CZ287357B6 - Bioproces pro přípravu 7-aminodeacetoxycefalosporanové kyseliny, (7 - ADCA) rekombinantní DNA vektor pro expresi expandázy a jím transformovaná buňka P. chrysogenum - Google Patents

Abstract

V bioprocesu pro přípravu 7-aminodeacetoxycefalosporanové kyseliny se kmen Penicillium chrysogenum kultivuje v médiu obsahujícím adipátový přípravek a připraví se adipoyl-6-APA. Kmen Penicillium chrysogenum je transformován pomocí DNA kódující expandázu využívající adipoyl-6-APA jako substrát, přičemž výsledkem exprese je expanze kruhu adipoyl-6-APA na adipoyl-7-ADCA. K hydrolýze adipoyl-7-ADCA se použije adipoylacyláza.ŕ

Description

Bioproces pro přípravu 7-aminodeacetoxycefalosporanové kyseliny, rekombinantní DNA vektor pro expresi expandázy a jím transformovaná buňka P. chrysogenum

Oblast techniky

Vynález se týká syntetických metod pro přípravu komerčních cefalosporinových antibiotik, kterých je již nyní známo velké množství a jejich vývoj se nachází ve čtvrté generaci. Velká rozmanitost postranních řetězců cefalosporinů a jejich ekonomický význam vedly k zájmu vytvořit účinnější a rovněž ekonomičtější metody přípravy klíčových meziproduktů, jež umožňují přímou syntézu různých cefalosporinů.

Jedním z těchto klíčových meziproduktů je 7-aminodeacetoxycefalosporanová kyselina (7-ADCA) o vzorci:

H

COOH

7-ADCA se nyní vyrábí z penicilinu G a vyžaduje pět nebo šest chemických stupňů k rozšíření kruhového systému penicilinu z pětičlenného na šestičlenný kruh, který je pro cefalosporiny charakteristický. Pro totální chemickou syntézu je typické, že tento proces vykazuje závažné nedostatky. Mezi tyto nedostatky patří vícestupňový a komplexní proces, drahé reagencie, značné množství vedlejších produktů, s čímž souvisí problém úpravy tekutých odpadů a rovněž vyčištění vysoce nečistého výchozího materiálu před započetím chemického postupu. Vzhledem k těmto skutečnostem se prováděl po dlouhou dobu výzkum zaměřený na vytvoření mikrobiologického nebo fermentačního procesu, který by vedl k enzymatickému rozšíření kruhu a k odštěpení postranních řetězců a přípravě 7-ADCA na daleko ekonomičtější bázi, než je tomu u chemického procesu, který se nyní užívá.

Vynález se tedy zaměřuje na přípravu klíčového meziproduktu cefalosporinů 7-ADCA, zejména na bioproces pro přípravu 7-ADCA.

Až dosud se výzkum vhodného bioprocesu pro přípravu 7-ADCA nesetkal s úspěchem, zejména s ohledem na náklady přípravy. Bylo sice možné připravit 6-aminopenicilanovou kyselinu (6APA) přímou fermentací a/nebo enzymatickou transformací penicilinu G, při čemž bylo zapotřebí jen rozšířit kruh pro získání 7-ADCA. Enzymy mikroorganismů Cephalosporium nebo Streptomyces, které provádějí rozšíření kruhu svou normální metabolickou dráhou, však nemohou využívat 6-APA jako substrát. Tyto enzymy, zvané expandázy, jsou definovány jako enzymy, které katalyzují rozšíření cyklických struktur, jež se nacházejí v molekulách typu penicilinu, na šestičlenné cykly vyskytující se v cefalosporinech. V dalším textu budou nazývány „expandázy“.

Substrát, na který expandáza působí, je penicilín N, který po rozšíření kruhu dává deacetoxycefalosporin C (DAOC). Je pouze nutné odštěpit (D)-a-aminoadipoylový postranní řetězec ke vzniku 7-ADCA. Ukázalo se však, že tento postranní řetězec je téměř zcela rezistentní k enzymatickému štěpení, jehož výsledkem jsou nepřijatelně nízké výtěžky.

Vynález umožňuje vytvořit účinný bioproces, při kterém se penicilinová sloučenina (s adipoylovým postranním řetězcem) vyrobí novým fermentačním procesem; tato sloučenina je pak

-1 CZ 287357 B6 vhodným substrátem pro expandázu produkovanou in šitu stejným transformovaným mikroorganismem, jehož produktem je penicilinová sloučenina a jenž způsobuje expresi systému expandázy. Expandáza pak působí na rozšíření kruhu penicilinové sloučeniny a vytváří tak cefalosporinovou sloučeninu s vysokým výtěžkem. V druhém stupni je možno postranní řetězec penicilinové sloučeniny, nyní cefalosporinové sloučeniny, odloučit pomocí dalšího enzymového systému za dosažení vysokých výtěžků. Výsledkem tohoto unikátního bioprocesu podle vynálezu jsou vysoké výtěžky 7-ADCA, které vůbec nebylo možno očekávat.

Dosavadní stav techniky

Cantwell a kol. v Curr Genet (1990) 17:213-221 navrhl bioproces pro přípravu 7-ADCA rozšířením kruhu penicilinu V a následnou enzymatickou hydrolýzou výsledného deacetoxycefalosporinu V za účelem přípravy 7-ADCA. Tento návrh je založen na dostupnosti klonovaného genu penicilín N expandázy (cefE) z mikroorganismu Streptomyces clavuligerus, Kovacevic a kol., J. Bacteriol. (1989) 171:754-760 a U.S. 5,070,020. Expandáza však působí na penicilín N, který je jejím přirozeným substrátem, nikoli však na penicilín V. Navržený proces vyžaduje aplikaci metod genetického inženýrství za účelem modifikace genu expandázy, která působí na rozšíření kruhu penicilinu V. Požadovaná modifikace nebyla Cantwellem a kol. dosažena a podařilo se uspět pouze při transformaci Penicillium chrysogenum cef E genem ze Streptomyces clavuligerus a docílit nízkého stupně exprese DAOCS expandázy.

Expandáza byla zkoumána jak s ohledem na její aktivitu, tak i genetickou sekvenci. Např. ve Wolfeho US patentech č. 4,510,246 a 4,536,476 se popisuje izolace cyklázy, epimerázy odděleně z bezbuněčného extraktu prokaryotních organismů produkujících β-laktamy včetně Streptomyces clavuligerus, takže vznikly stabilní enzymové preparáty. V EP-A-0 366 354 se popisuje izolovaná a vyčištěná expandáza ze Streptomyces clavuligerus včetně koncového residua a aminokyselinového složení a uvádí se, že má molekulovou hmotnost cca 34,000 Daltonů. V US patentu č. 4,536,476 se na rozdíl od toho uvádí, že jde o molekulovou hmotnost 29,000 Daltonů u pravděpodobně stejného enzymu. V EP-A-0-233 715 se popisuje izolace a charakteristika expandázy pomocí restrikční endonukleázy získané ze Streptomyces clavuligerus, transformaci a expresi v hostiteli enzymu a demonstraci rozšíření kruhu na substrátu penicilinu N za využití stejného enzymu. US patent 5,070,020 popisuje kódování struktury expandázy ze sekvence DNA získané ze Streptomyces clavuligerus, jakož i transformaci kmene Penicillium chrysogenum s vektorem exprese obsahujícím DNA sekvenci, čímž se dosáhne exprese expandázy. Předpokládá se, že tento enzym je užitečný pro rozšíření jiných substrátů než je penicilín N, ale takové rozšíření nebylo ještě prokázáno.

Výše uvedené práce se soustředily na expandázu odvozenou s prokaryotického mikroorganismu Streptomyces clavuligerus. K expresi stejného enzymu nebo alespoň enzymu se stejnou expandázovou aktivitou dochází také u kmene eukaryotického mikroorganismu Cephalosporium acremonium (popisované také jako Acremonium chrysogenum). Zde ovšem dochází k expresi expandázové aktivity bifunkčním genem (cefEF) a to expresi DACS (hydroxylázová aktivita), jejíž přirozenou funkcí je konvertovat deacetocycefalosporanovou kyselinu (DAOC) na deacetylcefalosporin C (DAC). Výsledkem je jediný, ale bifunkční enzym expandáza/hydroláza. Separovat tyto aktivity dvou genových produktů nelze. Např. EP-A-O-281 391 popisuje izolaci a identifikaci DNA sekvence DAOCS/DACS genu získaného z Cephalosporium acremonium ATCC 11550 spolu s příslušnými aminokyselinovými sekvencemi enzymů. Penicillium se transformuje a dochází k expresi enzymů, ale žádoucí konverze penicilinů G a V na odpovídající cefalosporiny se nikdy neprokázala. Předpoklad, že techniky genetického inženýrství zajistí prostředky, které umožní separovat genetickou informaci pro DAOC od informace pro DACS a provést pak jejich oddělenou expresi, se nikdy neověřil.

-2CZ 287357 B6

Enzym DAOCS/DACS (expandáza/hydroláza) z Cephalosporium acremonium byl rovněž zkoumán, a to jak s ohledem na jeho aktivitu, tak charakteristiky a genetickou sekvenci. Např. v patentech Demain US 4,178,210, 4,248,966 a 4,307,192 byly různé výchozí materiály penicilinového typu podrobeny působení bezbuněčného extraktu z Cephalosporium acremonium, který epimerizuje a rozšiřuje kruh za vzniku cefalosporinového antibiotického produktu. WeKuang Yeh popisuje v US patentu 4,753,881 charakteristiky Cephalosporium acremonium enzymu, a to jeho isoelektrický bod, molekulární hmotnost, aminokyselinová residua, poměr aktivity hydrolázy k aktivitě expandázy a peptidové fragmenty.

Výše uváděný stav techniky zkoumal pouze jeden aspekt našeho vynálezu tj. transformaci kmene Penicillium chrysogenum genem způsobujícím expresi expandázy a dosažením exprese u tohoto enzymu. Expresovaný enzym se však využíval jenom k rozšíření kruhu u penicilinu N, nikoli u penicilinu G a V. I v tomto případě penicilín N má v 7. poloze postranní řetězec, který nelze enzymaticky odštěpit za vzniku 7-ADCA, jak je tomu u metody podle našeho vynálezu. Předmětný vynález je založen na překvapujícím objevu, že adipoylový postranní řetězec může být účinně adován kmenem Penicillium chrysogenum takže expresovaná expandáza může in šitu účinně využít tuto sloučeninu jako substrát pro rozšíření kruhu na dipoyl-7-ADCA; tento adipoylový postranní řetězec může být účinně odstraněn ještě dalším enzymem a vznikne 7ADCA. Různé izolované části tohoto vynálezu lze nalézt v předchozím stavu techniky, nedošlo však nikdy k jejich kombinaci takovým způsobem, že se metodou podle vynálezu docílilo překvapujících výsledků.

