UA47385C2 - Спосіб одержання 7-амінодеацетилцефалоспоранової кислоти, спосіб одержання 7-аміноцефалоспоранової кислоти, вектор експресії рекомбінантної днк (варіанти), клітина-хазяїн penicillium chrysogenum (варіанти), спосіб культивування рекомбінантної клітини-хазяїна penicillium chrysogenum (варіанти) - Google Patents

Abstract

Важливі проміжні продукти для виробництва цефалоспоринових антибіотиків - 7-аміноцефалоспоранова кислота (7-АЦК) и 7-амінодеацетилцефалоспоранова кислота (7-АДАЦ) – виготовляються за допомогою нових біопроцесів, у яких трансформований штам Penicillium культивується в присутності джерела надходження адипату з утворенням адипоїл-6-АПК (6-амінопеніцилланової кіслоти); після цього відбувається експресія in situ наступних генів, якими був трансформований штам P.chrisogenum: 1) ген експандази дає адипоїл-7-АДЦК; 2) ген гідроксилази дає адипоїл-7-АДАЦ; і 3) ген ацетилтрансферази дає адипоїл-7-АЦК. Кінцевий продукт – 7-АЦК отримують за рахунок відщеплення адипоїлової бокового ланцюга при використанні адипоїлацилази.

Description

Опис винаходу

Настоящее изобретение относится к области синтетических методов изготовления коммерческих 2 цЦефалоспориновьх антибиотиков; в настоящеє время имеется значительноє количество цефалоспориновьх антибиотиков, лечебнье средства цефалоспориновой природь! сейчас находятся в своем четвертом поколении.

У коммерческих цефалоспоринов обнаруживаєтся огромное разнообразие боковьх цепей; большая зкономическая важность цефалоспоринов определяет повьішенную значимость разработок более зкономичньх и зффективньїх методов производства ключевьх промежуточньїх продуктов, которье позволяют легко 70 синтезировать различнье цефалоспоринь!.

Одним из ключевьх промежуточньх продуктов цефалоспоринов является 7-амино-цефалоспорановая кислота /7-АЦК/, которая монет бьіть представлена следующей формулой: ед й о Сну соОон

В настоящее время 7-АЦК производится из цефалоспорина С. Цефалоспорин С, сам по себе являющийся ферментационньім продуктом, является исходньім веществом почти для всех имеющихся в настоящее время торговьіїх препаратов цефалоспоринов. Однако, синтетические манипуляции по производству различньх коммерческих цефалоспоринов в большинстве случаев начинаются, по существу, с 7-амино-цефалослорановой кислоть, которая должна бьіть получена из цефалоспорина С путем отщепления 7-амшоадипоиловой боковой сч ов Чепи. Обьічнье коммерческие цефалоспориньії получают синтетически из 7-АЦК, в том числе и те, которье имеют З-ацетилоксиметиленовую боковую цепь, включая цефотаксим, цефалоглицин, цефалотин и цефапирин. (о)

Еще одним из ключевьїх промежуточньїх продуктов является 7-аминодеацетил-цефалоспорановая кислота

ЛП-АДАЦІ/, которая может бьіть представлена следующей формулой:

ІС) зо су нщі со в! сн,»он о ї- з5 сеоБ «

В настоящее время 7-АДАЦ также опроизводится из цефалоспорина С путем удаления 7-б-а-аминоадипоиловой боковой цепи вместе с превращением 3-ацетилоксиметиленовой боковой цепи в

З-гндроксиметил. 7-АДАЦ применяется в качестве промежуточного соегдинения в синтезе цефалоспоринов, « содержащих модифицированнье заместители в положений С-3.

В настоящее время в данной области техники предпочтительньм способом отщепления З с 7-аминоадипоиловой боковой цепи является химический способ. Основной иминогалоидньій процесс требует "» защитьі амино- и карбоксильной групп 7-аминозадипоиловой боковой цепи; для достижения зтого сейчас " используется несколько методов. Однако, процесс химического отщепления, применяемьїй в настоящее время, имеет серьезнье о недостатки. Среди зтих недостатков можно оотметить необходимость проведения Многозтапного и сложного процесса; чрезвьмайно низкие действительнье температурь); дорогостоящие те реактивьї; значительнье количества побочньїх продуктов зтого процесса, приводящие к проблемам обработки -І образующейся реакционной смеси; и очистку сильно загрязненного исходного материала перед началом химической обработки. Позтому ведется непрерьівньй поиск микробиологического или ферментативного о процесса, по которому достигалось бьі ферментное деацилирование цефалоспорина С с образованием о 50 7-аминоцефалоспорановой кислоть! на более зкономичной основе, чем та, что имеется у используемого сейчас химического процесса. сл Однако, зтот поиск успешного микробиологического процесса оказьмшваєтся в значительной степени тщетньм. Как становится ясно из литературь, зто является результатом особенностей структурь и, в частности, стереохимиий аминоадипоиловой боковой цепи молекульь цефалоспорина С, так как пенициллин успешно 255 деацилируется ферментньм расщеплением с использованием пенициллин-ацилазьї, образуемой множеством

Ф! микроорганизмов. С другой стороньї, сообщения в литературе об успешном однозтапном ферментном деацилированиий цефалоспорияа С часто являются невоспроизводимьми или обеспечивают только очень о небольшие вьїходь! конечного продукта.

Позтому, настоящее изобретение главньм образом относится к области изготовления ключевого 60 цефалоспоринового промежуточного соединения 7-АЦК, а более конкретно - к области биопроцессов для производства 7-АЦК.

К настоящему времени поиск успешногоббиопроцесса для изготовления 7-АЦК остается в значительной степени тщетньім, конечно же, и в отношений биопроцесса промьішленного масштаба. Например, в то время, как возможно прямой ферментацией и/или ферментной обработкой получить б-амино-пенициллановую кислоту бо /6-АПК)/, у которой остается необходимьм только расширить кольцо, чтобьі получить 7-АДЦК, бьіло обнаружено,

что, к несчастью, ферменть! СерпаІозрогішт или бігеріотусевз, которне осуществляют расширение кольца в нормальньїх метаболических путях зтих микроорганизмов, не воспринимают 6-АПК в качестве субстрата. Зти ферментьі, которье в совокупности обозначаются как ДАОЦС или "фермент зкспандаза" в данной области техники, определяются как ферменть, которье катализируют расширение структур пенамовьх колец, найденньїх в молекулах пенициллинового типа, в цеф-З3-емовье кольца, найденнье у цефалоспоринов. В дальнейшем зти ферменть! будут коллективно упоминаться как "фермент зкспандаза".

Субстратом, на которьій действует фермент зкспандаза, является пенициллин М, которьій после расширения кольца и гидроксилирования дает деацетилцефалоспорановую кислоту /ДАЦ/. Теперь для 7/0 получения 7-АДАЦ необходимо только отщепить /0/-5-аминоадипоиловую боковую цепь, но зта боковая цепь оказалась упорно невосприимчивой к ферментному отщеплению, что приводит только к непригмлемо-низким вьходам конечного продукта.

В соответствий с настоящим изобретением стало возможньм проводить зффективньій биопроцесс, по которому пенициллиновое соединения, /имеющее адипоиловую боковую цепь/, образуется посредством нового 75 Фферментационного процесса в вьсоких титрах; названное пенициллиновое соєдинение является приемлемьм субстратом для зкспандазного фермента, которьій образуется "в месте нахождения" тем же самьім организмом, которьій производит и пенициллиновое соединение, трансформированньм для зкспрессии названного фермента зкспандаза. Фермент зкспандаза затем осуществляет расширение кольца пенициллинового соединения с образованиєм цефалоспоринового соединения с вьісоким вьіходом последнего.

Адипоил-7-АДЦК, образуемая действием фермента зкспандазь! "в месте нахождения", имеет З-метильную боковую цепь /-СНз/, тогда как 7-АЦК, конечньій продукт, имеет З-ацетилоксиметяльную боковую цепь

ІСНЬОС/О/СНЗі. Для того, чтобьї превратить З-метильную боковую цепь в З-ацетилоксиметильную боковую цепь, в соответствии с настоящим изобретением также "в месте нахождения" зкспрессируются две другие ферментнье активности в добавление к зкспандазной активности. Для зтого имеются гидроксилаза и с ацетилтрансфераза; оба фермента являются продуктами зкспрессии огенов, которье также бьл трансформирован микроорганизм, образующий пенициллиновое соединение. Гидроксилазньй фермент о превращаєт З3-метильную боковую цепь адппойл-7-АДЦК в З-гидроксиметильную, а ацетилтрансферазньй фермент превращаеєет З-гидроксиметильную боковую цепь в З-ацетилоксиметильную боковую цепь 7-АЦК.

И на последнем решающем зтапе метода настоящего изобретения важно то, что боковую цепь ю пенициллинового соединения, теперь уже цефалоспоринового соединения, можно удалить друтой ферментной системой с неожиданно вьсокими вьходами конечного продукта. Непредвиденньм результатом зтого со уникального общего биопроцесса, которьій включает в себя настоящее изобретение, является образование со 7-АЦК с удивительно вьісокими вьїходами и зкономичность, достаточная для того, чтобь! представлять приемлемую альтернативу используемьм в настоящее время методам, связанньм с химическими и в биохимическими процессами. « 2. Краткое описание предшествующего уровня техники.

Новьїй биопроцесс настоящего изобретения предоставляет уникальньй и удивительно зффективньм метод производства 7-АЦК как зкономически жизнеспособную альтернативу используемому в настоящее время химическому синтезу. Непрерьівнье попьтки изобретения такого биопроцесса в данной области техники « 0 приводят к постоянно повторяющимся неудачам. Например, ЕР-А-О 422 790 описьівает ДНК, кодирующую шщ с изопенициллин М :ацил-КоА - ацилтрансферазную активность Азрегоїїи5 підцшапе, и ее использование для й получения полезньїх цефалоспоринов с участием образующих пенициллин грибов, которое не достигалось до "» зтого в данной области техники. Но оно описьівается как осуществляемое путем разрушения или перемещения ацетилтрансферазного гена вместе с добавлением генов, коюодирующих ферменть! зпимеразу и зкспандазу, из образующих цефалоспорин организмов; кроме того, по-видимому, не получено действительно полезного ї» результата трансформации и зкспрессии. К тому же, если описанная трансформация бьла бьї удачной, она все равно не бьіла бьї применима для целей настоящего изобретения, так как по прежнему оставалась бьі проблема і удаления Ю-о-аминоадипоиловой боковой цепи. Такая неудачная попьїтка получить значительнье результать! 9) по производству промежуточньх продуктов в синтезе коммерческих цефалоспоринов из культур грибов, образующих пенициллин, составляет полную противоположность результатам, полученньім при использований

Ме метода настоящего изобретения. сл Первьій ферментньй зтап биопроцесса по методу настоящего изобретения представляет собой расширение кольца у адипоил-6-АПК, которое осуществляется ферментом зкспандазой, являющимся продуктом зкспрессии зкспандазного гена, которь!м бьіл трансформирован хозяйский не-рекомбивантньійй штамм Р. Спгузодепит.

Мспользование такого зкспандазного фермента уже применялось в данной области техники. Например,

Сапімеї! еї аї., Си. Мепеї. /1990/, 17: 213 - 221, предложили биопроцесс для получения 7-АДЦК посредством і) расширения кольца пенициллина М, сопровождаемого ферментньм осгидролизом полученного ко деацетоксицефалоспорина М с образованием 7-АДЦК. Зто предложение основано на имеющемся в наличийи гене зкспандазьь пенициллина М /сеї Е/, клонированном из 5. сіамціідегив; Комасеміс еї аї., І.Васіегіо!. 6о /1989/, 171: 754 - 760; и Іпдоїїа ек аІ. 0.5. 5,070,020. Однако, поскольку зкспандаза действует на пенициллин

М, ее естественньій субстрат, а не на пенициллин М, то сделанное предложение требует генно-инженерньх работ по формированию модифицированного гена зкспандазьі, продукт которого может расширять кольцо у пенициллина М. Однако, требуемая модификация не вьіполнена Сопіймеї| еї аіІ; им удалось трансформировать

Репісійит спгузодепит геном сеїЕ из Зігеріотусез сіамиціїдегиз и получить зкспрессию фермента ДАОЦС 65 /зкспандазь/ только на низком уровне.

Фермент зкспандаза хорошо изучен в данной области техники как в отношений его активности, так и в отношений его генетической последовательности. Например, в работах УуоМе /0.5. 4,510,246 и 4,536,476/ для предоставления стабильньїх ферментньїх препаратов из бесклеточньїх зкстрактов образующих р -лактамь! прокариотических организмов, включая Зігеріотусевз сіамціїдегиз, бьіли по отдельности вьіделень! циклаза, зпимераза и ферменть, расширяющие кольцо. Оеїліаї /0.5. 5,082,772; ЕР-А-О 366 354/ описьіваєт вьіделенньй и очищенньй фермент зкспандазу из 5. СіІамшіідегиз которьій охарактеризован, включая концевье остатки и аминокислотньй состав; определено также, что фермент имеет молекулярньй вес около 34,600 Дальтон.

Однако, зтот результат противоречит молекулярному весу в 29,000 Дальтон, определенному для вещества, которое очевидно, является таким же ферментом в О.5. 4,536,476. ЕР-А-О 233 715 описьівает вьіделение и 7/0 характеристику картьі, построенной при помощи рестриктирующих зндонуклеаз, гена зкспандазь, полученного из 5. сіамцідегиз и зкспрессированного рекомбинантной кодирующей зкспандазу ДНК, /дающей активньй зкспандазньій фермент/, в штамме 5. СіІамиїдегив, дефектного по способности образовьівать цефалоспорин.

Іпдоїїа еї аіІ., 0.5. 5,070,020 /"ЕР-А-О 341 892/ описьявают последовательность ДНК, кодирующую фермент зкспандазу, которая бьла получена из Р.спгузодепит; также описьвается трансформация штамма 75 Р.спгуводепит зкспрессирующим вектором, содержащим названную последовательность ДНК, и получение тем самьмм зкспрессии фермента зкспандазь. В то время, как предлагается применимость зтого фермента для расширения колец у субстратов, отличающихся от пенициллина М, не представлено действительной демонстрации такого расширения колец.

Описанная вьіше работа сосредоточена на зкспандазном ферменте, происходящим из прокариотического 2о штамма 5. сіамшідегив. Фермент, по-видимому, имеющий такую же расширяющую кольцо активность, также зкспрессируется у зукариотических штаммов Серпаіозрогит асгетопішт /также относимь! Кк Асгетопішт спгузодепит/. Однако, в таких штаммах зкспандазная активность зкспрессируется бифункциональнь!м геном /сетЕР/, которьій также зкспрессирует активность ДАЦС /гидроксилаза/, чьей естественной функцией является превращение дезацетоксицефалоспорановой кислотьі /ДАОЦ/, продукта зкспандазного фермента, в с деацетил-цефалоспорин С /ДАН/. Результатом такой зкспрессии является единственньй, но бифункциональньй фермент зкспандаза/гидроксилаза. Хотя и бьіли приложеньі усилия по разделению активностей у продукта о двойного гена, ни одна из попьіток еще не имела успеха. Например, ЕР-А-О 281 391 описьіваєт вьіделение и идентификацию последовательности ДНК гена ДАОЦС/ДАЦС, полученного из С. асгетопічт АТСС 11550, а таюке соответствующую аминокислотную последовательность фермента. Штамм Репісййшт бьл цю зо трансформирован и зкспрессировал ферменть, однако, попьітки превращения пенициллинов С и М в соответствующие цефалоспоринь! ни разу не бьіли продемонстрировань!і. Далее, несмотря на то, что методь! со генной инженерии предлагаются в качестве легкого способа разделения генетической информации, со кодирующей ДАОЦС и ДАЦС, и их раздельной зкспрессии, не представлено действительной демонстрация такого разделения. в

Фермент ДАОЦС/ДАЦС/зкспандаза/гидроксилаза/ из С. астетопішт такке хорошо изучен в данной области «ф техники, как в отношений его активности и ее характеристик, так и в отношений его генетической последовательности. Например, в работах ЮОетдаіп /0.5. 4,178,210; 4,248,966; и 4,307,192/ различнье исходнье материальї пенициллинового типа обрабатьваются бесклеточньм зкстрактом С. асгетопішт, которьй зпимеризует- и орасширяет кольцо с ообразованием цефалоспоринового антибиотического продукта. «

УММи-Коапд-Хен /0.5. 4,753,881/ описьшваєт С.асгетопішт через посредство его изозлектрической точки, с молекулярного веса, аминокислотньїх остатков, соотношения гидроксилазной и зкспандазной активностей и й пептидньїх фрагментов. "» Ацетилтрансферазньй фермент С. асгетопішт также описан в данной области техники в отношений его активности, различньїх характеристик, рестрикционного картирования и последовательностей нуклеотидов и аминокислот. Смотри, например, ЕР-А-О 437 378 ий ЕР-А-О 450 758. ї» Предшествующий уровень техники, обсуждавшийся вьіше, относится только к одному аспекту настоящего изобретения, а именно к трансформации штамма Р.спгузодепит генами, коюодирующими ферменть! зкспандазу и і зкспандазу/гидроксилазу и обеспечивающими зкспрессию зтих ферментов. На предшествующем уровне, г) однако, используются только зкспрессированнье ферменть! для расширения кольца пенициллина М, но не у 5р пенициллинов С и У. И даже в зтом случае у пенициллина М остаеєтся боковая цепь в положений 7, которую бо нельзя отщепить при помощи фермента для получения свободной аминогруппьі. Настоящее изобретение сл основано на неожиданном открьтии того, что адипоиловая боковая цепь может бьіть зффективно добавлена штаммом Р.спгузодепит; что зкспандазньй фермент, зкспрессируемьй "в месте нахождения", может зффективно использовать зто соединение в качестве субстрата для расширения кольца с образованием Т-ФДЦК; что ферменть! гидроксилаза и ацетилтрансфераза, также зкспрессируемье "в месте нахождения", могут использовать адипоийл-7-АДЦК в качестве субстрата с образованием З-ацетоксиметиловой боковой цепи іФ) 7-ФЦК; и что адипоиловая боковая цепь затем может бьїть зффективно удалена еще одним ферментом с ко образованием 7-АЦК. Тогда как различнье отдельнье фрагменть! настоящего изобретения могут бьіть найдень на предшествующем уровне техники, на нем не имеется предложения обьединения их для получения бо неожиданньх результатов, предоставляемьїх методом настоящего изобретения.

Например, образование б-адилоил-пенициллановой кислоть! известно в данной области; смотри Ваїо еї аї.,

Маїшиге /1960/, 185, 97 - 99. Ферментное расширение кольца б-адипоил-пенициллановой кислоть!ї, но только на основе данньїх іп міо, также известно в данной области; смотри Ваїдигіп еї аї., Тейгапедгоп /1987/ 43, 3009-3014; и ЕР-А-О 268 343. И ферментное отщепление адипоиловьїх боковьїх Ццепей также известно в данной 65 области; смотри, например, работу Маїзцаа еї а!., М.Васі /1987/ 169, 5815 - 5820.

Адипоиловая боковая цепь имеет следующую структуру: СООН-/СН 5//-СО-, тогда как две бокове цепи близко родственной структурь являются цепями глутарила, имеющего следующую формулу:

СОоОНн/-СНОо/3-СО-. и цепями /0/-у-аминоадипоила, имеющего формулу:СООН-СН/МН»6-/СН»/3-СО-. Ферментное отщепление глутариловьїх боковьїх цепей известно в данной области техники. Смотри, например, работь ЗПпірсуа еї аї., Адгіс. Віої. Спет. /1981/ 45, 1561 - 1567, 0.5. 3,960,662; Маївида апа Катаїви, І.Васі. /1985/ 163, 1222-1228; Маївцаа еї аї.,, ІВасі /1987/ 169, 5815 - 5820; Іар. 53-086084 /1978- Вапуи

Рпагтассшіса! Со.,Ца./; и Іар. 52-128293 /1977 - Вапу Рпагтассшіса! Со., Ца./ ЕРА-А-О 453 048 описьіваєт методьі улучшения отцепляющей адипоил активности глутарил-ацилазьі, образуемой Рзепдотопаз З У-77-1.

