JP3027847B2

JP3027847B2 - ７−ａｄｃａの生化学的新規製造法

Info

Publication number: JP3027847B2
Application number: JP5505516A
Authority: JP
Inventors: コンダー，マイケル・ジエイ; クラウフオード，ロリリー; マクエイダ，フイリス・シー; ランボセツク，ジヨン・エイ
Original assignee: デー・エス・エム・エヌ・ベー
Priority date: 1991-09-11
Filing date: 1992-09-11
Publication date: 2000-04-04
Anticipated expiration: 2015-04-04
Also published as: TW270149B; JP2000060582A; EP0532341B1; MX9205175A; FI108148B; EP0843013A3; JPH07501931A; ATE173017T1; DK0532341T3; CA2077921A1; AU657787B2; BG62177B1; ES2126588T3; SK282387B6; CZ53294A3; HU9400715D0; WO1993005158A1; NO316742B1; US5318896A; HU217171B

Description

【発明の詳細な説明】発明の属する分野本発明は、市販のセファロスポリン系抗生物質を製造
するための合成方法の分野に関する。該抗生物質の数は
現在、かなり多く、これらの治療物質は現在、第４世代
にある。市販のセファロスポリン系抗生物質には種々の
多数の側鎖があり、セファロスポリン系抗生物質の経済
的重要性が大きいことから、種々のセファロスポリン系
抗生物質の合成を容易にする重要中間体のより経済的で
効率的な製造方法の達成に対する重要性が高まっいて
る。

これらの重要中間体の一つは７−アミノデスアセトキ
シセファロスポラン酸（７−ADCA）であり、下記式：で表すことができる。現在、７−ADCAはペニシリンＧか
ら製造されるが、ペニシリン環系の５員環からセファロ
スポリン系の特徴である６員環へ広げるには４または５
個の化学工程を必要とする。全合成の場合の常として、
この方法には重大な欠点がある。とりわけ、複雑な多段
工程を必要とし、試薬が高価であり、かなりの量の副成
物が生じるため排出液の処理が問題になり、また、化学
処理を施す前にかなり不純な出発物質の精製を要するこ
とが挙げられる。従って、環の拡張および側鎖の開裂を
酵素的に行って、現在使用されている化学的方法よりも
経済的に７−ADCAを製造する微生物または醗酵による方
法に関する研究が進行している。

従って、本発明は特に、重要なセファロスポリン中間
体である７−ADCAの製造分野に関し、とりわけ、７−AD
CAの生化学的製造方法の分野に関する。

今日まで、７−ADCAの生化学的取得を成功させるため
の研究は大部分が徒労に終わっており、商業的規模での
製造法に関しては特にそうである。例えば、直接醗酵に
より、および／またはペニシリンＧを酵素処理すること
により、７−ADCAを得るために必要な環の拡張を別にし
て、６−アミノペニシラン酸（６−APA）を製造するこ
とは可能であるが、不幸なことに、自身の正常な代謝経
路に環の拡張を含むCephalosporiumまたはStreptomyces
属の酵素は、６−APAを基質として受け入れない。公知
文献ではDAOCSまたはエクスパンダーゼ酵素と総称して
いるこれらの酵素を、ここではペニシリン型分子に見ら
れるペナム環構造をセファロスポリン類に見られるセフ
−３−エム環に拡張するのを触媒する酵素として定義す
る。以後、これらの酵素は「エクスパンダーゼ酵素」と
称する。

エクスパンダーゼ酵素が作用する基質はペニシリンＮ
であり、これは、環が拡張されるとデアセトキシセファ
ロスポリンＣ（DAOC）になる。この場合、７−ADCAを得
るためには、（Ｄ）−α−アミノアジポイル側鎖を開裂
するだけでよいが、この側鎖は、酵素開裂に対して頑強
に抵抗して、許容されないほどの低収量しか得られない
ことがわかっている。

本発明によれば、ペニシリン化合物（アジポイル側鎖
を有する）を新規醗酵法により高力価で製造する効率的
な生化学方法を達成することができる。そして、該ペニ
シリン化合物は、ペニシリン化合物を産生する同一の微
生物をエクスパンダーゼ酵素系をも発現するように形質
転換すると、それによってin situで産生されるエクス
パンダーゼ酵素系の許容可能な基質である。エクスパン
ダーゼ酵素は、ペニシリン化合物の環を拡張してセファ
ロスポリン化合物が高収率で得られるように作用する。
この第二の必須工程で重要なことは、ペニシリン化合
物、ここではセファロスポリン化合物の側鎖が、別の酵
素により驚くほど高収率で脱離可能であることである。
本発明の一部をなすこの独自の生化学方法は、予期しな
かったことに、７−ADCAが驚くほど高収率で製造される
という結果をもたらす。

従来技術の簡単な説明 Cantwell et al.,in Curr Genet（1990）17:213−221
は、ペニシリンＶの環を拡張した後、得られたデアセト
キシセファロスポリンＶを酵素的に加水分解することに
より７−ADCAを製造する生化学方法を提案した。この提
案は、S.clavuligerus由来のクローン化したペニシリン
Ｎエクスパンダーゼ遺伝子（cefE）が入手可能であるこ
とに基づいている（Kovacevic et al.,J.Bacteriol.（1
989）171:754−760およびU.S.5,070,020）。しかし、そ
のエクスパンダーゼは、天然基質であるペニシリンＮに
は作用するものの、ペニシリンＶには作用しないので、
その提案は、ペニシリンＶの環拡張を行うことができる
ような修飾エクスパンダーゼ遺伝子が得られるような遺
伝子処理を必要とする。必要な修飾は、Cantwell et a
l.では達成されておらず、Streptomyces clavuligerus
由来のcefE遺伝子によりPenicillium chrysogenumを形
質転換し、DAOCS（エクスパンダーゼ）酵素を低レベル
で発現することに成功したに過ぎない。

エクスパンダーゼ酵素は、その活性および遺伝子配列
の両方に関して十分研究されている。例えば、U.S.4,51
0,246および4,536,476（以上、Wolfe）では、サイクラ
ーゼ、エピメラーゼおよび環拡張酵素が、Streptomyces
clavuligerusを含む、原核生物のβ−ラクタム産生微
生物の無細胞抽出物から別々に単離されて、安定な酵素
試薬が得られた。EP−Ａ−0366354には、S.clavuligeru
sから単離・精製したエクスパンダーゼ酵素が記載され
ており、該酵素は末端残基およびアミノ酸組成物などで
確認され、約34,000ダルトンの分子量を有すると言われ
ている。しかし、これは、U.S.4,536,476では同一酵素
であると思われるものの分子量が29,000になっており、
対照的である。EP−Ａ−0233715は、S.clavuligerusか
ら得られるエクスパンダーゼ酵素の単離およびエンドヌ
クレアーゼ制限酵素による制限地図作成、該酵素の宿主
での形質転換および発現、ならびに該酵素を使用したペ
ニシリンＮ基質の環拡張の実例を開示している。U.S.5,
070,020は、S.clavuligerusから得られるエクスパンダ
ーゼ酵素をコードするDNA配列を開示しており、また、
P.chrysogenum菌株を該DNA配列を含む発現ベクターによ
り形質転換してエクスパンダーゼ酵素を発現させること
を記載している。この酵素はペニシリンＮ以外の基質の
拡張にも有用とされているが、そのような拡張の実例は
ない。

上述した研究は、原核生物S.clavuligerusから得られ
るエクスパンダーゼ酵素に集中している。この同一の酵
素または少なくとも見かけ上同じ環拡張活性を有する酵
素は、真核生物（Cephalosporium acremonium（Acremon
ium chrysogenumとも言う。）の菌株によっても発現さ
れる。しかし、そのような菌株でのエクスパンダーゼ活
性は二機能性遺伝子（cefEF）によって発現され、その
遺伝子は、その本来の機能がエクスパンダーゼ酵素のデ
スアセトキシセファロスポラン酸（DAOC）産物をデアセ
チルセファロスポリンＣ（DAC）に変換することであるD
ACS（ヒドロキシラーゼ）活性も発現する。その結果、
単一であるが二機能性のエクスパンダーゼ／ヒドロキシ
ラーゼ酵素が得られる。これら２個の遺伝子産物の活性
を分離する試みがなされているが、まだ誰も成功してい
ない。例えば、EP−Ａ−0281391は、C.acremonium ATCC
11550から得られるDAOCS/DACS遺伝子の単離およびDNA配
列の同定をその酵素の対応するアミノ酸配列とともに開
示している。Penicilliumは形質転換され、その酵素を
発現するが、ペニシリンＧおよびＶを対応するセファロ
スポリンに変換するという試みは少しも例示されていな
い。さらに、DAOCSをコードする遺伝子情報をDACSから
分離してそれらを別々に発現することは、遺伝子工学技
術により容易に行うことができるという示唆にもかかわ
らず、そのような分離の実例は全く記載されていない。

C.acremoniumのDAOCS/DACS（エクスパンダーゼ／ヒド
ロキシラーゼ）酵素も、その活性および特徴ならびに遺
伝子配列に関して十分に研究されている。例えば、U.S.
4,178,210、U.S.4,248,966およびU.S.4,307,192（以
上、Demain）では、エピマー化して環を拡張することに
よりセファロスポリン抗生物質を生じるC.acremoniumの
無細胞抽出物によりペニシリン型の種々の出発物質を処
理している。U.S.4,753,881（Wu−Kuang Yeh）は、C.ac
remonium酵素の等電点、分子量、アミノ酸残基、ヒドロ
キシラーゼ活性とエクスパンダーゼ活性との比およびペ
プチド断片に関して記載している。

上述した公知文献は、P.chrysogenum菌株を、エクス
パンダーゼ酵素を発現する遺伝子により形質転換してそ
の酵素を発現させるという点のみで、本発明に関連して
いる。そこでは、発現した酵素を使用して、ペニシリン
ＧおよびＶではなく、ペニシリンＮの環拡張を行ってい
るだけである。その場合ですら、ペニシリンＮの７位に
は、本発明方法のように酵素的に開裂して７−ADCAにす
ることができない側鎖がある。本発明は、アジポイル側
鎖がP.chrysogenum菌株により効率的に付加され、in s
itu発現したエクスパンダーゼ酵素がその化合物を環拡
張の基質として効率的に使用してアジポイル７−ADCAに
し、次いで、そのアジポイル側鎖が別の酵素により効率
的に脱離されて７−ADCAになるという驚くべき発見によ
るものである。本発明個々の断片自体は公知文献に見出
すことができるとしても、それらを結合すると本発明方
法のように予期しない結果が得られるということは示唆
されていない。