Např. je známa výroba penicilanové kyseliny; viz Ballio, A. a kol., Nátuře (1960) 185, 97-99. Enzymatické rozšíření 6-adipoylpenicilanové kyseliny na basi in vitro je rovněž známé. Viz Baldwin a kol. Tetrahedron (1987) 43, 3009-3014; a EP-A-0 268 343. Enzymatické odštěpení adipoylového postranního řetězce je rovněž známé; viz Matsuda a kol., J. Bact. (1987) 169, 5815-5820.

Adipoylový postranní řetězec má tuto strukturu:

COOH-(CH2)4-CO-, zatímco postranní řetězce podobné struktury jako glutaiyl mají tento vzorec: COOH-(CH2)3-CO-. Enzymatické odštěpení glutarylového postranního řetězce je rovněž známé. Viz např. Shibuya a kol., Agric.Biol.Chem. (1981) 45, 1561-1567; Matsuda aKomatsu, J.Bact. (1985) 163, 1222-1228; Matsuda a kol., J.Bact. (1987) 169, 5815-5820; Jap. 53-086084 (1978 -Banyu Pharmaceutical Co., Ltd.); a Jap. 52-128293 (1977 -Banyu Pharmaceutical Co., Ltd.).

Také EPA-A-0 453 048 popisuje metodu zdokonalení odštěpné aktivity působením glutarylacylázy produkované Pseudomonas SY-77-1. Substitucí různých aminokyselin na určitých pozicích uvnitř alfa-podjednotky se dosáhne 3 - 5ti násobného zrychlení této štěpné reakce (z adipoylserinu). Je třeba poznamenat, že ačkoli se v EP-A-0 453 048 popisuje acyláza se zdokonalenou aktivitou u adipoylových postranních řetězců, nepopisuje se zde žádný způsob (ať chemický nebo bioproces v něčem analogický postupu, který je předmětem vynálezu), podle kterého by bylo možno produkovat přímo adipoyl-cefalosporin.

Když je přítomen (D)-a-aminoadipoyl postranní řetězec, je známé, že se nejprve enzymaticky odstraní aminoskupina a zkrátí se postranní řetězec pomocí (D)-aminoacioxidázy, ponechá se glutarylový postranní řetězec (GL7), jenž se pak odstraní dalším enzymem(glutarylacyláza). Takovéto dvoustupňové odštěpení je popsáno v US patentu Matsudy 3,960,662; EP-A-0 275 901; Jap. 61-218057 (1988 - Komatsu, Asahi Chemical Industry Co.,); WO 90/12110 (1990 Wong - Biopure Corp.); a Isogai a kol., Bio/technology (1991) 9, 188-191.

-3CZ 287357 B6

Podstata vynálezu

Vynález se týká bioprocesu pro přípravu 7-aminodesacetoxycefalosporanové kyseliny (7ADCA). Pro lepší pochopení bioprocesu podle vynálezu jsou v dalším textu znázorněny různé 5 stupně metabolické dráhy vedoucí k penicilinu G a cefalosporinu C, meziprodukty a enzymy, které transformaci provádějí.

L-alfa-aminoadipová kyselina + (L)

L-cystein + L-valin

isopenicilin N syntetáza (IPNS)

CL)

HOOCX

..·χ Í 'X V h₂n

isopenicilin N (IPN)

IPN amidolyáza

-4CZ 287357 B6 acyl CoA : 6-APÁ acyltrans feráza fenylacetyl CoA

penicilín C

isopenicilin N (IPN)

IPN epiraeráza ’ ’

-5CZ 287357 B6 (D) penicilín N

deacetoxycefalosporanová kyselina (DAOC)

DAOC 3*- hydroxýláza

-6CZ 287357 B6

CD)

deacetoxycefalosporanová kyselina (DAC)

DAC acetyltransferáza

cefalosporin C

Vynález se týká bioprocesu pro přípravu 7-aminodeacetoxycefalosporanové kyseliny (7-ADCA) 5 enzymově katalyzovanou expanzí adipoyl-6-aminopenicilanové kyseliny (adipoyl-A-APA) na adipoyl-7-ADCA a odstraněním adipoylového řetězce enzymově katalyzovanou hydrolýzou adipoyl-7-ADCA, který se provádí tak, že při kultivaci transformovaného kmene Penicillium chrysogenum v médiu obsahujícím adipátový přípravek je produkována adipoyl-6-APA a kde kmen Penicillium chrysogenum je transformován pomocí DNA kódující expandázu využívající

-7CZ 287357 B6 adipoyl-6-APA jako substrát, při čemž výsledkem exprese je produkce expandázy, jejíž enzymová aktivita katalyzuje expanzi kruhu adipoyl-6-APA na adipoyl-7-ADCA a pro hydrolýzu adipoyl-7-ADCA se použije adipoylacyláza.

Výše uváděné termíny mají tyto významy:

„adipoyl-6-APA“ znamená [2S-(2a,5a,6P)]-3,3-dimethyl-7-oxo-6-[(hexan-l ,6-dioyl)amino]-4-thia-l-azabicyklo-[3.2.0]heptan-2-karboxylová kyselina; a „adipoyl-7-ADCA“ znamená 7-[(hexan-l ,6-dioyl)amino-3-methyl-8-oxo-5-thia-lazabicyklo-(4.2.0)-oct-2-ene-2-karboxylová kyselina.

Vynález se zejména týká bioprocesu pro přípravu 7-aminodeacetoxycefalosporanové kyseliny (7-ADCA), ve kterém se jako adipátový přípravek užívá adipát dvojsodný a kde se DNA se zakódovanou aktivitou expandázy odvodí ze Streptomyces clavuligerus ATCC-27064 a adipoylacyláza z Pseudomonas species.

Kmen Penicillium chrysogenum se transformuje vektorem exprese rekombinantní DNA plazmidem pPenFTSO na rekombinantní Penicillium chrysogenum PC 100, ATCC 24182.

Rekombinantní DNA expresní vektor, kterým je plazmid pPenFTSO použitý ve výše zmíněném bioprocesu, integrovaný do chromozomální DNA hostitelské buňky Penicillium chrysogenum za vzniku rekombinantního Penicillium chrysogenum PC 100, ATCC 74182, je tvořen DNA kódující aktivitu enzymu expandázy odvozené ze Streptomyces clavuligerus ATCC 27064 a promotorem řídícím expresi DNA kódující aktivitu expandázy, jímž je promotor IPNS genu Penicillium chrysogenum.

Transformovaná buňka Penicillium chrysogenum označená PC 100, ATCC 74182 použitá ve výše uvedeném bioprocesu, kde rekombinantní DNA expresní vektor je plazmid pPenFTSO, který je integrovaný do transformované buňky Penicillium chrysogenum PC 100, ATCC 74182 a je tvořen DNA kódující aktivitu expandázy odvozené ze Streptomyces clavuligerus ATCC 27064 a promotorem řídícím expresi DNA kódující aktivitu expandázy, jímž je promotor IPNS genu Penicillium chrysogenum.

7-aminodeacetoxycefalosporanová kyselina (7-ADCA) je klíčovým meziproduktem pro přípravu syntetických komerčních cefalosporinů o vzorci:

H

COOH

Navíc k cefalosporinovému jádru jsou rozlišujícím význakem 7-ADCA 7-aminoskupina a 3methylskupina. 7-aminoskupinu lze konvertovat na jakýkoli počet derivátů postranních řetězců, což tvoří bázi pro syntézu různých komerčních cefalosporinů. 3-methylskupina se obvykle, nikoli však vždy, musí konvertovat na jiný postranní řetězec pro syntézu komerčního cefalosporinu.

7-ADCA vyrobená podle vynálezu je v kontrastu s cefalosporinem C, dalším klíčovým cefalosporinovým meziproduktem o vzorci:

-8CZ 287357 B6

O li ch₂occh₃

U tohoto cefalosporinu by byl přijatelný postranní řetězec 3-acetyloxymethyl pro komerční cefalosporiny. 7-(D)-a-aminoadipoyl postranní řetězec není přijatelný pro další syntetickou derivaci a musí být odštěpen tak, aby vznikla vhodná 7-aminoskupina. Odštěpení je však jak chemickou, tak biochemickou cestou velice nesnadné.

Definice

V tomto popisu a zejména v oddílu nazvaném „popis výhodných uspořádání“ mají dále uváděné termíny tyto významy:

7-ADCA	7-aminodeacetoxycefalosporanová kyselina
6-APA	6-aminopenicilanová kyselina
DAOC	deacetoxycefalosporanová kyselina
DAOCS	DAOC syntetáza
DAC	deacetylcefalosporin C
DACS	DAC syntetáza
IPNS	isopenicilin N syntetáza
Tris	tris hydroxymethyl aminomethan
EDTA	ethylendiamintetraoctová kyselina
DEPC	diethylpyrouhličitan
TE	tris/EDTA pufr
SSC	sůl, (chlorid sodný), citrát sodný, pufr
SDS	dodecylsulfát sodný
PEG	polyethylenglykol

Kultura mikroorganismu Penicillium Chrysogenum

První stupeň bioprocesu podle vynálezu zahrnuje kultivaci kmene Penicillium chrysogenum který produkuje isopenicilin N, v kultivačním médiu, jež je schopno podporovat jeho vzrůst s přidáváním adipátového přípravku do tohoto kultivačního média, přičemž tento adipátový přípravek obsahuje kyselinu adipovou nebo jednu nebo i více jejích solí a esterů. Adipátový přípravek může být přidáván do kultivačního média po naočkování mikroorganismem Penicillium chrysogenum, dává se však přednost tomu, aby byl adipátový přípravek přítomen v příslušném kultivačním médiu již v době, kdy se provádí naočkování. Kyselina adipová nebo její soli a estery mohou být jako takové asimilovány a využívány kmenem Penicillium chrysogenum za účelem produkce adipoyl-6-APA; uvedený kmen Penicillium chrysogenum se transformuje DNA se zakódovanou aktivitou expandázy, přičemž výsledkem exprese je rozšíření kruhu in šitu uvedené adipoyl-6-APA za vzniku adipoyl-7-ADCA.

Další species rodu Penicillium mimo Penicillium chiysogenum species produkují rovněž isopenicilin N. Nejvíce produkční kmeny produkující isopenicilin N však byly v minulosti vyvinuty dobře známými technikami zdokonalení kmene z Chrysogenum species. Z praktických důvodů se tedy vynález omezil na kmeny Penicillium chrysogenum, ačkoli jej jistě lze uplatnit i u dalších species. Jakýkoli deponovaný kmen Penicillium chrysogenum nebo i další veřejně přístupný pramen tohoto kmene se vhodným výchozím bodem pro provádění metody podle vynálezu.

-9CZ 287357 B6

Kultivační médium, které může podporovat růst kmene Penicillium chrysogenum, jenž produkuje isopenicilin N, může připravit snadno odborník v tomto oboru. Např. může být kultivace prováděna submerzní aerobní fermentační metodou a použité médium může být zvoleno z řady vhodných dostupných médií. Typická média používají pramenů uhlíku jako sacharózy, glukózy a škrobu; prameny dusíku jsou sojové maso a granulát, olej ze semen bavlníku, burské oříšky a různé aminokyseliny, jejich směsi a peptony. Při výrobě se klade důraz na výtěžek a izolaci a tak bývá z tohoto důvodu dávána přednost melase jakožto zdroji uhlíku a sojovým produktům a aminokyselinám jakožto zdroji dusíku.