При замещений различньїх аминокислот в определенньїх местах в пределах альфа-субьединиць! /фермента/ 7/0 наблюдалась в три-пять раз более вьісокая скорость отщепления адипоила /от адипоил-серина/. Следует отметить, что хотя ЕР-А-О 453 048, очевидно, демонстрирует ацилазу с улучшенной активностью в отношений адипоиловьїх боковьїх цепей, зта работа не описьшвает какого-либо способа /либо химического, либо при посредстве биопроцесса, каким-либо образом аналогичного тому, что описьівается в настоящей спецификации)/, по которому адипоил-цефалоспорин должен образовьваться в первую очередь.

В данной области техники известно, что в тех случаях, где присутствует /0/-5-аминоадипоиловая боковая цепь, первой удаляется аминогруппа и происходит укорачивание боковой цепи с участием фермента оксидазь! /О /-аминокислот, после чего остаєется глутариловая /ГЛ-7/ боковая цепь; глутариловая боковая цепь удаляется вторьім ферментом /глутарилацилазой/. Такое двух-зтапное отщепление списьівание в работах Маїзида, 0.5. 3,960,662; ЕР-А-О 275 901; Іар. 61-218057 /1988 - Котаїзви, Азайі Спетіса! дпаивігу Со./; УМО 90/12110/1990 - ММопа, Віориге Согр./; и ЕР-А-О 436 355, Огодаї еї аі., такке Віо/Гесппоіоду /1991/ 9, 188-191.

В данной области техники также известно, как вьшолняется однозтапное отщепление /р/-4-аминоадипоиловой боковой цепи, в частности, с использованием техники рекомбинантной ДНК. Смотри, например: одно-зтапное отщепление /0/-5-аминоаздипоиловой боковой цепи:

Уар. 53-94093 /Меї|ї Рзейдотопаз Зр. ВІМ-188/; с

Уар. 52-143289/ - 5. 4,141,790, Ме), Азрегойив Зр./; о

ОЗ 4,774,179 /Авайі, 1988, Рвейдотопаз 5р 5Е-83 и 5Е-495/, - Іар. 61-21097 и Іар. 61-152286;

Ек. Раї. 2,241.557/Агіез 1975, Васійшз сегецв маг. ПОогезсепв/;

Уар. 52-082791 /Роуо Іого 1977, Васійив тедай(егішт МАКІВ 53857;

ЕР-А-О 321.849 /Ноеснзі, Рзендотопаз, Васійив зибііїв, |-дішатуї! ігапзреріідазе/; іс)

ЕР-А-О 322 032, ЕР-А-0 405 846, и ). 5 5,104,800/Мегск, Васійив8 тедайегішт/; со

ЕР-А-0 283 218 и ).5. 4,981,789/МегскК, АпНгобасіег мізсозив/; одно-зтапное отщепление (рекомбинантное) : цеф С - » 7-АЦК; со

Уар. 60-110292/Азайі 1985,Сотатопаз, рекомбинантньй штамм Е.соїї с геном из Сотатогавз ср. 5М-77-1, їм- одно-зтапное превращение);

Зо Уар. 61-152-286 /Азапі 1986, Рзейдотопаз, реконбинантньій штамм Е.соїї с геном из Рзейдотопаз зр. ЗЕ 83, - генетическая последовательность описана и внесена в формулу изобретения; одно-зтапньй процесс уже сформулирован в И.5. 4,774, 179/;

Уар. 63-74499 /Азапі 1988, Тгідопорвзів магіаріїв, Сотатопавз, зкспрессия в рекомбинантном штамме Е.соїї « конструкции оксидазь /О0/-аминокислот и ГЛ-7-АЦК-ацилазь//;

ЕР-А-О 475 652 /Рціізажа, цефалоспорин С-ацилаза и ее продукция посредством техники рекомбинантной о) с ДНК). "» В данной области техники известньі различнье аспекть! методов для получения 7-АДАЦ. Смотри, например, " О.5. 3,304,236 и 3,972,774 /ЕІй Шу б Со./; ЕР-А-О 454 478 /Зпіоподі Со., Ца./; и опубликованную Японскую заявку 04 53,499 /ЗПпіоподі Со., Ца./,

Ссьілка на заявку, находящуюся в процессе одновременного рассмотрения ве Ссьілка делается на находящуюся в процессе одновременного рассмотрения заявку с серийньм номером -І 07/933,469, вьіданную 28 августа 1992 года /Мо 185321А в проверенном списка/, которая описьівает биопроцесс для получения 7-АДЦК, основанньй на зкспрессии активности зкспандазного фермента в трансформанте Р. і Спгузодепит тем же способом, что и в биопроцессе для получения 7-АДАЦ и 7-АЦК, описанном здесь. Однако, со 20 в настоящем биопроцессе дополнительнье трансформации используются для зкспрессии дополнительньмх ферментньїх активностей с целью осуществить полностью отличающийся рекомбинантньши метаболический сл путь для синтеза определенньїх конечньїх продуктов, ни один из которьїх не предлагается в заявке, находящейся в процессе одновременного рассмотрения.

Для того, чтобьі облегчить лучшее понимание метода настоящего изобретения и освоение ссьІлок 22 предшествующего уровня техники, обсуждавшихся вьше, далеє сразу 7ее излагаєтся представлениє

ГФ! различньїх зтапов метаболического пути, приводящего к адипоийл-6-АПК, адипсил-7-АДЦК, адипойил-7-АЦК и 7-АЦК, промежуточньїх продуктов и ферментов, которье вьполняют все вовлеченнье в зтот процесс о превращения. 60 б5

-альга-амичоадипиновал кислота -

Ц -шистейн я Б- валин

АВ - сяинтетаза о вн

БОС И й ук М НН (г) НОМ 7 у сон о н

ЦК -АТВ сч

І | о изопенициллин М-- - синтетаза

ІС

7 /ЛЛИКС/ со со ч- «І ноос ПО ку -х Сн « с 40 СІЗ НАМ то н. З . т щ о сон с» -І о Изопенициллин М оо 50 с /ЯПМ/ ПА - амидолиаза

Ф) о бо 65

Апило КоА с: 2-ААПК -- - вВтттпане?" воаза

Ї

7 Н пенилацетил КОоА

До» о сон в Пенипиллин її сч (о) о В нс м 1 кутод-х Ст. ю (зи шо щ- ій

М со о СсОоОоНн те щі "зопенипиллин З /лк/ « т с з с» -І (95) о 50 сл

Ф) ко бо 65

Таопенчп"ляин //

ДИ

7170

ЧИХ - апимераза (2) о н зениплацетптло од

НОМ Пі бук д-й ще З нос Ге)

Із

М ІС о) (ее) со т / те зв Пентптиллин М «

Пенипиллин М - - вкопандаза, « - с з с» -І (95) о 50 сл (Ф; ко 60 65 о нн (в) ТМ І й сС-М З нООосС

М о) СНУ в сОооНн пазапетокси- пебалоспораногая кислота /ДЛАОЦ/ сч

Ге)

ІС в) с , со «АОЦ ОЗ - гидроксилаза ї- « «

З с з

ЧК» -І о о 50 сл

Ф) т 60 б5

(в) 72 т й с-м

М о сон дезацетокКси- пе"бе ловпорановал кислота /ЛАЦ/ с о

ІС) и ж со

ЛАТ - ацетилтоанстераза со й - н М о н «І (В 2 ру о - с М ї з» о сСРрОССНУ сОооНн щ» -І (95) тт Ай со ПЧебалоспорин с сл Краткое содержание изобретения

Настоящее изобретение относится к новому биопроцессу производства 7-аминодеацетилцефалоспорановой кислоть /7-АДАЦ/, включающему зтапь!: 1/ вниіращивание штамма РепісійШт спгузодепит, образующего изопенициллин, в культуральной среде, о которая способна поддерживать его рост; добавление к названной культуральной среде источника поступления адипата, включающего что-либо одно или более одного из адипиновой кислоть!, ее солей и зфиров, которьй іме) способен ассимилироваться и использоваться названньм штаммом РепісйШит спгузодепит обоазования адипоил-б-аминопенипиллановой кислоть! /(адипоил-6-АПК/, посредством чего и синтезируется адипоил-6-АПК; 60 2/ осуществление следующих ферментньїх превращений посредством зкспрессии "в месте нахождения" соответствующих генов: а/ кольцо адипоил-6-АЛПК расширяєтся ("в месте внахождения" с о образованием адипоил-7-аминодезацетоксицефалоспорановой кислотьі /адипоил-7-АДЦК/ зкспандазньм ферментом; названньй штамм Р.спгузодепит бьл трансформирован ДНК, кодирующей активность зкспандазного 65 фермента, которьій способен воспринимать названную адипоийл-6-АПК в качестве субстрата; в результате зкспрессии зкспандазьі! кольцо названной адипоил-6-АПК, образуемой названньм штаммом, расширяется "в месте нахождения" с образованием адипойл-7-АДЦК; б/ З-метиловая боковая цепь адипойл-7-АДЦК гидроксилируется "в месте нахождения" ферментом гидроксилазой с ообразованием адипоил-7-аминодеацетилцефалоспорановой кислоть! /адипоил-7-ДЦАЦ/; названньй штамм Р.спгузодепит бьл трансформирован ДНК, кодирующей активность гидроксилазного фермента, которьій способен воспринимать названную 7-АДЦК в качестве субстрата; в результате зкспрессий гидроксилазьї названная адипоийл-7-АДЦК, образуемая названньм штаммом, гидроксилируеєется "в месте нахождения" с образованием адипоил-7-АДАЦ; и

З/ соприкосновение названной адипойл-7-АДАЦ с адипоил-амидазой, посредством чего адипоиловая 7/0 боковая цепь удаляется с образованием продукта 7-АДАЦ; названньй продукт затем вьіделяется.

Кроме того настоящее изобретение оотносится ок новому биопроцессу для производства 7-аминоцефалоспорановой кислоть /7-АЦК/, включающему зтапь!: 1/ вниращивание штамма РепісйШіит спгузодепит, образующего изопенициллин М, в культуральной среде, которая способна поддерживать его рост; добавление к названной культуральной среде источника поступления /5 адипата, включающего что-то одно или более одного из адипиновой кислотьі, ее солей и зфиров, которьй способен ассимилироваться и использоваться названньм штаммом Репісійцт спгузодепит для образования адипоил-б-аминопенициллановой кислоть! /адипоийл-6-АПК/, посредством чего и синтезируется названная адипоил-6-АПК; 2/ осуществление следующих ферментньїх превращений посредством зкспрессии " в месте нахождения" боответствующих генов: а/ кольцо адипойл-6-АПК орасширяєтся ("в месте внахождения" с о образованием адипоил-7-аминодезацетоксицефалоспорановой кислотьі /адипоил-7-АДЦК/ зкспандазньм ферментом; названньй штамм Р.спгузодепит бьл трансформирован ДНК, кодирующей активность зкспандазного фермента, которьій способен воспринимать названную адипоил-6-АПК в качестве субстрата; в результате с 2г5 Зкспрессии зкспандазь! кольцо названной адипоил-6-АПК, образуемой названньм штаммом, расширяется "в месте нахождения" с образованием адипойл-7-АДЦК; (8) б/ З-метиловая боковая цепь адидоил-7-АДЦК гидроксилируеєется "в месте нахождения" с образованием адилойл-7-аминодеаце-тилцефалоспорановой кислотьі /адипоил-7-АДАЦ/ ферментом гидроксилазой; названньй штамм Р.спгузодепит бьл трансформирован ДНК, кодирующей активность гидроксилазного ю зо фермента, которьій способен воспринимать названную адипоийл-7-АДЦК в качестве субстрата; в результате зкспрессии гидроксилазьії названная адипоил-7-АДЦК, образуемая названньм штаммом, гидроксилируется со также "в месте нахождения" с образованием адипоил-7-АДАЦ; и с с/ адипоийл-7/-АДАЦ ацетилируется "В месте нахождения" с образованием адилоил-7-аминоцефалоспорановой кислоть! /адипоил-7-АЦК/ ацетилтрансферазньм ферментом; Названньй ї-

Зв штамм- Р.спгузодепит бьіл трансформирован ДНК, кодирующей активность ацетилтрансферазного фермента, «Е которьій способен воспринимать названную адипоийл-7-АДАЦ в качестве субстрата; в результате зкспрессийи ацетилтрансферазьі названная адипоийил-7-АДАЦ, образуемая названньм штаммом, ацетилируется также "в месте нахождения" с образованием адипоил-7-АЦК; и 3З/ соприкосновение названном адипоил-7-АЦК и адипоил-амидазьї, посредством чего адипоиловая боковая «

Чцепь удаляется и образуется продукт 7-АЦК; названньй продукт затем вьіделяется. в с Следующие терминь! при использований здесь имеют указаннье значения: "7-АЦК" означает 3- (/ацетоилокси/-метил| -ї-амино-8-оксо-5-тио-1-азабицикло І4.2.01 з окт-2-ен-2-карбоновая кислота; "адипоил-6-АПК" означаєт (25 -Г а, бо. бр -3,3-диметил-7-оксо-6- Кгексан-1,6-дисил)амино) -4-тио-1-азабицикло (3.2.0) -гептан-2-карбоновая кислота; «їз» "адипоил-7-АДЦК" означает З-метил-7-(/гексан-1,6-дисил/ аминої| -3-метил-8-оксо-5-тио-1-азабицикло Ц|4.2.01 окт-2-ен-2-карбоновая кислота; и - "адипоийл-7-АДАЦ" означаєт З-гидроксиметил-7- (/гексан-1,6-дисил/амино)

Ге) -3-метил-8-оксо-5-тио-1-азобицикло (4.2.0) окт-2-ен-2-карбоновая кислота.

В частности, настоящее изобретение оотносится ок новьім биопроцессам для производства бо 7-аминодеацетилцефалоспора новой окислотьі /7-АДАЦ/ и 7-аминоцефалоспорановой кислоть! /7-АЦК/, сл перечисленньм вьше, в которьїх: источником поступления адипата является динатрий-адипат; ДНК, кодирующая активность зкспандазного фермента, гидроксилазного фермента и ацетилтрансферазного фермента, происходит из Серпаіозрогішт асгетопішт, а адипоил-ацилаза происходит из Рзепдотопаз зресіев.

Далее, настоящее изобретение относится к векторам зкспрессиий рекомбинатной ДНК, включающим ДНК, которая кодирует оактивность зкспандазного, гидроксилазного и ацетилтрансферазного ферментов, іФ) происходящих из Серпаіозрогіцт асгетопіцт, и просмотрь!ї, которне управляют зкспрессией генов, коюдирующих ко названнье ферменть!; зти векторьї включают плазмидьії РРЕМ/СЕРН-1, РРЕМСАСТ и рт -8, описаннье ниже.

Далее, настоящее изобретение относится к клеткам хозяйского штамма РепісшШіит спгузодепит, бо трансформированньм векторами зкспрессиий рекомбинантной ДНК; векторь включают ДНК, кодирующую активность зкспандазного, гидроксилазного и ацетилтрансферного ферментов, которье происходят из

Серпаіозрогішт асгетопічт, и промоторьії, которне управляют зкспрессией кодирующей названнье ферменть!

ДНК, включающие промотор гена ИПМС РепісшШит спгузодепит.

В частности, настоящее изобретение относится к клеткам хозяйского штамма РепісйШит спгузодепит 65 трансформированньм векторами зкспрессий рекомбинантной ДНК, включающими плазмидьї рРРЕМ/СЕРН-1,

РРЕМСАСТ и ртз -8, описаннье ниже.

Далее, настоящее изобретение относится к методу культивирования рекомбинантньїх клеток хозяйского штамма Репісіїййшт спгузодепит в условиях, подходящих для зкспрессии генов; рекомбинантнье хозяйские клетки включают векторьї зкспрессий рекомбинантной ДНК, содержащие ДНК, которая кодирует активность,

Зкспандазного, гидроксилазного и ацетилтрансферазного ферментов, происходящих из Серпаіозрогійт асгетопішт и промоторь, которье управляют зкспрессией кодирующей названнье ферменть: ДНК, включающие промотор гена Репісіїййшт спгузодепит. В частности, настоящее изобретение относится к методу культивирования рекомбинантньїх клеток хозяйского штамма Репісіййшт спгузодепит в условиях, подходящих для зкспрессии сгенов; названнье рекомбинантнье хозяйские клетки содержат векторь зкспрессий 70 рекомбинантной ДНК, включающие плазмидьі РРЕМ/СЕРН-1, РРЕМСАСТ и рт -8, описаннье ниже.

Подробное описание изобретения

Главньм аспектом настоящего изобретения является новьій биопроцесс для производства 7-аминоцефалоспорановой кислоть /7-АЦК/ и 7-аминодеацетилцефалоспорановой кислоть! /7-АДАЦІ/, ключевьїх промежуточньїх продуктов в производстве синтетических коммерческих цефалоспоринов, которьіе могут бьть /5 представлень! следующими структурньіми формулами: су р "

М М о СН о сн.он соон соон

В добавление к цефалоспориновому ядру отличительньми признаками 7-АЦК являются 7-амино группа и

З-ацетилоксиметильная группа /или З-ацетоксиметильная группа, как она более часто обозначается/. 7-амино с

Группа является группой, которая может бьіть превращена в любое количество производньх боковьх цепей, и, таким образом, формирует основу для синтеза различньх коммерческих цефалоспоринов. і)

З-ацетилоксиметильная группа часто может бьїть превращена в некоторое количество других боковьїх цепей для того, чтобьї также синтезировать коммерческие цефалоспоринь!.

Конечньй продукт 7-АЦК и промежуточньй продукт адипоил-7-АЦК по методу настоящего изобретения могут МУ зо боставлять противоположность цефалоспорину С, другому ключевому цефалоспориновому промежуточному продукту, которьій может бьіть представлен следующей структурной формулой: со ви з й (в) А С-ВИ їм нос о « в! ниОссн, сен «

У зтого промежуточного продукта 7-/0/-5-аминоадипоиловая боковая цепь неприемлема для дальнейшего - с получения синтетических производньїх и должна бьіть отщеплена с образованием приегемлемой 7-амино-группь. в К несчастью, часто оказьівается, что 7-/0/-39-аминоадипоиловую боковую цепь трудно удалить как химическими, ня так и биологическими средствами.

Определения Следующие терминь), используемье в настоящем описаний и, особенно, в разделе, озаглавленном "Описание предпочтительньїх осуществлений изобретений", имеют указаннье ниже значения: ве 7-АЦК 7-аминоцефалоспорановая кислота -І 7-АДАЦ 7-аминодеацетилцефалоспорановая кислота 7-АДЦК 7-аминодезацетоксицефалоспорановая кислота о 6-АПК б-аминопенициллановая кислота оо 20 ДАОЦ дезацетоксицефалоспорановая кислота

ДАОЦС ДАОЦ-синтетаза сл ДАЦ деацетилцефалоспорин С

ДАЦС ДАЦ-синтаза

ИПМС Изопенициллин М-синтетаза оо Трис Трис (гидроксиметил) аминометан о ЗДТА зтилендиаминтетрауксусная кислота

ДЗПК дизтилпирокарбонат ю ТЕ буфер Трис/зЗДтТА

ЗЗС буфер, содержащий соль/хлористьй натрий/ и цитрат натрия 60 ОБ додецилсульфат натрия

ПОГ полизтиленгликоль

Культура Репісіййшт спгузодепит.

Первьій зтап метода настоящего изобретения включаєт зтап виіращивания штамма Репісіїйшт спгузодепит, образующего изопенициллин М, в культуральной среде, которая способна поддерживать его рост, и добавления бо к названной культуральной среде источника поступления адипата, включающего что-то одно или более одного из адипиновой кислотьі, ее солей и зфиров; зти вещества должньії ассимилироваться и использоваться названньм штаммом Репісійшт спгузодепит для образования адипойл-6-АПК. Источник поступления адипата можно добавлять к культуральной среде после посева Р.спгузодепуит, но предпочтительно, чтобьі он уже присутствовал в культуральной среде в то время, когда производится посев.