例えば、６−アジポイルペニシラン酸は文献により公
知である（Ballio,A.et al.,Nature（1960）185,97−99
参照）。in vitroでの６−アジポイルペニシラン酸の
酵素的拡張も文献により公知である（Baldwin et al.,T
etrahedron（1987）43,3009−3014およびEP−Ａ−02683
43参照）。そして、アジポイル側鎖の酵素的開裂も文献
により公知である（Matsuda et al.,J.Bact.（1987）16
9,5815−5820）。

アジポイル側鎖は次の構造:COOH−（CH₂）_４−CO−を
有するが、密接に関連した構造の側鎖として、構造:COO
H−（CH₂）_３−CO−を有するグルタリル側鎖がある。グ
ルタリル側鎖の酵素的開裂は文献により公知である（例
えば、Shibuya et al.,Agric.Biol.Chem.（1981）45,15
61−1567、Matsuda and Komatsu,J.Bact.（1985）163,1
222−1228、Matsuda et al.,J.Bact.（1987）169,5815
−5820、特開昭53−086084（萬有製薬）および特開昭52
−128293（萬有製薬）参照）。

また、EP−Ａ−0453048は、Pseudomonas SY−77−１
によって産生されるグルタリルアシラーゼのアジポイル
開裂活性を改善する方法を記載している。α−サブユニ
ット内に位置する種々のアミノ酸を置換することによ
り、（アジポイル−セリンからの）アジポイル開裂速度
が３〜５倍高くなった。なお、EP−Ａ−0453048は見か
け上、アジポイル側鎖に対する活性が改善されたアシラ
ーゼを実証しているが、アジポイル−セファロスポリン
を主に生じさせる方法（化学的方法または本明細書に記
載した方法と類似の生化学的方法のいずれによっても）
については何も記載していない。

（Ｄ）−α−アミノアジポイル側鎖が存在する場合、
最初にアミノ基を酵素的に除いて、その側鎖を（Ｄ）−
アミノ酸オキシターゼにより短くしてグルタリル（GL−
７）側鎖とし、これを別の酵素（グルタリルアシラー
ゼ）によりグルタリル側鎖を脱離することは文献により
公知である。そのような二段開裂は、U.S.3,960,662（M
atsuda）、EP−Ａ−0275901、特開昭61−218057（1988
−Komatsu,旭化成工業）、WO90/12110（1990−Wong,Bio
pure Corp.）およびIsogai et al.,Bio/Technology（19
91）9,188,191に開示されている。

係属の出願との関連エクスパンダーゼ酵素の活性を、本明細書に記載した
７−ADCAを得るための生化学方法と同様の方法によりP.
chrysogenum形質転換細胞で発現させ７−ACAを得るため
のバイＯ方法を開示した出願中の米国特許出願番号07/9
53,492、1992年10月６日出願（特開昭４−319194号）と
関連する。しかし、この７−ACAバイオ方法では、別個
の最終産物を得るための全く異なる組換え代謝経路を達
成するために、別の酵素活性を発現するには別の形質転
換が必要であるが、本明細書は、それに関しては何も示
唆していない。

本発明方法および上述した公知文献の開示をより十分
に理解するのを助けるために、以下に、ペニシリンＧお
よびセファロスポリンＣに導く代謝経路の種々の段階、
中間物質および関与する形質転換を行う酵素を示す。

発明の要旨本発明は、７−アミノデスアセトキシセファロスポラ
ン酸（７−ADCA）を製造するための新規生化学方法に関
している。本発明の方法は、下記工程：１）イソペニシリンＮを産生するPenicillium chryso
genum菌株を、それが生育できる培養培地中で維持し、
該培養培地にアジピン酸または該Penicillium chrysoge
num菌株によって同化・利用され得る１種以上のその塩
およびエステルを含むアジペート原料を添加してアジポ
イル−６−アミノペニシラン酸（アジポイル−６−AP
A）を製造する工程であって、該Penicillium chrysogen
um菌株は、アジポイル−６−APAを基質とすることがで
きるエクスパンダーゼ酵素の活性をコードするDNAによ
って形質転換されており、その酵素の発現に伴い、該菌
株によって産生されたアジポイル−６−APAがin situ
で環拡張されてアジポイル−７−ADCAを生じる工程；お
よび２）該アジポイル−７−ADCAをアジポイルアシラーゼ
と接触させることによりアジポイル側鎖を脱離して７−
ADCAを生成し、次いで該物質を単離する工程を含む。

本明細書で使用する下記用語の意味を表示する。

「アジポイル−６−APA」は、〔2S−（２α、５α、
６β）〕−3,3−ジメチル−７−オキソ−６−〔（ヘキ
サン−1,6−ジオイル）アミノ〕−４−チア−１−アザ
ビシクロ−〔3.2.0〕ヘプタン−２−カルボン酸を意味
し、「アジポイル−７−ADCA」は、７−〔（ヘキサン−
1,6−ジオイル）アミノ〕−３−メチル−８−オキソ−
５−チア−１−アザビシクロ−〔4.2.0〕オクト−２−
エン−２−カルボン酸を意味する。

特に、本発明は、上記で詳述した７−アミノデアセト
キシセファロスポラン酸（７−ADCA）を製造するための
新規生化学的方法において、アジペート源がアジピン酸
二ナトリウムであり、エクスパンダーゼ酵素の活性をコ
ードするDNAがStreptomyces clavuligerus ATCC27064に
由来し、アジポイルアシラーゼがPseudomonas属に由来
する方法に関する。

さらに、本発明は、Streptomyces clavuligerus ATCC
27064に由来するエクスパンダーゼ酵素の活性をコード
するDNAおよびエクスパンダーゼ活性をコードするDNAの
発現を促進するプロモータを含む、後述するプラスミド
pPenFTSOから成る組換えDNA発現ベクターに関する。

本発明はさらに、Streptomyces clavuligerus ATCC27
064に由来するエクスパンダーゼ酵素の活性をコードす
るDNAおよびエクスパンダーゼ活性をコードするDNAの発
現を促進するプロモータ（Penicillium chrysogenum IP
NS遺伝子のプロモータなど）を含む組換えDNA発現ベク
ターで形質転換されたPenicillium chrysogenum宿主細
胞に関する。特に、本発明は、後述するプラスミドpPen
FTSOから成る組換えDNA発現ベクターで形質転換されたP
enicillium chrysogenum宿主細胞に関する。

さらに、本発明は、遺伝子の発現に適した条件下で組
換えPenicillium chrysogenum宿主細胞を培養する工程
を含み、該組換え宿主細胞がStreptomyces clavuligeru
s ATCC27064に由来するエクスパンダーゼ酵素の活性を
コードするDNAおよびエクスパンダーゼ活性をコードす
るDNAの発現を促進するプロモータ（Penicillium chrys
ogenum IPNS遺伝子のプロモータなど）を含む組換えDNA
発現ベクターから成る方法に関する。特に、本発明は、
遺伝子の発現に適した条件下で組換えPenicillium chry
sogenum宿主細胞を培養する方法であって、該組換え宿
主細胞が後述するプラスミドpPenFTSOなどの組換えDNA
発現ベクターから成る方法に関する。

発明の詳細な説明本発明の第一は、下記構造式：で表される、市販の合成セファロスポリンの重要な製造
中間体である７−アミノデスアセオキシセファロスポラ
ン酸（７−ADCA）を製造するための新規生化学的方法で
ある。７−ADCAの特徴は、セファロスポリン核の他に、
７−アミノ基および３−メチル基である。７−アミノ基
は多数の誘導側鎖に変換することができ、従って、市販
の種々のセファロスポリンを合成するためのベースとな
る。３−メチル基は、セファレキシンの場合のようにい
つもではないが通常は、市販のセファロスポリンを合成
するためにいくつかの他の側鎖に変換されることとな
る。

本発明方法の７−ADCA物質は、下記構造式：で表される別の重要なセファロスポリン中間体であるセ
ファロスポリンＣと対比させることができる。この中間
体の場合、３−アセチルオキシメチル側鎖は市販のセフ
ァロスポリンに対して許容されるかもしれないが、７−
（Ｄ）−α−アミノアジポイル側鎖は、合成によるこれ
以上の誘導には適しないので、許容可能な７−アミノ基
を得るために開裂しなければならない。不幸なことに、
７−（Ｄ）−α−アミノアジポイル側鎖は、化学的また
は生化学的ないずれの手段によっても、いつも脱離が困
難である。

定義本明細書、特に好ましい態様の説明の章で使用する下
記の用語の意味を表示する。

７−ADCA ７−アミノデスアセトキシセファロスポラ
ン酸６−APA ６−アミノペニシラン酸 DAOC デスアセトキシセファロスポラン酸 DAOCS DAOCシンセターゼ DAC デアセチルセファロスポリンＣ DACS DACシンセターゼ IPNS イソペニシリンＮシンセターゼ Tris トリス〔ヒドロキシメチル〕アミノメタン EDTA エチレンジアミン四酢酸 DEPC ジエチルピロカーボネート TE Tris/EDTA緩衝液 SSC 塩（塩化ナトリウム）、クエン酸ナトリウ
ム緩衝液 SDS ドデシル硫酸ナトリウム PEG ポリエチレングリコール Penicillium chrysogenum培養本発明方法の第一工程は、イソペニシリンＮを産生す
るPenicillium chrysogenum菌株を、それが生育できる
培養培地中で維持し、該培養培地にアジピン酸またはそ
の塩およびエステルを含むアジペート源を添加する工程
を含む。アジペート源は、P.chrysogenumを接種した
後、その培養培地に添加することができるが、接種を行
うときにすでに培養培地に存在しているのが好ましい。
アジピン酸またはその塩およびエステルは、該P.chryso
genum菌株によって同化・利用されてアジポイル−６−A
PAを生成することができるものである。ここで、P.chry
sogenumはエクスパンダーゼ酵素の活性をコードするDNA
によって形質転換されており、その酵素の発現の際、該
アジポイル−６−APAがin situで環拡張されてアジポ
イル−７−ADCAを生じる。

ペニシリウム属のchrysogenum種以外の種もイソペニ
シリンＮを産生する。しかし、歴史上、イソペニシリン
Ｎの産生量が最も高い菌株は全て、周知の菌株改良技術
によりchrysogenum種から発育させている。このため本
発明は、事実上、Penicillium chrysogenum菌株に限定
したが、他の種にも適応できることは明らかである。Pe
nicillium chrysogenumの寄託菌株または該菌株の他の
公的に入手可能な源は、いずれも本発明方法を行うため
の適する出発点である。

イソペニシリンＮを産生するPenicillium chrysogenu
m菌株の生育を維持することができる培養培地は、当業
者が容易に慣れ親しむ型のものである。例えば、培養は
水中下通気醗酵法により行い、使用培地は多数の使用可
能な適する培地から選択される。典型的な培地は、ショ
糖、グルコースおよび澱粉などの炭素源；大豆の粉末お
よび粕、綿実油、ピーナツ油ならびに種々のアミノ酸、
それらの混合物およびペプトンなどの窒素源を利用す
る。産生条件は、収量および単離し易さに重点が置か
れ、従って、そのような状況に好ましい培地は、炭素源
を糖蜜にして、窒素源を大豆粉末およびアミノ酸にする
ことができる。