Do kultivačního média se dále obvykle přidávají anorganické soli a zejména soli schopné dodat potřebné iontové složky: soli sodíku, draslíku, ammonia, vápníku, dále sírany, fosforečnany, chloridy, bromidy, dusičnany, uhličitany, dvojmocné a trojmocné soli železa, soli hořčíku, manganu atd. Stopové prvky důležité pro vzrůst, vývoj a metabolismus Penicillium chrysogenum mohou být přímo přidávány do kultivačního média, pokud se nedostávají do média jako složky jiného kultivačního média.

Kmeny Penicillium chrysogenum lze pěstovat v zařízení o malém objemu jako je třepačka o obsahu 1 1, jestliže hodláme vyprodukovat pouze malá množství 7-ADCA. Jestliže máme v úmyslu připravit větší množství adipoyl-7-ADCA, pak je nutno použít velké fermentační nádrže pro submerzní aerobní fermentaci.

Při přípravě adipoyl-7-ADCA ve větším měřítku, se spory Penicillium chrysogenum pěstují na šikmém agaru. Spory z agaru se pak používají pro naočkování vegetativního média o malém objemu. Vegetativní médium po inkubaci produkuje čerstvou, aktivní kulturu mikroorganismů s bohatým růstem. Tento vegetativní vzrůst se pak používá jako očkovací látka pro fermentační média v širokém měřítku. V některých případech by mohlo být žádoucí zařadit ještě další vegetativní médium pro naočkování fermentačního média. Toto druhé stadium vegetativního média se obvykle používá tehdy, když je objem fermentačního média větší než první vegetativní médium. Tak se spory mikroorganismů kultivují nejprve v malém objemu vegetativního média za účelem vytvoření očkovací látky pro vegetativní médium o větším objemu. Větší objem vegetativního média pak poskytne dostačující koncentraci mikroorganismů, které je zapotřebí k rychlé iniciaci fermentace prováděné ve větším měřítku v fermentačním tanku. Vegetativní médium může mít stejné složení jako fermentační médium nebo může obsahovat další ingredienty k podpoře růstu a vývoje mikroorganismů v malém měřítku.

Kmeny Penicillium chrysogenum používané v metodě podle vynálezu jsou účinně kultivovány při teplotách mezi a 20 °C a 30 °C, optimálních výtěžků však lze dosáhnout při teplotách mezi 22 °C až 28 °C, s výhodou pak při 25 °C.

Maximální produkce adipoyl-7-ADCA se dosáhne tehdy, když se kmen Penicillium chrysogenum kultivuje ve velkých nádržích po dobu 10 až 30 dnů, s výhodou pak 15-25 dnů. Když se však kultura pěstuje v nádobě o malém objemu, jako je 250 ml třepačka, růst mikroorganismů je daleko rychlejší, produkce adipoyl-7-ADCA proběhne rychleji, např. od a do 15 dnů, obvykle pak do 5 až 7 dnů.

Jestliže konečné pH ve velkých fermentačních nádržích dosáhne 8,0 nebo je i vyšší, výtěžek adipoyl-7-ADCA může být ovlivněn negativně. Za těchto situací je žádoucí monitorovat pH kultivačního média během procesu fermentace. Jestliže dochází k tomu, že pH dosáhne těchto hodnot ještě dříve než dojde k maximální produkci adipoyl-7-ADCA, pH může být upraveno přidáním vhodné kyseliny nebo pufru do fermentačního média.

Produkce adipoyl-7-ADCA lze sledovat testováním vzorků z fermentačního média pomocí chromatografie.

-10CZ 287357 B6

Jak tomu bývá u četných submerzních aerobních fermentačních postupů, kultivačním médiem probublává sterilní vzduch za účelem dosažení většího růstu kmene Penicillium chrysogenum a zvýšené produkce adipoyl-7-ADCA. Objem vzduchu proháněného kultivačním médiem je obvykle nejméně cca 0,2 objemu vzduchu za minutu na objem kultivačního média. Zvýšené množství průtoku vzduchu může mít často příznivý účinek na produkci adipoyl-7-ADCA.

Kmen Penicillium chrysogenum produkuje mimo adipoyl-7-ADCA mnohé vedlejší produkty ametabolity. Protože některé z nich jsou labilní, je žádoucí při získávání adipoyl-7-ADCA z fermentačního média, působit na celé fermentaČní médium po krátkou dobu kyselinou za účelem úpravy pH, což povede k odstranění některých nečistot, jež se v průběhu procesu vytvořily. FermentaČní produkt adipoyl-7-ADCA se pak odloučí z takto upraveného fermentačního média, separuje se od jiných složek iontovou chromatografií a může se i dále chromatografícky vyčistit - je-li tak zapotřebí - předtím, než dojde k enzymatickému odštěpení adipoylového postranního řetězce. Je také možné uplatnit iontovou chromatografii po separaci postranního adipoylového řetězce. Jedním z hlavních vedlejších produktů je adipoyl-6-APA a je možné tento produkt chemicky nebo enzymaticky degradovat tak, aby separace byla snazší. Nejprve se zfiltrované fermentaČní médium podrobí předběžnému vyčištění, jež může zahrnovat počáteční extrakci organickým rozpouštědlem nemísitelným s vodou jako je n-butanol nebo amylacetát, aby se odstranily nečistoty. Extrahované médium se pak dále čistí chromatografií s aktivním uhlím.

Přidávání adipátového přípravku

V době, když se připravuje fermentaČní kultura pro Penicillium chrysogenum jak je výše popsáno, tedy před naočkováním, přidává se adipátový přípravek k dalším ingredientům fermentačního kultivačního média. S výhodou se přidává adipátový přípravek nějakou dobu po naočkování, např. 1, 2 a/nebo 3 dny po naočkování. Definovali jsme adipátový přípravek jako adipátovou kyselinu nebo některou zjejích solí nebo esterů, jež mohou být asimilovány a využity kmenem Penicillium chiysogenum pro produkci adipoyl-6-APA. Adipová kyselina, její soli a estery mohou být používány odděleně nebo i v kombinaci. Dává se přednost dvojsodné soli, ačkoli draselná sůl i směs solí se sodíkem by byla rovněž výhodná. Je možno použít methylester, ethylester je vodou nerozpustný. Sůl nebo ester kyseliny adipové musí vyhovovat podmínkám tak, aby mohly být asimilovány a využity kmenem Penicillium chrysogenum pro produkci adipoyl-6-APA. Např. by byla vhodná samotná kyselina adipová, i když je ve vodě nerozpustná, jestliže se za vhodných podmínek pH vytvoří asimilovatelná sůl.

Vhodné expandázy

Kmen Penicillium chrysogenum v kultivačním médiu, do něhož se přidá adipátový přípravek, jak výše uvedeno, za účelem produkce adipoyl-6-APA, je kmenem, který byl transformován DNA se zakódováním aktivity expandázy, přičemž výsledek této exprese, uváděná adipoyl-6-APA rozšíří in šitu svůj kruh a expanduje na dipoyl-7-ADCA.

Adipoyl-6-APA je produkována intracelulámě v důsledku přidání adipátového přípravku do kultury Penicillium chrysogenum. V tomto intracelulámím prostředí tj. in šitu transformovaný Penicillium chrysogenum provádí expresi DNA se zakódováním aktivity expandázy, zatímco enzym působí na adipoyl-6-APA jako substrát a rozšiřuje kruh za vzniku adipoyl-7-ADCA.

Nový bioproces podle vynálezu zahrnuje tedy rovněž transformaci kmene Penicillium chrysogenum popsaného typu s DNA kódující aktivitu expandázy a výsledkem jeho exprese je adipoyl-6APA, který in šitu rozšiřuje kruh za vzniku adipoyl-7-ADCA. Tedy DNA transformovaná s Penicillium chiysogenum musí provést expresi enzymu, který nevykazuje jen aktivitu expandázy, jak se obvykle chápe, tj. schopnosti rozšířit kruh isopenicilinu N na DAOC, ale také

-11CZ 287357 B6 schopnost rozšířit kruh adipoyl-6-APA na adipoyl-7-ADCA. Vzhledem k podobnosti vedlejších řetězců je možné, že by takto bylo možno použít jakéhokoli enzymu expandázy v tomto novém bioprocesu.

Již bylo uvedeno v oddílu o dosavadním stavu techniky, že expandáza odvozená ze Streptomyces clavuligerus ATCC 27064 byla zcela sekventována a charakterizována mapováním pomocí restrikčních endonukleáz. I když se pravděpodobně jedná o stejný enzym odvozený ze Streptomyces clavuligerus NRRL 3585, bylo v literatuře uvedeno, že má rozdílnou molekulovou hmotnost, nebyl však sekvenován.

Expandázy identifikované v dřívějším stavu techniky jsou užitečné v novém bioprocesu podle vynálezu. Další, dosud neindentifikované expandázy, odvozené z různých kmenů Streptomyces clavuligerus nebo i z mikroorganismů jiných rodů, mohou být také vhodné pro provádění nového bioprocesu podle vynálezu. Procedury identifikace těchto nových kmenů a rodů užitečných mikroorganismů, jakož i izolace předpokládaných expandáz a stanovení, zda jsou vhodné pro užití v metodě podle vynálezu, jsou známé a odborníky užívané. Screening bezbuněčných extraktů nových kmenů a rodů užitečných mikroorganismů je možno provádět spolehlivým a reprodukovatelným způsobem tak, že se uvedené extrakty přidají k substrátu adipoyl-6-APA za přítomnosti známých DAOCS kofaktorů, které zahrnují železnaté ionty, askorbát, alfaketoglutarát a adenosintrifosfát (ATP). Substrát adipoyl-6-APA lze připravit v dostatečných množstvích přidáním adipátového přípravku k netransformovanému Penicillium chrysogenum analogickým způsobem, jak je popsáno výše. Žádoucí expandáza je přítomna, jestliže adipoyl-7ADCA se vytvoří; její přítomnost se zjistí chromatograficky.

Rovněž je možné za využití dobře známých rekombinantních technik vytvořit vzorky DNA založené na sekvenci expandázy Streptomyces clavuligerus a Cephalosporium acremonium za účelem provedení screeningu DNA mikroorganismu, o kterém se předpokládá, že by mohl produkovat expandázu vhodnou pro použití v metodě podle vynálezu.

Potenciální zdroje expandáz

Jak jsme již uvedli, expandázy jsou enzymy, které katalyzují rozšíření pětičlenného kruhu (penicilinový typ molekul) na šestičlenný kruh (cefalosporinový typ molekul). Jakýkoli organismus produkující látky cefalosporinového typu je tedy potenciálním pramenem expandázy se zakódováním DNA. Příklady takovýchto organismů jsou uvedeny níže, ale tento seznam slouží pouze jako příklad a není jej možno považovat za vyčerpávající:

Plísně

Cephalosporium acremonium

Cephalosporium sp.