Другие родьі, отличнье от рода Репісійшт, например, Азрегойивз підшапе, а также другие видьі из рода

Репісійшт кроме вида спгузодепит, также образуют изопенициллин М. Однако, исторически сложилось так, что все штаммь!ї с самьм вьісоким уровнем образования изопенициллина М бьіли разработаньі из штам-мов вида спгузодепит при помощи хорошо известньїх методов улучшения штаммов. С практической сторонь! настоящее изобретение ограничено штаммами Репісіїйшт спгузодепит, хотя очевидна его применимость и к другим видам. 70 Любьсе заложеннье в коллекциий штаммь Репісіййшт спгузодепит или такие штаммь! из других источников с открьїтьім доступом являются подходящим исходньм материалом для, осуществления метода настоящего изобретения.

Культуральная, среда, способная поддерживать рост штамма Репісійцт спгузодепит которьій образует изопенициллин М, относится к типу сред, с которьім квалифицированньій специалист в данной области мог бь /5 легко познакомиться. Например, культивирование могло бьі осуществляться посредством метода погруженной азробной ферментации, используемая среда могла бь бьїть вьібрана из ряда подходящих сред, имеющихся в наличии. В обьічньх средах используются источники углерода, такие как сахароза, глюкоза и крахмал; источники азота, такие как соевне бобь, /в виде муки грубого помола или в дробленом виде/, масло из семян хлопка, мука грубого помола из земляньїх орехов и различнье аминокислоть, их смеси и пептоньі. Обеспечение го потребностей продукции /антибиотика/ увеличивает вьход и облегчает вьіделение /антибиотика/; предпочтительньми средами в таких ситуациях могут бьїіть средь! с мелассой в качестве источника углерода и с соевой мукой и аминокислотами в качестве источника азота.

К культуральной среде обьічно добавляют пищевье неорганические соли, которье включают соли, способнье поставлять следующие ионнье компоненть!: натрий, калий, аммоний, кальций, фосфат, сульфат, с ов Хлорид, бромид, нитрат, карбонат, двухвалентное железо, трехвалентное железо, магний, марганец и другие.

Микрозлементь! обьічно также необходимь! для роста, развития и метаболизма Репісіїййшт спгузодепит; их і) можно добавлять прямо в культуральную среду в том случає, если они уже не доставлень в качестве загрязнений других ингредиентов культуральной средні.

Штаммьї Репісіййшт спгузодепит могут культивироваться в емкостях с мальм обьемом, такие как, ю зо качалочнье колбьі на Лл, в тех случаях, когда желательно получить только небольшие количества адипоил-7-АЦК и, в конечном счете, 7-АЦК. Когда желательно получить больше количества адипоял-7-АЦК, со однако, будут использоваться резервуарьі для крупномасштабной ферментации в погруженньїх азробньх со условиях.

При осуществлений крупномасштабного производства адипоийл-7-АЦК споровую культуру штамма Репісійшт ї- з5 спгуводепит вніращивают на скошенном агаре. Спорь! с косяка используются для засева небольшого обьема «г средь! для вегетативного роста мицелия. Культивирование на зтом зтапе проводится для получения обильной, свежей, активно-растущей культурьі микроорганизма. Зтот вегетативньй мицелий затем используется в качестве посевного материала на среду для крупномасштабной ферментации. В определенньїх случаях может бьть желательно в качестве посевного материала вносить дополнительньй вегетативньй мицелий в « Ферментационную среду. Такое двухзтапное внесение вегетативного мицелия обьічно используется, когда в с обьем ферментационной средьі значительно больше, чем обьем средь! для начального вегетативного роста.

По зтому способу спорь! микроорганизма культивирует сначала в малом обьеме средь! для вегетативного роста ;» для получения посевного материала, которьм засевают больший обьем средь! для вегетативного роста.

Мицелием со средьї большего обьема для вегетативного роста затем обеспечивают такую концентрацию Микроорганизма, которая достаточна для начала бьістрого установления ферментации в резервуаре для ї5» крупномасштабной ферментации. Среда для вегетативного роста может иметь такой же состав, как и ферментационная среда, или же может содержать дополнительнье ингредиента для начала роста и развития ш- микроорганизма в малом масштабе. 2) Штаммь Репісіййшт спгузодепит применяемье в методе настоящего изобретения, найболее зффективно 5о растут при температурах между, приблизительно, 207 и З0"С, но оптимальнье вьїходьії получаются, когда бо температура находится между, приблизительно, 22"7С и 28"С, а предпочтительно около 2576. сп Наийбольшее образование адипоийл-7-АЦК осуществляєется при культивирований штамма Репісіїшт спгузодепит резервуарах большого масштаба в течение периода между, приблизительно, 10 и ЗО дней; предпочтительно, от 15 до 25 дней. Однако, при культивирований в емкостях малого масштаба, таких в Качалочнье колбьї на 250мл, рост микроорганизма является более бьістрьім, и он образует адипоил-7-АЦК за более короткое время, например, за 4 - 15 дней, чаще за 5 - 7 дней. (Ф, Если в резервуарах для крупномасштабной ферментации конечньїй рН достигает 8,0 или вьіше того, то зто ка неблагоприятно отражаєтся на вьходе адипоил-7-АЦК. В таких случаях желательно следить за рн культуральной средь! на всем протяжениий ферментации. Если становится ясно, что рН достигнет таких вьісокКих бо уровней до того времени, когда осуществляется найбольшее образование адипоил-7-АЦК, то его можно подвести в. сторону понижения, добавляя к ферментационной среде подходящую кислоту или буферньй агент.

За образованием адипоил-7-АЦК можно следить посредством хроматографической проверки образцов ферментационного бульона.

Как и при большинстве погруженньхх азробньх ферментации, стерильньій воздух пропускается Через 65 Культуральную среду для получения более зффективного роста штамма Репісіййшт спгузодепит и повьішенного образования адипоил-7-АЦК. Обьем воздуха, пропускаемого через культуральную среду, обьічно составляет, по крайней мере, приблизительно, 0,2 обьема воздуха в минуту на обьем культуральной средьі. Однако, увеличенная скорость пропускания воздуха часто может оказьввать благоприятное воздействие на образование адипоил-7-АЦК.

Штамм Репісіїїшт спгузодепит обьічно будет образовьввать множество побочньїх продуктов и метаболитов в дополнение к адипоил-7-АЦК. Так как некоторье из зтих продуктов являются кислото-неустойчивьми, то желательно при извлечений из ферментационной средьй адипоил-7-АЦК в течение короткого времени обработать кислотой весь ферментационньй бульон для того, чтобь! разрушить некоторье из параллельно образующихся загрязнений. Ферментационньій продукт - адипоил-7-АЦК - извлекается из профильтрованного 7/0 ферментационного бульона, обработанного таким образом, и далее может бьтть произвольно отделен от других компонентов ферментационной средьі посредством хроматографии на )ионообменной смоле, и, если необходимо, может бьть очищен при помощи хроматографии перед последующим зтапом ферментного отщепления адипоиловой боковой цепи. Возможно также проводить такое ионообменное хроматографическое разделение после того, как проведено отщепление боковой цепи. Одним из основньїх побочньїх продуктов, 7/5 Которьй создаєт проблемь! разделения, является адипоил-6-АПК; и для того, чтобь! сделать разделение более легким, возможно разрушить химическим или ферментньм способом зтот побочньй продукт. Сначала профильтрованньй ферментационньй бульон подвергается процедуре предварительной очистки, которая может включать начальную зкстракцию несмешивающимся с водой органическим растворителем, таким как н-бутанол или амил-ацетат, для удаления загрязнений. Зкстрагированньй бульон затем может бьіть далее очищен на предварительном уровне посредством хроматографии на активированном угле.

Добавление источника поступления адипата

Предпочтительно, чтобьі источник поступления адипата добавлялся К ферментационной среде для

Репісійшт спгузодепит при ее составлений описанньм вьше образом, /то есть перед засевом/, вместе с другими ингредиентами зтой ферментационной средьі. Источник поступления адипата может добавляться с г произвольно, через какое-либо время после засева, например, через 1, 2 и/или З дня после засева. Источник поступления адипата определяется как что-то одно или более одного из адипиновой кислотьі, солей и зфиров і) адипиновой кислоть, что может ассимилироваться и использоваться штаммом Регпісіййшт спгузодепит культивируемь!м для образования адипоил-6-АІПК. Адипиновая кислота, ее соли и зфирьї можно использовать по отдельности или же в любьїх сочетаниях. Предпочтительна двунатриевая соль, хотя калиевая и смешанная ю зо Ккалий-натриєвая соли также подошли бь. Можно использовать метиловьй зфир, но зтиловьй зфир нерастворим в воде. Соль или зфир адипиновой кислотьі! должнь бьть такими, чтобь они могли со ассимилироваться и использоваться штаммом, Репісіййшт спгузодепит для образования адипоил-6-АПК. с

Например, может подходить сама по себе адипиновая кислота, несмотря на то, что она нерастворима в воде, если при надлежащих условиях рН образуется ассимилируемая соль. -

Подходящие зкспандазньй и/или гидроксилазньій ферменть!. «г

Штамм Репісіїїйшт спгузодепит которьій культивировался и снабжался источником поступления адипата, как описано вьіше, для образования им адипоил-6-АПК, также является штаммом, которьій бьіл трансформирован

ДНК, кодирующей активность зкспандазного и гидроксилазного ферментов, после чего, в результате зкспрессии зтих ферментов, кольцо названной адипоил-6-АПК "в месте нахождения" расширялось с « образованием'адипоил-7-АДЦК; 3-метиловая боковая цепь также превращалась в З-гидроксиметиловую. з с Адипоил-6-АПК образуется внутри клеток культурьі штамма Репісіїййшт спгузодепит культивирований его в присутствий источника поступления адипата. Также внутриклеточно, то есть на оснований положения "в месте ;» нахождения", трансформированньій штамм РепісйШит спгузодепит зкспрессирует ДНК, кодирующую активность зкспандазного и гидроксилазного ферментов, после чего зти ферменть! действуют на адипоийл-6-АПК как на субстрат; происходит расширение его кольца с образованием адипоил-7-АДЦК, которая затем їх гидроксилируется в адипоил-7-АДАЦ /адипоил-7-аминодеацетилцефалоспорановую кислоту/.

Новье биопроцессьі! настоящего изобретения включают в свою сферу трансформацию штамма РепісшШит ш- спгузодепит того типа, которьій описан вьше, любой ДНК, кодирующей активность зкспандазного и оо гидроксилазного ферментов; после зтого в результате зкспрессии зтих ферментов кольцо адипоийл-6-АПК 5ор расширяется "в месте нахождения" с образованием адипоил-7-АДЦК, а затем зто вещество гидроксилируется с со образованием адипойл-7-АДАЦ. Таким образом, ДНК, которой трансформируется штамм Репісіййшт с спгузодепит должна зкспрессировать ферментьї, имеющие не только активность зкспандазного фермента, подразумеваемую в данной области техники /то есть способность расширять кольцо изопенициллина М с образованием ДАОЦ/, но также способность расширять кольцо адипоил-6-АПК с образованием ов адипоил-7-АДЦК. о Кроме того, гидроксилазньій фермент должен бьть способен гидроксилировать адипоил-7-АДЦК и образованием адипоил-7-АДАЦ. (Ф, В отношений способа, которьім обеспечиваются активности ферментов зкспандазьй и гидроксилазь, в ка качестве подходящих осуществлений в рамках настоящего изобретения рассматриваются два альтернативньх подхода. В одном осуществлений настоящего изобретения, которое является предпочтительньїм, зкспандазная бо М гидроксилазная функции осуществляются посредством активности, зкспрессируемой одним, хотя по существу, бифункциональньм геном Сірпйозрогішт азгетопішт, которьім трансформируєется штамм

Р.спгузодепит. Зтот ген, которьій зкспрессирует вместе обе активности - зкспандазную и гидроксилазную, дале,е будет обозначаться как ген зкспандазь /гидроксилазь!; продукт зтого гена будет обозначаться фермент зкспандаза/ гидроксилаза. Когда штамм Р.спгузодепит трансформируется ДНК из С.азгетопішт, кодирующей б5 активность зкспандазь! /гидроксилазь!, то обьічно зкспрессия зтой активности будет контролироваться одной промоторной последовательностью, что указьівает на присутствие одного гена.

Альтернативное осуществление настоящего изобретения, которое в равной степени является подходящим, включаєт трансформацию хозяйского штамма Р.спгузодепит ДНК, кодирующей активности зкспавдазь! и гидроксилазь в виде отдельньх генов, что составляет противоположность одному /- гену Зкспандазь/гидроксилазьі. Следовало бь отметить, что отдельнье гень зкспандазьі и гидроксилазь и соответствующие ферментнье активности, которье они окодируют, более часто обнаруживаются у прокариотических микроорганизмов, таких как 5.сіамціідегив, чем у зукариотических микроорганизмов, таких как

С.азгетопішт, у которьїх закодирован один ген зкспандазьигидроксилазьі и один фермент, как уже рассматривалось вьіше. 70 Последовательности прокариотического гидроксилазного фермента и кодирующих его нуклеотидов описьшваются в работе Коуасеміс еї аї..).Васіегіої, 173/1/, 398 - 400 /1991/ и в ЕР-А-О 465 189, где представлень! способь! вбіделения названного фермента. Для квалифицированного специалиста понятно, что, исходя из последовательности гидроксилазьь при помощи хорошо известньїх ручньх методов или с использованием автоматических синтезаторов ДНК возможно синтезировать ДНК, кодирующую- 7/5 Гпидроксилазньй фермент. В свою очередь, соединение ДНК или альтернативнье последовательности, кодирующие такую же аминокислотную последовательность гидроксилазьі, или их фрагменть! и производньеєе, которне имеют равноценную гидроксилазную активность, могут бьїть использованьй в качестве основь! для изготовления различньїх векторов клонирования и зкспрессии при комбинирований с промотором или другими регуляторними последовательностями, которьіми затем возможно трансформировать хозяйский штамм Р.спгузодепит для того, чтобьї зкспрессировать гддроксилазньій фермент и тем самьім осуществить метод настоящего изобретения. Соединение ДНК также возможно использовать в качестве зонда, с помощью которого можно проверить геномную библиотеку штампа-кандидата, потенциально содержащего / иИскомьй гидроксилазньій фермент, с целью идентифицировать гомологичную последовательность посредством гибридизации. Активность любой предполагаемой гидроксилазьі, идентифицированной таким образом, может с бьіть подтверждена путем использования ее действительного субстрата адипоил-7-АДЦК по методу настоящего изобретения и вьіделения продукта ее гидроксилироваяйя посредством ВЗЖХ. і)

В зтом осуществлений настоящего изобретения, то есть при использований одного гена, зкспрессирующего только гидроксилазную активность, затем будет необходимо также отдельно предоставить ДНК, кодирующую активность зкспандазного фермента; штамм Р.спгузодепит можно трансформировать подходящим ю зо Ззкспрессионньім вектором, которьій обеспечивает зкспрессию "в месте нахождения" зкспандазной функции для осуществления зтапа расширения кольца в методе настоящего изобретения. Известно множество зкспандазньїх со ферментов; на оснований сходства боковьїх цепей можна считать, что многие зкспандазньюе ферменть смогут се участвовать в новом биопроцессе настоящего изобретения.

Другое полезное осуществление настоящего изобретения щсновано на том факте, что ДНК, кодирующая -

Зз5 активность более чем одной зкспандазь! и/или более чем одной гидроксилазьі, может бьіть использована для «г трансформации не-рекомбинантного штамма Р. СПпгузодепуит. При таком осуществлениий настоящего изобретения возможно получить повьішенную активность зкспандазьі! и/или гидроксилазь! из-зф увеличенньх количеств ферментного белка, которне будут зкспрессироваться.

В разделе, описьівающем предшествующий уровень техники, уже отмечалось, что для зкспандазного « фермента, производящего из Зіеріотусев сіауцідегие АТСС 27064, полностью установлена з с последовательность нуклеотидов, а также проведена характеристика расположения на ней участков расщепления рестриктирующими зндонуклеазами /картирование/. Однако, имеется сообщение о том, что ;» вещество которое, по-видимому, является таким же ферментом, происходящим из штамма 5.сіамціїдегиз МАК. 3585, имеет другой молекулярньій вес; последовательность нуклеотидов для зтого вещества не бьла определена. Вьіше - в разделе, касающемся предшествующего уровня техники, - таюке указьівалось, что для їх фермента ДАОЦС/ДАЦС из Серпаіозрогішт азгетопішт АТСС 11550 бьла определена нуклеотидная последовательность /Затвоп еї аї!., Віо /ТесппоЇоду /19877/5: 1207 - 1214, и ЕР-А-О 281 391/, ш- Зти зкспандазнье ферментьі, уже идентифицированнье на предшествующем уровне техники, применимь! в оо новьїх биопроцессах настоящего иизобретения. Другие зкспандазнье ферменть, которне еще не охарактеризованьі и пройсходят из различньїх штаммов З.сіамцідегив или С.авгетопішт или даже из со микроорганизмов других родов, также могут оказаться подходящими для осуществления новьїх биопроцессов с настоящего изобретения. Процедурьі идентификации таких новьїх штаммов и родов пригодньх микроорганизмов, вьіделения предполагаемьїх зкспандазньїх ферментов и установления их применимости для использования в методе настоящее изобретения хорошо известньі квалифицированному специалисту в данной области. Проверка бесклеточньїх зкстрактов новьїх штаммов и родов, являющихся кандидатами в применимьсе микроорганизмь!, может бьїть вбьіполнена надежньм и воспроизводимьім способом посредством добавления

Ф) названньїх зкстрактов к субстрату адипоил-6-АПК в присутствиий известньїх кофакторов ДАОЦС, которье ко включают двухвалентнье йионьй железа /Бе2"/, аскорбат; о-кетоглютарат и аденозинтрифосфат /АТФ/.

Ддипоил-6-АПК может бьть изготовлена в достаточньїх количествах посредством добавления источника 60 поступления адипата к не-трансформированной культуре РепісйШіит спгузодепит таким образом, которьй аналогичен подробно описанному ниже. Присутствие желаемого фермента зкспандазь //или зкспандазь/гидроксилазь/ определяєется по образованию адипоийл-7-АДЦК и/или адипоил-7-АДАЦ, наличие которьїх может бьіть обнаружено при помощи хроматографии.

Используя хорошо-известнье рекомбинантнье методь, на оснований нуклеотидной последовательности 65 зкспандазньїх генов из 5.сіамшціїдегив и С.азгетопічт возможно также получить зондьі! ДНК, например, для проверки ДНК, содержащейся в микроорганизмах, вероятно, образующих зкспандазу, которне применимь! в методе настоящего изобретения.

Потенциальнье источники ферментов зкспандазь, гидроксилазь! и зкспандазьі/гидроксилазь!

Как уже отмечалось, зкспандазнье ферментьії являются ферментами, которье катализируют расширение структур пенамовьх колец /найденньїх в молекулах пенициллинового типа/, с образованием цеф-3-емовьх колец, /найденньх у цефалоспоринов/. Любой организм, образующий метаболить!, которье содержат цефемовое кольцо, следовательно, являются потенциальньми источниками кодирующей зкспандазу ДНК.

Подобно зтому, любой организм, которьій образует цефалоспориньі, содержащие З3-гидроксиметильную группу, является потенциальньм источником кодирующей гидроксилазу /или зкспандазу/гидроксилазу/ ДНК. Примерь! /о таких микроорганизмов перечисленьі ниже, но зтот перечень является только примерньм; его не следует рассматривать как исчерпьівающий: 1). Грибиь!:

СтірпаІозрогіцт асгетопіт

СітрпаІозрогіцт зр.

ЕтегісеІПІорзів

Раесіотусевз

Зсоршіагіорзів ріпе(егозроїа

Зрігоіїдінт

Апохіорзів 2). Актиномицеть!:

Зігеріотусез сіоигеїдегив

З. Іртапії

З. мадауатепвів сч

З. доготіпепвів

З. Піріпепзіз серпатуицпі і)

З. пеєгееготогрпи5

З. рапауепвів

З. дгівеи5 ю зо з. саШеуа

Мосагаїа Іасіатацгапз со 3). Другие бактнрии: с

Ніамобасієегішт зр.