通常は栄養無機塩を培養培地に添加し、そのような塩
としては、次のイオン成分：ナトリウム、カリウム、ア
ンモニウム、カルシウム、リン酸塩、硫酸塩、塩化物、
臭化物、硝酸塩、炭酸塩、第二鉄、第一鉄、マグネシウ
ム、マンガンなどを供給できる塩が挙げられる。微量元
素も、通常は、Penicillium chrysogenumの生育、発育
および代謝のために必須であり、他の培養培地成分にも
ともと成分としてすでに与えられていないならば、培養
培地に直接添加することができる。

Penicillium chrysogenum菌株は、ごく少量の７−ADC
Aの生産を所望する場合は、１容振とうフラスコなど
の容積の小さい装置中で培養することができる。しか
し、もっと大量のアジポイル−７−ADCAを所望する場合
は、水面下通気醗酵条件下で大規模な醗酵槽を使用す
る。

アジポイル−７−ADCAを大規模に製造する場合は、Pe
nicillium chrysogenum菌株の胞子を傾斜寒天培地に保
持する。傾斜培地の胞子を使用して、小さい体積の栄養
培地に接種する。その栄養培地をインキュベートして、
その微生物の培養を大量かつ新鮮で活発に増殖するよう
に行う。次いで、この栄養培地を大規模醗酵培地の接種
物として使用する。場合によっては、醗酵培地の接種物
としてさらに別の栄養培地を含めるのが好ましいかもし
れない。そのような第二の栄養培地は、通常、醗酵培地
の体積が第一栄養培地よりもかなり大きい場合に使用す
る。このように、微生物の胞子が最初に体積の小さい栄
養培地で培養されて体積の大きい栄養培地用の接種物と
なる。次いで、体積の大きい栄養培地から十分な濃度の
微生物が得られたら、大規模醗酵槽での急速な醗酵が開
始される。栄養培地は、醗酵培地と同じ組織物を有する
か、小規模での微生物の生長および発育を高めるための
他の成分を含むことができる。

本発明方法で使用するPenicillium chrysogenum菌株
は約20〜30℃の温度で最も効率的に培養されるが、最適
な収率は、温度が約22〜28℃、好ましくは約25℃のとき
に得られる。

アジポイル−７−ADCAは、Penicillium chrysogenum
菌株を大規模槽中で、約10〜30日間、好ましくは15〜25
日間、培養すると生産が最大になる。しかし、250ml容
の振とうフラスコなどの小規模装置で培養すると、微生
物の生長はより急速になり、アジポイル−７−ADCAがよ
り短時間、例えば４〜15日、しばしば５〜７日間で生産
される。

大規模醗酵槽の最終pHが8.0以上に達すると、アジポ
イル−７−ADCAの収率に悪影響を及ぼす可能性がある。
そのような状況では、醗酵の間中、培養培地のpHを監視
するのが好ましい。アジポイル−７−ADCAの生産が最大
になる前にpHがそのようなレベルに達すると考えられる
場合は、適切な酸または緩衝剤を醗酵培地に添加するこ
とによりpHを下方に調整すると好都合であると考えられ
る。

アジポイル−７−ADCAを生産した後、醗酵培養液のサ
ンプルをクロマトグラフィーによりテストすることがで
きる。

ほとんどの水面下通気醗酵と同じように、培養培地に
滅菌空気を通すことにより、Penicillium chrysogenum
菌株の生長がより効率的に行われ、アジポイル−７−AD
CAの生産が高まる。培養培地に通す空気の体積は通常、
単位体積の培養培地につき、１分間に少なくとも約0.2
体積である。しかし、空気の通過速度を高めると、アジ
ポイル−７−ADCAの生産に対して有益な影響が得られる
ことが多い。

Penicillium chrysogenum菌株は、典型的には、アジ
ポイル−７−ADCAの他に多くの副成物および代謝物を生
産する。これらのいくつかは酸に対して感受性であるた
め、アジポイル−７−ADCAを醗酵培地から回収する際、
醗酵培養液全体を短時間、酸性pHで処理することによ
り、副成した不純物の一部を、分解するのが望ましい。
アジポイル−７−ADCA醗酵産物は、こうして処理した醗
酵培養液を濾過して回収し、所望により、イオン交換樹
脂でのクロマトグラフィーにより醗酵培地の他の成分か
ら分離し、さらに、必要であれば、続くアジポイル側鎖
の酵素的開裂工程の前にクロマトグラフィーにより精製
することができる。また、そのようなイオン交換クロマ
トグラフィーによる分離は、側鎖の開裂を行った後に行
うこともできる。分離上の問題がある主要な副成物の一
つはアジポイル−６−APAであり、この副成物は、化学
的または酵素的に分解して分離をより容易にすることが
できる。最初に、濾過した醗酵培養液を、ｎ−ブタノー
ルまたは酢酸アミルなどの水と混和しない有機溶媒で最
初に抽出するなどの予備精製にかけて不純物を除去す
る。次いで、抽出した培養液は、さらに、活性炭でのク
ロマトグラフィーによる予備的方法で精製することがで
きる。

アジペート源の添加上述のように好ましくは、Penicillium chrysogenum
に対する醗酵培養を行うとき、接種の前にアジペート源
を醗酵培養液の他の成分に添加する。所望により、接種
後、例えば接種の１、２および／または３日後にアジペ
ート源を添加してもよい。アジペート源は、アジピン酸
または培養されているPenicillium chrysogenum菌株に
より同化・利用されてアジポイル−６−APAを生産する
ことができるアジピン酸の１種以上の塩もしくはエステ
ルとして定義される。アジピン酸、塩およびエステルは
単独または組み合わせて使用することができる。二ナト
リウム塩が好ましいが、カリウム塩およびナトリウムと
の混合塩も適する。メチルエステルは使用できるが、エ
チルエステルは水に不溶である。アジピン酸塩またはエ
ステルは、Penicillium chrysogenum菌株により同化・
利用されてアジポイル−６−APAを生産することができ
るものでなければならない。例えば、アジピン酸自体は
水に不溶であるにもかかわらず、同化可能な塩が適正な
pH条件下で生成されるために適する。

適するエクスパンダーゼ酵素上述したように培養され、アジペート源が与えられて
アジポイル−６−APAを生産するPenicillium chrysogen
um菌株はまた、エクスパンダーゼ酵素の活性をコードす
るDNAによって形質転換されており、その発現の際、該
アジポイル−６−APAはin situで環拡張されてアジポ
イル−７−ADCAになる。

アジポイル−６−APAは、アジペート源を添加して培
養したPenicillium chrysogenumにより細胞内で生産さ
れる。また、その細胞内、すなわちin situ条件では、
形質転換されたPenicillium chrysogenumがエクスパン
ダーゼ酵素の活性をコードするDNAを発現し、その際、
その酵素が基質としてのアジポイル−６−APAに作用し
て環を拡張させ、アジポイル−７−ADCAを生成させる。

本発明の新規生化学的方法は、エクスパンダーゼ酵素
の活性をコードするDNAによる上述した型のPenicillium
chrysogenum菌株の形質転換をその範囲内に含み、その
酵素の発現の際、アジポイル−６−APAがin situで環
拡張されてアジポイル−７−ADCAを生じる。すなわち、
Penicillium chrysogenumを形質転換するDNAは、従来技
術において理解されているエクスパンダーゼ酵素の活
性、すなわちイソペニシリンＮを環拡張してDAOCにする
能力だけでなく、アジポイル−６−APAを環拡張してア
ジポイル−７−ADCAにする能力も有する酵素を発現しな
ければならない。しかし、側鎖の類似性からして、どの
エクスパンダーゼ酵素も本発明の新規生化学的方法にお
いて使用可能であると考えられる。

従来技術の章ですでに述べたように、Streptomyces c
lavuligerus ATCC27064由来のエクスパンダーゼ酵素
は、その全塩基配列が分析されているとともに、エンド
ヌクレアーゼ制限酵素による地図作製により特徴付けら
れている。しかし、同一酵素であると思われるS.clavul
igerus NRRL3585由来のものは、分子量が異なると報告
されているに止まり、塩基配列は分析されていない。

従来技術においてすでに同定されたこれらのエクスパ
ンダーゼ酵素は、本発明の新規生化学的方法において有
用である。まだ同定されていないS.clavuligerusの異な
る菌株または別の属の微生物に由来する他のエクスパン
ダーゼ酵素でさえも、本発明の新規生化学的方法を行う
のに適すると考えられる。有用な微生物の新しい菌株お
よび属を同定し、エクスパンダーゼ酵素とされるものを
単離し、それらが本発明方法での使用に適していること
を検証するための方法は簡単であり、当業者には周知で
ある。有用な微生物の候補となる新しい菌株および属の
無細胞抽出物のスクリーニングは、該抽出物を、第一鉄
（Fe²⁺）イオン、アスコリビン酸塩、α−ケトグルタル
酸塩およびアデノシン三リン酸（ATP）などの公知のDAO
CS補助因子の存在下でアジポイル−６−APAに添加する
という、信頼でき再現性のある方法で行うことができ
る。アジポイル−６−APA基質は、下記に詳細に記載す
る方法と同様にしてアジペート源を未形質転換Penicill
ium chrysogenumに供給することにより十分な量で製造
することができる。所望のエクスパンダーゼ酵素は、ア
ジポイル−７−ADCAが生成するならば存在し、その有無
はクロマトグラフィーにより検出することができる。

また、公知の組換え技術を使用すると、S.clavuliger
usおよびC.acremoniumのエクスパンダーゼ配列に基づい
てDNAプローブを作り、本発明方法での使用に適するエ
クスパンダーゼを生産しそうな候補微生物のDNA部分を
スクリーニングすることができる。

エクスパンダーゼ酵素の可能源すでに述べたように、エクスパンダーゼ酵素は、ペナ
ム環構造（ペニシリン型分子に見られる）を拡張してセ
フ−３−エム環（セファロスポリンに見られる）にする
のを触媒する酵素である。従って、セフェム環を含む代
謝産物を生産するどの有機体もエクスパンダーゼをコー
ドするDNAの可能源である。そのような有機体の例を下
記に挙げるが、このリストは例示に過ぎず、全てを網羅
していると考えるべきではない。