Emericellopsis

Paecilomyces

Scopulariopsis

Diheterospora

Spiroidium

Anoxiopsis

Actinomycetes

Streptomyces clavuligerus Streptomyces lipmanii Streptomyces wadayamensis Streptomyces todorominensis

-12CZ 287357 B6

Streptomyces filipinensis cephamycini

Streptomyces heteromorphus

Streptomyces panayensis

Streptomyces griseus

Streptomyces catleya Nocardia lactamdurans

Další bakterie

Flavobacterium sp.

Alcaligenes denitrifícans

Mycoplana bullata Providencia rettqeri Lysobacter lactamgenus

Expandázy organismů výše uvedených jsou kandidáty pro další průzkum a může se stát, že všechny nebudou vhodné pro nový postup podle vynálezu. Využití enzymů, které mají jak expandázovou, tak i hydrolázovou aktivitu, jako je Cephalosporium acremonium může vyústit v syntézu hydroxylované adipoyl-7-ADCA např. DAC a adipoylovým postranním řetězcem.

Izolace fragmentů DNA se zakódováním aktivit expandázy

Když byla přítomnost žádaného enzymu expandázy zjištěna způsobem shora uvedeným, postup izolace DNA se zakódováním aktivity expadázy je v oboru dobře známý a jednoduchý. Próby DNA na základě známých sekvencí a částečných sekvencí genů se zakódováním expandázy se připraví a budou hybridizovat na žádoucí enzym se zakódováním DNA, který se má izolovat. Příprava takových prób je založena na poznatku, že aminokyselinové a nukleotidové sekvence bází se zakódováním expandázy, zrovna tak jako kodónové preference pro určitý mikroorganismus jsou dány. Podrobný popis typického postupu tohoto typu aplikovaný na genomovou DNA odvozenou ze Streptomyces clavuligerus ATCC 27064 je dále popsán.

Izolace DNA se zakódováním aktivity expandázy se docílí restrikčními a vazebnými postupy dobře známými v technologii rekombinantní DNA. Je zapotřebí mít restrikční mapu endonukleázy genomu příslušného mikroorganismu, aby mohl být vyroben a izolován vlastní restrikční fragment. Restrikční mapy pro Streptomyces clavuligerus a Cephalosporium acremonium jsou již dostupné; použijí se restrikční enzymy BamHI a Sal I a elektroforézou se vytvoří žádané fragmenty o velikosti 1,8 až 2,2 kb.

Transformace kmene Penicillium chrysogenum

Když jsme připravili fragmenty DNA se zakódováním aktivity expandázy, lze je vázat na plazmid nebo jiný expresní vektor spolu s fragmenty DNA obsahujícími promotory, translační aktivační sekvence, markéry rezistence, regulační sekvence a další DNA sekvence, které umožňují nebo podporují transformaci, řídí expresi genového produktu a usnadňují izolaci transformantů. Vektor exprese, který byl takto připraven, se užívá k transformaci Penicillium chrysogenum kmene a k intracelulámí expresi aktivity expandázy. Techniky transformace a exprese jsou dobře známé a detailní popis těchto typických postupů je dále uveden.

Jak jsme již výše uváděli, transformovaný kmen Penicillium chrysogenum provádí expresi aktivity expandázy intracelulámě a in šitu působí na adipoyl-6-APA substrát rozšířením kruhu na adipoyl-7-ADCA.

-13CZ 287357 B6

Nový transformant

Specifický transformant Penicillium chrysogenum s expresí aktivity expandázového genu, který je výhodnou variantou uspořádání podle vynálezu, je nový se zřetelem na podobné konstrukce prováděné dříve Cantwellem a kol. (1990) Current Genetic, 17, 213-221. V těchto konstrukcích se používá mutagenese in vitro pro spojení promotoru s genem expandázy. V konstrukci podle Cantwella se manipulací zavede Ndel místo na ATG expandázového genu, které se naváže na Xbal místo na 3‘ konci promotoru IPNS spojovačem Xbal/Ndel. V konstrukci podle vynálezu se místo Ncol vytvoří na ATG expandázového genu a naváže se na Ncol místo na 3‘ konci spojovače IPNS. Tak se vytvoří sekvence spojení promotor-gen v těchto konstrukcích.

Xbal Ncol

IPNS promotor	5‘	TCTAGACACCATGG	3‘	SEQ IN č. 1
Střep expandáza	5‘	GTGAGAGTTGATGGAC	3‘	SEQ ID č. 2
Cantwell	5‘	TCTAGACACTATGGAC	3‘	SEQ ID č. 3
vynález	5‘	TCTAGACACCATGGAC	3‘	SEQ ID č. 4

V Cantwellově konstrukci T nahrazuje C, zatímco v konstrukci podle vynálezu se C zachovává; sekvence promotoru IPNS přilehlá ATG start kodónu přesně odpovídá v přírodě se vyskytujícímu genu. Je možné, že promotor známý v dřívějším stavu techniky, který se odlišuje pouze jedinou nukleotidovou bází, může vést k nižší účinnosti translace a tím i k nižší úrovni exprese expandázového genu.

Další rozdíly existují v oblasti promotoru nebo genu používaných pro konstrukce. Cantwellova konstrukce obsahuje 5‘BamHI - Xbal 3‘ oblasti promotoru IPNS, zatímco vektor podle vynálezu obsahuje 5’NcoI-NcoI 3‘ oblasti promotoru (Diez a kol., (1990), J. Biol.Chem. 265, 1635816365). To dává cca 250 bps dalších na 5‘ konci promotoru IPNS v Cantwellově konstrukci.

Cantwellova konstrukce také obsahuje gen Streptomyces od ATG k BamHI 3‘ místu genu, zatímco vektor podle vynálezu obsahuje ATG až SalL R‘ místu genu (Kovacevic a kol. (1989), J.Bacteriol., 171, 754-760). To dává cca 1000 bps dalších na 3‘ konci sekvence Cantwellovy konstrukce. Konstrukce podle vynálezu stále obsahuje proti směru oblast genu expandázy na BamHI místě 5’ATG; separuje se z čtecího rámce expandázy promotorem IPNS.

Další rozdíl v konstrukci podle vynálezu oproti tomu, co bylo popsáno v dosavadním stavu techniky se týká volitelného markéru, který se užívá. Využití promotoru IPNS Penicillia: fuze genu fleomycinu v konstrukci podle vynálezu má tendenci provést výběr pro integraci mnohonásobných kopií nebo integraci v místech, která umožňují vysokou úroveň exprese, a tak by i měly dávat vyšší procento transformantů, které provádějí expresi genu expandázy na vysoké úrovni.

Nový transformant popsaného typuje Penicillium chrysogenum identifikované jako PC 100. Jeho taxonomické význaky zahrnují typickou produkci široce rozvinutých kolonií, modrozelených až zelených, sametových se žlutými tečkami; hlavičky konidií jsou rozvětvené, konidia mají eliptický tvar o délce 3-4 mm. Vhodné podmínky pro kultivaci Penicillium chrysogenum užívají tuhého média s obsahem laktózy, monohydrátu 1,5 %, kukuřičný extrakt 0,5 %, pepton 0,5 %, NaCl 0,4 %, MgSO₄-7H₂O, 0,05 %; KH₂PO₄, 0,06 %; FeCl₃-6H₂O, 0,0005 %; CuSO₄-5H₂O, 0,0002 %; agar 3,0 % v jednom litru destilované vody o pH 4,8. Penicillium chrysogenum takto popsané a označené PC100 bylo uloženo v Američan Type Culture Collection (ATCC), 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852 pod vstupním číslem ATCC 74182 (data depositu: došlo 21.8.1992 a životnost potvrzena 27.8.1992).

-14CZ 287357 B6

Odštěpení postranního adipoylového řetězce

Dalším stupněm v novém bioprocesu podle vynálezu je odštěpení adipoylového postranního řetězce z adipoyl-7-ADCA, což vyžaduje, aby se na produkt z předešlého stupně působilo systémem adipoylacylázy. Jak jsme již poznamenali, jedním z významných úspěchů vynálezu je schopnost provádět veškeré stupně vedoucí k vytvoření adipoyl-7-ADCA v jedné fermentační kultuře. Tato schopnost zdokonaluje zcela výjimečně účinnost procesu, jelikož není třeba izolovat a částečně čistit meziprodukty z jednoho stupně před započetím stupně druhého.

V tomto posledním stupni není systém adipoylacylázy přítomen, tj. nebyl vytvořen in šitu v originální fermentační kultuře.

V novém bioprocesu podle vynálezu prováděném vsádkovým způsobem bude nutné izolovat a částečně i čistit produkt z prvního stupně, přičemž tyto postupy již byly výše popsány.

Proces podle vynálezu může být prováděn jakýmkoli způsobem, který uvede efektivně adipoylacylázu do spojení s adipoyl-7-ADCA tak, že nastane enzymatická konverze této sloučeniny na 7-ADCA. To je definice termínu „spojení“ v jeho nejširším významu. Je možno využít bezbuněčný extrakt surové adipoyl-7-ADCA jako vstupní tok a vsádkovým způsobem působit surovou adipoylacylázou. Tento přístup je někdy dosti účinný, protože nevyžaduje vyčištění reaktantů. Samozřejmě jsou možné některé modifikace. Např. reaktanty mohou být vyčištěny do žádoucí míry předtím, než se dostanou do spojení. Bylo by také možné provádět proces kontinuálním způsobem spíše než vsádkovým. Spojení reaktantů může být různě modifikováno podle postupu příslušné technologie. Např. může být použit imobilizovaný enzym ve formě kolony obsahující adipoylacylázu a adipoyl-7-ADCA bude touto kolonou procházet. Imobilizovaný enzym lze rovněž přidávat do roztoku adipoyl-7-ADCA jako suspensi. Tyto systémy s imobilizovanými enzymy poskytují výhody v tom, že je možno znovu získat enzym a mnohokrát jej použít. Další příklad takové technologie dává membránový reaktor. Dává se ovšem přednost systému kolony s imobilizovaným enzymem.