АїІсаїдепез депійгігсав ї-

Мусоріапа риПа «Е

Ргомідепсіа гейдегі

Ї узорасіег Іасіатдепив

Зкспандазьі и гидроксилазьії из организмов, перечисленньїх вьіше, являются только кандидатами для дальнейших исследований, и возможно, что не все из них окажутся подходящими для нового биопроцесса « настоящего изобретения. в с Вьіделение фрагментов ДНК, кодирующих зкспандазную активность

Когда присутствие желаемого зкспандазного фермента обнаружено тем способом, которьій описан вьіше, то ;» способь! вбіделения ДНК, кодирующей активность зкспандазного фермента, также хорошо известнь! в данной области техники. Конструируются зондьі! ДНК, основаннье на известной последовательности или частичной последовательности генов, коюдирующих зкспандазнье ферменть; зти зондь! будут гибридизоваться с желаемой ї5» кодирующей фермент ДНК, которую нужно вьіделить. Конструирование таких зондов основано на знаний последовательностей аминокислот и азотистьїх оснований, кодирующих зкспандазньй фермент, а также на ш- кодоновьіх предпочтениях конкретного исследуемого микроорганизма. Подробное описание обьічньїх методов 2) такого типа, применимьїх для геномной ДНК штамма Зігеріотусез сіамгейдегиз АТСС 27064, излагается ниже.

Вьіделение ДНК, кодирующей зкспандазную ферментную активность, осуществляется с использованием со процедур рестрикции и лигирования, хорошо известньїх в технике рекомбинантной ДНК. Необходимо иметь с рестрикционную карту генома исследуемого микроорганизма для того, чтобьі можно бьіло получить и вьіделить нужньій рестрикционньій фрагмент. Рестрикционнье карть! для 5.сіамціїдегиз и С.азгетопішт уже имеются; таким образом, для первого из них используются рестриктирующие ферменть! Ват НІ и 5аї 1, а злектрофорез ов предоставляет фрагменть! желаемого размера в 1,8 и 2,2 т.п.н.

Источники ацетилтрансферазного фермента и вьіделение фрагментов ДНК, кодирующих названную (Ф, активность ка Клонирование ацетилтрансфера зного гена ДАЦ из С.азгетопіт, может бьіть вьіполнено в соответствий с рекомбинантньми методами, хорошо известньми в данной области техники, которье в общих чЧертах бор описьваются тут не ниже.

Для того, чтобьі клонировать ацетилтрансферазньй ген, прежде всего нужно получить мутанть

С.азгетопішт, дефектнье по способности превращать деацетилцефалоспорановую кислоту /ДАЦ/ , в цефалоспорин С. Такой процесс состоит из обработки клеток С.азгетопішт мутагенами, такими как

М-нитрозогуанидин /НТГ/, азотистая кислота или ультрафиолетовьй свет, позволяющий обработанньім клеткам 65 Восстановить рост на подходящей для зтого среде, а затем - проверки накопления ДАЦ при помощи, например, хроматографического или биологического способов.

После идентификации подходящего мутанта, следующим зтапом в идентификации гена, кодирующего ацетилтрансферазу, является вьіделение ДНК С.азгетопішт штамма, образующего цефалоспорин С. После расщепления /либо посредством переваривания рест-рикционньми зндонуклеазами либо механического Вазрезания/ на фрагментьі подходящего размера они включаются в плазмиднье или космиднье трансформационньсе векторьї, которне также содержат подходящий доминантньїй маркерньй ген, такой как ген устойчивости к гигромицину или флеомицину. Вектор также должен содержать последовательности ДНК для облегчения последующего извлечения вставленной ДНК, например, сов -сайтьї фага лямбда, которье позволяют извлекать клонированную ДНК путем упаковки іп міго, сопровождающейся инфицированием ЕЄ.соїїЇ, 7/0 что может бьть вьіполнено посредством хорошо разработанньїх методов.

Затем протопластьї мутантного штамма ацетилтрансфераза-минус трансформируются с использованием векторов, содержащих случайнье фрагментьі геномной ДНК; трансформанть! отбираются на оснований устойчивости к антибиотикам. Затем у трансформантов может бьть проверено восстановление продукции цефалоспорина С, что является показателем успешной комплементации ацетилтранс-феразньм геном, /5 содержащимся в векторе. Мутантьі, предположительно содержащие клонированнье копий гена, затем могут бьіть вніращень, их ДНК вьіделена, векторная ДНК извлекаєтся методом, в общих чертах описанньім вьіше.

Подтверждение того, что вектор действительно содержит ацетилтрансферазньй ген, получается посредством субклонирования в Е.соїЇї, с использованием стандартньїх методов и легко доступньїх векторов, сопровождаемого повторной трансформацией мутанта ацетилтрансфераза-минусє. Затем зтот ген можно 2о Вьіделить, определить его последовательность и далее использовать так, как описано здесь в рабочих примерах, применяя методь), которьіе обьічно используются квалифицированньмми специалистами в области молекулярной генетики.

Следующие альтернативнье процедурь также хорошо известньі в данной области техники: Маївцда еї аї вьіделили ген и определили последовательность зтого гена, кодирующего ацетилтрансферазную активность с об С.авгетопійт, а также вьівели последовательность аминокислот самого фермента, как описьіваєтся в ЕР-А-О 450 758. Зти альтернативнье процедурь состояли из вьіделения ацетилтрансферазного фермента, і) определения аминокислотной последовательности М-конца и вьіведения из зтой информации нуклеотидной последовательности, кодирующей зтот участок фермента. В свою очередь, на оснований зтой информации получают зондьі, которне гибридизуются с полной кодирующей последовательностью, что позволяет ее ю зо внДелИТть.

Трансформация штамма Репісійит спгузодепит со

Когда полученьі фрагменть! ДНК, кодирующие зкспандазную/гидроксилазную, зкспандазную, гидроксилазную (се и ацетилтрансферазную активности, они могут бьть вставленьі! /лигированьи в плазмиду или другой зкспрессионньїй вектор вместе с фрагментами ДНК, включающими промоторь, трансляционно-активирующиеся - з5 последовательности, маркерь! устойчивости, регуляторнье последовательности, составляющие космид и «г любье другие последовательности ДНК, которне обеспечивают или способствуют трансформации, управляют зкспрессией генньїх продуктов и облегчают вьіделение трансформантов. Зкспрессионнье вектора, которье сконструировань! таким образом, затем используются для обеспечения трансформации штампа Репісійшт спгузодепит внутриклеточной зкспрессии активности зкспандазного/гидроксилазного, зкспандазного, « гидроксилазного и ацетилтрансферазного ферментов. Методь, используемье для достижения трансформациийи в с и зкспрессии, хорошо известньї в данной области техники; подробное описание таких обьічньїх методов изложено ниже. ;» Как уже подробно обсуждалось вьіше, трансформированньій штамм Репісійшт спгузодепит внутриклеточно зкспрессирует активности зкспандазного/гидроксилазного, зкспандазного, гидроксилазного и ацетилтрансферазного ферментов, которье затем действуют "в месте нахождения" на субстрат адипоийл-6-АПК, ї5» расширяя его кольцо с образованием адипоил-7-АДЦК; гидроксилируют последнюю с образованием адипоил-7-АДАЦ, которая затем ацетилируется с образованием адипоил-7-АЦК, соответственно.

Ш- Новье трансформанть! 2) Специфические трансформантьі Репісійит спгузодепит, окоторье зкспрессируют активности, закодированнье генами зксландазьигидроксилазьі и зкспандазьигидроксилазьі плюс ацетилтрансферазь, со /которне являются предпочтительньіми осуществлениями настоящего изобретения/, являются новьіми по с отношению к сходньім конструкциям на предшествующем уровне техники, таким как в работе Сапімеї! еї аї. /1990/ Ситепі Сепеїїсв, 17, 213 - 221, ЕР-А-0 281 391 и ЕР-А-0 437 378. Конструкция СапімжмеїЇ содержит зкспандазньй ген бЗігеріотусез сіамціїдегиз, помещенньій под контроль промотора изопенициллин М-синтетазь дв /ЛМПМС/ Р. спгузодепит, и отличается от конструкций настоящего изобретения отсутствием какой-либо ДНК, кодирующей гидроксилазную или ацетилтрансферазную активности.

Ф) Іпдоїїа е( аЇ. в ЕР-А-О 281 391 описьівают трансформационнье вектора Р. спгуводепит, которье содержат ка ДНК, кодирующую бифункциональньй фермент зкспандазу/гидроксидазу С. асгетопішт с зкспрессией, управляемой промотором ИПМС Репісійшт. В одной из зтих конструкций /рР562/, ген зкспандазь/ гидроксилазь бор после окончания слит и находится в одной рамке считьівания с геном гигромицин-фосфотрансферазьі. Продукт зтого гена - слитьій белок гигромицин-фосфотрансфераза::зкспандаза/ гидроксилаза - отличается от продукта по настоящему изобретению - фермента зкспандазь/гидроксилазь, которьій, по существу, идентичен ферменту, образуемому С. Асгетопішт. Другой вектор, описанньій в ЕР-А-0О 281 391, бьіл сконструирован посредством обширньїх серий молекулярно-генетических манипуляций, включающих использование синтетических линкеров 65 ДНК. В конечной конструкции /рР5 61/ используется МсоІ-фрагмент промотора ИПМС Репісіїййшт размером 1,2 т.п.н. для зкспрессии гена зкспандазьигидроксилазьі и ген ацетамидазьй Азрегойивз підцапе в качестве селективного маркера для отбора трансформантов Репісійит. Последовательность кодонов девять и десять гена зкспандазь/гидроксилазьі, которне кодируют, соответственно, аргинин и лейцин, изменена с ЦГ"ЦтТЦ на

ЦГЦЦТА, что не меняет закодированньій аминокислотной последовательности.

В конструкции настоящего изобретения МсоІ-фрагмент промотора ИПМС размером 1,2 т.п.н. бьіл слит с геном зкспандазь/гидроксилазь! без изменения естественной последовательности гена зкспандазьу/гидроксилазьі. Промотор ИПМС, используемьй в конструкции настоящего изобретения, содержит по отдельности два удвоения по четьіре основания, относящихся к естественному промотору - одно при сайте заї 1, на 760 п.н. опережающее стартовьій кодон АТГ, а другое - при сайте Храї, на пять пар оснований 7/0 опережающее стартовьйй кодон и находящееся в пределах нетранслируемой лидирующей последовательности на 5 -конце. Зти изменения не затрагивают вьісокий уровень зкспрессии гена зкспандазь/гидроксилазь.

Следующее различие векторов относится к используемь!м селективньім маркерам. Те конструкции, которьіе описаньі в ЕР-А-О0 281 391, в качестве селективньїх маркеров используют ацетамидазу и гигромицин. Зто составляет противоположность зкспандазно/гидроксилазному трансформационному вектору Репісйіит, /5 Мспользуемому в настоящем, изобретении, /РРЕМ/СЕРН-1/ которьій содержит маркер устойчивости к флеомицину. Штамм Репісіййшт спгузодепит, трансформированньій вектором , /"яРРЕМ/СЕРН-1/ и способньй зкспрессировать зкспандазно/гидроксилазную активность, бьіл обозначен Ро200. Его таксономические признаки обьічно включают формирование широко-распластанньїх колоний, имеющих окраску от голубовато-зеленой до зеленой, гладко-бархатисньїх с желтьіми каплями: обратная сторона колоний, погруженная в агар, желтая; Конидиальнье верхушки разветвлень!, все их части гладкие; конидии от зллиптических до сферических, З - 4 мкм, в длину. В качестве приемлемьїх культуральньх условий для штамма Р. спгузодепит используется плотная среда, содержащая моногидратированную лактозу-1,596/вес/обьем/; жидкий кукурузньй зкстракт - 0,59б/вес/обьем/; пептон - 0,590/вес/обьем/; ІМасі - 0,496/вес/обьем/; МазО -7НЬО - 0,0596/вес/обьем/; КНоРО, - 0,069в/вес/обьем/; РесСіз-6НьЬО - 0,000596/вес/обьем/; СЬЗО,)-5Н50 - 0,000290/вес/обьем/; агар - З,09б/вес/обьем/ сч

В одном литре дистиллированной водь; рН 4.8. Штамм Р. спгузодепит, только что описанньй и обозначенньй

РС200, бьіл заложен в Американскую коллекцию типовьїх культур /"АТСС/, 12301. РагкКІамп Огіме, КоскміПе, і)

Магуїапа 20852, под присвоенньїм его номером АТСС 74186 /дата закладки: 23 сентября 1992 года)/.

Второй новьій трансформант РепісйШит спгузодепит по настоящему изобретению, способньїй образовьівать адипоил-7-АЦК, зкспрессирует обе активности - зкспавдазно/гидроксилазную и ацетил-трансферазную - му зо благодаря тому, что зтот штамм бьл трансформирован одним вектором /ртЗ3 -8/, которьій включаєет ДНК, кодирующую зти ферменть. Зтот вектор, следовательно, отличается от тех трансформационньїх векторов со

Репісійшт, которне указьіваются в, ЕР-А-0 437 378; зти вектора включают ДНК, кодирующую либо одну только с ацетилтрансферазуп С. асгетопішт, либо в сочетаний с последовательностью ДНК, кодирующую мутантньй зкспандазно/гидроксилазньй полипептид. В конструкций різ -8 зкспрессия каждого из генов - зкспандазьигидроксилазьь и ацетилтрансферазьі управляется отдельной копией промотора ИПМС Р. «Е спгузодепит; третья копия промотора ИПМС используется для управления транскрипцией гена устойчивости к флеомицину, которьіїй используется в качестве селективного маркера.

В альтернативном осуществлениий настоящего изобретения геньі зкспандазь/гидроксилазь и ацетилтрансферазь! могут бьіть включень в отдельнье вектора и введень в хозяйский штамм Репісйит « последовательньм образом. Порядок, в котором фрагменть ДНК, кодирующие активности ферментов з с зкспандазь/гидроксилазьі и ацетилтрансферазьі, вводятся в штамм Репісійцт важен только с практической точки зрения. Предпочтительно, чтобьї трансформация штамма Репісіййшт геном/ами/ зкспандазь/гидроксилазь ;» предшествовала введению ацетилтрансферазного гена, так как в таком порядке зти ферменть! работают,п мімо.

Следовательно за зкспрессией зкспандазь/гидроксилазьі могло следить при помощи проверки образования адипоил-7-АДАЦ. На образование адипоил--7-АДАЦ, являющейся субстратом ацетилтрансферазного ї5» фермента, которьій зкспрессируется с введенного впоследствий кодирующего ацетил трансферазу гена, указьівает продукция адипоил-7-АЦК. Используя подходящую іп міго проверку ацетилтрансферазь!, можно

Ш- сначала трансформировать штамм Репісійит геном ацетилтрансферазьі, подтвердить его зкспрессию при оо помощи проверки іп міо, а затем продолжить введение гена зкспандазь/гидроксилазьі. Следовательно, любой способ бьл бьі подходящим осуществлением процесса настоящего изобретения для производства 7-АЦК. со Однако, предпочтительньмм осуществлением настоящего изобретения является одновременное введение с всех трех ферментньїх активностей посредством конструирования одного плазмидного вектора, которьй включает ДНК, кодирующую зкспандазно/гидроксилазную и ацетилтрансферазную активности С.асгетопішт.

Штамм Репісіїййшт спгузодепит, трансформированньій таким единственньмм плазмидньім вектором, вектором дво рТЗ -8, и способньй к зкспрессии активностей зкспандазь/гидроксилазь! и ацетилтрансферазь, бьіл обозначен

РОСЗОО. Его таксономические признаки являются такими же, как те, что вьше описаньь для РС200. И (Ф, приемлемье условия для культивирования штамма РОСЗО0О являются такими же, как те, что вьіше описань! для ка РОС200. Штамм Р. спгузодепит, обозначенньій РОЗОО, бьіл заложен в Американскую коллекцию типовьїх культур

АТС, 12301, Рагкіам'п Огіме, КоскуШе, Магуїапа, 20852, под присвоенньм ему номером АТСС 74187 /дата бо закладки: 23 сентября 1992 года)/.

Специфический штамм РепісшШіит спгузодепит, трансформированньй вектором рРепЕТ5О, которьй зкспрессирует активность зкспандазного гена 5. сіауціїдегиз и является предпочтительньім осуществлением настоящего изобретения, представляется новьім по отношению к таким конструкциям на предшествующем уровне техники, как конструкция в работе СапімжеїЇ ей аі. /1990/ Сицтепі Сзепеїйс, 17, 213 - 221. В обоих 65 Конструкциях для соединения промотора с зкспандазньм геном использован мутагенез іп мйго. В конструкции

СапімеїІЇ, соответствующая манипуляция вводит сайт Мае! при АТГ зкспандазного гена, которьій лигируется в

Хра1ї-сайт, на 3З-конце промотора ИПМС при помощи линкера Хра1/Маде1ї. В конструкции настоящего изобретения Мсо1-сайт создается при АТГ зкспандазного гена и лигируется в Мсо11І-сайт на 3- конце линкера

ИПМеС. Зто создает следующие последовательности в области соединений промотор-ген в зтих конструкциях:

Хваї Мої промотор ИПМС 5 ТЦТАГАЦАЦЦАТТТ 3 Посл-сть ІД Мо: 1 зкспандаза Зігер. 5 ГТГАГАГТТГАТТТАЦ 3 Посл-сть ІД Мо: 2

Сапежеї! 5 ТЦТАГАЦАЦТАТГТАЦ 3 Посл-сть ІД Мо: З 70 Настоящее изобретение 5 ТЦТАГАЦАЦЦАТГТАЦ 3' Посл-сть ІД Мо: 4

В конструкции СапімеїІ! С замещено на Т, тогда как в конструкций настоящего изобретения С сохраняется: таким образом, последовательность промотора ИПМС, непосредственно прилежащая к стартовому кодону ФТГ, точно соответствует той последовательности, которая обнаруживаєтся в естественно существующем гене 75 ИПМеС. Возможно, что промотор с предшествующего уровня техники, хотя й отличается только одним азотистьм основанием, может приводить к более низкой зффективности трансляции и, следовательно, к более низкому уровню зкспрессии зкспандазного гена.

Имеются и другие различия в участках промотора или гена, включенньїх в зти конструкции. Конструкция

Сапіжме!І! содержит участок 5 ВатНі-ХьЬаІ З промотора ИПМС, тогда как вектор настоящего изобретения содержит участок 5 Мсої1 - Мсо1 3 зтого промотора /Оіе? еї аЇ. 1990/, .Віої. Спет. 265,16358 - 16365/. Зто приводит к добавлению, приблизительно, 250 п.н. на 5'-конце промотора ИПМС в конструкции СапімеїЇ. Однако, зтот участок находится внутри открьїтой рамки считьівания гена АЦВ-синтетазьї перед геном ИПМС.

Конструкция Сапімеі!Ї также содержит ген Зігеріотусез от АТГ-до сайта ВатнНі1-3 зтого гена, тогда как вектор настоящего изобретения содержит зтот ген от АТГ до сайта ЗаїІ-3/Комасеміс еї аї., /1989/, б

Васіегіої.,, 171, 754 - 760/. Зто приводит к добавлению, приблизительно, 1000 п.н. ко 3'-концевой с последевательностий в конструкций СапімеїЇ. Конструкция настоящего изобретения по-прежнему содержит (о) участок перед зкспандазньм геном вплоть до сайта ВатнНі-5 АТГ; однако, он отделен от рамки считьівания зкспандазного гена промотором ИПМС.