真菌： Cephalosporium acremonium Cephalosporium sp. Emericellopsis Paecilomyces Scopulariopsis Diheterospora Spiroidium Anoxiopsis 放線菌： Streptomyces clavuligerus S.lipmanii S.wadayamensis S.todorominensis S.filipinensis cephamycini S.heteromorphus S.panayensis S.griseus S.cattleya Nocardia lactamdurans 他の細菌： Flavobacterium sp. Alcaligenes denitrificans Mycoplana bullata Providencia rettgeri Lysobacter lactamgenus 上記で挙げた生体のエクスパンダーゼは、さらに研究
するための単なる候補に過ぎず、それらが全て本発明の
新規方法に適するとは限らない。例えば、C.acremonium
に由来する酵素などのエクスパンダーゼ活性およびヒド
ロキシラーゼ活性の両方を有する酵素を使用すると、ヒ
ドロキシル化アジポイル−７−ADCA、すなわちアジポイ
ル側鎖のついたDACが製造される可能性がある。

エクスパンダーゼ活性をコードするDNA断片の単離所望のエクスパンダーゼ酵素の存在が上記方法により
検出されると、エクスパンダーゼ酵素活性をコードする
DNAの単離法も簡単で、当業者には周知である。エクス
パンダーゼ酵素をコードする遺伝子の公知配列および部
分配列に基づくDNAプローブは、所望の酵素をコードす
る単離すべきDNAとハイブリッド形成するように構成さ
れる。そのようなプローブの構成はエクスパンダーゼ酵
素をコードするアミノ酸およびヌクレオチド塩基配列な
らびに関与する特定の微生物の優先コドンに関する知見
に基づく。Streptomyces clavuligerus ATCC27064のゲ
ノムDNAに適用されるこの種の典型的方法の詳細な説明
を以下でさらに述べる。

エクスパンダーゼ酵素活性をコードするDNAの単離
は、組換えDNA技術でよく知られた制限および連結方法
により行われる。適正な制限断片を得て単離するには、
関与する微生物のゲノムのエンドヌクレアーゼによる制
限酵素地図を知ることが必要である。S.clavuligerusお
よびC.acremoniumの制限酵素地図はすでに入手可能であ
る。すなわち、前者の場合は、制限酵素BamH IおよびSa
l Iを使用すると、電気泳動により、所望の1.8および2.
2kbの断片が得られる。

Penicillium chrysogenum菌株の形質転換エクスパンダーゼ活性をコードするDNA断片が得られ
たら、それらを、プロモータ、翻訳活性化配列、耐性マ
ーカー、調節配列、コスミドフォーマー、ならびに形質
転換を可能にし、または促進し、遺伝子産物の発現を行
い、形質転換細胞の単離を容易にする他のDNA塩基配列
とともに、プラスミドまたは他の発現ベクターに挿入
（連結）することができる。こうして構成した発現ベク
ターを使用すると、Penicillium chrysogenum菌株の形
質転換およびエクスパンダーゼ酵素の活性の細胞内発現
が達成される。形質転換および発現を達成するために使
用される技術は文献により公知であり、そのような典型
的な方法の詳細な説明を以下でさらに述べる。

上記で既に詳述したように、形質転換されたPenicill
ium chrysogenum菌株は、エクスパンダーゼ酵素の活性
を細胞内で発現し、in situでアジポイル−６−APA基
質に作用して環を拡張し、アジポイル−７−ADCAにす
る。

新規な形質転換細胞エクスパンダーゼ遺伝子の活性を発現する特定のPeni
cillium chrysogenum形質転換細胞は、本発明の好まし
い態様であり、Cantwell et al.（1990）Cuiient Genet
ic,17,213−221にあるような従来の構成と比べて新規で
ある。いずれの構築でも、in vitro突然変異誘発を使
用してプロモータをエクスパンダーゼ遺伝子に連結す
る。Canwellの構築では、エクスパンダーゼ遺伝子のATG
にNde I部位を導入し、それを、Xba I/Nde Iリンカーに
よりIPNSプロモータの３′−末端にあるXba I部位に連
結する。本発明の構築では、エクスパンダーゼ遺伝子の
ATGにNco I部位を作り、IPNSリンカーの３′−末端にあ
るNco I部位に連結する。この結果、これらの構築にお
けるプロモータ−遺伝子連結部の周りの塩基配列は次の
ようになる。

Cantwell構築では、ＣがＴで置き換わっているが、本
発明の構築では、Ｃは保持されている。すなわち、ATG
開始コドンのすぐ隣のIPNSプロモータの配列は、天然に
存在するIPNS遺伝子に見られるものと正確に一致する。
この従来のプロモータは、ただ１個のヌクレオチド塩基
が異なるだけだが、翻訳効率が低下し、その結果エクス
パンダーゼ遺伝子の発現レベルを下げる可能性がある。

他の違いは、構築に含まれるプロモータまたは遺伝子
の領域である。Cantwell構築には、IPNSプロモータの
５′BamH IからXba I3′までの領域を含むが、本発明の
ベクターはそのプロモータの５′Nco IからNco I3′ま
での領域を含む〔Diez,et al.,（1990）,J.Biol.Chem.2
65,16358−16365〕。この結果、Cantwell構築のIPNSプ
ロモータには５′末端に約250塩基対が付加される。し
かし、この領域はIPNS遺伝子の上流にあるACVシンセタ
ーゼ遺伝子の読み取り枠にある。

また、Cantwell構築は、Streptomyces遺伝子を、ATG
からその遺伝子の３′側のBamH I部位まで含むが、本発
明のベクターは、ATGからその遺伝子の３′側のSal I部
位まで含む〔Kovacevic et al.,（1989）,J.Bacterio
l.,171,754−760〕。この結果、Cantwell構築の３′末
端には約1000bpsの塩基配列が付加される。本発明の構
築はさらに、エクスパンダーゼ遺伝子の上流域を、ATG
の５′側のBamH I部位まで含むが、エクスパンダーゼ遺
伝子の読み取り枠とはIPNSプロモータにより分離されて
いる。

本発明の構築が公知文献に記載されたものとさらに異
なる点は、使用する選択的マーカーに関する。Penicill
ium IPNSプロモータの使用：本発明の構築におけるphle
omycin遺伝子融合は、多重複製の組み込みまたは高レベ
ルの発現を可能にし、従ってエクスパンダーゼ遺伝子を
高レベルで発現する形質転換細胞を高い割合で産生する
可能性がある位置での組み込みを選択するようになる。

上述した型の新規形質転換細胞は、PC100と命名したP
enicillium chrysogenumである。その菌学上の特性とし
ては、典型的には、広範囲に広がる緑青色〜緑色で、滑
らかなベルベット様で黄色の粒のついたコロニーを生
じ、寒天中に黄色が逆拡散し、分生子頭の分枝は全体に
滑らかで、分生子は長さが３〜4mmの楕円形〜球形であ
ることが挙げられる。P.chrysogenumに対する許容可能
な培養条件は、１の蒸留水中にラクトース一水和物1.
5％（w/v）、コーン浸出液0.5％（v/v）、ペプトン0.5
％（w/v）、NaCl0.4％（w/v）、MgSO₄・7H₂O0.05％（w/
v）、KH₂PO₄0.06％（w/v）、FeCl₃・6H₂O0.0005％（w/
v）、CuSO₄・5H₂O0.0002％（w/v）、寒天3.0％（w/v）
を含む固形培地を使用し、pH4.8である。すぐ上に記載
し、PC100と命名したP.chrysogenumは、American Type
Culture Collection（ATCC）（12301 Parklawn Drive,R
ockville,Maryland 20852）にATCC74182の受託番号（寄
託日:1992年８月21日に受理され、生存は1992年８月27
日に確認）で寄託されている。

アジポイル側鎖の開裂本発明の新規生化学的方法の次の工程は、アジポイル
−７−ADCAからアジポイル側鎖を開裂することであり、
この工程では、前の工程の産物をアジポイルアシラーゼ
酵素系で処理する必要がある。上記ですでに述べたよう
に、本発明の重要な成果の一つは、アジポイル−７−AD
CAの製造に導く全工程を単一の醗酵培養で行うことがで
きることである。これにより、その方法の工程ごとに中
間物質を単離し、部分的に精製する必要がない点で有効
性が非常に改善される。しかし、この最終工程にアジポ
イルアシラーゼ酵素系は存在しない、すなわち、最初の
醗酵培養においてin situで生成されていない。

本発明の新規生化学的方法をバッチ式で行う場合は、
最初の工程の産物を単離し、部分的に精製する必要があ
る。このための予備的操作については上記ですでに記載
した。

にもかかわらず、本発明の方法は、アジポイル−７−
ADCAが７−ADCAに酵素的に変換できるようにアジポイル
アシラーゼをアジポイル−７−ADCAに効果的に接触させ
る方法であればどの方法でも行うことができる。これ
は、「接触」の最も広い意味での定義である。原料とし
て粗アジポイル−７−ADCAの無細胞培養液を使用し、そ
れを、粗アジポイルアシラーゼ培養液によりバッチ式で
処理することが可能である。この方法は、最初の反応物
の実質的な精製を必要としないので、ある程度の有効性
が得られる。もちろん、改良は可能である。例えば、反
応物は、互いに接触させる前に所望する程度に精製して
もよい。また、バッチ法ではなく連続的方法でその工程
を行うこともできる。反応物自体の接触は、処理技術の
向上に応じ、種々の方法で改良することができる。すな
わち、固定化酵素を、例えばアジポイルアシラーゼを含
むカラムの形で使用し、アジポイル−７−ADCAをそのカ
ラムに通す。また、固定化酵素を懸濁物としてアジポイ
ル−７−ADCAに添加してもよい。そのような固定化酵素
系は、酵素の回収が容易で、何度でも再使用できるとい
う利点を有する。そのような処理技術の他の例は、膜反
応器に関するものである。反応物を接触させる好ましい
方法は、固定化酵素カラムによる方法である。

開裂工程に有用なアジポイルアシラーゼ酵素アジポイル側鎖に対して既知特異性を有する酵素は多
数存在する。市販のRAEV Corp.製アジポイルアシラーゼ
を使用して得られる結果は、下記の実施例でさらに詳述
する。文献には、セファロスポリン型分子からアジポイ
ル側鎖を脱離する他の７種類の酵素が報告されている。
これら７種類の酵素のうち６個はPseudomonas種に由来
し、７番目はBacillus種に由来する。各々のPseudomona
s酵素はいくつくかの類似性があるが、全７種は、物理
的／生物学的特性がある程度異なる。それらの特性のい
くつかを下記にまとめる。

上記アジポイルアシラーゼ酵素は全て、本発明の新規
性化学的方法に有用である。本発明方法に有用な他のア
ジポイルアシラーゼを、候補の酵素を、作用すべき実際
の基質であるアジポイル−７−ADCAに対してテストする
ことにより容易に発見できるかもしれない。よさような
結果が得られたら、信頼できて再現性のある方法によ
り、候補の酵素が本発明方法に実際に有用であることを
測定する。基質は、Szewczuk and Wellman−Bednawska
in Clin.Chim.Acta（1978）84.19−26により報告された
方法を改良して無水アジピン酸と７−ADCAとの反応から
直接調製できる。無水アジピン酸は、J.Macromol.Sci.C
hem.（1990）A27,397−412に記載されたAlbertson and
Lundmarkの方法に従って調製できる。７−ADCAは、いく
つかの市販のもの（例えば、E.R.Squibb ＆ Sons,Ltd.,
NJおよびInterchem Corp.,NJ）を利用する。

