel-5 letoitiin sentrifugoimalla kiihtyvyydellä 350·G 10 min. Sferoplastit pestiin sitten kolmesti 10 ml:11a KMP-pusku-ria, suspendoitiin sitten uudelleen KMPC:hen (KMP, joka sisältää 50 mmol/1 CaCl2:a) pitoisuudeksi 5·107 solua/ml ja jätettiin sitten huoneenlämpötilaan 20 min:n ajaksi. Peni-10 cllliumin transformoimiseksi lisättiin 200 μΐ sferoplasti-suspensiota DNA:han (5 pg vektori-DNA:ta 6,2 pl:ssa KMPC:tä, joka sisältää 5 mg/ml hepariinia) PPC:n (50 μΐ) ohella (40 % PEG:a, M 3500, 20 mmol/1 KP04:a, pH 6,3, lisättiin juuri ennen käyttöä 5 % CaCl2:a) ja transfor-15 maatioseosta inkuboitiin jäähauteessa 30 min. Lisättiin 1 ml juuri valmistettua PPC:tä ja seos siirrettiin 50 ml:aan sulatettua (50 °C) regenerointiagaria (CM ynnä 1,3 mol/1 mannitolia ja 3 % agaria). Transformaatioseos jaettiin sitten 5 petrimaljan kesken. Kun oli regeneroitu 20 24 tuntia lämpötilassa 25 °C, maljat peitettiin OL:llä (1 % peptonia l-%:isessa agarissa), joka sisälsi 100 pg/50 ml fleomysiiniä. Peittokerroksen määrä oli sama kuin regenerointiagarin. Maljoja inkuboitiin lämpötilassa

« 4 C

, ,f 25 °C 7 - 14 vuorokautta ja tarkkailtiin transformanttipe- 25 säkkeiden muodostumista.

Γ*.. Esimerkki 15 ·;**; Bioaktiivisuusmääritykset • i. Biologista agardiffuusiomääritystä käytettiin HPLC:llä eristettyjen adipoyyli-6-APA- ja adipoyyli-7- 30 ADCA-fermentointituotteiden antibioottiaktiivisuuden mää- . rittämiseen. 20 μΐ eristettyä tuotetta levitettiin 5 mm:n ...* kiekkoihin, jotka olivat LB-agarmaljalla (20 g/1 LB Broth * · ···* Basea, 3 % agaria, Gibco, Paisley, Skotlanti), johon oli siirrostettu Bacillus subtilus ATCC 33677:ää tai E. coli 35 Super Sensitive -kantaa (toimittaja professori Arnold L.

4 4« • · « · 444 72 106965

Demain, MIT). Bacillus subtilusia käytettiin indikaattori-kantana adipoyyli-6-APA-tuotteen tutkimiseen ja E. colx Super Sensitive -kantaa indikaattorikantana adipoyyli-7-ADCA-tuotteen tutkimiseen. Kun oli inkuboitu 15 tuntia 5 lämpötilassa 37 “C, indikaattoribakteerien kasvun estoren-gas kiekon ympärillä osoitti, että tuotteilla oli biologista aktiivisuutta. Tässä kokeessa käytettyihin vertailu-näytteisiin kuuluivat deasetoksikefalosporiini C, kefalo-sporiini C, penisilliini V ja penisillinaasia sisältävä 10 tai penisillinaasia sisältämätön agar vertailunäytteenä B-laktaamirakenteiden varmistamiseksi.

Esimerkki 16 HPLC-menetelmä adipoyyli-6-ÄPÄ:n, -7-ADCA:n, -7-ADAC:n ja -7-ACA:n analysoimiseksi samanaikaisesti 15 Transformoiduista Penicillium-kannoista saadut fer- mentointituotteet (adipoyyli-6-ACA, adipoyyli-7-ADCA, adi-poyyli-ADAC ja adipoyyli-7-ACA) analysoitiin samanaikaisesti suurtehonestekromatografialla (HPLC). HPLC-järjes-telmä koostui seuraavista Watersin komponenteista: liuot-20 teensyöttöj ärjestelmä 625, aallonpituussäädöllä varustettu detektori (asetettu aallonpituuksille 220 ja 260 nm) ja tietojärjestelmä 825 Maxima. Stationaarifaasi oli Nova-Pak C18 säteittäispuristuspatruuna (5 x 100 mm), jossa oli