Enzymy adipoylacylázy užitečné pro stupeň odštěpení

Existuje řada enzymů, jejichž specifíta vůči postranním adipoylovým řetězcům je známa. Výsledky dosažené s komerčně dostupnou adipoylacylázou od firmy RAEV Corp. jsou detailně popsány v příkladech. Sedm jiných enzymů je popsáno v literatuře s tím, že odstraňují postranní adipoylový řetězec z molekul cefalosporinového typu. Šest z těchto enzymů je odvozeno zPseudomonas species a sedmý z Bacillus species. Mezi určitými enzymy odvozenými z Pseudomonas existují jisté podobnosti, ale všech sedm se liší určitou měrou svými fyzickými/biologickými vlastnostmi. Některé z těchto charakteristik uvádíme níže:

ENZYM (kmeny Pseudomonas a Bacillus)	REFERENCE	APPROX. MOLEKULOVÁ HMOTNOST (podjednotka)
P. SY-77-1	Shibuya a kol.	pravděpodobně stejné
(Toyo Jozo)	(1981)	jako GK 16 dole
P. GK16	Matsuda, Komatsu	16,000
(Asahi)	(1985)	54,000
P. SE83 (acyl)	Matsuda a kol.	38,200
(Asahi)	(1987)	19,900

-15CZ 287357 B6

P. SE83 (acyll)	Matsuda a kol.	25,400
(Asahi)	(1987)	58,200
P. diminutaN176	Aramori a kol.	58,000
(Fujisawa)	(1991a)+	26,000
P.diminuta V22	Aramori a kol.	?
(Fujisawa)	(1991a)+	?
Bacillus laterosporus JI	Aramori a kol.	70,000
	(1991b)++	(monomemí)
Pseudomonas sp.		16,000
(RAEV Corp.)		54,000

+ Aramori a kol., J.Ferment. Bioeng. (1991) 72: 232-243 -H-Aramori a kol., J. Bacteriol. (1991) 173: 7848-7855

Všechny výše uvedené adipoylacylázy jsou užitečné pro nový bioproces podle vynálezu. Další adipoylacylázy, které by mohly být v tomto novém procesu využity, mohou být ještě objeveny testováním v úvahu přicházejících enzymů, pokud jde o jejich aktivitu vůči adipoyl-7-ADCA, což je substrát, na kterém musí působit. Positivní výsledek dává spolehlivou a reprodukovatelnou metodu, jak určit, zda v úvahu přicházející enzym je vhodný pro metodu podle vynálezu. Substrát je možno připravit přímo z reakce adipového anhydridu s 7-ADCA za využití modifikace postupu popsaného Szewczukem a Wellman-Bednawskou v Clin.Chim. Acta (1978) 84, 1926. Adipový anhydrid lze připravit podle metody Albertsona a Lundmarka popsané v J.Macromol.Sci. Chem. (1990) A27, 397-412. 7-ADCA je možno získat z různých komerčních zdrojů, včetně E.R. Squibb and Sons, Ltd., NJ a Interchem Corp., NJ.

Jestliže je zapotřebí provést hrubý výběr v úvahu přicházejících enzymů za použití rychlé kolorimetrické metody, můžeme substituovat adipoyl-7-ADCA substrát kolorimetrickým substrátem jako je adipoyl-PABA (paraaminobenzoová kyselina) nebo adipoyl-PNA (paranitroanilin). Odštěpení postranního řetězce vede k barevné species, jejíž přítomnost a koncentrace lze snadno určit kolorimetrem. Detailní informace týkající se této metody i jiných kolorimetrických metod viz Marelli, L.P. (1968) J. Pharm.Sci, 57: 2172-2173; Szasz, G. (1989) Clin-Chem. 15 124-136; Szewczuk, A. a kol. (1980) Anal. Biochem. 103: 166-169; Reyes, F. a kol. (1989) J.Pharm.Pharmacol. 41: 136-137.

Bylo provedeno srovnání N-terminálu aminokyselinových sekvencí RAEV enzymu s velkými podjednotkami acyll a GK 16 enzymů, jak je uvedeno níže. Výsledky srovnání jsou viditelné (závorky označují méně přesvědčivé přenosy):

RAEV - SEQ ID č. 5

SN (S) (G) AV APGKTANGNAL (L) LQN (P)

GK16 - SEQ ID č. 6

SN S W AVAPGKTANGNAL L LQN P acyll - SEQ ID č. 7

SN N W AVAPGRTATGRPI L AGD P

Z těchto sekvencí je zřejmé, že všechny tři peptidy jsou příbuzné. Přesto však protein s Nterminálovou sekvencí podobnou výše uvedeným nemusí nutně vykazovat adipoylacylázovou aktivitu, jak je tomu v případě penicilín G acylázy produkované kmenem Arthrobacter. Na druhé

-16CZ 287357 B6 straně existují adipoylacylázy, které se dají použít v metodě podle vynálezu, které nejsou příliš podobné N-terminálové sekvenci. Např. Asahi enzym acyl a Fujisawa B. laterosporus JI acyláza uvedená výše, která vykazuje určitou aktivitu adipoyl-7-ACA acylázy, nemá žádnou stejnou sekvenci s výše uvedenými enzymy. Z toho vyplývá, že rozsah tohoto vynálezu s ohledem na adipoylacylázy použitelné v druhém stupni nového bioprocesu jsou určeny tím, zda jsou či nejsou schopny odštěpit adipoylový postranní řetězec z adipoyl-7-ADCA, což může být určeno rychle a spolehlivě, jak se výše uvádí.

Jsou ještě možné další přístupy, jak nalézt vhodné adipoylacylázy. Např. EPA-A-0 453 048 popisuje metody zdokonalení adipoylové odštěpné aktivity glutarylacylázy odvozené z Pseudomonas SY-77-1. Substitucí různých aminokyselin na určitých pozicích uvnitř alfa podjednotky se dosáhne tří až pětinásobně vyšší míiy odštěpení adipoylu (z adipoyl-serinu). Takové zdokonalené enzymy by tedy byly vhodné pro použití i v procesu podle tohoto vynálezu. Je třeba poznamenat, že ačkoli EP-A-0 453 048 zřejmě popisuje acylázu se zdokonalenou aktivitou vůči postrannímu adipoylovému řetězci, nepopisuje žádný způsob (ani chemický, ani bioproces jakkoli analogický s procesem popsaným v této specifikaci), podle kterého může vzniknout přímo adipoyl-cefalosporin.

Popis výhodných uspořádání

Následuje podrobný popis určitých výhodných uspořádání podle vynálezu, která jsou však uváděna pouze jako příklad a nikterak neomezují rozsah vynálezu.

Příklad 1

Podmínky kultivace Penicillium chrysogenum

Kmen Penicillium chrysogenum užívaný v těchto postupech byl kultivován na deskách obsahujících LCSB médium skládající se z laktózy 1,5 % (m/V); kukuřičného extraktu 0,5 % (V/V); peptonu 0,5 % (m/V); NaCl 0,4 % (m/V); MgSO₄.7 H₂O, 0/05 % (m/V) KH₂PO₄ 0,06 % (m/V); FeCl₃.6H₂O, 0,0005 % (m/V); CuSO₄.5H₂O 0,0002 % (m/V); agaru 3,0 % (m/V); v jednom litru destilované vody pH 4,8. Po 12 dnech při 25 °C a 65 % relativní vlhkosti byly vyňaty jednotlivé kolonie a přidalo se 2 ml sterilizované vody do zašroubované nádoby s obsahem skleněných kuliček. Po maceraci kultury mícháním se suspense použije k naočkování rýže v baňkách o obsahu 250 ml a 25 g Uncle Ben‘s konvertované naturální dlouhozmné rýže; rýže se předtím promyla třemi až čtyřmi objemy destilované vody po dobu 7 minut, mixovala se každých 30 sekund a poté se usušila až do doby, kdy obsah vody v rýži činil cca 25 %. Po 12 dnech při 25 °C a 65 % vlhkosti se spory vymyly z rýže 50 ml sterilní vody. Suspense spor se použila k naočkování tekutých kultur a k vytvoření lyofilů kultur, které byly skladovány při 4 °C. Spory se přidaly do stejného objemu 5 % odstředěného mléka a lyofilizovaly ve sterilních zkumavkách.

Dvoustupňová fermentace kmene v třepačkách se použila pro přípravu penicilinů nebo pro produkci mycelia jakožto zdroje RNA nebo DNA. První stadium bylo iniciováno přidáním 1 x 10⁸ spor do 50 ml/500 ml baňky s médiem složeným z glukózy 3,0 % (m/V); pharmamédia 1,0 % (m/V); kukuřičného extraktu 3,0 % (V/V), síranu amonného 0,2 % (m/V), CaCO₃ 0,5 % (m/V); dehydrogenfosforečnanu draselného 0,05 % (m/V); laktózy 1,0 % (m/V), suchého droždí 1,0 % (m/V) v jednom litru destilované vody. Inkubace byla provedena při 25 °C a 65 % relativní vlhkosti v třepačce o průměru 70 mm a amplitudě 220 ot/min. Po 48 hodinách inkubace byl iniciován produkční stupeň přenesením 2 ml vegetativního „semene“ do baňky o obsahu 500 ml s 35 ml média o tomto složení: KH₂PO₄ 0,05 % (m/V); K₂SO₄ 0,5 % (m/V); (NH₄)₂SO₄ 1,0 % (m/V); laktózy 12,0% (m/V), pharmamédia 2,75% (m/V); CaCO₃ (vysrážený) 1,0% (m/V), oleje 1,0% (V/V) v jednom litru destilované vody o pH6,6. Následuje zahřátí v autoklávu

-17CZ 287357 B6 a před naočkováním se přidá sterilní 25 % adipát sodný (pH 6,6) tak, že konečná koncentrace adipátu sodného je 2,5 %. Po inkubaci následuje naočkování a poté se pokračuje za stejných podmínek jako u prvního stupně po dobu 5 až 7 dnů.

Jestliže je zapotřebí připravit mycelia pro protoplasty za účelem transformace nebo jako zdroj DNA, kmen byl pěstován v 5250 ml baňce s 50 ml kompletního média (CM) složeného takto: 50 ml 20X Clutterbuck‘s solí (120 g Na₂NO₃, 10,4 g KCI, 10,4 g MgSO₄.7H₂O, 30,4 g KH₂PO₄), 2,0 ml Vogelových Trace Elements (3 M kyseliny citrónové, 0,2 M ZnSO₄, 25 mM Fe(NH₄)₂(SO₄). 2,6 H₂O, 10 mM CuSO₄, 3 mM MnSO₄, 8 mM kyseliny borité, 2 mM Na₂MoO₄.2 H₂O), 5 g tryptonu, 5 g extraktu droždí; 10 g glukózy v jednom litru destilované vody. Inkubace se prováděla při 25 °C v třepačce za 220 ot/min.

Příklad 2

Izolace genomové DNA a totální RNA z Penicillia

Vegetativní myceliální růst kultury po dobu 48 hodin byl připraven jak výše popsáno a zfiltrován přes fáčovinu, zmrazen v tekutém dusíku a přes noc lyofílizován. Vysušená mycelia byla spolu s pískem v misce rozmělněna, utlučena a resuspendována v 25 ml 100 mM LiCl, 50 mM EDTA, 10 mM Tris pH 8,0, 4 % SDS. Po ohřevu suspense na 50-55 °C v 60 °C vodní lázni se směs extrahuje nejprve 1 M Tris (pH 8) nasyceným fenolem, poté Tris - saturovaný fenohchloroform (1:1, ,V:V) a naposled chloroformem. RNA se vysráží z vodní fáze přidáním stejného objemu studeného 6 M LiCl, poté se nechá směs stát při -20 °C po dobu dvou nebo tří hodin. Po odstředění při 12 000 g po dobu 20 minut při 4 °C, byl supematant smíchán s 66 % (V/V) ethanolem a ochlazen na -20 °C po dobu 15 minut za účelem vysrážení DNA. Po odstředění, jak je výše popsáno, se DNA pelety promyly 70 % ethanolem, vysušily a resuspendovaly v TU pufru (10 mM Tris-HCl, pH7,5, 1 mM EDTA). Koncentrace DNA byla odhadnuta srovnáním se známými DNA standardy obarvením ethidiumbromidem elektroforézou v agarozovém gelu.