高速比色法を使用して候補の酵素を粗選別する場合
は、アジポイル−７−ADCA基質の代わりにアジポイル−
PABA（パラ−アミノ安息香酸）またはアジポイル−PNA
（パラ−ニトロアニリン）などの呈色基質を使用しても
よい。側鎖の開裂により発色種が生じ、その種の有無お
よび濃度が比色計により容易に測定される。これらおよ
び他の適する比色法に関するさらに詳細な情報は、Mare
lli,L.P.（1968）,J.Pharm.Sci.,57:2172−2173;Szasz,
G.（1969）,Clin.Chem.15:124−136;Szewczuk,A.et a
l.,（1980）Anal.Bichem.103:166−169;およびReyes,F.
et al.,（1989）J.Pharma.Pharmacol.41:136−137を参
照。

acy IIの大きいサブユニットを持つRAEV酵素のＮ−末
端アミノ酸配列を、上記表に記載したGK16と比較した。
比較結果を下記に示す（括弧内は、決定的なものではな
いことを示す。）。

示した配列から、これら３個のペプチドは全て、明ら
かに関連している。しかし、上記で示した配列と同様の
Ｎ−末端配列を有する蛋白は、Arthrobacter菌株により
産生されるペニシリンＧアシラーゼの場合のように、必
ずしもアジポイルアシラーゼ活性を有するとは限らな
い。他方、上記Ｎ−末端配列との相同性が小さくとも本
発明方法に有用なアジポイルアシラーゼがある。例え
ば、上記の表で述べたAsahi酵素のacy IおよびFujisawa
B.laterosporus J1アシラーゼは一応のアジポイル−７
−ACAアシラーゼ活性を示すが、上記に記載した他の酵
素との配列の相同関係はない。従って、新規生化学的方
法の第二工程に有用なアジポイルアシラーゼに関する本
発明の範囲は、候補の酵素がアジポイル−７−ADCAから
アジポイル側鎖を開裂することができるかどうかで決定
され、それは、上記で詳述したように容易かつ確実に決
定することができる。

他の方法により適するアジポイルアシラーゼを見出す
ことは可能である。例えば、EPA−Ａ−0453048は、Pseu
domonas SY−77−１により生産されるグルタリルアシラ
ーゼのアジポイル開裂活性の改善方法を記載している。
α−サブユニット内の特定位置の種々のアミノ酸を置き
換えることにより、（アジポイル−セリンからの）アジ
ポイル開裂速度が３〜５倍高まるのが認められた。その
ような改善された酵素も本発明での使用に適する。な
お、EP−Ａ−0453048は、確かにアジポイル側鎖に対す
る活性が改善されたアシラーゼを例示しているが、アジ
ポイル−セファロスポリンをまず生成させる（化学的ま
たは本明細書に記載した方法と類似した生化学的方法に
よる）方法は全く記載していない。

好ましい態様の記載以下に本発明の好ましい態様について詳細に記載する
が、これらは説明のためのものに過ぎず、本発明はこれ
らの態様によって限定されるものではない。

実施例１ Penicillium chrysogenum培養条件これらの方法で使用するPenicillium chrysogenum
は、１の蒸留水中にアクトース一水和物1.5％（w/
v）、コーン浸出液0.5％（v/v）、ペプトン0.5％（w/
v）、NaCl0.4％（w/v）、MgSO₄・7H₂O0.05％（w/v）、K
H₂PO₄0.06％（w/v）、FeCl₃・6H₂00.0005％（w/v）、Cu
SO₄・5H₂O0.0002％（w/v）、寒天3.0％（w/v）を含むLC
SB培地（pH4.8）を含む平板上に保持した。25℃、相対
湿度65％で12日間後、単集落を取り出し、ガラスビーズ
を含むねじ栓付き試験管中の蒸留水2mlに添加した。増
殖培養部をかきまぜて解離した後、その懸濁物を使用し
てライスフラスコに接種した。ライスフラスコは、３〜
４倍体積の蒸留水で７分間洗浄し、30秒ごとに混合した
後、米の水の吸収が約25％になるまで排水した、天然長
粒種のUncle Ben転換米を25g/250mlフラスコで含んでい
た。25℃、湿度65％で12日間後、50mlの滅菌水で胞子を
その米から洗い流した。その胞子懸濁物を使用して液体
培地に接種し、また、４℃で貯蔵するために培養液の親
液性を付与した。胞子を同体積の５％スキムミルクに添
加し、滅菌アンプル中に凍結乾燥した。

ペニシリンの生産またはRNAもしくはDNA源しての菌糸
体の生産のために、菌株を振とうフラスコ中で２段階醗
酵した。接種段階は、１の蒸留水にグルコース3.0％
（w/v）、pharmamedia1.0％（w/v）、コーン浸出液3.0
％（v/v）、硫酸アンモニウム0.2％（w/v）、CaCo₃0.5
％（w/v）、無水リン酸一カリウム0.05％（w/v）、ラク
トース1.0％（w/v）、一次乾燥酵母1.0％（w/v）を含む
培地50ml/500mlフラスコに１×10⁸胞子を添加すること
により開始した。インキュベーションは、直径70mmの円
を描いて回転する（220rpm）盤上、25℃、相対湿度65％
で行った。48時間インキュベーションした後、生産段階
を、１の蒸留水にKH₂PO₄0.05％（w/v）、K₂SO₄0.5％
（w/v）、（NH₄）₂SO₄1.0％（w/v）、ラクトース12.0％
（w/v）、pharmamedia2.75％（w/v）、CaCO₃（沈降）1.
0％（w/v）、ラード油1.0％（v/v）の組成物を含む培地
（pH6.6）35ml/500mlフラスコに生長能力のある種子2ml
を移すことにより開始した。オートクレーブ後、しかし
接種の前に、滅菌した25％アジピン酸ナトリウム（pH6.
6）を添加して最終のアジピン酸ナトリウム濃度を2.5％
にした。次いで、接種後、前段階と同じ条件下で５〜７
日間インキュベーションを続けた。

形質転換のため、またはDNA源としてプロトプラスト
を生成させるために菌糸体が必要な場合は、その菌株
を、１の蒸留水に50mlの20X Clutterbuck塩（120gのN
aNO₃、10.4のKCl、10.4gのMgSO₄・7H₂O、30.4gのKH₂P
O₄）、2.0mlのVogel微量元素（0.3Mのクエン酸、0.2Mの
ZnSO₄、25mMのFe（NH₄）_２（SO₄）_２・6H₂O、10mMのCuS
O₄、3mMのMnSO₄、8mMのホウ酸、2mMのNa₂MoO₄・2H
₂O）、5gのトリプトン、5gの酵母抽出物、10gのグルコ
ースを含む完全媒体（CM）50ml/250mlフラスコ中で生長
させた。インキュベーションは、220rpmの回転盤上、25
℃で行った。

実施例２ PeniclliumゲノムDNAおよび全RNAの単離上記したように調製した、48時間培養して生長させた
植物菌糸体を寒冷紗により濾取し、液体窒素中で凍結
し、一夜凍結乾燥した。乾燥した菌糸体を乳鉢・すりこ
ぎで砂とともにすりつぶし、100mMのLiCl、50mMのEDT
A、10mMのTris（pH8.0）、４％SDSの25mlに再懸濁し
た。その懸濁物を60℃の湯浴中で50〜55℃に加熱した
後、その混合物を、最初に1MのTris（pH8）飽和フェノ
ール、次いでTris飽和フェノール：クロロホルム（1:1,
v/v）、次いでクロロホルムで抽出した。同量の6M冷LiC
lを添加し、次いでその混合物を−20℃で２〜３時間保
持すると、RNAが水相から析出した。４℃、12000×ｇで
20分間遠心分離した後、上澄みを66％（v/v）エタノー
ル溶液にして、−20℃で15分間冷却すると、DNAが析出
した。上述したように遠心分離した後、DNAペレットを7
0％エタノールで洗浄し、脱水してTE緩衝液（10mMのTri
s−HCl、pH7.5、1mMのEDTA）に再懸濁した。DNA濃度
を、アガロースゲル電気泳動において臭化エチジウムに
より染色して、既知DNA基準と比較することにより推定
した。

上記実施例１で記載したPenicillium chrysogenumの
培養を、25℃、220rpmの回転盤上に載せた35mlの醗酵培
地中（醗酵条件は前述した通り）で96時間生長させた。
菌糸体を、真空下、Whatman ＃１フィルターにより濾取
し、約50mlで水で洗浄した。直ちに菌糸体をそのフィル
ターからこすり取り、5mlの「破壊緩衝液」（50mMのTri
s−HCl,pH7.4、150mMのNaCl、5mMのEDTA,pH8.0、５％の
SDS）に再懸濁し、液体窒素で凍結し、凍結乾燥した。
一夜凍結乾燥した後、0.1％のDEPCを含む5mlの水および
5mlの1M Tris（pH8）飽和フェノール：クロロホルム：
イソアミルアルコール（50:50:1）を添加し、その混合
物を振とうしながら37℃で20分間溶かした。混合物を４
℃、12000×ｇで10分間遠心分離し、水相を分離して、
最初に1MのTris（pH8）飽和フェノール：クロロホル
ム：イソアミルアルコール（50:50:1）、２番目に1Mの
トリス（pH8）飽和フェノール、３番目にクロロホルム
で再抽出した。同量の6MLiClを最終的に得られた水相と
混合し、その溶液を−20℃で最低４時間放置した。全RN
Aを４℃、12000×で20分間ペレット化し、そのペレット
を0.3mlのTE緩衝液＋0.03mlの3M酢酸ナトリウムに溶解
し、2.5倍体積のエタノールを添加してRNAを両析出させ
た。最終的に得られたペレットを0.1mlのTE緩衝液に溶
解し、RNA濃度を、分光光度計による260nmでの吸光度に
より測定した。

実施例３ Streptomyces clavuligerus培養条件以下の操作で使用するStreptomyces clavuligerus菌
株は、ATCC27064であった。その菌株を、１の蒸留水
に酵母エキス4g、麦芽エキス10g、グルコース4g、寒天2
0gを含む（pH7.2）平板上で維持した。30℃で５日間生
長させた後、2mlの滅菌水をその平板に添加し、培養増
殖したものを寒天表面からこすり採った。得られた懸濁
物を、ガラスビーズを含む滅菌ねじ栓つき管に移した。
培養増殖したものを、かきまぜて解離させた後、その懸
濁物を液体培地の接種に使用した。また、その懸濁物
は、最終体積が15％になるまでグリセロールを添加し
て、−70℃での永久保存培地に使用した。