< ( I

Nova-Pak C18 Guard-Pak -sisäkappale. Liikkuva faasi (vir- • 25 tausnopeus 1 ml/min) koostui lineaarisesta gradientista, joka muuttui 10 min:ssa alkutilanteesta 5 % metanolia ja ··«·· 95 % KP04-liuosta (10 mmol/1), pH 5, lopputilanteeseen 40 % * .j. metanolia ja 60 % KP04-liuosta, pH 5. Adipoyyli-6-APA mää- ··«*

.·:·. ritettiin kvantitatiivisesti vertaamalla penisilliini N

• · · 30 -standardikäyrään aallonpituudella 220 nm. Laajennustuot- . teet määritettiin kvantitatiivisesti vertaamalla synteet- ·«♦·« tiselle adipoyyli-7-ADCA:lle ja adipoyyli-7-ACA:lie mitat- • · ·”* tuihin standardikäyriin.

• * « · · t «· • · • « « a · a · • « « « « « « · « · · • · M» t · • · • · · 73 106965

Esimerkki 17 RAEV-entsyymimääritykset

Kemiallisesti syntetisoitua adipoyyli-7-ADCA:ta ja adipoyyli-7-ACA:ta käytettiin substraatteina RAEV-entsyy-5 min (saatavana kaupallisesti, RAEV Corp.) ominaisaktiivi-suuden määrittämiseksi. Reaktioseos käsitti 10 mmol/1 substraattia, 1 pg RAEV-entsyymiä ja 5 % glyserolia KH2P04-liuoksessa (0,16 mol/1) kokonaistilavuuden ollessa 50 μΐ, ja sitä inkuboitiin lämpötilassa 37 eC. (Optimaalisemmissa 10 reaktio-olosuhteissa käytetään substraattipitoisuutta vähintään 20 mmol/1 kaliumfosfaattipuskurissa, jonka konsen-traatio on 20 - 50 mmol/1.) Otettiin 5 pl:n annoksia ajan-hetkillä 0, 1, 3, 5, 10, 20 ja 30 min, laimennettiin ne 35 piillä KH2P04-puskuria (0,010 mol/1), pH 3,5, ja pakas-15 tettiin lämpötilassa -70 °C ennen analysointia HPLCillä edellä kuvatuissa olosuhteissa.

RAEV-entsyymin aktiivisuus kolorimetrisen adipoyy-li-P-aminobentsoehapposubstraatin suhteen määritettiin käyttämällä 5 mmol/1 substraattia, 8,25 pg RAEV-entsyymiä 20 ja 10 % glyserolia KH2P04-puskurissa (0,065 mmol/1), pH 7,0, kokonaistilavuuden ollessa 50 pl 30 min:n ajan lämpötilassa 37 eC. Reaktio toteutettiin 96-syvennyksisessä mikromaljassa. 50 pl suhteessa 1:100 laimennettua liuosta, i c f joka sisälsi 1 mol/1 NaN02:ä etikkahappoliuoksessa ‘ 25 (0,25 mol/1), lisättiin reaktion keskeyttämiseksi ja reak- tioseoksen annettiin seistä huoneenlämpötilassa 3 min. ·;··; Lisättiin 100 pl NaC03-liuoksella (0,5 mol/1) suhteessa •j. 1:100 laimennettua liuosta, joka sisälsi 10 mg/ml 4-amino- • 4 « « 5-hydroksi-2,7-naf taleenidisulf onihappomononatriumsuola- • · · 30 hydraattia vedessä, ja seurattiin värin kehittymistä välittömästi aallonpituudella 515 nm käyttämällä EL-312 Bio- • 0 ... kinetics Plate Reader -laitetta (BioTek Instruments).