Kultury Penicillium chrysogenum jak výše popsáno v příkladu 1 rostly 96 hodin v 35 ml fermentačního média (viz výše popsané fermentační podmínky) při 25 °C v třepačce při 220 ot/min. Mycelia byla oddělena filtrací Whatman #1 filtrem ve vakuu a promyta asi 50 ml vody. Mycelia byl okamžitě shrnuta z filtru, resuspendována v 5 ml pufru (50 mM Tris-HCl pH 7,4, 150 mM NaCl, 5 mM EDTA pH 8,0; 5 % SDS), zmrazená v tekutém dusíku a lyofilizována. Po lyofilizací přes noc se přidá 5 ml vody obsahující 0,1 % DEPC a 5 ml 1 M Tris (pH 8) nasyceného fenol:chloroform:isoamyl alkohol (50:50:1) a směs se pak nechala roztát při 37 °C po dobu 20 minut za třepání. Směs se poté odstřeďovala při 12 000 g po dobu 10 minut při 4 °C a vodná vrstva se odstranila a reextrahovala se nejprve 1 M Tris (pH 8) nasyceným fenokchloroform:isoamyl alkohol (50:50:1) a poté 1 M Tris (pH 8) nasyceným fenolem a naposled chloroformem. Stejný objem 6 M LiCl byl kombinován s konečnou vodnou vrstvou a roztok se nechal ustát při -20 °C nejméně po dobu čtyř hodin. Celková RNA byla peletována při 12 000 g po dobu 20 minut při 4 °C, pelety byly rozpuštěny v 0,3 ml TE pufru plus 0,03 ml acetátu sodného a poté se přidaly 2,5 objemy ethanolu za účelem vysrážení RNA. Výsledné pelety byly rozpuštěny v 0,1 ml TE pufru a koncentrace RNA byla určena spektrofotometricky za absorbance 260 nm.

Příklad 3

Kultivační podmínky pro Streptomyces clavuligerus

Kmen Streptomyces clavuligerus používaný v těchto pochodech byl ATCC 27064. Kmen byl pěstován na deskách sestávajících z drožďového extraktu 4 g; maltosového extraktu 10 g; glukózy 4 g; agaru 20 g; v jednom litru destilované vody při pH 7,2. Po pěti dnech růstu při

-18CZ 287357 B6 teplotě 30 °C se přidá 2 ml sterilované vody a kultura se shrne z povrchu agaru. Výsledná suspenze se přenese do sterilní zkumavky se skleněnými kuličkami a šroubovým uzávěrem. Po maceraci kultury mícháním se suspenze použila k naočkování tekutých kultur. Suspenze se tedy používala pro stálé skladování kultur při -70 °C přidáním glycerolu k 15% výslednému objemu.

Když bylo zapotřebí mycelií pro tvorbu protoplastů k transformaci nebo jako zdroj DNA, 200 mg suspenze kmene rostlo v 1 litrové baňce YEME média složeného takto: drožďový extrakt 3 g; pepton 5 g; maltosový extrakt 3 g; glukóza 10 g; sacharóza 340 g; MgCl₂.6H₂O 1,02 g; glycin 5 g; agar 18 g; v jednom litru destilované vody. Inkubace byla prováděna při 28 °C v třepačce za 220 ot/min.

Příklad 4

Izolace genomové DNA Streptomyces

Vegetativní růst kultury, která rostla po dobu 48 hodin připravená jak výše popsáno, byl shrnut a odstřeďován při 22 100 g po dobu 10 minut. Buňky byly resuspendovány v 10 ml TE pufru a 10 mg lysozymu se přidalo; poté se směs inkubovala při teplotě 30 °C po dobu 15 minut. Přidá se 1 ml 20 % SDS, ihned poté pak 10 ml TE (pH 8) saturovaného fenolu a 1,5 ml 5 M NaCl, směs se mírně míchá po 20 minut. Poté se separovaly fáze při 12 000 g po dobu 10 minut a pak se vodná vrstva odstranila a přenesla do nové zkumavky. Stejný objem chloroformu se přidá a směs se dále míchá po dobu 10 minut. Poté se opět separovaly fáze odstředěním při 12 000 g po dobu 10 minut a vodná vrstva se oddělila a znovu přenesla do nové zkumavky. Opatrně se přidají dva objemy isopropanolu a vysrážená DNA se navine a znovu se rozpustí v minimálním objemu TE pufru. RNAza A se přidá k výsledné koncentraci 20 mg/ml a roztok se inkubuje při 5 °C po dobu jedné hodiny. Proteáza K se přidá k výsledné koncentraci 100 mg/ml spolu s 100 mM NaCl a 0,4 % SDS a směs se inkubuje při 37 °C po dobu jedné hodiny. Pak se znovu extrahuje roztok stejným objemem TE (pH 8) nasyceného fenolu, po čemž následuje další extrakce chloroformem. DNA z konečné extrakce se navine po přidání dvou objemů isopropanolu a koncentrace se určí spektrofotometricky při absorbanci 260 nm.

Příklad 5

Vytvoření sbírky genu a izolace fragmentu DNA obsahujícího gen expandázy Streptomyces clavuligerus

Genomová DNA ze Streptomyces clavuligerus získaná podle postupu výše uvedeného byla podrobena působení restrikčních enzymů Bam HI a Sal I. Takto upravená DNA prošla elektroforézou na 0,8 % agarózovém gelu a fragmenty 1,8 až 2,2 kb byly eluovány a napojeny na pUC18 DNA, na kterou se předem působilo Bam HI a Sal I. Zředění této směsi se použilo k transformaci JM 109 buněk elektroporací (Gene Pulser, Bio-Rad, Richmond, Ca). Příprava odpovídajících buněk a podmínky elektroporace byly prováděny podle doporučení výrobce. Transformační směs se přenesla na LB desky obsahující 100 mg/ml ampicilinu, 75 ml 2% G-Gal. Inkubace se prováděla přes noc při 37 °C, rekombinantní kolonie se identifikovaly jejich bezbarvým výskytem v důsledku inaktivace genové aktivity plazmidového vektoru beta-galaktosidázy. Bezbarvé kolonie byly přeneseny na novou LB desku obsahující 100 mg/ml ampicilinu. Kolonie rostly přes noc při teplotě 37 °C, poté se přenesly na nitrocelulózu a hybridizovaly se vzorkem získaným reakcí polymerázového řetězce, jak odpovídá publikované sekvenci genu expandázy získané ze Streptomyces clavuligerus z bází 52-918 (Kovacevic a kol. (1989) J. Bacteriol. 171; 754-760 a US patent 5.070.020). Značení produktu reakce polymerázového řetězce bylo doplněno reakcí rozšíření s (³²P) dCTP a Olligolabelling Kit podle instrukcí výrobce (Pharmacia,

-19CZ 287357 B6

Piscataway, New Jersey). Hybridizační reakce byla provedena za přítomnosti 10⁶ CPM radioaktivně značeného vzorku, 30 % formamidu, 5X SSC (0,15 M NaCl, 0,015 M citrátu sodného pH 7), 0,1 % SDS, 5X Denhardťs (5 g ficoll, 5 g polyvinylpyrolidin a 5 g BSA pro 500 ml 50X látky) a 100 mg/ml DNA z telecího brzlíku přes noc za teploty 37 °C. Četné transformanty silně hybridizovaly k vzorku. Bylo potvrzeno, že jedna kolonie obsahuje vektor nesoucí gen expandázy a tento plazmid byl označen pFTSO-1.

Příklad 6

Izolace plazmidové DNA

Kultury Escherichia coli obsahující plazmid rostly v 500 ml LB roztoku (20 g/1 LB Broth Base (Gibco, Paisley, Scotland)) s 15 mg/ml tetracyklinu v třepačce při 220 ot./min, po 12 -16 hodin při 37 °C. Buňky byly peletovány odstředěním při 4000 g po dobu deseti minut při 4 °C. Buněčný pelet byl resuspendován v 18 ml glukózového pufru (50 ml glukózy, 25 mM Tris pH 8,0, 10 mM EDTA) a 2 ml 40 mg/ml lysozomu (Sigma, St.Louis, MO) bylo přidáno do glukózového pufru, mícháno a směs byla inkubována při laboratorní teplotě po 15 minut. 40 ml čerstvě připraveného roztoku 0,2N NaOH, 1 % SDS se přidá a směsí se mírně míchá a poté umístí na led po dobu 10 minut. Třicet ml 5M acetátu draselného o pH4,8 se přidá, dobře promíchá a výsledná směs se umístí na led po dalších 10 minut. Buněčná tkáň se peletuje odstředěním při 4000 g po dobu 10 minut při 4 °C a výsledný supematant se zfiltruje přes fáčovinu. Přidá se isopropanol (0,6 objemu) k vyčištěnému supematantu, aby se vysrážela plazmidová DNA a sraženina se vytvoří během inkubace při laboratorní teplotě za 20 minut. Plazmidová DNA peletuje při 4000 g po dobu 20 minut při 4 °C a poté se promyje 70 % ethanolem a krátce vysuší. Pelety se resuspendují v 9 ml TE pufru, poté se přidá 10 g CsCl a 0,387 ml 10 mg/ml roztoku ethidium bromidu. Tento roztok se odstředil při 313 100 g po dobu 24 hodin. Výsledný plazmid v gradientu chloridu cesia byl zviditelněn ultrafialovým světlem, izolován, poté byl odstraněn ethidium bromid extrakcí nasyceným butanolem. CsCl v plazmidu byl odstraněn dialýzou proti TE pufru a nakonec byla za použití PEG (MW 8000) zkoncentrována DNA. Koncentrace DNA byla zjištěna spektrofotometricky při absorbanci 260 nm.

Příklad 7

Konstrukce transformačního vektoru pPenFTSO Penicillia

Transformační vektor Penicillia byl zkonstruován s rezistentním genem phleomycinu jako dominantním volitelným markérem. Nejprve se izoloval fragment 660 bp obsahující rezistentní gen phleomycinu (phleomycin s vazbou genu proteinu ze Streptoallteichus hindustanus) a napojil se terminátor Cl cytochromu kvasinek z Bam HI/ Bgl II plazmidu pUT713 (CAYLA, Toulouse Cedex, France) elektroforézou a eluci z agarozového gelu. Izolovaný fragment byl vpraven na místo Bam HI vektoru pSELECT⁺ 1 (Promega Corporation) a orientace genu byla určena restriktivní enzymovou analýzou. Dále byl vložen 5.50 bp Pst I fragment obsahující lambda cos místo, což umožňuje, aby byl vektor použit pro vytvoření kosmidu, jsou-li přítomny složky o vhodné velikosti. Poté byl izolován 1,5 kb Nco Ι/Bam HI fragment obsahující oblast promotoru (IPNS) genu isopenicilin N syntetázy penicillium chrysogenum (elektroforézou a eluci z agarozového gelu) zNcoI/BamHI genomického klonu obsahujícího gen IPNS. Izolovaný fragment IPNS promotor byl napojen na Bam HI/Nco I vektor. Nco I místo je na ATG start kodónu rezistentního genu phleomycinu. Tento vektor se označuje pUTZ-2.