形質転換のため、またはDNA源としてプロトプラスト
を生成させるために菌糸体が必要な場合は、その菌株
を、１の蒸留水に酵母エキス3g、ペプトン5g、麦芽エ
キス3g、グルコース10g、ショ糖340g、MgCl₂・6H₂O1.02
g、グルシン5g、寒天18gを含むYEME培地200ml/1フラ
スコ中で生長させた。インキュベーションは、220rpmの
回転盤上、28℃で行った。

実施例４ StreptomycesゲノムDNAの単離上述したように調製した培地で48時間培養して生長さ
せた植物菌糸体を、22100×ｇで10分間遠心分離するこ
とにより集めた。その細胞を10mlのTE緩衝液に再懸濁
し、10mgのリゾチームを添加して、その混合物を30℃で
15分間インキュベートした。次いで、1mlの20％SDSを添
加し、次いですぐに10mlのTE（pH）飽和フェノールおよ
び1.5mlの5M−NaClを添加して、その混合物を20分間静
かに上下動させた。12000×ｇで10分間、相分離を行っ
た後、水相を取り出して新しい管に移した。同量のクロ
ロホルムを添加し、その混合物を10分間静かに上下動さ
せた。再び12000×ｇで10分間遠心分離することにより
相分離を行い、水相を取り出して新しい管に移した。２
倍体積のイソプロパノールを注意しながら添加し、析出
したDNAを取り、最少量のTE緩衝液に再溶解した。RNAア
ーゼＡを添加して最終濃度を20mg/mlとし、その溶液を5
0℃で１時間インキュベートした。次いで、100mMのNaCl
および0.4％のSDSとともにプロテアーゼＫを添加して最
終濃度を100mg/mlとし、この混合物を37℃で１時間イン
キュベートした。この溶液を同量のTE（pH8）飽和フェ
ノールで再び抽出し、さらにクロロホルムで抽出した。
最後の抽出により得られたDNAを２倍体積のイソプロパ
ノールを添加した後に取り、その濃度を分光光度計によ
る60nmでの吸光度により測定した。

実施例５遺伝子ライブラリーの構築およびStreptomyces clavuli
gerusエクスパンダーゼ遺伝子を含むDNA断片の単離前記操作により得たStreptomyces clavuligerusゲノ
ムDNAを制限酵素BamH IおよびSal Iで消化した。消化さ
れたDNAを0.8％アガロースゲル上で電気泳動にかけ、1.
8〜2.2kbの大きさの断片を溶離し、予めBamH IおよびSa
l Iで消化してあるpUC18DNAに連結した。連結混合物を
希釈し、電気穿孔法（Gene Pulser,Bio−Rad,Richmond,
CA）によりコンピテントJM109細胞に取り込んで形質転
換した。コンピテント細胞の作製および電気穿孔法の条
件はともに、製造者の指示に従った。形質転換混合物を
100mg/mlのアンピシリンおよび75mlの２％Ｘ−Galを含
むLB平板上で平板培養した。37℃で一夜インキュベート
した後、組換えコロニーを、プラスミドベクターβ−ガ
ラクトシダーゼ遺伝子活性の不活化により無色になるこ
とから同定した。無色のコロニーを選んで、100mg/mlの
アンピシリンを含む新しいLB平板に移した。37℃で一夜
生長させた後、コロニーをニトロセルロースに移し、複
製連鎖反応により作製した、公開されたStreptomyces c
lavuligerusエクスパンダーゼ遺伝子配列の52〜918の塩
基〔Kovacevic et al.,（1989）J.Bacteriol.171:754−
760;およびU.S.5,070,020〕に対応するプローブとハイ
ブリッド形成させた。複製連鎖反応産物の標識を、（³²
P）dCTPおよびオリゴ標識キットを使用し、製造者（Pha
rmacia,Piscateway,New Jersey）の指示に従ってランダ
ムプライマー伸長法により行った。ハイブリッド形成反
応は、10⁶CPMの放射性同位体で標識したプローブ、30％
のホルムアミド、5XSSC（0.15MのNaCl、0.015Mのクエン
酸ナトリウム、pH7）、0.1％のSDS,5×Denhardt（5gの
フィコール、5gのポリビニルピロリドンおよび5gのBSA
（500mlの50Xストック用））および100mg/mlの牛胸腺DN
Aの存在下、37℃で一夜行った。いくつかの形質転換細
胞がプローブと強くハイブリッドを形成した。うち１個
のコロニーについて、制限酵素分析によりエクスパンダ
ーゼ遺伝子を有するベクターを含むことが確認され、こ
のプラスミドをpFTSO−１と命名した。

実施例６プラスミドDNAの単離プラスミドを含むE.coli培養液を500mlのLB培養液（2
0g/のLB培養液ベース）（Gibco,Paisley,Scotland）
中で、15mg/mlのテトラサイクリンとともに、37℃、220
rpmの回転盤上で12〜16時間生長させた。４℃、4000×
ｇで10分間遠心分離することにより細胞をペレット状に
した。その細胞ペレットを18mlのグルコース緩衝液（50
mMのグルコース、25mMのTris（pH8.0）、10mMのEDTA）
に再懸濁し、40mg/mlのリゾチーム（Sigma,St.Louis,M
O）／グルコース緩衝液を2ml添加して混合し、その混合
物を室温で15分間インキュベートした。新しく調製した
0.2NのNaOHおよび１％のSDSの溶液を40ml添加し、その
混合物を静かに攪拌して氷上に10分間置いた。次いで、
5Mの酢酸カリウム（pH4.8）30mlを添加して十分混合
し、得られた混合物を氷上にさらに10分間置いた。細胞
片を、４℃、4000×ｇで10分間遠心分離することにより
ペレット化し、得られた上澄みを寒冷紗フィルターによ
り濾過した。プラスミドDNAを析出させるためにイソプ
ロパノール（0.6倍体積）を透明な上澄みに添加し、室
温で20分間インキュベートしている間に析出物が生成し
た。プラスミドDNAのペレット化を４℃、4000×ｇで20
分間行い、次いで、70％エタノールで洗浄して軽く乾燥
した。そのペレットを9mlのTE緩衝液に再懸濁した後、1
0gのCsClおよび10mg/mlの臭化エチジウム溶液0.387mlを
添加した。この溶液を313,100×ｇで24時間遠心分離し
た。塩化セシウム勾配において得られたプラスミドのバ
ンドを紫外線により可視化して単離した後、臭化エチジ
ウムを抽出用の飽和ブタノール水溶液により除去した。
次いで、プラスミドの作製に使用したCsClをTE緩衝液に
対する透析により除去し、最後にDNAをPEG（MW8000）を
使用して濃縮した。DNAの濃度は分光光度計による260nm
での吸光度により測定した。

実施例７ Penicillium形質転換ベクターpPenFTSOの構築 Penicillium形質転換ベクターは、優性選択マーカー
としてのフレオマイシン耐性遺伝子を入れて構築した。
これは、まず、フレオマイシン耐性遺伝子（Streptoall
oteichus hindustanus由来のフレオマイシン結合蛋白遺
伝子）を含み、酵母シトクロムC1ターミネータに結合し
た660bp断片を、BamH I/Bgl IIで消化したプラスミドpU
T713（CAYLA,Toulouse Cedex,France）からアガロース
ゲル上で電気泳動して溶離することにより単離して行っ
た。単離した断片はベクターpSELECT^＊１（Promega Cor
poration）のBamH I部位に連結し、遺伝子の方向は制限
酵素分析により決定した。次に、λ付着末端部位を含む
550bpのPst I断片を挿入して、適切な大きさの挿入配列
を含む場合はそのベクターを使用してコスミドが形成で
きるようにした。次いで、Penicillium chrysogenumイ
ソペニシリンＮシンセターゼ（IPNS）遺伝子のプロモー
タ領域を含む1.5kbのNco I/BamH I断片を、Nco I/BamH
Iで消化したIPNS遺伝子を含むゲノムクローンから（ア
ガロースゲル上で電気泳動して溶離することにより）単
離した。単離したIPNS−プロモータ断片をBamH I/Nco I
で消化したベクターに連結した。Nco I部位は、フレオ
マイシン耐性遺伝子ATG開始コドンにある。このベクタ
ーをpUTZ−２と命名する。

Streptomyces clavuligerusエクスパンダーゼ遺伝子
を含む1.645kb断片をBamH IおよびSal Iで消化したpFTS
O−１（前述のベクター）から、0.8％アガロースゲル上
で電気泳動して溶離することにより精製した。単離した
断片は、やはりBamH IおよびSal Iで消化したベクターp
SELECT（Promega Corporation）に連結した。このベク
ターは、pFTSO−８と命名した。新規Nco I部位を、Alte
red Sites^＊ in vitro突然変異誘発系（Promega Corpor
ation）を使用したpFTSO−８の部位特異的突然変異誘発
によりエクスパンダーゼ遺伝子のATG開始コドンに作っ
た。突然変異誘発は、製造者の指示に従って行った。オ
リゴヌクレオチドは、Streptomycesエクスパンダーゼ遺
伝子の公開された塩基配列（Kovacevic et al.,（199
0）Journal of Bacteriology,171,p.3952−3958）由来
のATG開始コドンにあるDNA領域のコード配列と相補的で
あるように構築した。オリゴヌクレオチドの合成は、シ
アノエチルホスホラミディト化学（Pharmacia Gene A
ssembler instrumentation）により行い、オリゴ塩基配
列は次の通りであった。

突然変異誘発は、制限酵素分析により確認した。次
に、Penicillium chrysogenumイソペニシリンＮシンセ
ターゼ遺伝子のプロモータ領域を含む1.2kbのNco I断片
を、IPNS遺伝子を含むNco Iで消化したゲノムクローン
から（アガロースゲル上で電気泳動して溶離することに
より）単離した。IPNS−プロモータ領域は、エクスパン
ダーゼ遺伝子のATG開始コドンに突然変異誘発により作
ったpFTSO−８ベクターの新規Nco I部位に連結した。プ
ロモータのエクスパンダーゼ遺伝子に対する方向は、制
限酵素分析により確認した。次いで、IPNS−プロモー
タ：エクスパンダーゼ遺伝子カセットをBamH I/Sal I断
片として、上述したPenicillium形質転換ベクターpUTZ
−２のBamH I/Sal I切断部位に移した。最終的な構成物
をpPenFTSOと命名した。