Другие отличия конструкции рРепЕТ5О настоящего изобретения от тех, что описаньї на предшествующем ю уровне техники, относятся к используемому селективному маркеру. Использование слитого гена "промотор

ИПМС РепісшШйит: устойчивость к флеомицину" в конструкций настоящего изобретения ведет к отбору (ее) интеграции, многочисленньїх копий или интеграции в локусьі, обеспечивающие вьісокий уровень зкспрессии, и, с таким образом, может давать вьісокий процент трансформантов, которне зкспрессируют зкспандазньїй ген на вьісоком уровне. Отщепление адипоиловой боковой цепи. -

Последним зтапом в новом биопроцессе настоящего изобретения является отщепление адипоиловой « боковой цепи от адипоил-7-. АДАЦ или адипоил-7-АЦК, которое требует обработки продуктов предшествующих зтапов ферментом адипоил-амидазой. Как уже отмечалось вьше, одним из значительньх достижений настоящего изобретения является возможность вьіполнять все зтапь, приводящие к образованию адипоил-7-ДЦАЦ и адипоил-7-АЦК в одной ферментационной культуре. Зто достижение обеспечивает « дю исключительно вьісокую зффективность за счет того, что отпадает необходимость вьіделять и частично - очищать промежуточнье продуктьі от зтапа к зтапу зтого процесса. На рассматриваемом последнем зтапе, с однако, адипоил-амидазная ферментная система отсутствует, то есть не образуется "в месте нахождения" :з» оригинальной ферментационной культурой посредством либо естественной либо рекомбинантной зкспрессий генов Р. Стузодепит.

Если новьій биопроцесс настоящего изобретения вьіполняется периодическим способом, то будет ї» 35 необходимо вьіделять и частично очищать продукт первого зтапа; предварительнье процедурь! для зтого уже бьіли описань! вьіше. -і Несмотря на зто, процесс настоящего изобретения можно осуществлять любьім способом, по которому сю адипоил-амидаза зффективно приводится в контакт с адипоил-7-АДАЦ или адипойл-7-АЦК для того, чтобь могло иметь место ферментное превращение зтих соединений в 7-АДАЦ или 7-АЦК. Термин "контактирование, (ее) 50 соприкосновение" здесь определяется в самом широком контексте. Возможно, использовать бесклеточньй сл бульон неочищенньїх адипоил-7-АДАЦ или'адипоил-7-АЩ в качестве источника поступления зтих веществ и периодическим способом обрабатьшвшать его неочищенньм бульоном с адипоил-амидазой. Зтот подход обеспечиваєт некоторую зффективность, так как он требует какой-либо начальной существенной очистки реагирующих веществ. Конечно же, возможньї модификации. Например, реагентьї могут бьїть очищень! до какой-либо желаемой степени перед тем, как приводить их в контакт друг с другом. Возможно также

ГФ) осуществлять процесс непрерьівньм способом, в отличии от периодического способа. Само по себе

ГФ контактирование реагентов может бьть модифицировано различньми способами в соответствии с перспективньіми технологическими процессами такого рода. Так, могут бьіть использованьї иммобилизованнье ферментьі, например, в форме колонки, содержащей адипоил-ацилазу, и пропускание адипойл-7-АДАЦ или бо адипоил-7-АЦК через зту колонку. Иммобилизованньй фермент также можно добавлять к раствору адипоийил-7-АДАЦ или адипойл-7-АЦК в виде суспензии. Такие системьї иммобилизованньїх ферментов предоставляют преймущества легкого извлечения фермента и многократного его использования. Другим примером технологии такого процесса является процесс, связанньй с мембранньми реакторами.

Предпочтительньм способом контактирования реагентов является использование колонки (с 65 иммобилизованньім ферментом.

Адипоил-амидазнье ферментьї, применимьсе на зтапе отщепления.

Ммеется ряд ферментов с известной специфичностью в отношений адипоиловьх боковьх цепей.

Результатьї, полученнье с использованием адипоил-амидазь, которая производится корпорацией КАТУ, подробно изложеньї ниже в рабочих примерах. В литературе сообщалось о семи других ферментах, которье удаляют адипоиловье боковьіе цепи из молекул цефалоспоринового типа. Шесть из зтих семи ферментов происходят из видов рода Рзепдотопаз, а седьмой фермент происходит из вида рода Васіїй5. Между некоторьими ферментами псевдомонад существует некоторое сходство, но Бсі семь ферментов до некоторой степени различаются по своим физико-биологическим свойствам. Ниже обобщаются некоторье из /о характеристик зтих ферментов: ів 0 вію вовною

Все перечисленнье вьіше адипоил-амидазнье ферменть! применимь! - в новом биопроцессе настоящего сч изобретения. Другие адипоил-амидазь, применимье в методе настоящего изобретения, могут бьіть легко обнаруженьі посредством проверки ферментов-кандидатов по отношению к адипойл-7-АЦК и адипоил-7-АДАЦ, о) действительньїх субстратов" на которье они должньі подействовать. Положительньй результат дает надежньй и воспроизводимьій метод определения того, что фермент-кандидат действительно применим в методе настоящего изобретения. Субстрат может бьіть получен при помощи реакций адипинового ангидрида с 7-АЦК с ю зр Использованием модификации того метода, о которой сообщается в работе 52еме?гик апа УУеПтап-Ведпамузка,

Сііп, Сіїт, Асі /1978/, 84, 19 - 26. Такке возможно приспособить метод, описанньїй в Адгіс. Вісі. Спет. /1981/ (2,0) 45/7/, 1561 - 1567, которьій предназначен для получения глутарил-7-АЦК. Адипиновьій ангидрид может бьть со получен в соответствии с методом АЇрегізоп апа І ипатагк, описанном в 5. Масготої! Зсі. Спет. /1990/, А27, 397 - 412. 7-АЦК можно приобрести из нескольких торговьїх источников, включая химическую компанию Зідта. в.

Если желательно провести ориентировочньій поиск ферментов-кандидатов с использованием бьстрого «т колориметрического метода, то можно заместить адипоил-7-АЦК колориметрическим субстратом, таким как адипоийл-пАБК/пара-аминобензойная кислота/ или адипоийл-пНА/пара-нитроанилин/. Такой метод может бьть получен адаптацией метода, описанного для у-глутарил-пАБК у Згемжмелик еї аЇ. Сіїтіса СНітіса Асіа, 84/1978/19 - 26. Отщепление боковой цепи дает окрашивающее вещество, присутствие и концентрацию «

Которого легко определять с использованием колориметра. Более подробную информацию, касающуюся зтих и 007- с других подходящих колориметрических методов, можно получить в работах Магеїїї І.Р. /1968/, 9У.РНагт. Збсі. 57: 2172-2173; газ» 0. /1969/ Сіп. Спет. 15: 124 - 136; Згем/с7икК еї аї. /1980/. Апаї. Віоспет. 103:166:169; и з Кеуез Б. Ес аІ.1989/, 3. Рнагта РНагптасої, 41:136 - 137.

Бьіло проведено сравнение М-концевьїх аминокислотньїх последовательностей фермента КАЕМ и больших субьединиц ферментов асуїЇ и ЗК16, представленньїх вьіше в таблице. Результать! зтого сравнения показань ї5» ниже /скобки указьівают не вполне окончательнье оценки/:

КАЕМ -Пос-сть ІД Мо 5 ш- ІМ М/Б/ІЮ/АМАРОКТАМОСОМАЇ Л/ О М /Р/ 2) ОКІ16 - Посл-сть ІД Мо 6

ЗМЗМУАМАРОКТАМОМАГ ГГОМР со асуї! - Посл-сть ІД Мо 7 с ЗМММАМАРОКТАТОКРІГ АСОР

Из представленньїх последовательностей очевидно, что все зти три пептида родственнь друг другу. Однако, белок, имеющий М-концевую последовательность, сходную с теми, которье показань! вьіше, не обязательно обладает активностью адипоил-амидазь», как, например, в случае в ацилазой пенициллина б, которая образуется штаммом Агіпгорасіег. С другой стороньї, имеются адипоил-амидазьї, применимье в методе (Ф, настоящего изобретения, которье не обнаруживают значительной гомологиий с показанной вьіше М-концевой ка последовательностью. Например, бьло показано, что ацилазь асу! (Азайі) и В/Лайегозрогиз ! /Ригізам/а/, представленнье вьіше в таблице, обладают некоторой ацилазной активностью в отношений адипоил-7-АЦК, не бо имея при зтом какой-либо гомологий с последовательностями других ферментов, представленньїх вьіше.

Позтому, сфера настоящего изобретения в отношений адипоил-амидаз, применимьх на последнем зтапе нового биопроцесса, определяется в зависимости от того, способен ли фермент-кандидат отщеплять адипоиловую боковую цепь от адипоил-7-АЦК; зту способность можно легко и надежно определить, как подробно описано вьіше. 65 Описание предпочтительньїх осуществлений изобретения

Далее следует подробное описание конкретньїх предпочтительньїх осуществлений настоящего изобретения,

которое следует рассматривать только в качестве иллюстрации без какого-либо ограничения настоящего изобретения.

Пример 1. Культуральньсе условия Репісіїййшт спгузодепит.

Штаммь Регпісіййшт спгузодепит, использованнье в зтих процедурах, вниращивали на чашках, содержащих среду І! СВ, которая содержала моногидратированную лактозу - 1,596/вес/обьем/; жидкий кукурузньїй зкстракт - 0,5 /обьем/обьем/; пептон.- О,596/вес/обьем Масі -0,495/вес/обьем/; МаозО, - 7НьЬО - 0,0596/вес/обьем/; КНРО)Х - 0,06Увб/вес/обьем/; РесСіз--6Н»О - 0,000596/вес/обьем/; Си5О,)-5Н5О - 0,000295/вес/обьем/; агар - З,О9б/вес/ обьем/ в одном литре дистиллированной водь; рН 4.8, По прошествий 12 дней при 257С и 6595 относительной /о влажности отдельнье колонки удаляли со средьі ЇСЗВ и переносили с 2мл стерильной водь! в пробирку с закручивающейся крьішкой, содержащей стекляннье шарики. После мацерации вьросшей культурь посредством интенсивного перемещивания, полученную суспензию использовали для засева рисовьїх колб.

Рисовье колбьії обьемом 250мл содержали по 25г обработанного по технологий фирмь! Опсіе Веп'з риса - натуральньїх длинньїх зерен, которьіе бьіли промьїтьї тремя-четьірьмя обьемами дистиллированной водь! в /5 Течение семи минут с перемешиванием каждьєе 30 секунд, и затем вьісушень! так, что вода, поглощенная рисом, составляла, приблизительно 2595 его веса. По прошествий 12 дней при 257С и 6595 влажности спорь! смьівали с риса БОмл стерильной водь. Споровую суспензию использовали для засева жидкой средь, а также для получения лиофильно-вьісушенньїх культур для хранения при 4"С. Спорьї добавляли к равному обьему 590 снятого молока и лиофилизировали в стерильньїх ампулах.

Для продукции пенициллинов или для вьіращивания мицелия с целью вьіделения из него РНК или ДНК использовали двух-зтапную ферментацию штамма в качалочньх колбах. Зтап вьращивания посевного материала начинался с добавления 1 х 10 спор к 5Омл питательной средьі в 500мл колбе; среда содержала глюкозу - 39о /вес/ обьем/; рпаппатеадіа - 1,096/вес-обьем/; жидкий кукурузньій зкстракт - 3,095 /обьем/обьем/; сульфат аммония - 0,295б/вес/обьем/; СасСо з - 0,59б/вес/обьем/; безводньй монокалийортофосфат - сч 0,0596/вес/обьем/; лактозу - 1,096/вес/обьем/; предварительно вьісушеннье дрожжи - 1,096/вес/обьем/ в одном литре дистиллированной водь. МИнкубацию проводили при 25"С и 6595 относительной влажности на і) вращающейся качалке с диаметром амплитудьї 7Омм при 220о06б/ мин. После 48 часов культивирования начинался зтап продукции антибиотика посредством переноса 2мл вегетативного посевного материала в 500мл колбу с Зо5мл средь! следующего состава: КНоРО»Х - 0,059о5 /вес/обьем/; К»озО4 - 0,590 /вес/обьем/; /МН./2505- У зо 1,096/вес/обьем/; лактоза - 12.0956/вес/обьем/; рпагптатеаіа - 2,7595 /вес/обьем/; СаСО» /осажденньй/ - 1,090 /вес/обьем/; лярдовое масло - 1,095 /обьем/обьем/ в одном литре дистиллированной водьі, рН 6.6. После со автоклавирования, но перед засевом добавляли стерильньій 2595 раствор адипата натрия /рН 6.6/ для с получения конечной концентрации адипата натрия 2.5956. После засева культивирование бьіло продолжено в течение 5 - 7 дней в тех же условиях, что и на зтапе виіращивания посевного материала. -

Когда мицелий бьл нужен для получения протопластов с целью их трансформации или в качестве источника «г

ДНК, то штамм вьіращивали в 250мл колбах с 5б0мл полноценной средь! /ПС/, составленной из: 5О0мл солей

Клаттербука 20 х /120г Ма»МоО», 10 4г КСІ, 10.4г МаЗО,-7НьЬО, 30.4г КНоРО,/; 2.0мл микрозлементов Вогеля; 0О.3М лимонной кислоть; 0.2М 727пО); 25мМ ГРе/МН//»/504/5-6Н250; 10ММ Си5зО;; ЗмМ Мпип5О); 8ММ борной кислотьї; 2ММ Ма»МоО,-2Н2О; 5г триптона; 5г дрожжевого зкстракта; 1Ог глюкозьі в одном литре « дистиллированной водьі. Культивирование проводили при 257С на вращающейся качалке при 220об/мин. з с Пример 2. Культуральнье условия СерпаІозрогішт азгетопіцт.

Штаммь! С. Авгетопішт вьращивали на косяках, содержащих полноценную среди, составленную з из,сахарозь - 20г; агара - 20г; пептона - 4г; дрожжевого зкстракта - 4г; Мамо» - Зг; КНРО,) -0,5г; КоНнРО, - 0О,5г;

КСІ - 0.5г; Ма5О,-7Н2О - 0.5г; РезО, - 7Н2О - 0.01г в 1 литре дистиллированной водь, рН 6.6. По прошествий 10 дней вьіращивания при 28"С и 6695 относительной влажности, к косякам добавляли бмл стерильной водь и ї5» вьіросшую культури соскребали с поверхности агара. Полученную суспензию переносили в стерильную пробирку с закручивающейся крьішкой, содержащей стеклянньіе шарики. После мацерации вьіросшей культурь ш- посредством интенсивного перемешивания в течение нескольких минут З.Бмл полученной суспензийи оо использовали для засева жидкой средь. Зта суспензия бьла также использована для получения 5о пиофилизированньх культур с целью их хранения при 4"С. Суспензию прошедшей мацерацию культурь со центрифугировали, осадок ресуспендировали в 5956 снятом молоке, аликвотьї лиофилизировали в стерильньх с ампулах.

Для продукции цефалоспоринов или для вьіращивания мицелия с целью вьіделения из него РНК или ДНК использовали двух-зтапную ферментацию штаммов в качалочньїх колбах. Зтап вьращивания посевного Мматериала начинался при добавлений посевного материала в 250мл колбь), содержащие по 15мл средь следующего состава: глюкоза - 5г; сахароза - 40г; кукурузньій крахмал - З0г; свекольная меласса - 50г; соевая

Ф) мука грубого помола - 65г; Са5оО)-2Н2О - 15.8г; . ацетат аммония - 8г; СасСо з /осажденньй/ - 5г; /МНА/250О54 - ка 7,5г; Ма5О,-7Н2О - 3.5г; КНоРО, - 1г; соевое масло - 0.15мл на колбу в 1 литре дистиллированной водь при рН 6.2. Культивирование проводили при 257"С и относительной влажности 6596 на вращающейся качалке с бо диаметром амплитудь! 7О0мм при 220об/мин. По прошествии 96 часов инкубации начинался зтап продукции антибиотика посредством переноса 2мл вегетативного посевного мицелия в 250мл колбу, содержащую 15мМл свежей средь, описанной вьіше. Инкубацию продолжали еще 96 часов в тех же условиях.

Когда мицелий бьл нужен в качестве источника ДНК для трансформации штамма вьуращивали в 500мл колбе со 100мл полноценной средь, составленной из: глицерина - 20г; пептона - 4г; дрожжевого зкстракта - 4г; 65 КНоРО; - 0.57; КоНРО, - 0.57; КСІ - б; Мо5зО)-7Н2О - 17; МамОз - Зг; РезО)/-7Н»О - 0.01г в 1 литре дистиллированной водьі. Инкубацию проводили при 30"С на вращающейся качалке с 200об/мин.

Пример 3. Вьіделение геномной ДНК и тотальной РНК на Репісіййшт и Сернаіозрогіит.

Вьіросший вегетативньй мицелий 48-часовой культурьі, полученньій описанньім вьіше способом, собирали фильтрованием через марлю, замораживали в жидком азоте л лиофилизировали в течение ночи. Вьісушенньй мицелий растирали с песком при помощи ступки и пестика и ресуспендировали в 25мл 100мМ ІСІ, 50ММ ЗДТА, 10мММ Трис рН 8.0, 495. 5ЄО5. После нагревания суспензии до 50 - 55"с в водяной бане с температурой 607С смесь зкстрагировали сначала ІМ Трис /рН 8.0/-насьіщщенньм фенолом, после зтого Трис-насьіщенной смесью фенол-хлороформ /1 : 1; обьем/обьем/, а затем хлороформом. РНК осаждали из водной фазьі добавлением равного обьема холодного ЄМ раствора ГіСІ, а затем вьідерживанием полученной смеси при -207С в течение /о двух-трех часов. После центрифугирования при 12000х9 в течение 20 минут при 40 содержание зтанола в надосадочной жидкости доводили до 6695 /обьем/обьем/ и смесь охлаждали до -20 С в течение 15 минут для осаждения ДНК, После центрифугирования описанньім вьіше способом осадок ДНК промьівали 7095 зтанолом, вьісушивали и ресуспендировали в буфере ТЕ /10мММ Трис-НСІ, рН 7.55 1мМ ЗДТА/. Концентрацию ДНК оценивали путем сравнения с рас творами ДНК известной концентрации /стандарть/ после их агарозного 7/5 Гель-злектрофореза и окрашивания бромистьм зтидием.

Для вьіделения РНК культурь! Репісіййшт спгузодепит и Серпаіозрогішт асгетопішт вьращивали, как описано вьіше в Примерах 1 и 2, в течение 96 часов в ЗбОмл ферментационной средь! /условия ферментации описаньї предварительно/ при 25"С на вращающейся качалке при 220об/мин. Мицелий собирали посредством фильтрования через фильтр Батман Мо | с помощью, вакуума и промьшали приблизительно 50мл водь.

Мицелий немедленно соскребали с фильтра, ресуспендировали в 5мл "разрушающего буфера" /50мММ Трис-НСЇІ рН 7.4, 150мММ Масі, 5мМ ЗДТА рН 8.0, 595 505/, замораживали в жидком азоте и лиофилизировали. После лиофилизации в течение ночи добавляли бмл водь, содержащей 0.195 ДЗПК, и бмл смеси фенол:хлорофом:изоамиловьй спирт /50 : 50 : 1/, насьіщщенной ІМ Трис /рН 8/; смесь оставляли оттаивать при

З37"С в течение 20 минут со встряхиванием. Смесь центрифугировали при І2000хд в течение 10 минут при сч ов температуре 40, воДдНьй слой удаляли и триждь зкстрагировали: сначала смесью фенол-хлороформ:изоамиловьій спирт /50 : 50 : 1/, насьщенной ІМ Трис /рН 8/, второй раз фенолом, і) насьіщенньм ІМ Трис /рН 8/, й третий раз хлороформом. Конечньїй водньій слой обьединяли с равньмм обьеемом бМ 1ч4/01; раствор оставляли при -20"С минимум на четьюфде часа. Тотальную РНК осалодали центрифугированием при І2000хд в течение 20 минут при 4"С; осадок растворяли в смеси 0,Змл суфера ТЕ и ю зо 0О,ОЗмл 0,3М ацетата натрия; для повторного осаждения РНК добавляли 2,5 обьема зтанола. Окончательньй осадок растворяли в О0,їмл буфера ТЕ, концентрацию РНК определяли спектрофотометрически, используя со поглощение при 2бОонм. с

Пример 4. Конструкция генной библиотеки Серпаіозрогішт асгетопішт и вьделение генов зкспандазь/гидроксилазь! и ацетилтрансферазьі С.Пасгетопіт -

Вьіделение гена акспандазь/гидроксилазь! С.Пасгетопіт. «Е

Геномную ДНК С.Пасгетопішт частично расщепляли 5аш ЗАЇ для получения фрагментов со средним размером 10 - 20От.п.н.; зтот диапазон размеров обогащали центрифугированием смеси фрагментов расщепленной ДНК в градиенте плотности Масі 5 - 2095. Фракционированную по размеру ДНК использовали для создания библиотеки геномной ДНКОС.Пасгетопішт посредством лигирования в сайт Ват НІ вектора )/, « 2001, упаковьівания фаговьїх частиц с использованием Сід арак /Зігаїадепе/ и инифицирования Б. Соїї. у с Полученнье бляшки переносили на нитроцеллюлозу и проводили поиск при помощи гибридизации с ц олигонуклеотидньім зондом, комплементарньм 3-концу опубликованной последовательности гена ,» зкспандазьигидроксилазьі/ Самсон и др. 1967/. Зонд метили по концу (Її: -2р| АТФ с использованием-полинуклеотид-киназь! Т4. Клоньі! с положительньі!м ответом вцделяли картировали по сайтам рестриктирущих зндонуклеаз; ориентацию гена установливали при помощи блот-гибридизации по Саузерну с т. указанньім вьіше олигонуклеотидньім зондом и другим зондом, содержащим последовательность, - комплетарную 5'-концу гена.