• · « • · • · « • · • « · • · • · « « · • · • 1 · « 1 · • « · · • · • · • · · 74 106965

Esimerkki 18

Vaihtoehtoisten adipoyyliasylaasien arviointi REAV-entsyymitutkimusten lisäksi adipoyylisivuket-jun poistuminen adipoyyli-7-ADCA:sta (ja muista adipoyyli-5 yhdisteistä) osoitettiin erilaisista mikrobilähteistä tuotetuilla entsyymeillä. Yhdessä alustavassa tutkimuksessa kasvatettiin Asahin Pseudomonas sp. -kantoja DE-83 ja SE-495 (talletettu the Fermentation Research Instituteen saantinumeroilla FERM BP-917 ja vastaavasti FERM BP-818) 10 ja Toyo Jozon Pseudomonas -kantaa SY-77-1- (talletettu the Northern Regional Reserach Laboratoryyn saantinumerolla NRRL B-8070) 72 tuntia alustassa, joka sisälsi 2,0 % (pai-no/tilavuus) HyCase SF:ää, 0,5 % (paino/tilavuus) mononat-riumglutamaattia, 0,5 % (paino/tilavuus) hiivauutetta, 15 0,2 % (paino/tilavuus) maissiuutejauhetta, 0,5 % (pai no/tilavuus) puuvillansiemenöljyä ja 0,1 % (paino/tilavuus) glutaarihappoa. Solut otettiin talteen sentrifugoi-malla ja pestiin fosfaattipuskurilla (50 mmol/1), pH 8,0; ne suspendoitiin sitten uudelleen puskuriin ja ulkokal-20 voista tehtiin läpäiseviä lisäämällä pieni tilavuus kloroformia. Solususpensioannoksia sekoitettiin sitten adipoyy-li-para-nitroanilidin (ad-pNA) kanssa ja inkuboitiin lämpötilassa 30 °C 2 - 18 tunnin ajan. Inkuboinnin jälkeen seokset tehtiin happamiksi lisäämällä 10 til-% etikkahap- • \ 25 poa. Vapautunut p-nitroanilidi detektoitiin sitten kolori- metrisesti, kun se oli muutettu diatsoyhdisteeksi käyttä-·;··; mällä reagensseja, joita Sigma Chemical Company toimittaa väleineistön muodossa gamma-glutamyylitransferaasimääri- • · ·· tystä varten (Sigman tuotenumero 545-A). Näiden kolmen • · · 30 kannan SE-495, SE-83 ja SY-77-1 suhteelliset aktiivisuudet . olivat 100, 85,5 ja vastaavasti 48 %. Käyttämällä edellä REAV-entsyymin yhteydessä kuvattujen kaltaisia menetelmiä • · *;·’ osoitettiin myös SE-83- ja SE-495-entsyymien aktiivisuus adipoyyli-7-ADCA:n suhteen. SY-77-1 :n beeta-laktamaasituo- 11« « · « · • « · • · • · · « · · « · « « « ' · « · « | · 75 106965 tanto esti tämän kannan deasylointiaktiivisuuden osoittamisen adipoyyli-7-ADCA:n suhteen.

Osoitettiin samanlaisilla menetelmillä adipoyyli-asylaasituotanto myös kahden sienikannan kohdalla [Alter-5 näriä sp. MA-133, ATCC-nro 20492 ja Aspergillus sp. MA-13, ATCC-nro 20491; viittaus US-patenttijulkaisuun 4 141 790 (Meiji Seika Kaisha Ltd.)] ja kolmen lisäbakteerikannan kohdalla [Brevihacteriuzn, ATCC-nro 14649, Achromobacte-rium, ATCC-nro 14648 ja Flavobacterium, ATCC-nro 14650, 10 joita on kuvattu kefalosporiini C -asylaasin tuottajiksi US-patenttijulkaisussa 3 239 394 (Merck & Co., Inc.)].

• · » ·· • « ·«« « ··« ··· ♦ « · « · o ««!·! • · ··· • · « « « « « « · « « · • « Λ • · « « « • 1 « · • · · • · t I · • · · » · 1 · • · • · ♦ · · 76 1 0 6 9 6 5

Sekvenssilista: (1) GENERAL INFORMATION: (i) APPLICANT: Conder, Michael J.

McAda, Phyllis Rambosek, John 2 Reeves* Christopher D.

(ii) TITLE OF INVENTION: Novel Bioprocess for Preparing 7-ACA and 7-ADAC

(iii) NUMBER OF SEQUENCES: 17 (iv) CORRESPONDENCE ADDRESS: (A) ADDRESSEE: Merck & Co., Inc.