実施例８ Penicilliumβ−チューブリンプロモータのクローン化 Penicilliumβ−チューブリン遺伝子を、ハイブリッ
ド形成プローブとしてAspergillus nigerβ−チューブ
リン遺伝子を使用して、Penicilliumλゲノムアリブラ
リーからクローン化した。このクローンの配列決定およ
びAspergillus nigerのβ−チューブリン遺伝子の既知
アミノ酸配列との比較により、ATG開始コドンで始まる9
1％の相同率の領域があることが確認された。機能性プ
ロモータを含む配列が、開始コドンと1.4kb上流のBamH
I部位との間で単離された。

Penicilliumβ−チューブリンプロモータを有する形質
転換ベクターの構築 Penicilliumβ−チューブリンプロモータを含む2.0kb
のXba I/Hind III断片を、やはりXba I/Hind IIIで消化
したベクターpSELECT（Promega Corporation）に連結し
た。新規Nco I部位を、Altered Sites^＊in vitro突然変
異誘発系（Promega Corporation）を使用した部位特異
的突然変異誘発によりATG開始コドンに作った。突然変
異誘発は、製造者の指示に従って行った。オリゴヌクレ
オチドはATG開始部位領域に対して相補的に構築した
が、Nco I部位を作るための変更をいくつか挿入し、突
然変異誘発のために使用した。オリゴヌクレオチド合成
は、シアノエチルホスホラミディト化学（Pharmacia
Gene Assembler instrumentation）により行い、オリゴ
塩基配列は次の通りであった。

突然変異誘発は、制限酵素分析により確認した。次
に、Penicilliumβ−チューブリンプロモータを含む1.4
kbのBamH I/Nco I断片を、BamH I/Nco Iで消化したベク
ターpFTSO−８（前記実施例７に記載したベクター）に
おいてStreptomycesエクスパンダーゼ遺伝子のATGに作
ったNco I部位に連結した。このベクターをbtFTSO−８
と命名した。β−チューブリンプロモータを含む1.4kb
のBamH I/Nco I断片はまた、BamH I/Nco Iで消化したベ
クターpUTZ−２（前記実施例７に記載したベクター）に
も連結した。この連結により、フレオマイシン耐性遺伝
子のすぐ前にβ−チューブリンプロモータが位置した。
このベクターはpCI−６と命名した。次に、β−チュー
ブリンプロモータエクスパンダーゼ遺伝子カセットを含
む、ベクターbtFTSO−８由来の2.4kbのBamH I/Hind III
断片をBamH I/Hind IIIで消化したベクターpCI−６に連
結して、最終的なPenicillium形質転換ベクターを得
た。このベクターにおいて、Streptomycesエクスパンダ
ーゼ遺伝子およびフレオマイシン耐性マーカーをβ−チ
ューブリンプロモータから発現させた。このベクターを
pTS−２と命名した。

実施例９ Penicillium（GAP）プロモータのクローン化 Penicilliumグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒド
ロゲナーゼ（GAP）遺伝子を、Aspergillus niger由来の
GAP遺伝子をハイブリッド形成プローブとして使用する
ことにより、Penicilliumλゲノムライブラリーからク
ローン化した。陽性の可能性がある４個のクローンにつ
いて、Cephalosporium GAP遺伝子（Kimura,H.et al.,
（1991）,J.Ferm.and Bioeng.,71,145−150）の５′領
域のプライマーから生じたPCR産物によりさらに探索し
た。複製連鎖反応（PCR）のプライマーに使用したオリ
ゴヌクレオチドは、シアノエチルホスホラミディト化学
（Pharmacia Gene Assembler instrumentation）により
合成し、オリゴ配列は次の通りである。

４個の陽性と目されたクローンの１個が、PCR産物と
クロスハイブリッド形成した。このゲノムクローンのBa
mH I断片（4kb）を、配列決定目的でBamH Iで消化した
ベクターpSELECT（Promega Corporation）に連結した。
このベクターをpTS−０と命名した。この断片を配列決
定すると、セファロスポリンGAP遺伝子の既知配列との
比較によりATG開始コドンが確認された。

Penicillium（GAP）プロモータを有する形質転換ベクタ
ーの構築 Penicillium GAPプロモータにStreptomycesエクスパ
ンダーゼ遺伝子を入れるために、ベクターpTS−０を使
用したin vitro部位特異的突然変異誘発により新規Nco
I部位をPenicillium GAP遺伝子のATGに作った。突然変
異誘発は、製造者の指示に従って行った。オリゴヌクレ
オチドは、GAP遺伝子のATG開始コドンのDNA領域をコー
ドする配列に相補的であるように構築したが、Nco I部
位を作るために塩基を変えて挿入した。オリゴヌクレオ
チドの合成はシアノエチルホスホラミディト化学（Phar
macia Gene Assembler instrumentation）により行い、
オリゴ配列は次の通りである。

突然変異誘発は、制限酵素分析により確認した。次
に、GAPプロモータを含むpTS−０のNco I/BamH I断片
（1.9kb）をNco I/BamH Iで消化したベクターpFTSO−８
（上記実施例７に記載のベクター）に連結し、Streptom
ycesエクスパンダーゼ遺伝子とともにGAPプロモータの
位置付けた。このベクターをpTS−０−１と命名した。
次に、GAPプロモータ：エクスパンダーゼカセットを含
むpTS−０−１のBamH I/Hind III断片（3.0kb）をBamH
I/Hind IIIで消化したベクターpCI−６（上記実施例８
に記載のベクター）に連結して、GAPプロモータからStr
eptomycesエクスパンダーゼ遺伝子が発現する最終的なP
enicillium形質転換ベクターpSD−１を得た。

実施例10 Penicillium chrysogenumの形質転換上記Penicillium chrysgenum菌株由来のプロトプラス
トを、25℃、220rpmの回転盤上で67時間、50mlのCM培養
液に１×10⁷個の胞子を接種することにより生成させ
た。菌糸体を寒冷紗上に濾取し、500ml容フラスコに移
し、100mgのNovozyme 234（Novo BioLabs,Bagsvaerd,De
nmark）を含む25mlのKMP（0.7MのKCl、0.8Mのマンニト
ール、0.02MのKPO₄、pH6.3）に再懸濁し、30℃、100rpm
でインキュベートした。スフェロプラストを寒冷紗／グ
ラスウールフィルターでの濾過により分離し、350×ｇ
で10分間遠心分離することによりペレット化した。次い
で、スフェロプラストを10mlのKMP緩衝液で３回洗浄
し、KMPC（50mMのCaCl₂を有するKMP）に再懸濁して５×
10⁷細胞/mlの濃度にし、室温で20分間放置した。Penici
lliumの形質転換のために、200mlのスフェロプラスト懸
濁物を、50mlのPPC（40％PEG,MW3500、20mMのKPO₄,pH6.
3、５％CaCl₂は使用直前に添加した）とともにDNA（5mg
/mlヘパリンを含む5mgのベクターDNA/6.2mlのKMPC）に
添加し、形質転換混合物を氷上で30分間インキュベート
した。新しく調製したPPC1mlを添加し、その混合物を50
mlの溶融した（50℃）再生寒天（CM＋1.3Mのマンニトー
ルおよび３％寒天）に移した。次いで、形質転換混合物
を５枚ペトリ皿に分配した。25℃で24時間再生した後、
プレートに、100mg/50mlOL（１％ペプトン/1％寒天）の
フレオマイシンを含むOLを上塗りした。上塗りの量は再
生寒天の量に等しい。プレートは、25℃で７〜14日間イ
ンキュベートし、形質転換コロニーの発生を観察した。

実施例11 アジポイル−６−APAおよびアジポイル−７−ADCA醗酵
生成物のHPLC分析高性能液体クロマトグラフィー（HPLC）を使用して、
使用した未形質転換P.chrysogenum菌株でのアジポイル
−６−APAの生産および使用した形質転換P.chrysogenum
菌株でのアジポイル−７−ADCAの生産の分析を行った。
その分析は、625溶媒供給システム、220nmおよび254nm
にセットした490E可変波長検出器、825Maximaデータシ
ステムおよび固定相としてのNovo−Ｃ−18カラムを有す
るWatersシステムで行った。移動相（流量は1ml/分）
は、２％メタノール/98％の0.010M−KH₂PO₄によるイソ
クラティク溶離を５分間、２→40％直線勾配のメタノー
ル/0.010M−KH₂PO₄、pH7.0を15分間とした。アジポイル
−６−APAの定量は、220nmでの標準ペニシリンＮの基準
線を使用して求め、アジポイル−７−ADCAの定量は254n
mでの標準デアセトキシセファロスポリンの基準線を使
用して求めた。

アジポイル−６−APAおよびアジポイル−７−ADCAの
ペニシリナーゼ処理に対する感受性の分析を、濾液に１
単位/mlのペニシリナーゼＩまたはペニシリナーゼIIIを
添加し、室温で10〜30分間インキュベートすることによ
り行った。これらのサンプルを、上記と同じHPLC条件下
で分析した。

アジポイル−６−APAおよびアジポイル−７−ADCA物
質のUVスペクトル分析を510溶媒供給システム、990フォ
トダイオードアレイ検出器、990データシステムおよび
固定相としてのNovo−Ｃ−18カラムを有するWatersシス
テムを使用して行った。使用した移動相は上記と同じ条
件であった。

全醗酵培養液からのアジポイル−７−ADCA物質の大規
模な単離を、510溶媒供給システム、990フォトダイオー
ドアレイ検出器、990データシステムおよび固定相とし
てのmBondapak C18予備カラムを使用したWatersシステ
ムを使用して行った。移動相（流量は5ml/分）は、0.01
0M−KH₂PO₄、pH7.0によるイソクラティク溶離が35分間
であった。アジポイル−７−ADCA物質の保持時間に対応
する吸収ピークをフラクションコレクターにより集め
た。

実施例12 生理活性分析寒天拡散バイオアッセイを使用して、HPLCにより単離
してアジポイル−６−APAおよびアジポイル−７−ADCA
醗酵物質の抗生活性を測定した。20mlの単離物質を、LB
寒天平板培地（Bacillus subtilus ATCC33677またはE.c
oli超感受性菌株（Prof.Arnold L.Demain,MITからの提
供）を接種した３％寒天（Gibco,Paisley,Scotland）を
有する20g/のLB培養液ベース）の5mmディスクに広げ
た。Bacillus subtilusをアジポイル−６−APA物質を分
析するための指示菌株として使用し、E.coli超感受性菌
株をアジポイル−７−ADCA物質を分析するための指示菌
株として使用した。37℃で15時間インキュベートした後
のディスク周辺の生育阻害のハロ形成は、その物質が生
理活性を有することを示した。この実験におけるコント
ロールは、デアセトキシセファロスポリンＣ、セファロ
スポリンＣ、ペニシリンＶおよびβ−ラクタム構造確認
のためのコントロールとしてのペニシリナーゼを含ん
だ、または含まない寒天であった。