Вьіделение гена ацетилтрансферазь! С.Пасгетопіт. (95) Хотя не бьіло разработанной методики для вьіделения ацетил- трансферазного гена для последующих со 50 векторньїх конструкций, описанньїх ниже в Примерах 11 и 12, квалифицированньй специалист в данной области техники может воспользоваться следующим методом с применением информации о последовательности ДНК, сл опубликованной и доступной в настоящее время. Из геномной библиотеки С.Пасгетопішт, сконструированной описанньм вьше способом, на оснований результатов гибридизации с синтетическим олигонуклестидним зондом, комплементарньм последовательности ацетилтрансферазь, отбирают клоньі, которье кодируют ацетилтрансферазньй ген /см. работу Маївцаа еї а!. /1992/ Віоспет Віорпуз. Кез Соттип, 182 : 995 - 10017, о Пример.5. Культуральнье условия Зігеріоптусез сіамціїдегив.

Штаммом б5ігеріотусез сіамиціїдегиз, использованньм в зтих процедурах, бьіл штамм АТСС 27064. Штамм їмо) вьіращивали на чашках со средой, содержащей дрожевой зкстракт - 4г,: солодовьій зкстракт - 10г; глюкозу - 4Гг; агар - 20г в одном литре дистиллированной водьі, рН 7.2. По прошествиий б5дней вьіращивания при З0"С на бо чашки наносили 2мл стерильной водьі и культуру соскребали с поверхности агара. Полученную суспензию переносили в стерильную пробирку с закручивающейся крьішкой, содержащую стекляннье шарики. После мацерации культурь! посредством интенсивного перемешивания суспензию использовали для засева жидкой средьі. Суспензию также употребляли для постоянного хранения культурьі при -70"С после добавления глицерина до 1595 от конечного обьема. 65 Когда мицелий бьл нужен для получения протопластов с целью их дальнейшей трансформации или в качестве источника ДНК, то штамм вніращивали віл колбах с 200мл средьі! УЕМЕ, состоящей из дрожжевого зкстракта - Зг; пептона - 5г; солодового зкстракта - Зг; глюкозь! - 10Ог; сахарозь! - З40г; МоСіІ»-6НьЬО - 1.02г; глицина - 5г; агара - 18г в одном литре дистиллированной водьі. Культивирование проводили при 287С на вращающейся качалке при 220 об/мин.

Пример, 6. Вьіделение геномной ДНК 5ігеріотусев.

Вегетативньйй мицелий 48-часовой культурьі, вьращенньй описанньм о вьіше способом, собирали центрифугированием при 22100х9 в течение 10 минут. Клетки ресуспендировали в 10мл буфера ТЕ, добавляли 10мг лизоцима, смесь инкубировали при З30"С в течение 15 минут. Затем добавляли один мл 2095 раствора 5О5 , после чего немедленно добавляли 1їОмл фенола, насьіщенного ТЕ /рН 8/, и 1.5мл 5М Масі; емкость со смесью 7/0 Мягко переворачивали в течение 20 минут. Фазьі разделяли центрифугированием при І2000х9 в течение 10 минут, после чего водньій слой удаляли и переносили в чистую пробирку. Добавляли равньій обьем хлороформа, емкость со смесью мягко переворачивали в течение 10 минут. Фазь снова разделяли центрифугированием при 12000худ в течение 10 минут, водньій слой удаляли и снова переносили в чистую пробирку. Осторожно добавляли два обьема изопропанола, осажденную ДНК "наматьівали" из раствора на 7/5 бтеклянную палочку и повторно растворяли в минимальном обьеме буфера ТЕ. Добавляли РНКазу А до конечной концентрации 2Омкг/ мл, раствор инкубировали при 50"С в течение одного часа. Затем добавляли протеазу К до конечной концентрации 100мкг/мл вместе со 100мММ раствором Масі и 0.495 раствором 5О5, смесь инкубировали при 37"С.в течение одного часа. Раствор снова зкстрагировали равньім обьемом фенола, насьіщенного ТЕ /рН 8/, что сопровождалось еще одной зкстракцией хлороформом. ДНК из конечного зкстракта 2о "Ччаматьвали" на стеклянную палочку после добавления к нему двух обьемов изопропанола, концентрацию ДНК определяли спектрофотометрически, используя показания поглощения при 2бОнм.

Пример 7. Конструкция генной библиотеки бЗігеріотусез сіамицідегиз и вьіделение фрагментов ДНК, содержащих гень гень!ї зкспандазь 5. Сіамиїїдегив.

Вьіделение гена зкспандазь 5. Сіамиіїдегив сч

Геномную ДНК Зігеріотусез сіамиідегиз5, полученную описанньм вьіше способом, расщепляли рестриктирущими ферментами Ват НІ и За! І. Расщепленную ДНК подвергали злектрофорезу в 0,895 агарозном і) геле; фрагменть! размером 1.8 и 2.2 т.п.н. злюировали из геля и лигировали в ДНК риС18, которая бьіла предварительно расщеплена Ват НІ и Заї І. Разведения лигированной смеси использовали для трансформации компетентньїх клеток /МІ0О с применением злектропорации /бСепе Риїзе, "Віо-Вай", Ричмонд, Калифорния/. ою Получение компетентньїх клеток и условия злектропорации соответствовали рекомендациям производителей.

Трансформационную смесь вьісевали на чашки со средой ЛБ, содержащей 100мкг/мл амшщиллина и 75мкл 290 со раствора Х-Гал. После культивирования при 37"С в течение ночи, рекомбнантнье колоний идентифицировали со по их бесцветному внешнему виду, которьій являлся следствием инактивации гена бзта-галактозидазь плазмидного вектора. Бесцветнье колонии перекальвали на чашку со свежей средой ЛБ, содержащей в

ООмкг/мл ампициллина. После культивирования при З7/"С в течение ночи, колониий переносили на «І нитроцеллюлозу и гибридизовали с зондом, в котором содержались основания 52 - 918 из опубликованной последовательности гена зкспандазь! Зігеріотусез сіамиціїдегиз /Комасеміс еї аі., /1989/. 9. ВасіегіоіЇ.,, 171 : 754 - 760 и Іпдоїїа ек аіІ. 0.5. 5.070 020/; зтот зонд бьіл получен при помощи полимеразной цепной реакции.

Мечение продукта полимеразной цепной реакции осуществляли посредством процесса удлинения случайной « затравки в присутствиий /2Р/дЦТФ, используя набор для олигонуклеотидного мечения в соответствий с - с рекомендациями производителя /"Ріпагтасіа", Різсаїамжшау, Мем/ Хегзеу/. Реакцию гибридизации вьіполняли в ч присутствий 105 СРМ радиоактивного меченого зонда, 30956 формамида, 5Х550 /0.15М масі, 0.015М цитрат я натрия, рН 7/. 0.195 раствора 505 , 5х раствора Денхарта /5г фикола, 5г поливинилпиролидона -и 5г БСА на 5ООмл 5О0Х исходного раствора/ и 1О0Омкг/мл ДНК тимуса теленка при 37"С в течение ночи. Несколько трансформантов сильно гибридизовались с зондом. Анализом рестриктирующими ферментами бьло ї подтверждено, что одна колония содержит вектор, несущий зкспандазньй ген; зта плазмида бьла обозначена -1 рЕТЗО-І.

Вьіделение гена гидроксилазь 5. сіамиїїдегив. (95) Геномную ДНК 5ігеріотусез сіамиіїдегиз частично расщепляли Ват НІ и лигировали в вектор лямбда Оавн ІІ со 50 фирмь! "Бігаїадепе.В полученной геномной библиотеке проводили поиск посредством гибридизации с олигонуклеотидом из 30 оснований, которьій содержал последовательность, идентичную первьім ЗО основаниям сл опубликованной последовательности гидроксилазного гена /Комасеміс апа Мійег 1991, 9. Васі. 173 : 398/.

Гибридизацией по Саузерну с ДНК из двух положительньх фаговьїх клонов, расщепленной Ват НІ, бьл обнаружен искомьій фрагмент 6 т.п.н., которьій бьіл субклонирован. Зтот субклон после расщепления Крпі дал набор фрагментов, которьій соответствовал опубликованной рестрикционной карте для области вокруг о гидроксилазного гена /Комасеміс апа Мійнег, 19917,

Пример 8. Вьіделение плазмидной ДНК. ко Культурь! Е.соїї, содержащие представляющую интерес плазмиду, виіращивали в 500мл бульона ЛБ /20г/л концентрата бульона ЛБ, "Хірсо", Пайсли, Шотландия/, содержащего 15мкг/мл тетрациклина, на вращдающейся 60 качалке с 220об/мин в течение 12 - 16 часов при 37"С. Клетки осаждали центрифугированием при 4000ха в течениє 10 минут при 40"С. Осадок клеток реоуспендировали в 18мл глюкозного буфера /50ММ глюкозьі, 25ММ

Трис рН 8.0, 10мММ ЗДТА/, добавляли 2мл 4Омг/мл раствора лизоцима /Зідта", Сент-Луис, Миссури/ в глюкозном буфере, смешвали и полученную смесь инкубировали при комнатной температуре в течение 15 минут. Добавляли сорок мл свежеприготовленного раствора 0.2М Маон, 195 505 , мягко центрифугировали и 65 помещали на лед на десять минут. Затем добавляли ЗОмл 5М раствора ацетата калия, рН 4.8, хорошо перемешивали, полученную смесь помещали на лед еще на десять минут. Клеточнье обломки осаждали центрифугированием при 4000х9 в течение десяти минут при 4"С, полученную надосадочную жидкость фильтровали через марлевьй фильтр, К прозрачной надосадочной жидкости добавляли изопропанол /0.6 обьема/ для осаждения плазмидной ДНК; осадок формировался при инкубирований при комнатной температуре

В течение 20 минут. Плазмиднуто ДНК осаждали центрифугированием при 4000х9 в течение 20 минут при 4"7С, затем промьвали 7095 зтанолом и бьістро внісушивали. Осадок ресуспендировали в Умл буфера ТЕ, затем добавляли 10 грамм С5 СІ и 0.387мл 1Омг/мл раствора бромистого зтидия. Зтот раствор центрифугировали при 313, 100хд в течение 24 часов. Полученную плазмидную полосу в градиенте хлористого цезия наблюдали в ультра-фиолетовом свете; вьіделяли бромистьй зтидий, затем удаляли, используя для зкстракции бутанол, 70 насьіщенньй водой. Затем из плазмидного препарата удаляли С5 СІ посредством диализа против буфера ТЕ; для окончательной концентрации применяли ПЗГ /М.в. 8000/, Концентрацию ДНК определяли спектрофотометрически, используя показания поглощения при 2бОнм.

Пример 9. Конструкция вектора рРеп ЕТ5О для трансформации Регпісіїйїчт.

Включение гена устойчивости к фдеомицину.

Вектор для трансформаций Репісійит бьіл сконструирован с геном устойчивости к флеомицину в качестве селективного доминантного маркера. Конструирование вьіполнялось, начиная с вьіделения фрагмента из 660 п.о., которьій содержал ген устойчивости к о флеомицину /ген флеомицин-связьвающего белка из

ЗігеріоаІоїеісниз пішаи віапиз/, сопряженньій также с терминатором дрожжевого цитохрома СІ, из плазмидь!

РИТ1З/САУГ А", Тоцшойве Седех, Франция/ посредством ее расщепления ВатнНі/Во! ІІ, злектрофореза в го агарозном геле и злюции из геля. Вьіделенньій фрагмент дигировали в сайт Ватні вектора рЗЕЇ ЕСТО /корпорация "Рготеда"; ориентацию гена определяли при помощи анализа рестриктирующими ферментами.

Уникальниьй сайт Ніпа ІІЇ в полученной плазмиде удаляли посредством рестрикции Ніпа Ії, заполнения концов с помощью полимеразьй Кленова и повторного лигирования. Затем вставляла Реї І-фрагмент из 550 п.о., содержащий совз-сайт фага лямбда, которьій позволяет использовать зтот вектор для формирования космид с при включений вставок подходящего размера. Зтот вектор обозначили реСРаА.

Геномную ДНК Р. спгузодепит частично расщепляли ЗашзЗА и использовали для получения библиотеки в і) фаговом векторе лямбда ЕМВІ 3. Клоньії, содержащие ген изопенициллин М-синтетазь! ЛИПМС/, вбіделяли из зтой библиотеки и использовали для получения серий субклонов; один субклон содержал фрагмент из 3.6 т.п.н, от первого сайта Ватні перед геном ИПМС до первого сайта Ніпа ІІІ после зтого гена. Уникальньй сайт заї! бьіл ю зо удален из зтого субклонайпри помощи рестрикции заї), заполнения концов с уступом с помощью полимеразь

Кленова и повторного лигирования. Затем аналогичньм образом бьл удален уникальньй сайт Хрьаї со посредством рестрикции Хваї, заполнения концов и повторного лигирования. Полученную плазмиду обозначили (се рЗХЕ-Ї. Инженерньй промотор ИПМС бьл вьіделен из геля с ДНК рехЕ-І как МсоІ-фрагмент из 1.2 т.л.н. и лигирован в МсоІ-сайт ресСР4, описанньй вьіше. Ориентация, определенная при помощи рестрикционного ї- з5 расщепления, бьла вьібрана так, чтобь! промотор бьл слит с геном устойчивости к флеомицину при стартовом «г кодоне АТГ. Зту плазмиду обозначили риТ2-2.

Включение гена зкспандазь 5. сіамціїдегив

Фрагмент из 1.645 т.п.н., содержащий ген зкспандазьі 5. Сіамицїдегиз5, бьл вьіделен из рЕТБО-Ї /предварительно описанного вектора/ посредством расщепления его Ватні и заїІЇ, злектрофореза полученньмх « Фрагментов в 0.87о агарозном геле и злюции из зтого геля. Вьіделенньій фрагмент лигировали в вектор з с рРЗЕГЕСТ/корпорация "Рготеда"/, таюке расщепленньй Ватні и ЗаїЇ. Зтот вектор бьіл обозначен рЕТ5О-8. . Новьій МесоІ-сайт бьл создан при стартовом кодоне АТГ зкспандазного гена путем сайт-направленного "» мутагенеза рЕТ5О-8, используя систему мутагенеза іп міго "Измененнье Сайть Ф " /корпорация Рготда'/.

Мутагенез вьіполняли в соответствии с инструкциями производителей. Олигонуклеотидь! конструировали на оснований комплементарности с кодирующей последовательностью участка ДНК при стартовом кодоне АТГ из с» опубликованной последовательности гена зкспандазь! бігеріотусез /Комасеміс еї аї., /1990/, 9. Васіегіої., 171, стр. 3952 - 3958/. Олигонуклеотидьі синтезировали при помощи цианозтил фосфорамидитовой химий ї /оборудование для сборки генов фирмь!і "Рпагтасіа"/; олигонуклеотидная последовательность бьіла следующей: (95) Посл-сть ІД Мо :8 3 ЦГАГАГТАТЦАГТГАГАГ ЦЦАТГГАЦАЦГАЦГГ 5

Со Мутагенез бьіл подтвержден, анализом рестриктирующими ферментами. Затем рестрикцией Мсої! из рОТ2-2 сл бьлл вьіделен МсоіІ-фрагмент из 1,2 т.п.н., соядержащий инженерньй промоторньїй участок ИПМС Р. спгузодепит; рестрикция сопровождалась агарозньм гель-злектрофорезом. Промоторньй участок лигировали в вектор рЕТ5О-8 по новому МсоІ-сайту, созданному при помощи мутагенеза при стартовом кодоне АТГ зкспандазного гена. Ориентация промотора по отношению к зкспандазному гену бьіла установлена анализом рестриктирущими ферментами. Кассета промотор ИПМС: зкспандазньй ген затем бьіла извлечена как ВатнНі/ЗаІ-фрагмент и

ІФ) помещена в ресщепленньй ВатнНі/За вектор рОТ2-2 для трансформации Репісіит, описанньїй вьіше. ко Конечная конструкция бьіла обозначена рРепЕТ5о.

Пример 10. Конструкция вектора Ррепсерн-1 для трансформации Репісйіит. 60 Включение промоторного участка ИПМС.

Промоторньій участок ИПМС бьіл вьіделен из рО0Т7-2, подробно описанной вьіше в Примере 9, путем расщепления ее ХпО/зтаІЇ. Вектор рИТ7-2 бьл расщеплен Ватні; вьіступающие концьі заполняли с использованием ДНТФ и фрагмента Кленова, получая тупьіе концьі; затем проводили расщепление ХПНОЇ; вьіделенньій. ХпПОЇ/зтаІ-фрагмент с промотором ИПМС лигировали в зтот расщепленньій вектор, получая 65 конструкцию, которая содержала два участка промотора ИПМС. Зтот вектор бьіл обозначен риТ2-7.

Включение гена акспандазь/гидроксилазь С, асгетопішт.

Один из участков промотора ИПМС бьіл затем вьіделен посредством злектрофореза в агарозном геле и злюции из геля/ из рИОТ7-7 в виде ХпоЇ/ХраІ-фрагмеята и лигирован в расщепленньй Хпо/Ї/Хваї вектор рВішезсгірі рИЇЗК/ Бігагадепе", Ла Джолла, Калифорния/. Зтот вектор бьіл обозначен ріРМ5р/річе.

Зкспандазно/гидроксилазньй ген СерпаІозрогішт бьл вьіделен/ посредством злектрофореза в агарозном геле и злюции из геля/ в виде Ніпіа П/храІ-фрагмента из 1.б т.п.н. одного из тех геномньїх. клонов, что идентифицировань! вьіше, и лигирован в вектор роЕГ ЕСТ, расщепленньй Ніпа ПШ/храї. Новьій ВерНі-сайт бьл создан при стартовом кодоне АТГ зкспандазно/гидроксилазного гена путем сайт-направленного мутагенеза, используя систему мутагенеза іп міго "Измененнье сайть! "М" /корпорация "Рготеда"/. Мутагенез бьл вьіполнен 70 в соответствий с инструкциями производителей. Олигонуклеотид бьл сконструирован на оснований комплементарности с кодирующей последовательностью участка ДНК при стартовом кодоне АТГ из опубликованной последовательности зкспандазно/гидроксилазного гена Серпаіозрогійт асгетопішт/ Затзоп еї а!І., Віо/Тесппоіоду, Мої. 5 Мометрбег, 1987/. Олигонуклеотвд бьіл синтезирован при использованиий цианоз тил фосфорамидитовой химиийи /оборудование для сборки генов фирмь "РНаптасіа"7, олигонуклеотидная 75 последовательность била следующей:

Посл-сть ІД Мо:9 3 ГТ ЦОТАГАГТТЦТГААГТТЦЦАГ 5

Мутагенез бьл подтверноден анализом рестриктирующими ферментами. Ген зкспандазь/гидроксидазь

Серпаіозрогішт асгетопішт затем бьіл вьіделен /посредством злектрофореза в агарозньїх гелях и злюции из гелей/ как ВзрНіІ/ХраІ-фрагмент и лигирован в расщепленньй Месоі/ Хра! вектор ріРМ5р/рісе, описанньй в предьідущем Примере. Зтот вектор теперь содерлсал промотор МПМС Репісіййшт при АТГ зкспандазно/гидроксилазного гена Серпаіозрогішт асгетопішт. Зтот вектор бьіл обозначен ріРМЗр/ЕХР/БІЧе.