10 (B) STREET: 126 E. Lincoln Ave (C) CITY: Rahway (D) STATE: New Jersey

(E) COUNTRY: USA

(F) ZIP: 07065 (v) COMPUTER READABLE FORM: (A) MEDIUM TYPE: Floppy disk 15 (B) COMPUTER: IBM PC compatible

(C) OPERATING SYSTEM: PC-DOS/MS-DOS

(D) SOFTWARE: Patentin Release #1.0, Version #1.25 (vi) CURRENT APPLICATION DATA: (A) APPLICATION NUMBER: (B) FILING DATE: (C) CLASSIFICATION: 20 (viii) ATTORNEY/AGENT INFORMATION: (A) NAME: Speer, Raymond M.

(B) REGISTRATION NUMBER: 26,810

(C) REFERENCE/DOCKET NUMBER: 18572IA

«I I

.* (ix) TELECOMMUNICATION INFORMATION: ··... (A) TELEPHONE: (908) 594-4481 * . 25 (B) TELEFAX: (908) 594-4720 • e v e ·*( •

Htt • eo • « · e c o e • » ··· • *> ¢.

’· c ' c ( t f 4

(U

t

f I « < I

< « « « I It· « ( « · « · (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:l: 106965 (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 14 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: double (D) TOPOLOGY: linear 5 (ii) MOLECULE TYPE: DNA (genomic) (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:l: TCTAGACACC ATGG 14 10 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:2: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 16 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: double (D) TOPOLOGY: linear 15 (ii) MOLECULE TYPE: DNA (genomic) (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID N0:2: GTGAGAGTTG ATGGAC 16 20 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:3: • · (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 16 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) S1RANDEDNESS: double ·:··: (D) TOPOLOGY: linear ..Ii* (ii) MOLECULE TYPE: UNA (genomic) • · · • · · • · · ' · (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:3: • · .··*. 30 TCTAGACACT ATGGAC 16 • · · • e t tic c « • · · • « • « • · · • » I I * • · (2) INFORMATION FOR SEQ ID N0:4: 106965 (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 16 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: double (D) TOPOLOGY: linear 5 (ii) MOLECULE TYPE: DNA (genomic) (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:A: TCTAGACACC ATGGAC 16 10 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO;5: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 22 amino acids (B) TYPE: amino acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear 15 (ii) MOLECULE TYPE: peptide (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:5:

Ser Asn Ser Gly Ala Val Ala Pro Gly Lys Thr Ala Asn Gly Asn Ala 20 1 5 10 15

Leu Leu Leu Gin Asn Pro 20 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:6: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: * / 25 (A) LENGTH: 22 amino acids ·;1 (B) TYPE: amino acid (O STRANDEDNESS: single v : (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE TYPE: peptide • · ·»« • t » • · · I · « 79 106965 (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:6:

Ser Asn Ser Trp Ala Val Ala Pro Gly Lye Thr Ala Aan Gly Asn Ala 1 5 10 15

Leu Leu Leu Gin Asn Pro 20 5 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:7: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 22 amino acids (B) TYPE: amino acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear 10 (ii) MOLECULE TYPE: peptide (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:7:

Ser Asn Asn Trp Ala Val Ala Pro Gly Arg Thr Ala Thr Gly Arg Pro 15 1 5 10 15 lie Leu Ala Gly Asp Fro 20 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:8: 20 (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 34 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE TYPE: DNA (genomic) 25 • · · (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:8: • · · CGAGAGGATC AGTGAGAGTC CATGGACACG ACGG 34 • · · · · • e • » * • . · 1 • · » » (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:9: 106965 (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 33 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear 5 (ii) MOLECULE TYPE: SNA (genomic) (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:9: GTTIIGGIGT CGTAGIAGTA CTGAAGGTTC CAG 33 10 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:10: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 21 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single 15 (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE TYPE: DNA (genomic) (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:10: 20 TACCCGGGGT TCCCGCGAAC T 21 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 11: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 10 base pairs » (B) TYPE: nucleic acid * 25 (C) STRANDEDNESS: single .:. (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE TYPE: DNA (genomic) * • 1 ··« • ♦ « · · · · (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:11: si 106965 CATGAAGAAG 10 (2) INFORMATION FOR SEQ ID N0:12: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 10 base pairs 5 (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE TYPE: DNA (genomic) 10 (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:12: TTCTTCCTAG 10 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:13: 15 (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 23 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE TYPE: DNA (genomic) 20 (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:13: GTCGGCGCAT CGATGGGTGG AAT 23 • · .:. 25 (2) INFORMATION FOR SEQ ID N0:14: ···» (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 22 base pairs (B) TYPE: nucleic acid ...,; (C) STRANDEDNESS: single ’* '“ (D) TOPOLOGY: linear 30 (ii) MOLECULE TYPE: DNA (genomic) Γ < « < « · (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:14: 82 106965 CGCCCACCAT GGCGCCTCAG AT 22 5 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:15: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 28 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear 10 (ii) MOLECULE TYPE: DNA (genomic) (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:15: TCTAGCTAGA CACCATGTCG CCTCAGAT 28 . 15 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:16: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 23 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single 20 (D) TOPOLOGY: linear