実施例13 RAEV酵素分析全醗酵培養液から精製したアジポイル−７−ADCA物質
を、RAEV酵素（RAEV Corp.から市販されたもの）の比活
性を測定するための基質として使用した。0.16MのKH₂PO
₄に10mMの基質、1mgのRAEV酵素、５％のグリセロールを
含む全体積50mlの反応混合物を37℃でインキュベートし
た。０、１、３、５、10、20および30分後に5mlずつ取
り、35mlの0.010M−KH₂PO₄、pH3.5で希釈して−70℃に
冷凍した後、前記条件下でのHPLC分析を行った。

比色用のアジポイル−ｐ−アミノ安息香酸基質に対す
るRAEV酵素の活性を、0.065MのKH₂PO₄、pH7.0に5mMの基
質、8.25mgのRAEV酵素、10％のグリセロールを入れて全
体積50mlとし、これを使用して37℃で30分間分析した。
反応は、96ウェルのマイクロタイターディッシュで行っ
た。1/100に希釈した1MのNaNO₂/0.25M酢酸を50ml添加し
て反応を停止し、その反応物を室温で３分間放置した。
10mg/mlの４−アミノ−５−ヒドロキシ−2,7−ナフタレ
ン−ジスルホン酸一ナトリウム塩水和物／水を0.5MのNa
HCO₃で1/100に希釈し、その100mlを添加して、EL312 Bi
o−Kinetics Plate Reader（BioTek Instruments）によ
り515nmですぐに発色をモニターした。

実施例14 RAEV酵素反応物質のHPLC分析アジポイル−７−ADCA基質を使用したRAEV酵素（RAEV
Corp.から市販されたもの）分析を全てHPLCでモニター
したが、これは、625溶媒供給システム、203nmおよび25
4nmにセットした490E可変波長検出器、825Maximaデータ
システムおよび固定相としてのNovo−C18カラムを有す
るWatersシステムを使用して行った。移動相（流量は1m
l/分）は、２％メタノール/98％の0.010M−KH₂PO₄、pH
3.5によるイソクラティク溶離を５分間、２→40％直線
勾配のメタノール/0.010M−KH₂PO₄、pH3.5を15分間とし
た。反応物質の保持時間をモニターするために標準７−
ADCAを使用した。反応物質の定量は、254nmでの標準７
−ADCAの基準線を使用して求めた。

実施例15 アジポイル−７−ADCA醗酵物質の¹³C−NMR分析 ¹³C−NMR（広幅プロトンデカップル）スペクトルを、
フーリエ変換方式のIBM−AF−350分光器により75.4MHz
（7.1T）で求めた。サンプルは、0.5mlのD₂O（99.8％
Ｄ、Aldrich）または0.5mlのDMSO−d₆（99.0％Ｄ、Aldr
ich）における醗酵培養液から得た50mgのアジポイル−
７−ADCA物質から成り、350゜Kで5mmの管に入れた。NMR
データにより、その物質がアジポイル−７−ADCAである
ことが確認された。

実施例16 別のアジポイルアシラーゼ酵素の評価 RAEV酵素を使用した研究の他に、アジポイル−７−AD
CA（および他のアジポイル化合物）からのアジポイル側
鎖の脱離を、種々の微生物源から得た酵素により例証し
た。最初の研究では、Pseudomonas sp.菌株SE−83およ
びSE−495（日本国微工研に各々、FERM BP−817およびF
ERM BP−818の受託番号で寄託されている。）ならび
に、Pseudomonas菌株SY−77−１（the Northern Region
al Research LaboratoryにNNRLB−8070の受託番号で寄
託されている。）を、2.0％（w/v）のHyCase SF、0.5％
（w/v）のグルタミン酸一ナトリウム、0.5％（w/v）の
酵母エキス、0.2％（w/v）のコーンスティープ粉末、0.
5％（w/v）の綿実油および0.1％（w/v）のグルタル酸を
含む培地で72時間生長させた。細胞を遠心分離により集
め、50mMのリン酸塩緩衝液、pH8.0で洗浄した後、緩衝
液に再懸濁し、少量のクロロホルムを添加することによ
り外膜を透過性にした。次いで、細胞懸濁物の一部をア
ジポイル−ｐ−ニトロアニリン（ad−PNA）と混合し、3
0℃で２〜18時間インキュベートした。インキュベーシ
ョン後、その混合物を10％（v/v）の酢酸を添加するこ
とにより酸性にした。遊離したｐ−ニトロアニリンを次
いで、γ−グルタミル−トランスフェラーゼ（Sigma製
品番号545−Ａ）の分析用の試薬（キット型、Sigma Che
mical Company製）を使用してジアゾ化合物に変換した
後、比色法により検出した。３種類の菌株の相対的活性
は、各々、SE−495、SE−83およびSY−77−１に対して1
00％、85.5％および48％であった。上記RAEV酵素に対し
て記載したものと同様の方法を使用して、SE−83および
SE−495酵素のアジポイル−７−ADCAに対する活性も示
された。SY−77−１のアジポイル−７−ADCAに対するデ
アシル化活性は、この菌株がβ−ラクタマーゼを生成す
るため、示すことができなかった。

同様にして、２種類の真菌性菌株（Alternaria sp.MA
−133、ATCC No.20492およびAspergillus sp.MA−13、A
TCC No.20491;U.S.4,141,790（明治製菓）参照）および
U.S.3,239,394（Merck ＆ Co.,Inc.）にセファロスポリ
ンＣアシラーゼ生産源として記載されている３種類の別
の細菌性菌株（Brevibacterium、ATCC No.14,649;Achro
mobacterium、ATCC No.14,648;およびFlavobacterium、
ATCC No.14,650）についても、アジポイル−アシラーゼ
産生が示された。

〔配列表〕

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩ (Ｃ１２Ｎ 1/15 Ｃ１２Ｒ 1:645） (72)発明者マクエイダ，フイリス・シーアメリカ合衆国、ワシントン・98072、ウツデインビル、ノース・イースト、ワンハンドレツドセブンテイサード・アベニユー・15611 (72)発明者ランボセツク，ジヨン・エイアメリカ合衆国、ワシントン・98115、シアトル、ノース・イースト、セブンテイーンズ・アベニユー・7701 (56)参考文献特開平２−27984（ＪＰ，Ａ) 特開平２−150284（ＪＰ，Ａ) 特開昭63−74488（ＪＰ，Ａ) Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，169 （1987）ｐ．5815−5820 Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，43（1987) ｐ．3009−3014 Ｎａｔｕｒｅ，185（1960）ｐ．97− 99 (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C12N 15/00 C12P 35/00 ＢｉｏｓｉｓＰｒｅｖｉｅｗｓ

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】下記菌株によってアジポイル−６−アミノ
ペニシラン酸を産生するために利用され得るアジピン酸
の塩及びエステルの一つもしくはそれ以上を含むアジペ
ート源が添加された培地中にアジポイル−６−アミノペ
ニシラン酸を産生する能力を有するペニシリュウム（Pe
nicillium）属の菌株を培養してアジポイル−６−アミ
ノペニシラン酸を生成せしめる工程、およびアジポイル
−６−アミノペニシラン酸を環拡張してアジポイル−７
−アミノデスアセトキシセファロスポラン酸を生成する
反応を触媒するエキスパンダーゼによりアジポイル−６
−アミノペニシラン酸をその場で（in situ）処理する
工程を含む、アジポイル−７−アミノデスアセトキシセ
ファロスポラン酸の製造方法。
【請求項２】アジペート源がアジピン酸ナトリトウムで
ある請求項１に記載の方法。
【請求項３】ペニシリュウム属の菌株がエキスパンダー
ゼをコードするDNAを有する組換えDNA発現ベクターによ
り形質転換された宿主菌株である請求項１又は２に記載
の方法。
【請求項４】DNAがストレプトミセス（Streptomyces）
属の菌株に由来する、請求項３に記載の方法。
【請求項５】ストレプトミセス属の菌株がストレプトミ
セス・クラブリゲルス（Streptomyces clavuligerus）
種に属する請求項４に記載の方法。
【請求項６】宿主菌株がイソペニシリンＮを生成する能
力を有するものである請求項３ないし５のいずれかに記
載の方法。
【請求項７】宿主菌株がペニシリュウム・クリソゲナム
（Penicillium chrysogenum）種に属する請求項３ない
し６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】組換えDNA発現ベクターがペニシリュウム
・クリソゲナムPC100ATCC74182として寄託されているプ
ラスミドpPenFTSOである請求項３ないし７のいずれかに
記載の方法。
【請求項９】アジポイル−６−アミノペニシラン酸を環
拡張してアジポイル−７−アミノデスアセトキシセファ
ロスポラン酸を生成する反応を触媒するエキスパンダー
ゼをコードするDNAを含み、ペニシリュウム（Peniclliu
m）属の宿主菌株に適合し、上記宿主菌株がアジピン酸
又はその宿主菌株によってアジポイル−６−アミノペニ
シラン酸を産生するために利用され得るアジピン酸の塩
及びエステルの一つ若しくはそれ以上を含むアジペート
源が添加された培地中にアジポイル−６−アミノペニシ
ラン酸を産生する能力を有するものである組換えDNA発
現ベクター。
【請求項１０】DNAがストレプトミセス（Streptomyce
s）属の菌株に由来する請求項９に記載の組換えDNA発現
ベクター。
【請求項１１】ストレプトミセス属の菌株がストレプト
ミセス・クラブリゲルス（Streptomyces clavuligeru
s）種に属する請求項10に記載の組換えDNA発現ベクタ
ー。
【請求項１２】宿主菌株がイソペニシリンＮを生成する
能力を有するものである請求項９ないし11のいずれかに
記載の組換えDNA発現ベクター。
【請求項１３】宿主菌株がペニシリュウム・クリソゲナ
ム（Penicillium chrysogenum）種に属する請求項９な
いし12のいずれかに記載の組換えDNA発現ベクター。
【請求項１４】DNAを発現させるためのプロモーターが
ペニシリュウム・クリソゲナムのIPNS遺伝子由来である
請求項９ないし13のいずれかに記載の組換えDNA発現ベ
クター。
【請求項１５】ペニシリュウム・クリソゲナムPC100 A
TCC74182として寄託されているプラスミドpPenFTSOであ
る請求項９ないし14のいずれかに記載の組換えDNA発現
ベクター。
【請求項１６】請求項９ないし15のいずれかに記載の組
換えDNA発現ベクターを有する形質転換宿主菌株。
【請求項１７】イソペニシリンＮを生成する能力を有す
るものである請求項16に記載の形質転換宿主菌株。
【請求項１８】ペニシリュウム・クリソゲナム（Penici
llium chrysogenum）種に属する請求項16又は17に記載
の形質転換宿主菌株。
【請求項１９】ペニシリュウム・クリソゲナムPC100 A
TCC74182である請求項16ないし18のいずれかに記載の形
質転換宿主菌株。