1,645 kb fragment obsahující gen expandázy Streptomyces clavuligerus byl vyčištěn z výluhu Bam HI a Sal I pFTSO-1 (výše popsaný vektor) elektroforézou a eluci z 0,8 % agarozového gelu. Izolovaný fragment byl vpraven do vektoru pSELECT (Promega Corporation) rovněž

-20CZ 287357 B6 vyluhovaného Bam HI a Sal I. Tento vektor byl označen pFTSO-8. Nové místo Nco I bylo vytvořeno na start kodónu genu expandázy mutagenezí pFTSO-8 orientovanou na místo za využití Altered Sites⁺ in vitro Mutagenesis Systém (Promega Corporation). Mutagenese se prováděla podle instrukcí výrobce. Byl zkonstruován nukleotid pro doplnění kódovací sekvence DNA oblasti na ATF start kodónu z publikované sekvence genu expandázy ze Streptomyces (Kovacevic et al. (1990) Joumal of Bacteriology, 171, p. 3952-3958). Oligonukleotid byl vytvořen kyanoethylfosforamiditinovou syntézou (Pharmacia Gene Assembler Instrumentation) a oligo sekvence byla následovná:

SEQ. ID č. 8

3‘ CGAGAGGATCAGTGAGAGTCCATGGACACGACGG 5‘

Mutageneze byla potvrzena restrikční enzymovou analýzou. Fragment Ncol 1,2 kb obsahující oblast promotoru Penicillium chrysogenum genu isopenicilin N syntetázy, byl izolován (elektroforézou a elucí z agarozového gelu) z Nco I výluhu genomového klonu obsahujícího 1PNS gen. Oblast IPNS promotoru byla napojena na pFTSO-8 vektor nového místa Nco I vytvořeného mutagenezí na STG start kodónu genu expandázy. Orientace na promotor enpandázového genu byla provedena restrikční enzymovou analýzou. Tento celek IPNSpromotor : gen expandázy byl pak odstraněn jako Bam ΗΙ/Sal I fragment v Bam ΗΙ/Sal I transformačním vektoru Penicillia pUTZ-2 popsaného výše. Výsledná konstrukce byla označena pPenFTSO.

Příklad 8

Klonování beta-tubulin promotoru Penicillia

Beta-tubulin gen Penicillia byl klonován z Penicillium lambda genomové sbírky za využití betatubulin genu Asperqillus niger jako hybridizačního vzorku. Sekvence tohoto klonu a srovnání se známými aminokyselinovými sekvencemi beta-tubulin genu Aspergillus niger identifikovalo oblast 91 % homologie počínaje s ATG iniciačním kodónem. Sekvence obsahující funkční promotor byly izolovány mezi iniciačním kodónem a Bam HI místem 1,4 kb směrem vzhůru.

Konstrukce transformačního vektoru zahrnujícího beta-tubulin promotor Penicillia

Fragment Xba I/Hind III 2.0 kb obsahující beta-tubulin promotor Penicillia byl napojen na vektor pSELECT (Promega Corporation) vyluhovaný Xbal/Hind III. Bylo vytvořené nové místo Nco I na ATG start kodónu mutagenezí orientovanou na místo za využití Altered Sites in Vitro Mutagenesis Systém (Promega Corporation). Mutageneze byla prováděna podle instrukcí výrobce. Byl zkonstruován oligonukleotid pro doplnění oblasti ATG start místa a byl využit pro mutagenezí. Oligonukleotid byl vytvořen kyanoethylfosforamiditinovou syntézou (Pharmacia Gene Assembler Instrumentation) a oligo sekvence byla následovná:

SEQ. ID č. 9

5‘ ATCTCTTTTCTAATACCTTCACCATGGGTGAGATTGTACGTGATCCC 3‘.

Mutageneze byla potvrzena restrikční enzymovou analýzou. Fragment BamHI/NcoI 1,4 kb obsahující beta-tubulin promotor Penicillia byl napojen na zkonstruované Nco I místo na ATG genu expandázy Streptomyces v Bam HI/Nco I vektoru pFTSO-8 (vektor výše popsaný v příkladu 7). Tento vektor byl označen btFTSO-8. Fragment Bam HI/Nco I 1.4 kb obsahující beta tubulin promotor byl rovněž vpraven do Bam HI/Nco I vektoru pUTZ-2 (vektor výše popsaný v příkladu 7). Toto napojení umístilo beta-tubulin promotor přímo před rezistentní gen

-21CZ 287357 B6 phleomycinu. Tento vektor byl označen pCI-6. Fragment Bam HI/Hind III 2,4 kb z vektoru btFTSO-8, který obsahoval celek beta-tubulin promotor: gen expandázy byl napojen na Bam HI/Hind II vektor pCl-6 tak, aby výsledkem byl nakonec transformační vektor Penicillia, ve kterém gen expandázy Streptomyces a rezistentní markér phleomycinu byly exprimovány z beta-tubulin promotoru. Tento vektor byl označen pTS-2.

Příklad 9

Klonování (GAP) promotoru Penicillia

Gen glyceraldehyd-3-fosfátdehydrogenázy (GAP) Penicillia byl klonován z Penicillium lambda genomové sbírky za využití GAP genu z Aspergillus niger jako hybridizačního vzorku. Dále byly ještě zkoušeny tři potenciální látky s PRC produktem připraveným z primerů pro 5‘ oblast GAP genu Cephalosporium (Kimura, H. a kol. (1991), J. Ferm. and Bioeng. 71, 145-150). Oligonukleotidy užité pro primery polymerázové řetězové reakce (PCR) byly vytvořeny kyanoethylfosforamiditinovou syntézou (Pharmacia Gene Assembler Instrumentation) a oligo sekvence byla následovná:

SEQ. IDč. 10

5‘ CGCGGATCCCGGCATCAACGGCTTCGGTCGTAT 3‘

SEQ. ID č. 11

5‘CGCGGATCCGGGCACGCGCATGGACATGCCAGTG 3‘

Jedna ze čtyř zkoušených látek křížově hybridizovala na produkt PRC,Fragment Bam HI 4,0 kb z tohoto genomického klonu byl napojen na Bam HI vektor pSELECT (Promega Corporation) pro sekvenování. Tento vektor byl označen pTS-0. Sekvenování tohoto fragmentu identifikovalo ATG iniciační kodón srovnáním se známou sekvencí genu GAP Cephalosporinu.

Konstrukce transformačního vektoru zahrnujícího GAP promotor Penicillia

Pro konstrukci GAP promotoru Penicillia s genem expandázy Streptomyces bylo vytvořeno nové místo Nco I na ATG GAP genu Penicillia in vitro mutagenezí orientovanou na místo za využití vektoru pTS-0. Mutageneze byla provedena podle instrukcí výrobce. Byl zkonstruován oligonukleotid pro doplnění kódovací sekvence oblasti DNA na ATG start kodónu GAP genu se změnami báze pro vytvoření Nco I místa. Oligonukleotid byl připraven kyanoethylfosforamiditinovou syntézou (Pharmacia Gene Assembler Instrumentation) a oligo sekvence byla následná:

SEQ. ID č. 12:

5‘ CAGTAAACGCAACCATGGTTGTCCAG 3‘

Mutageneze byla potvrzena restrikční enzymovou analýzou. Fragment NcoI/BamHI 1,9 kb z pTS-0, který obsahoval GAP promotor, byl napojen na NcOI/Bam HI vektor pFTSO-8 (vektor výše popsaný v příkladu 7) pro umístění GAP promotoru s genem expandázy Streptomyces. Tento vektor byl označen pTS-0-1. Fragment Bam HI/Hind III 3,0 kb z vektoru pTS-0-1, který obsahoval celek GAP promotor: expandáza byl napojen na Bam HI/Hind III vektor pCl-6 (vektor výše popsaný v příkladu 8), takže výsledkem je transformační vektor pSD-1 Penicillia, ve kterém byl gen expandázy Streptomyces exprimován z GAP promotoru.

-22CZ 287357 B6

Příklad 10

Transformace Penicillium chrysogenum

Protoplasty z kmene Penicillium chrysogenum výše popsaného byly vytvořeny naočkováním 50 ml CM výluhu s 1 x 107 spor na dobu 67 hodin při 25 °C v rotační třepačce při 220 ot./min. Mycelia shromážděná filtrací přes fáčový filtr, přenesená do 500 ml baněk a resuspendovaná v 25 ml KMP (0,7 M KC1, 0,8 M mannitol, 0 02 Μ KPO4 pH 6,3) s obsahem 100 mg Novozyme 234 (Novo Biolabs, Bagsvaerd, Denmark) inkubovala při 30 °C a 100 ot/min.

Sferoplasty byly separovány filtrací přes fáčový filtr a filtr se skleněnou vatou a peletovány odstředěním při 350 g po dobu 10 minut. Sferoplasty se pak třikrát promyly 10 ml KPM pufru a poté resuspendovaly v KMPC (KMP s 50 mM CaCl₂) na koncentraci 5 x 107 buněk/ml a ponechaly stát při laboratorní teplotě 20 minut. Pro transformaci Penicillia bylo 200 ml suspense sferoplastů přidáno k DNA (5 mg vektor DNA v 6,2 ml KPMC s 5 mg/ml heparinu) spolu s 50 ml PPC (40% PEGMW3500, 20 mM KPO₄, pH6,3, 5% CaCl₂ bylo přidáno před použitím) a transformační směs inkubovala na ledu po dobu 30 minut. Jeden ml čerstvě připraveného PPC byl přidán a směs se přenesla do 50 ml roztaveného (50 °C) regeneračního agaru (CM plus 1,3 M mannitolu a 3 % agaru). Transformační směs pak byla rozdělena do 5 Petriho misek. Po regeneraci po dobu 24 hodin při 25 °C byly pak desky překryty OL (1 % peptonu v 1% agaru) obsahujícího 100mg/50ml OL phleomycinu. Množství použité pro překrytí bylo stejné jako množství regeneračního agaru. Mikroorganismy na deskách inkubovaly při teplotě 25 °C po dobu 7-14 dnů a vytvořily se generace transformačních kolonií.

Příklad 11

HPLC stanovení adipoyl-6-APA a adipoyl-7-ADCA fermentačních produktů

Byla použita vysokoúčinná kapalná chromatografie (HPLC) ke stanovení produkce adipoyl-6APA v netransformovaném kmenu Penicillium chrysogenum, který byl použit, jakož i pro stanovení adipoyl-7-ADCA produkce v použitém transformovaném kmeni Penicillium chrysogenum. Analýza byla provedena Watersovým systémem s přívodem mobilní fáze model 625, s proměnnou vlnovou délkou model 490E nastavenou na 220 nm a 254 nm, se systémem 825 Maxima data a na koloně Novo-C18 jako stacionární fázi. Eluce byla provedena v prvních pěti minutách isokraticky 2 % methanol/98 % 0,010 M KH₂PO4, pH 7,0 a dále gradientem po dobu 15 minut lineárně od 2 - 40 % methanolu na 0,010 M KH₂PO₄ pH 7,0 v mobilní fázi. Použit byl průtok 1 ml za minutu. Kvantifikace adipoyl-6-APA byla určena podle standardní křivky standardního penicilinu N při 220 nm a kvantifikace adipoyl-7-ADCA byla určena podle standardní křivky standardního deacetoxycephalosporinu C při 254 nm.