(ii) MOLECULE TYPE: cDNA to mRNA

• it (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:16: 25 GTCGGCGCAT CGATGGGTGG AAT 23 «·« « • · · · • · · • · o • · · o «<··« « · • e · » · • · · c < • « « · *

4 M

83 106965 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:17: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 35 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear

5 (ii) MOLECULE TYPE: cUNA to mRNA

(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:17: CTCCGAIAGG GCGTGGTACC CGGCCCTACT CTTAT 35 • < « » • · « · « • · · · • · « • · » • · · « a » · t • · • · • » « t e

I I I

• « • ·

Claims (9)

1 I · « I « · · • · • · ·♦ · 87 106965 roiduiksi Penicillium chrysogenum -rekombinanttikannan kromosomi-DNA:han ja jotka koostuvat olennaisilta osiltaan Cephalosporium acremonium -peräisestä DNA:sta, joka koo-dittaa ekspandaasiaktiivisuutta, hydroksylaasiaktiivisuut-5 ta ja valinnaisesti asetyylitransferaasiaktiivisuutta, promoottorista, joka sisältää Penicillium chrysogenumin IPNS-geenin, joka ohjaa mainitun ekspandaasi-, hydroksy-laasi- ja mahdollisesti asetyylitransferaasiaktiivisuutta koodittavan DNA:n ilmentymistä, ja fleomysiini-geenin 10 DNA:sta valikointimarkkerina.

1. Biologinen menetelmä 7-aminodeasetyylikefalospo-raanihapon (7-ADAC:n) valmistamiseksi, tunnettu 5 siitä, että se käsittää seuraavat vaiheet: 1. pidetään yllä isopenisilliini N:ää tuottavaa Penicillium chrysogenum -kantaa sen kasvun ylläpitoon kykenevässä kasvualustassa ja lisätään mainittuun kasvualustaan adipaattiravintoa, joka käsittää yhtä tai useampaa 10 adipiinihapon tai sen suolojen ja estereiden joukosta, joita mainittu Penicillium chrysogenum -kanta pystyy assimiloimaan ja hyödyntämään adipoyyli-6-aminopenisillaaniha-pon (adipoyyli-6-APA:n) tuottamiseksi, jolloin syntyy mainittua adipoyyli-6-APA:ta, 15 2) toteutetaan seuraavat entsymaattiset muuttamiset vastaavan geenin in situ -ilmentymisen kautta: a) laajennetaan adipoyyli-6-APA:n rengasta in situ, niin että muodostuu adipoyyli-7-aminodeasetoksikefalospo-raanihappoa (adipoyyli-7-ADCA:ta) ekspandaasientsyymin 20 vaikutuksesta, jolloin mainittu P. chrysogenum -kanta on transformoitu DNA:11a, joka koodittaa ekspandaasientsyymi-aktiivisuutta, jolla on kyky hyväksyä mainittu adipoyyli-