Кассета промотор ИПМС:зкспаддаза/гидроксилаза бьіла частично расщеплена Х/поЇ и полностью расщеплена

Хваї, фрагмент вьіделен /посредством злектрофореза в агарозньїх гелях и злюции из гелей/ и лигирован в Га расщепленньй /ХПпо1/Хбаї вектор риТ72-2, описанньй в Примере вьіше, с о образованием о конечного-трансформационного вектора РРЕМСЕРН-Ї.

Пример ІІ. Конструирование трансформационного вектора РепісШіит для зкспрессии зкспандазного и гидроксилазного генов 5. сіамиїїдегив.

Ген Д-тубулина Р. спгуводепит бьл клонирован из геномной библиотеки в фаге лямбда с использованиеєм зо гена Д-тубулина АРЕКСІЦ ОЗ МІСЕК в качестве гибридизационного зонда. Фрагмент Хваї/Ніпа ПІ из 2.0 т.п.н., содержащий промотора р-тубулина Репісіййчт, бьл лигирован в Хваї/Ніпа І-сайть РЗЕГЕСТ /Рготеда", со

ФЗЛЕСТ / Рю/пела"/. МсоІ-сайт бьл введен при стартовом кододе АТГ при помощи сайт-направленного СО мутагенеза последовательности АЦЦАТПТТ. їм

Из полученного вектора с помощью геля бьл вьіделен Ватні/МсоІ-фрагмент из 1.4 т.п.н. и лигирован между сайтами Ватні и Мсої! вектора риТ7-2 /описанного предварительно/ с образованием вектора рсі-6. Из геномного « клона Р спгузодепит с помощью геля бьіл вьіделен ЗаЇІ-фрагмент из 5.1 т.п.н., содержащий геньї ИПМС и ацилтрансферазь, и лигирован в За|І-сайт вектора риТ7-2 с образованием вектора риТ7-5. 3" -терминаторная последовательность гена ИПМС бьіла вьіделена из вектора рОТ27-5 при помощи рестрикции Ватні и Ніпа ІП, « сопровоздающейся вьіделением из геля фрагмента из 1.3 т.п.н., которьій бьіл лигирован мевду сайтами Ватні и

Ніпа І вектора рСІ-6 /описанного вьіше/ с образованием вектора рсСіІ-13. Уникальнь! ЗаїІ-сайт неподалеку от З с Ватні-сайта в векторе рсСІ-13 бьл удален посредством рестрикции, заполнения с использованием.полимеразь! хз» Кленовой повторного лигирования. Новьй зЗаїІ-сайт бьіл введен с другой стороньі от ВатНі-сайта при помощи сайт-направленного мутагенеза последовательности ГТААГАЦГ в последовательность ГТ ЦГАЦГ Затем ген устойчивости к амшциллину бьл удален из плазмидьі при помощи рестрикции Руи І, вьіделения из большего фрагмента и повторного лигирования с образованием рсСі-15. Наконец, кассета промотор ИПМС: ген зкспандазк ве бьіла вьіделена с помощью геля из РРЕМЕТ5О в виде Взтні/ЗаїІІ-фраг-мента размером 2.4 т.п.н. и лигирована в -1 рСІ-15 с образованием рЕХР-Ї.

Конструирование вектора для зкспрессии обоих генов гидроксилазьі и зкспандазь! 5. сіауиціїдегив состоит из о следующих зтапов. Крпі-фрагмент из 2.9 т.п.н., содержащий гидроксилазньй ген, суб-клонйруется в рРЗЕГ ЕСТ со 250 так, что ЕсоКіІ-сайт в полилинкере является соседним с 5' -концом гена. Уникальньій МсоІ-сайт удаляєтся из плазмидьй путем сайт-направленного мутагенеза последовательности ТЦГАТТТЦ в последовательность сл ТЦГАТГТГЦ; одновременно новьій МсоіІ-сайт вводится в область стартового кодона путем изменения последовательности ААЦАТГТЦ на АЦЦАТГТЦ. Оба изменения предохраняют закодированную аминокислотную последовательность. ЕсокКІ/Мсо!І--фрагмент из 1.0 т.п.н., содержащий инженерньій промотор ИПМС, с помощью геля вьіделяєтся из рОТ7-2 и лигируеєтся между сайтами ЕсокКіІ и Мсо! вьішеописанного вектора, содержащего

ГФ! измененньій гидроксилазньй ген. Затем, уникальньй сайт ЕсоК! в полученном векторе Ніпа П-сайтом при помощи сайт-направленного мутагенеза. Слитая конструкция 5 МИПМС: гидроксилаза вьіделяется из о полученного вектора в виде Ніпа ІП-фрагмента, которьій затем лигируется в уникальньй Ніпа ПІ-сайт вектора рЕХР-Ї, описанного вьіше. Конечньй вектор содержит геньі зкспандазьй и гидроксилазьі, причем каждьй ген 60 управляется промотором ИПМС; и маркер устойчивости к фле-омицину, управляемьй промотором р-тубулина.

Пример 12. Конструирование вектора рРе/пСсАСТ для трансформации РепісшШіит.

Включение гена устойчивости к гигромицину.

Трансформационньй вектор Репісіїййшт бьіл сконструирован с геном устойчивости к гигромицину в качестве доминантного селективного маркера. Ген гигромицин В-фосфотрансферазь! Е.соїї бьіл вьіделен /при помощи бо злектрофореза в агарозном геле и злюции из геля/ в виде ВатНі-фрагмента из І.І5 т.п.н. из вектора рНрі-1

""Военгіпдег Мапппеіт" Индианополис, Индиана/ и лигирован в расщепленньій Ватні вектор мр19. Ориентация гена устойчивости к гигромицину в тр19 бьіла определена анализом рамки считьівания ДНК рестрикционньіми ферментами. 5 ВатнНі-сайт находится неподалеку от стартового кодона АТГ гена устойчивости к гигромицину.

Для облегчения расположения алтернативного промотора при 5 ВатнНі-сайте 3 ВатнНі-сайт бьіл удален сайт-направленньм мутагенезом при помощи набора для сайт-направленного мутагенеза "Мутатор "М"/"Зігаїадепе", Ла Джолла, Калифорния/. Мутагенез бьіл вьіполнен в соответствии с инструкциями производителей, Олигонуклеотид бьіл сконструирован на оснований комплементарное ти с участком ДНК при 3'

Ватні-сайте из опубликованной последовательности гена гигромицин В-фосфотрансферазь! Е.соїї зп, Її апа 70 Оаміев, у9., 1983, Сепе, 25, 179/. Олигонуклеотид бьл синтезирован при использованиий цианозтил фос-форамидитовой химии /оборудование для сборки генов фирмь! "РНагтасіа"7/; олигонуклеотидная последовательность бьіла следующей:

Посл-сть ІД Мо:10 5 ТАТЦЦЦТТТТтТЦЦЦтТЦТтТААЦТ 3"

Мутагенез бьл подтвервден анализом рестрикционньми ферментами. Мутагенизированньій ген устойчивости к гигромицину затем бьіл вьіделен в виде Зтаї|/ХраІ-фрагмента /посредством злектрофореза в агарозньхх гелях и злюции из гелей/ и лигирован в расщепленньій Зтаї/Хваї вектор рис 18.

Промотор ИПМС Репісіййшт бьіл вьіделен /посредством злектрофореза в агарозньх гелях и злюции из гелей/ в виде МсоІ-фрагмента размером 1.2 т.п.н. из расщепленного Мсо! вектора риТ7-2 /предварительно описанньй вектор/. Синтетические олигонуклеотид-нье линкерь! бьіли синтезированьії для создания ВатнНі-сайтов из

МсоІ-сайтов на концах промоторного фрагмента ИПМС так, чтобьі расположить промотор ИПМС в 5

Ватні-сайте неподалеку от АТГ гена устойчивости к гигромицину. Олигонуклеотидь! бьіли синтезировань! при использований цианозтил фосфорамидитовой химии /оборудование для сборки генов фирмь!ї "РНагтасіа"/; бьіли полученьї следующие олигонуклеотиднье последовательности: с

Пос-сть ІД Мо: 11 о 5 ЦАТГААГААГ 3

Пос-сть ІД Мо: 12 3 Т"ЦТТЦЦТАГ 5

В зтой последовательности сохраняется естественная последовательность промотора ИПМС, но вставлень юю две аминокислоть! в ген устойчивости к гигромицину. Олигонуклеотидь! бьіли отожженьії, фосфорили-ровань и лигированьі в расщепленньій Мсо! промоторньій фрагмент ИПМС, что привело к появлению ВатнНі-сайтов на 09 обоих - 5 и 3 -концах промоторного фрагмента ИПМС. Зтот промотор с-линкерами на концах бьіл лигированв "со расщепленньїй Ватні ген устойчивости к гидромицину в рос 18; его ориентация бьіла подтверждена аналізом рестриктирующими ферментами. Зта кассета промотор ИПМС: ген устойчивости к гигромицину затем бьла -

Ввіделена /посредством злектрофореза в агарозньїх гелях и злюции из гелей/ в виде Хпо1//ЗаІІ-фрагмента ч;Е размером 2.1 т.п.н. /сайт Хо! расположен на 5' -конце промотора ИПМС, а сайт Заї!Ї происходит из полилинкера рисС/ и лиги-рована в расщепленньй заїЇ вектор рРЗЕГЕСТ. Ориентация кассеть! била определена анализом рестриктирующими ферментами. Зтот вектор бьіл обозначен рІРМБ/НУЄС. Включение ацетилтрансферазного « гена Серпаіозрогіит асгетопіт.

Ацетилтрансферазньй ген Серпаіозрогіт бьл вьіделен из геномного клона /описанного вьіше/ посредством щей с злектрофореза в ага-розньїх гелях и злгоции из те лей в виде ВайП/ЗаїП-фрагмента размером 1.8 т.п.н. ц Ацетилтрансферазньй ген бьл лигнрован в расщепленньй ВатнНі/За!! вектор рОЕЇ ЕСТ. Для облегчения ,» расположения промотора ИПМС Репісіййшт при АТГ ацетилтрансферазного гена Серпаіозрогійт бьл создан новьІй МсоІ-сайт при АТГ ацетилтрансферазного гена, а внутренний МсоіІ-сайт бьіл удален из структурного гена сайт-направленньмм мутагенезом с использованием системь: мутагеназа іп мійго "Измененнье сайть тми т» /корпорация "Рготеда". Мутагенез бьл вьшполнен в соответствий с инструкциями производителей. - Олигонуклеотидьі бьли сконструированьь на оснований комллементарно-сти со кодирующими последовательностями участков ДНК, представляющих интерес, из последовательности ацетилтрасферазного (95) гена Серпаіозрогішт, представленной вьіше в Посл-стях ІД Мо:/1 и 2, Олигонуклеотидная последовательность, со 50 использованная для удаления Мсо|1-сайта из структурного гена, била следующей: Пос-сть ІД Мо: 13 3 ГІТЦГІТЦГЦАТЦГАТТТТТГТААТ 5 сл Олигонуклеотидная последовательность, использованная для создания нового МсоІ-сайта при стартовом кодоне АТГ, бьіла следующей:

Посл-сть ІД Мо: 14 3 ЦГЦЦЦАЦЦАТТЦГЦЦТЦАГАТ 5 о Зти олигонуклеотидьі бьли синтезированьь при использований цианозтил фосфорамидитовой химийи /оборудование для сборки генов фирмь! "Ріагтасіа"/ Мутаганез бьіл подтвержден анализом рестриктирующими іме) ферментами. Зтот вектор биіл обозначен РМОТАСТ.

Промотор ИПМС Репісіййшт бьіл вьіделен /посредством злектрофореза в агарозньх гелях и злюции из гелей/ 60 в виде МсоІ-фрагмента размером 1.2 т.п.н. из вектора рОТ2-2, подробно описанного в Примере вьіше. Зтот промоторньій фрагмент бьл лигирован в расщепленньій Мсо! вектор РМОТАСТ, в котором промотор ИПМС теперь расположен прямо при АТГ ацетилтрансферазного гена СерпаІозрогішт асгетопіит.

Ориентация промотора бьла подтверждена анализом рестрик-тирующими ферментами. Зта кассета промотор ИПМС:ацетилтрансферазньій ген бьла расщеплена ХПпо1І/ЗаПй/сайт Хпо! расположен на 5'-конце бо промотора ИПМС, а сайт Заї! находится на 3' -конце ацетилтрансферазного гена/ и лигирована в расщепленньй заїЇ вектор РЗЕГЕСТ. Ориентация фрагмента бьіла определена анализом рестриктирущими ферментами. Зтот вектор бьиіл обозначен РМОТАСТЛР М.

Мутагенез, использованньй для создания нового сайта МсоїІ при АТГ ацетилтрансферазного гена, привел к Замене второй аминокислоть! серина на аланин. Для того, чтобьі сохранить кодирующую последовательность идентичной последовательности нативного гена, бьіл проведен сайт направленньй мутагенез с использованием системь! мутагеназа іп мійго "Измененнье Сайть!' М", Олигонуклеотид бьл сконструирован на оснований комплементарности с кодарующей последовательностью участка ДНК, представляющего інтерес из последовательности ацетилтрансферазного гена, представленной вьше как Посл-сти ІД Мо: 1 и 2. 70 Олигонуклеотидная последовательность, изпользованная для замень! второй аминокислоть! с аланина на серии, била следующей:

Посл-сть ІД Мо: 15 3 ТЦТАГЦТАГАЦАЦЦАТ ТЦГЦЦТЦАГАТ 5

Олигонуклеотид бьіл синтезирован с использованием цианозтил фосфорамидитовой химии /оборудование 75 для сборки генов фирмь"РІагтасіа"/. Мутагенез бьіл подтвержден определением последовательности ДНК при помощи набора для определения последовательности ДНК "Секвеназа Версия 2.0" фирмь! "О5В"О5В",

Кливленд, Огайо/. Затравки для определения последовательности ДНК бьіли синтезировань! с использованием цианоз тил фосфорамидитовой химии /оборудование для сборки генов фирмь!ї РНагтасіа"/. Зтот вектор бьл обозначен РМОТАСТ/ЛРМ5-2.

Кассета промотор ИПМС: ген устойчивости к гигромицину бьіла удалена из вектора рІРМ5З/НУС- в виде

ХраІ-фрагмента и лигирована в расщепленньій Хра | вектор РМОТАСТ/ЛРМ5З-2с образованием конечного трансформационного вектора рРепсСАСТ. Ориентация гигромициновой кассеть! бьіла определена анализом рестриктирующими ферментами. Пример 13. Конструирование трансформационного вектора рТ5-8 Репісіййшт для зкспрессии генов зкспандазь/гидроксилазьі! и ацетилтрансферазьі! Серпаіозрогішт асгетопіт. Га

Ген ацетилтрансферазьі Серпаіозрогішт бьіл вьіделен /посредством злектрофореза в агарозньїх гелях и злюции из гелей/ в виде ВайП/5За|І-фрагмента размером 1.8 т.п.н. из геномного клона и лигирован в і9) расщепленньій Ватні/заї! вектор рРЗЕГ ЕСТ /корпорация "Рготеда". Для облегчения расположения промотора

ИПМС РепісшШіит при АТГ ацетилтрансферазного гена СерпаІозрогішт при кодоце АТГ бьіл создан новьй

МесоІ-сайт, расположенньійОпри оснований-42 /Маїнпізоп еї аїЇ., Сигпгепі (зепеїйсв, в печати/, а внутренний ю МесоІ-сайт бьл удален из структурного гена сайт-направленньм мутагенезом с использованием системь! мутагенеза іп міго "Измененнье Сайть!" /корпорация "Рготеда"/. Мутагенез бьіл вьшполнен в соответствии с со инструкциями производителей. Олигонуклеотидь! бьіли сконструированьі на оснований комплементарности сс кодирующей последовательностью участков ДНК, представляющих интерес, которье, однако, включают несколько изменений для создания или удаления МесоІ-сайта. Олигонуклеотидная последовательность, - использованная для удаления из структурного гена внутреннего Мсоі!-сайта, била следующей: «І

Посл-сть ІД Мо: 16 3 ГІТЦГІТЦГЦАТЦГАТГТТТТТААТ 5

Олигонуклеотидная последовательность, использованная для создания нового МсоіІ-сайта при АТГ на « расстояний -42 основания, бьіла следующей:

Посл-сть ІД Мо: 17 - с 5 ЦТЦЦГАТАГТТТЦГТТТАЦЦЦГГЦЦЦТАЦТЦТТАТ 3" й Олигонуклеотидь! бьіли синтезированьї при использований цианозтил фосфорамидитовой химий "» /оборудование для сборки генов "РПагтасіа"7/. Мутагенез в обоих случаях бьл подтвержден анализом рестрикцисиньми ферментами. Зтот вектор бьіл обозначен РМОТАСТ. Промотор ИПМС РепісшШит бьіл вьіделен /посредством злектрофореза в агарозньх гелях и злюции из гелей в виде МсоІ-фрагмента размером 1.2 т.п.н, из «г» вектора рИиТ2-2, предварительно описанного вьше. Зтот промоторньй фрагмент бьл лигирован в расщепленньй Мсо! вектор РМОТАСТ, в котором промотор ИПМС теперь располагался прямо при -42 основания 7 от АТГ гена адетилтрансферазь! СерпаІозрогішт. Ориентация промотора бьла подтверждена анализом оз рестриктирующими ферментами. Зтот вектор биіл обозначен РМОТАСТЛРМЗ. Хпоі/ЗаІІ-фрагмент размером 2.5 т.п.н. бьіл вьіделен /посредством злектрофореза в агарозньїх гелях и злюции из гелей/ из вектора со РМИОТАСТ/ЛРМЗ, которьій содержал кассету промотор ИПМС:ацетилтрансфераза, и лигирован в расщепленньй сл ЗаїІвектор рОТ7-2 /описанньій предварительно/. Зтот промежуточньій вектор затем бьл расщеплен Хваї и лигирован с ХраІ-фрагментом размером 2.1 п.н. из вектора рРРЕМ/СЕРН-Ї /описанного предварительно)/, содержащим кассету промотор ИпПМс: зкспандаза/гидроксилаза, с о образованием конечного трансформационного вектора рТ5-8.

Пример 14. Трансформация Репісіїййшт спгузодепит.

Ф, Протопласть! штамма Репісіїййшт спгузодепит, описаного вьіше, получали посредством засева 5О0мл бульона іме) ПС І х 107 спор и культивирования в течение 67 часов при 257С на вращающейся качалке с 220об/мин. Мицелий собирали фильтрованием через марлевье фильтрьі, переносили в 500мл колбьі и ресуспендировали в 25мМл бо КМФ /0.7М КСІ, 0.8М маннита, 0.02М КРО;), рН 6.3/.содержащего 100мг Момогуте 234 /Момо Віо Іарв",

Багсваерд, Дания/; смесь инкубировали при температуре 3З0"С при 100боб/мин. Сферопласть! отделяли фильтрованием через фильтрь, состояние из марли и стекловатьї, и осаждали центрифугированием при З50ха в течение 10 минут. Затем сферопластьї промьвали три раза по 1їОмл буфера КМФ, ресуспендировали в буфере КМФК /КМФ с 50мМ Сасі»/ до концентрации 5 х 107 клеток/мл и оставляли при комнатной температуре бо на 20 минут. Для трансформации Репісіїййшт к 200мкл суспензии сфероплас-тов добавляли ДНК /5мкг векторной

ДНК в 6.2 мкл КМФК с 5мг/мл гепарина/ вместе с 50мкл ПФК /4095 ПОГ, М.В. 3500; 20мММ КРО,, рН 6.3; 595 Сасі»

добавляли непосредственно.перед использованием/; трансформационную смесь инкубировали на льду в течение 30 минут. Затем добавляли один мл свежеприготовленного ПФК и смесь переносили в Б5Омл расплавленной /50"С/ регенерационной средь! /ПС плюс 1.395 маннита и 395 агара/. Затем трансформационную смесь распределяли между 5 чашками Петри. После регенерации в течение 24 часов при 2573 чашки покрьівали слоем средь ОЇ. /195 пептона в 195 агара/, содержащей 100мкг флеомщина/5Омл ОГ. Обьем верхнего слоя бьл равен обьему регенерационной средь. Чашки инкубировали при 257"С в течение 7 - 14 дней и наблюдали за образованием колоний трансформантов.