2. Biologinen menetelmä 7-aminokefalosporaanihapon (7-ACA:n) valmistamiseksi, tunnettu siitä, että se käsittää seuraavat vaiheet: 10 1) pidetään yllä isopenisilliini N:ää tuottavaa Penicillium chrysogenum -kantaa sen kasvun ylläpitoon kykenevässä kasvualustassa ja lisätään mainittuun kasvualustaan adipaattiravintoa, joka käsittää yhtä tai useampaa adipiinihapon tai sen suolojen ja estereiden joukosta, 15 joita mainittu Penicillium chrysogenum -kanta pystyy assimiloimaan ja hyödyntämään adipoyyli-6-aminopenisillaaniha-pon (adipoyyli-6-APA:n) tuottamiseksi, jolloin syntyy mainittua adipoyyli-6-APA:ta, 2. toteutetaan seuraavat entsymaattiset muuttamiset 20 vastaavan geenin in situ -ilmentymisen kautta: a) laajennetaan adipoyyli-6-APA:n rengasta in situ, niin että muodostuu adipoyyli-7-aminodeasetoksikefalospo- *··«' raanihappoa (adipoyyli-7-ADCA: ta) ekspandaasientsyymin •« « ! V vaikutuksesta, jolloin mainittu P. chrysogenum -kanta on • ' · 25 transformoitu DNA:11a, joka koodittaa ekspandaasientsyymi- aktiivisuutta, jolla on kyky hyväksyä mainittu adipoyyli-··* 6-APA substraatiksi, jolloin kyseisen DNA:n ilmentymisen «•M ;*;c; seurauksena kannan tuottaman adipoyyli-6-APA:n rengas tu- lee sen jälkeen myös laajennetuksi in situ, niin että muo- #><t; 30 dostuu adipoyyli-7-ADCA:ta, • · ... b) hydroksyloidaan adipoyyli-7-ADCA:n 3-metyylisi- *;· vuketju in situ, niin että syntyy adipoyyli-7-aminodease- • /'l tyylikefalosporaanihappoa (adipoyyli-7-ADAC:tä) hydroksy- laasientsyymin vaikutuksesta, jolloin mainittu P. chryso-35 genum -kanta on transformoitu DNA:lla, joka koodittaa hyd- I t I • « 1·« • · • · • « · 86 106965 roksylaasientsyymiaktiivisuutta, jolla on kyky hyväksyä mainittu adipoyyli-7-ADCA substraatiksi, jolloin kyseisen DNA:n ilmentymisen seurauksena kannan tuottama adipoyyli-7-ADCA tulee sen jälkeen myös hydroksyloiduksi in situ, 5 niin että muodostuu adipoyyli-7-ADAC:tä, c) asetyloidaan adipoyyli-7-ADAC in situ, niin että muodostuu adipoyyli-7-aminokefalosporaanihappoa (adipoyy-li-7-ACA:ta) asetyylitransferaasientsyymin vaikutuksesta, jolloin mainittu P. chrysogenum -kanta on transformoitu 10 DNA: 11a, joka koodittaa asetyylitransferaasientsyymiaktii-visuutta, jolla on kyky hyväksyä mainittu adipoyyli-7-ADAC substraatiksi, jolloin kyseisen DNA:n ilmentymisen seurauksena kannan tuottama adipoyyli-7-ADAC tulee sen jälkeen myös asetyloiduksi in situ, niin että muodostuu adi-15 poyyli-7-ACA:ta, 3. saatetaan mainittu adipoyyli-7-ACA kosketukseen adipoyyliamidaasin kanssa, jolloin adipoyylisivuketju poistuu ja muodostuu 7-ACA-tuote, ja eristetään sitten mainittu tuote.

3. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen biologinen menetelmä, tunnettu siitä, että adipaattiravinto ... on dinatriumadipaatti. «

4. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen biologinen • menetelmä, tunnettu siitä, että ekspandaasi- ja i cr 25 hydroksylaasi- ja valinnaisesti asetyylitransferaasiaktii- visuuksia koodittava DNA on peräisin Cephalosporium acre-·:* moniumista. • · · o

5. Patenttivaatimuksen 4 mukainen biologinen mene-telmä, tunnettu siitä, että käytetään yhtä kak- 30 sitoimista ekspandaasi-hydroksylaasientsyymiä. • ♦

6. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen biologinen « T menetelmä, tunnettu siitä, että adipoyyliamidaasi i on peräisin Pseudomonas-lajista.