Пример 15. Исследование биологической активности. 70 Для определения антибиотической активности ферментационньїх продуктов адипоил-6-АПК и адипоил-7-АДЦК, вьіделенньїх с помощью ВЗЖХ, использовали их биологическое испьітание путем диффузии в агар. Двадцать гжл вьіделенного продукта наносили на бмм диски, которье накладьвали на чашки с агаризованной средой ЛБ /20г/л концентрата бульона ЛБ с 395 агара, "Сірсо" Пайсли, Шотландия/, засеянной

Васійнв зиБійв АТСС 33677 или сверх-чувствительньм штаммом Е.соїї /лпредоставленньм проф. Агпоїй Ї.

Оетаїп МІ. Васійив5 зибБійїв использовали в качестве индикаторного штамма для испьтания продукта адипоил-6-АПК, а сверх-чувствительньй штамм Е.соїї использовали в качестве индикаторного штамма для испьітания продукта адипоил-7-АДЦК. Через 15 часов инкубации при 37"С ободки подавления роста индикаторньїх бактерий вокруг дисков указьівали на то, что продуктьї обладают биологической активностью.

Контроля в зтом зксперименте включали деацетоксицефалоспорин С, цефалоспорин С, пенициллин М и го агаризованную среду, содержащую или не содержащую пенициллиназу, которая служила контролем для подтверждения р-лактамазньїх структур.

Пример 16. Метод ВЗЖХ для одновременного анализа адипоил-содержащих 6-АПК, 7-АДЦК, 7-АДАЦ и 7-АЦК.

Ферментационнье продуктьї трансформированньх штаммов Ріпісіййшт /адипойл-6-АПК, адипоил-7-АДЦК, су адипоийил-7-АДАЦ и адипоил-7-АЦК/ одновременно анализировали при помощи вьісокозффективной жидкостной хроматографии /ВЗЖХ/. Система ВЗЖХ состояла из следующих компонентов УУа(еге: системь! подачи о растворителя 625, индикатора различньїх длин волн 409Е /установленного на 220нм и 26бОнм/ и системьї данньх

Махіта 825. Для стационарной фазь! пользовались патроном радиального давления 5 х 100мм Мома-Рак С 18 со вставкой Мома-Рак зцага-Рак. Подвижная фаза состояла из 10-минутного, линейного градиента от начальньх ою зо условий: 595 метанол и 9596 10мММ КРО,, рН 5; до конечньїх условий: 4095 метанол и 6095 КРО,, рН 5 /при скорости потока 1 мл/глин/. Адипоил-6-АПК определяли количественно путем сравнения со стандартной кривой со пенициллина М при 220нм. Продукть! с расширенньім кольцом определяли количественно путем сравнения со со стандартньіми кривьіми синтетических, адипоил-7-АДЦК и адипоил-7-АЦК при 2бОнм.

Пример 17. Исследование фермента КАЕМ. -

Для определения специфической активности фермента КАЕМ /его можно приобрести у производящей «І корпорациий КАЕМ/ в качестве субстрата использовали химически синтезированнье адипоил-7-АДЦК и адипоил-7-АЦК. Реакционная смесь содержала 10мММ субстрата, їмкг фермента КАЕМ и 595 глицерина, растворенньх в 0.16М КНоРО,, /общий обьем смеси 5Омкл/; смесь инкубировали при 37"С. /Более оптимальнье условия реакций включают использование 20ММ или более концентрированного раствора субстрата в 20 - « 5ОММ калий-фосфатном буфере/. Аликвоть! по 5мкл отбирали через 0, 1, 3, 5, 10, 20 и ЗО минут после начала ЩО) с реакции, разводили в ЗоОмкл 0.010 М КНоРО»;, рН 3.5, и замораживали при -70"С перед анализом ВЗЖХ в й условиях, описанньїх предварительно. «» Активность фермента КАЕМ оиспьїтьшали по отношению ок колориметрическому субстрату адипоил-п-аминобензойной кислоте, используя 5ММ субстрата, 8.25мкг фермента КАЕМ и 1095 глицерина, растворенньх в 0.065М КНоРО,, рН 7.0 /общий обьем смеси составлял 50мкл/, и инкубацию при 37"С в течение ї» 30 минут. Реакцию проводили в чашках для микротитрования с 96 лунками. Для остановки реакции добавляли пятьдесят мкл разведения 1/100 ІМ Ма МО 5 в 0.25М уксусной кислоте; реакционную смесь оставляли при

Ше комнатной температуре на З минуть. Затем добавляли сто мкл разведения 1/100 раствора гидрата

Ге) мононатриевой соли 4-амино-5-гидрокси-2,7-наф-талин-дисульфокислотьі в воде с концентрацией 1Омг/мл в 9.5М МаСОз; немедленно определяли появлениє окрашивания при 515нм, используя прибор ЕЇ. 312 для бо считьівания био-кинетических результатов с чашек /оборудование "ВіоТек"/. Пример 18. Оценка альтернативньх сл адипоил-ацилаз.

Помимо исследований с оприменением фермента КАЕМ, удаление адипоиловой боковой цепи изадипойл-7-АДЦК /и других адипоил-содержащих соединений/ бьіло продемонстрировано с ферментами, Ообразуемьх множеством микробньїх источников. В начале исследования штаммь! Рзепдотопаз зр. ЗЕ-83 и

ЗЕ-495, принадлежащие Авзапйі /заложеньії в коллекцию Мнститута Ферментационньх исследований под (Ф, присвоенньми им номерами РЕКМ ВР-817 и РЕКМ ВР-818, соответственно/ и штамм Рзепдотопав 5У-77-1, ко принадлежащий Тоуо Уо20о /заложен в коллекцию Северной Региональной Исследовательской Лаборатории под присвоенньм ему номером МКК. В-8070/ вниіращивали в течение 72 часов на среде, содержащей НуСаве 5БЕ - бо 2.090 /вес/обьем/; мононатрий глутамат - 0.595 /вес/обьем/; дрожжевой екстракт - 0.595 /вес/обьем/; порошкообразньій кукурузньій зкстракт - 0.295 /вес/обьем/ масло из семян хлопка - 0.5950 /вес/обьем/ и глутаровую кислоту - 0.195 /вес/обьем/. Клетки собирали центрифугированием и промьівали 50ММ фосфатньм буфером, рН 8.0; затем клетки ресуспендировали в буфере; их внешнюю мембрану делали проницаемой путем'добавления небольшого количества хлороформа. Аликвотьі клеточной суспензий затем смешивали с 65 адипоил-пара-нитроанилином /ад-пНА/ и инкубировали при З0"С в течение 2 - 18 часов. После инкубации реакционнье смеси подкисляли добавлением 1095 /обьем/обьем/ уксусной кислоть. Освободившийся п-нитроанилин затем определяли колориметрическим способом при его превращениий в диазо-соединение, используя реактивьі), предоставляемье в виде набора химической компанией "Зідта" для исследования гамма-глутамил-трансферазь! /продукт фирмь! "Зідта"номер 545-А/. Относительньюе активности трех штаммов составляли 10095, 85.595 и 4895 для штаммов ЗЕ-495, 5Е-83 и 5У-77-1, соответственно. С использованием методов, сходньїх с теми, что описаньі вьиіше для фермента КАЕМ, бьіло также продемонстрировано действие ферментов 5Е-83 и ЗЕ-495 на адипойл-7-АДЦК. Образование р-лактамаз у штамма 5У-77-1 препятствует демонстрации деацилирующего действия зтого штамма на адипойл-7-АДЦК.

Сходньїм образом образование адипоил-ацилазь! бьіло также продемонстрировано у двух грибньїх штаммов 70 /АМетага зр. МА.-133, АТСС Мо 20492 и Аврегаїйиз зр. МА-13, АТСС Мо 20491; ссьілка на 0.5. 4, 141, 790, вьіданньій Мем Зеїка Каїзпа ЦЕ. и трех дополнительньїх бактериальньїх штаммов /Вгемірасіегішт, АТСС Мо 14, 649; Аспготобрасіегішт, АТСС Мо 14, 648; и Тіаморасіейцт, АТСС Мо 14, 650, которье бьіли описаньі как продуценть! цефалоспорин С-ацилазь в О.5. З, 239, 394, вііданном Мегск 5 Со, Инк./. т

Claims (17)

Формула винаходу

1. Способ получения 7-аминодеацетилцефалоспорановой кислоть! (7-АДАЦ), отличающийся тем, что осуществляют: - вниращивание штамма Репісйит спгузодепит, которьій образует изопенициллин М, в культуральной среде, способной поддерживать его рост, и добавление к упомянутой культуральной среде источника поступления адипата, вьібранного из группьі: адипиновая кислота и/или ее соли и зфирьї, при зтом источник поступления адипата усвайваєтся и используется упомянутьм штаммом Репісіїййшт спгузодепит для образования адипоийл-б6-аминопенициллановой кислоть! (адипоийл-6-АПК), посредством чего и образуется упомянутая с адипоил-6-АПК; - осуществление следующих ферментативньїх превращений посредством зкспрессии іп о-віш і) соответствующих генов: - кольцо адипоийл-6-АПК расширяется іп зіш с образованием адипоил-7-аминодезацетоксицефалоспорановой кислоть! (адипоил-7-АДЦК), ферментом зкспандазой, где ю зо упомянутьй штамм Репісіїййшт спгузодепит бьіл трансформирован ДНК, кодирующей активность зкспандазного фермента, которьій способен воспринимать упомянутую адипойил-6-АПК в качестве субстрата, где в результате 90 зкспрессии зтой ДНК кольцо упомянутой адипоил-6-АПК, образуемой упомянутьмм штаммом, расширяется іп віш со с образованием адипоил-7-АДЦК, - З-метильная боковая группа адипоил-7-АДЦК гидроксилируеєется іп озйи с о образованием - адипоил-7-аминодеацетилцефалоспорановой кислотьі (адипоил-7-АДАЦ) ферментом гидроксилазой, где «г упомянутьй штамм РепісійШт спгузодепит бьл трансформирован ДНК, кодирующей активность гидроксилазного фермента, которьій способен воспринимать упомянутую адипоил-7-АДЦК в качестве субстрата, где после трансформации, в результате зкспрессии зтой ДНК упомянутая адипойил-7-АДЦК, образуемая упомянутьм штаммом, гидроксилируется іп зйи с образованием адипоил-7-АДАЦ; и « - взаймодействие упомянутой адипоил-7-АДАЦ с адипоил-амидазой, посредством чего боковая цепь 2 с адипоила удаляется и образуется продукт 7-АДАЦ, и упомянутьй продукт затем вьіделяется.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что источником поступления адипата является динатрий адипат. :з» З.

Способ по п. 1, отличающийся тем, что ДНК, кодирующая активность зкспандазного и гидроксилазного ферментов, происходит из Серпаіозрогішт асгетопіт.

4. Способ по п. 3, отличающийся тем, что используют один бифункциональньй фермент ї» зкспандаза/гидроксилаза.

5. Способ по п. 1, отличающийся тем, что адипоил-амидаза происходит из видов Рзейдотопаз.

-

6. Способ получения 7-аминоцефалоспорановой кислоть (7-АЦК), отличающийся тем, что осуществляют: оо - вниращивание штамма Репісйит спгузодепит, которьій образует изопенициллин М, в культуральной среде, способной поддерживать его рост, и добавление к упомянутой культуральной среде источника поступления со адипата, вьібранного из группьі: адипиновая кислота и/или ее соли и зфирьї, при зтом источник поступления с адипата усвайваєтся и используется упомянутьм штаммом Репісіїййшт спгузодепит для образования адипоийл-б6-аминопенициллановой кислоть! (адипоийл-6-АПК), посредством чего и образуется упомянутая адипоил-6-АПК; - осуществление следующих ферментативньїх превращений посредством зкспрессии іп о-віш соответствующих генов: (Ф) - кольцо адипоийл-6-АПК расширяется іп зіш с образованием ка адипоил-7-аминодезацетоксицефалоспорановой кислотьі (адипоил-7-АДЦК) ферментом зкспандазой, где упомянутьй штамм Репісіїййшт спгузодепит бьіл трансформирован ДНК, кодирующей активность зкспандазного бо фермента, которьій способен воспринимать упомянутую адипоил-6-АПК в качестве субстрата, где в результате зкспрессии зтой ДНК кольцо упомянутой адипоил-6-АПК, образуемой упомянутьмм штаммом, расширяется іп віш с образованием адипоил-7-АДЦК, - З-метильная боковая группа адипоил-7-АДЦК гидроксилируеєется іп озйи с о образованием адипоил-7-аминодеацетилцефалоспорановой кислотьі (адипоил-7-АДАЦ) ферментом гидроксилазой, где 65 упомянутьй штамм РепісійШт спгузодепит бьл трансформирован ДНК, кодирующей активность гидроксилазного фермента, которьій способен воспринимать упомянутую адипоил-7-АДЦК в качестве субстрата,

где после трансформации в результате зкспрессиий зтой ДНК упомянутая адипоил-7-АДЦК, образуемая упомянутьм штаммом, гидроксилируется іп зйи с образованием адипоил-7-АДАЦ; и адипоийл-7-АДАЦ оацилируеєется іп 8зйи с ообразованием адипоил-7-аминоцефалоспорановой кислоть (адипоил-7-АЦК) ферментом ацетилтрансферазой, где упомянутьій штамм РепісіййшШт спгузодепит бьл трансформирован ДНК, кодирующей активность ацетилтрансферазного фермента, которьй способен воспринимать упомянутую адипоил-7-АДАЦ в качестве субстрата, после трансформации в результате зкспрессии зтой ДНК упомянутая адипойл-7-АДАЦ, образуемая упомянутьім штаммом, ацилируется іп зіш с образованием адипоил-7-АЦК; 70 - взайимодействие упомянутой адипоил-7-АЦК с адипоил-амидазой, посредством чего боковая цепь адипоила удаляется и образуется продукт 7-АЦК, и упомянутьїй продукт затем вьіделяется.

7. Способ по п. б, отгличающийся тем, что источником поступления адипата является динатрий адипат.

8. Способ по п. 6, отличающийся тем, что ДНК, кодирующая активность зкспандазного, гидроксилазного и ацетилтрансферазного ферментов, происходит из Серпа|озрогіцт асгетопіцт.

9. Способ по п. 8, отличающийся тем, что используется один бифункциональньй фермент зкспандаза/гидроксилаза.

10. Способ по п. 6, отличающийся тем, что адипоил-амидаза происходит из видов Рзейдотопазв.

11. Вектор зкспрессим рекомбинантной ДНК, плазмида рРРЕМ/СЕРН-1, которьій способен встраийваться в хромосомную ДНК рекомбинантного штамма Репісіїййшт спгузодепит, где указанньйй вектор состоит по существу 2о из ДНК, кодирующей зкспандазную/гидроксилазную активность, происходящую из Серпаіозрогішт асгетопіцт, и промотора, которьій управляет зкспрессией ДНК, кодирующей зкспандазную/гидроксилазную активность, причем указанньй промотор состоит по существу из промотора гена ІРМ5 Репісіййшт спгузодепит.

12. Вектор зкспрессии рекомбинантной ДНК, плазмида рРепСсСАСТ, которьій способен встраиваться в хромосомную ДНК рекомбинантного штамма Репісіїййшт спгузодепит, где указанньйй вектор состоит по существу сч ов из ДНК, кодирующей ацетилтрансферазную активность, происходящую из Серпаіозрогішт асгетопіцт, и промотора, которьій управляет зкспрессией ДНК, кодирующей ацетилтрансферазную активность, причем і) указанньій промотор состоит по существу из промотора гена ІРМЗ Репісіййшт спгузодепит.

13. Вектор зкспрессии рекомбинантной ДНК, плазмида різ-8, которьій способен встраиваться в хромосомную ДНК рекомбинантного штамма Репісіїййшт спгузодепит, где указанньйй вектор состоит по существу ю зо из ДНК, кодирующей зкспандазную/гидроксилазную и ацетилтрансферазную активность, пройсходящую из Серпаіозрогішт оасгетопішт, и промотора, которьій управляєт зкспрессией ДНК, кодирующей со зкспандазную/гидроксилазную и ацетилтрансферазную активность, причем указанньй промотор состоит по (У существу из промотора гена ІРМЗ5 РепісшШит спгузодепит.

14. Клетка-хозяин Репісіййт спгуводепит АТСС 74186, трансформированная вектором зкспрессий ї- рекомбинантной ДНК, плазмидой РРЕМ/СЕРН-1, которьїй способен встраиваться в хромосомную ДНК указанной «г клетки-хозяина, где указанная плазмида состойт по существу из ДНК, кодирующей зкспандазную/гидроксилазную активность, происходящую из СерпаІозрогічт асгетопіцт, и промотора, которьй управляет зкспрессией ДНК, кодирующей зкспандазную/гидроксилазную активность, причем Ууказанньй промотор, состоит по существу из промотора гена ІРМ5 Репісйит спгузодепит. «

15. Клетка-хозяин Репісіййт спгувзодепит АТСС 74187, трансформированная вектором зкспрессий з с рекомбинантной ДНК, плазмидой рі5-8, которьій способен встрайваться в хромосомную ДНК указанной клетки-хозяина, где указанная плазмида состойт по существу из ДНК, кодирующей ;» зкспандазную/гидроксилазную и ацетилтрансферазную активность, происходящую из Серпаіозрогіцт асгетопішт, и промотора, которьій, управляет зкспрессией ДНК, кодирующей зкспандазную/гидроксилазную и ацетилтрансферазную активность, причем указанньій промотор состоит по существу из промотора гена ІРМЗ їх Репісійшт спгузодепит.

16. Способ культивирования рекомбинантной клетки-хозяина Репісіїййшт спгузодепит в условиях, пригодньїх ш- для зкспрессии генов, отличающийся тем, что указанная рекомбинантная клетка-хозяин содержит вектор 2) зкспрессии рекомбинантной ДНК, плазмиду РРЕМ/СЕРН-1, которьій способен встрайваться в хромосомную ДНК указанной клетки-хозяина, и состоит по существу из ДНК, кодирующей зкспандазную/гидроксилазную со активность, происходящую из Серпаіозрогішт асгетопішт, и промотора, которьій управляет зкспрессией ДНК, с кодирующей зкспандазную/гидроксилазную активность, причем указанньій промотор состоит по существу из промотора гена ІРМ5 Репісіййшт спгузодепит.

17. Способ культивирования рекомбинантной клетки-хозяина Репісіїййшт спгузодепит в условиях, пригодньїх ов для зкспрессии генов, отличающийся тем, что указанная рекомбинантная клетка-хозяин содержит вектор зкспрессии рекомбинантной ДНК, плазмиду рІЗ-8, которьій встрайваєтся в хромосомную ДНК указанной (Ф, клетки-хозяина, и состоит опо осуществу из ДНК, кодирующей зкспандазную/гидроксилазную «и ка ацетилтрансферазную активность, происходящую из Серпаіозрогішт асгетопішт, и промотора, которьй управляет зкспрессией ДНК, кодирующей зкспандазную/гидроксилазную и ацетилтрансферазную активность, бо причем указанньій промотор состоит по существу из промотора гена ІРМ5 Репісіййшт спгузодепит. б5