6-APA substraatiksi, jolloin kyseisen DNA:n ilmentymisen ; seurauksena kannan tuottaman adipoyyli-6-APA:n rengas tu- ; 25 lee sen jälkeen myös laajennetuksi in situ, niin että muo- *:**: dostuu adipoyyli-7-ADCA:ta, ··· b) hydroksyloidaan adipoyyli-7-ADCA:n 3-metyylisi- • · · · j**\ vuketju in situ, niin että syntyy adipoyyli-7-aminodease- tyylikefalosporaanihappoa (adipoyyli-7-ADAC:tä) hydroksy-30 laasientsyymin vaikutuksesta, jolloin mainittu P. chryso- • · ... genum -kanta on transformoitu DNA: 11a, joka koodittaa hyd- ”* roksylaasientsyymiaktiivisuutta, jolla on kyky hyväksyä • * :t c mainittu adipoyyli-7-ADCA substraatiksi, jolloin kyseisen : : DNA:n ilmentymisen seurauksena kannan tuottama adipoyyli- « · * · · < « · • · • · * * · • · • · · 106965 7-ÄDCA tulee sen jälkeen myös hydroksyloiduksi in situ, niin että muodostuu adipoyyli-7-ADAC:tä, 3. saatetaan mainittu adipoyyli-7-ADAC kosketukseen adipoyyliamidaasin kanssa, jolloin adipoyylisivuketju 5 poistuu ja muodostuu 7-ADAC-tuote, ja eristetään sitten mainittu tuote.

7. Yhdistelmä-DNA-ilmentymisvektorit, plasmidit (1) ,7, 35 PEN/CEPH-1 ja (2) pTS-8, joilla on kyky tulla integ-

8. Penicillium chrysogenum -isäntäsolu, jonka kromosomi -DNA: hän on integroitu ilmentymisvektoriplasmidi ja joka on PC 200, ATCC 74186, tai PC 300, ATCC 74187, jotka on transformoitu yhdistelmä-DNA-ilmentymisvektoriplasmi-15 dilla pPEN/CEPH-1 tai pTS-8, vastaavasti, jolloin ilmentymisvektoriplasmidi pPEN/CEPH-1 koostuu olennaisilta osiltaan Cephalosporium acremonium -peräisestä DNA:sta, joka koodittaa ekspandaasi- ja hydroksylaasiaktiivisuutta, Penicillium chrysogenumin IPNS-geenin promoottorista, ja 20 fleomysiinigeenin DNA:sta valikointimarkkerina, ja jolloin ilmentymisvektoriplasmidi pTS-8 koostuu olennaisilta osil-... taan Cephalosporium acremonium -peräisestä DNA:ta, joka koodittaa ekspandaasi-, hydroksylaasi- ja asetyylitransfe-: ' raasiaktiivisuutta, Penicillium chrysogenumin IPNS-geenin i " 25 promoottorista ja fleomysiinigeenin DNA:sta valikointi- *ϊ**ϊ markkkerina. *:1

9. Menetelmä viljellä Penicilliim chrysogenum -re- • · · o ;1;ci kombinantti-isäntäsolua kefalosporiinisynteesiin osallis- tuvien entsyymien ilmentymisen indusoimiseksi, jolloin 30 isäntäsolua viljellään geenien ilmentymiseen sopivissa • · olosuhteissa, tunnettu siitä, että isäntäsolu si- • · “1 sältää kromosomi-DNA:hän integroituneena joko • · a) yhdistelmä-DNA-ilmentymisvektoriplasmidin i': pPEN/CEPH-1, joka koostuu olennaisilta osiltaan Cephalos- 35 porium acremonium -peräisestä DNA:sta, joka koodittaa eks- • · · · • · • » · 88 106965 pandaasi- ja hydroksylaasiaktiivisuutta, Penicillium chry-sogenumin IPNS-geenin sisältävästä promoottorista ja fleo-mysiinigeenin DNA:sta valikointimarkkerina, tai b) yhdistelmä-DNA-ilmentymisvektoriplasmidin pTS-8, 5 joka koostuu olennaisilta osiltaan Cephalosporium acre-monium -peräisestä DNA:sta, joka koodittaa ekspandaasi-, hydroksylaasi- ja asetyylitransferaasiaktiivisuutta, Penicillium chrysogenumin IPNS-geenin sisältävästä promoottorista ja fleomysiinigeenin DNA:sta valikointimarkkerina. i < · « • < « < < « « < 4 < C • · ♦ ♦ ♦ • « « e • •f • · · • · · • · • · · • · « · · 9 » • · · • « · * · • » · • « « « • · « * · * 1 I • · · • · · · • · * · « · « 89 106965