Stanovení citlivosti adipoyl-6-APA a adipoyl-7-ADCA na penicilinázu byly provedeny přidáním 1 jednotky na ml penicilinázy I nebo penicilinázy II k filtrátům a inkubováním při pokojové teplotě po dobu 10 - 30 minut. Tyto vzorky byly podrobeny identickým HPLC podmínkám jako je výše popsáno.

UV spektrální analýza adipoyl-6-APA a adipoyl-7-ADCA produktů byla provedena za použití Watersova systému s přívodem mobilní fáze model 510, s detektorem diodového pole 990, data systémem 990 a s kolonou Novo C-18 jako stacionární fází. Použitá mobilní fáze byla identická s podmínkami výše popsanými.

Širokopásmová izolace adipoyl-7-ADCA produktu od dalších fermentačních produktů byla provedena za využití Watersova systému s přívodem mobilní fáze 510, s detektorem diodového pole, data systémem 990 a dále mBondapak Cl8 preparativní kolonou jako stacionární fázi.

-23CZ 287357 B6

Mobilní fáze (při 5 ml za min. průtoku) byla provedena isokraticky po dobu 15 minut 0,010 M KH2PO4 pH 7,0. Frakce odpovídající retenční době adipoyl-7-ADCA byla zachycena za využití děliče frakcí.

Příklad 12

Stanovení bioaktivity

Ke stanovení antibiotické aktivity produktů fermentace získaných vysokoúčinnou kapalinovou chromatografií adipoyl-6-APA a adipoyl-7-ADCA byl použit biovzorek na agaru. 20 ml izolovaného produktu bylo aplikováno na 5 mm disky na LB agarové desce (20 g/1 LB Broth Base s 3 % agarem (Gibco, Paisley, Scotland)) s Bacillus subtilus ATCC 33677 nebo Escherichia coli Super Sensitive (dodávaný Prof. Arnold L. Demain, MIT). Bacillus subtilus byl použit jako indikační kmen ke stanovení adipoyl-6-APA produktu a Escherichia coli Super Sensitive byl použit jako indikační kmen ke stanovení adipoyl-7-ADCA produktu. Po 15 hodinách inkubace při 37 °C kolečko inhibovaného růstu indikační bakterie okolo disku prokázalo, že produkty jsou bioaktivní. Rovněž byly provedeny kontrolní experimenty s deacetoxycefalosporinem C, cefalosporinem C, penicilinem V a agarem obsahujícím penicilinázu nebo bez penicilinázy jakožto kontrola beta-lactam struktur.

Příklad 13

Stanovení enzymu RAEV

Vyčištěný produkt adipoyl-7-ADCA z fermentace byl použit jako substrát pro stanovení specifické aktivity enzymu RAEV (komerčně dostupný od firmy RAEV Corp.). Reakční směs obsahovala 10 M substrátu, 1 mg RAEV enzymu, 5 % glycerolu v 0,16 Μ KH2PO4 v celkovém objemu 50 ml a inkubovala při 37 °C. 5 ml směsi bylo odebráno v časových rozmezích 0, 1,3, 5, 10, 20 a 30 minut, rozředěno 35 ml 0,010 Μ KH2PO4 pH3,5 a zchlazeno na -70 °C před analýzou HPLC za podmínek popsaných výše.

Aktivita enzymu RAEV vůči kolorimetrickému substrátu adipoyl-P-aminobenzoové kyseliny byla stanovena za použití 5 mM substrátu, 8,25 mg enzymu, 10 % glycerolu, v 0,065 M KH₂PO₄ pH 7,0 v celkovém objemu 50 ml po dobu 30 minut při 37 °C. Reakce byla provedena v mikrotitrové nádobě. 50 ml 1/100 zředěného 1 M NaNO₂ v 0,25 M kyseliny octové bylo přidáno k ukončení reakce a reakční směs se ponechala stát při laboratorní teplotě po dobu 3 minut. 100 ml lOOx zředěného roztoku hydrátu monosodné soli 4-amino-5-hydroxy-2,7naftalendisulfonové kyseliny v 0,5 M NaHCOj bylo přidáno a vznik zbarvení byl bezprostředně zaznamenán při 515 nm spektrofotometrem EL 312 Bio-kinetics Plate Reader (BioTek Instruments).

Příklad 14

HPLC stanovení reakčního produktu enzymu RAEV

Všechna stanovení RAEV enzymu (komerčně dostupného od RAEV Corp.) s využitím adipoyl7-ADCA jako substrátu byla monitorována HPLC za použití Watersova systému s přívodem mobilní fáze model 625, s proměnnou vlnovou délkou nastavenou na 203 nm a 254 nm, se systémem Maxima data 825 a s kolonou Novo-C18 jako stacionární fází. Eluce byla provedena v prvních pěti minutách isokraticky 2 % methanol/98 % 0,010 Μ KH2PO4 a dále gradientem po dobu 15 minut lineárně od 2 - 40 % na 0,010 M KH₂PO₄ pH 3,5. Standardní ADCA byla použita

-24CZ 287357 B6 pro monitorování retenční doby reakčního produktu. Kvantifikace reakčního produktu byla propočítána pomocí standardní křivky standardní 7-ADCA při 254 nm.

Příklad 15

13C-NMR analýza fermentačního produktu adipoyl-7-ADCA

13C-NMR spektrum bylo naměřeno při 75,4 MHz (7,1 T) na 1BM-AF-350 spektrometru způsobem Fourier Transform. Vzorky sestávaly z 50 mg adipoyl-7-ADCA produktu z fermentace v 0,5 ml D20 (99,8 % D, Aldrich) nebo 0,5 ml DMSO-d₆ (99,0 % D, Aldrich) v 5mm zkumavkách při 350° k. Údaje NMR potvrdily označení produktu jako adipoyl-7-ADCA.

Příklad 16

Určení alternativních enzymů adipoyl acylázy

Navíc ke studiím prováděným s RAEV enzymem bylo odštěpení adipoylového postranního řetězce z adipoyl-7-ADCA (a dalších adipoylových sloučenin) prokázáno za pomoci enzymů odvozených z celé řady mikrobiálních zdrojů. Počáteční studie kmenů Pseudomonas sp. SE-83 a SE-495 (uloženy u Fermentation Research Institute pod přijímacím číslem FERM BP-817 a FERM BP-818) a kmene Pseudomonas SY-77-1 (uloženého u Northem Regional Research Laboratory pod přijímacím číslem NNRL B-8070) rostly po dobu 72 hodin v médiu obsahujícím HyCase SF, 2,0 % (m/V); glutamát monosodný 0,5 % (m/V); drožďový extrakt 0,5 % (m/V); kukuřičný prášek 0,2 % (m/V); bavlněný olej 0,5 % (m/V) a kyselina glutarová 0,1 % (m/V). Buňky byly soustředěny odstředěním a promyty 50 mM fosfátovým pufrem pH 8,0; poté byly v pufru resuspendovány a vnější membrány se staly permeabilní po přidání malého množství chloroformu. Stejné díly buněčné suspense byly promíchány s adipoyl-para-nitroanilinem (adPNA) a inkubovány při 30 °C po 2 až 18 hodin. Po inkubaci se směsi okyselily přidáním 10 % (V/V) kyseliny octové. Uvolněný p-nitroanilin byl pak zjištěn kolorimetrickými prostředky po jeho konverzi na diazosloučeninu za využití reagencií firmy Sigma Chemical Company pro stanovení gamma-glutamyl-transferázy (produkt Sigmy číslo 545-A). Relativní aktivity třech kmenů byly 100 %, 85,5 % a 48 % pro SE—495, SE-83 a SY-77-1. Využití metod podobných metodám popsaným výše u enzymu RAEV byla rovněž prokázána aktivita SE-83 a SE-495 enzymů na adipoyl-7-ADCA. Produkce beta-laktamázy SY-77-1 zabránila stanovení deacylační aktivity tohoto kmene na adipoyl-7-ADCA.

Podobnými prostředky byla také prokázána produkce adipoyl-acylázy u dvou kmenů (Altemaria sp. MA-133, ATCCč. 20492 a Asperqillus sp. MA-13, ATCCč. 20491; ref. US 4,141,790 firmy Meiji Seika Kaisha Ltd.) a tří dalších bakteriálních kmenů (Brevibacterium ATCC č. 14,649, Achromobacterium ATCCč. 14,648 a Flavobacterium ATCCč. 14,650, které byly popsány jako produkující cephalosporin C acylázu v US 3,239,394 firmy Měrek & Co., Inc.

Seznam sekvencí (1) všeobecné informace (i) Přihlašovatel: Conder, Michael J.

McAda, Phyllis a Rambosek, John (ii) Název vynálezu: Nový bioproces pro přípravu 7-ADCA (iii) Počet sekvencí: 12 (iv) Korespondenční adresa:

-25CZ 287357 B6 (A) Adresát: Měrek & Co., lne.

(B) Ulice: 126 E. Lincoln Avenue (C) Město: Rahway (D) Země: USA (F) ZIP: 07065 (v) Forma pro počítač (A) Typ: Floppy disk (B) Počítač kompatibilní s IBM PC (C) Operační systém : PC-DOS/MS-DOS (D) Software: Patentln release * 1.0, verse # 1.25 (vi) Data přihlášky:

(A) Číslo přihlášky: US 07/757,879 (B) Datum podání: 11. září 1991 (C) Zatřídění (viii) Zástupce/agent:

(A) Jméno: Speer, Raymond M.

(B) Registrační číslo: 26,810 (C) Referenční číslo: (07/757,879) 18532 (ix) Telekomunikační spojení:

(A) Telefon: (908) 594-4481 (B) Telefax: (098) 594-4720 (2) Informace o sekvenci ID č. 1:

(1) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 14 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Struktura: dvouvláknová (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: genomová DNA (xi) Popis sekvence: sekvence ID č. 1:

TCTAGACACC ATGG (2) Informace o sekvenci ID č. 2:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 16 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Struktura: dvouvláknová (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: genomová DNA (xi) Popis sekvence: sekvence ID č. 2:

GTGAGAGTTA ATGGAC

-26CZ 287357 B6 (2) Informace o sekvenci ID č. 3;

(1) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 16 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Struktura: dvouvláknová (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: genomová DNA (xi) Popis sekvence: sekvence ID č. 3:

TCTAGACACT ATGGAC (2) Informace pro sekvenci ID č. 4:

(1) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 16 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Struktura: dvouvláknová (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: genomová DNA (xi) Popis sekvence: sekvence ID č. 4:

TCTAGACACC ATGGAC (2) Informace pro sekvenci ID č. 5:

(1) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 22 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (C) Struktura: jednovláknová (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: peptid (xi) Popis sekvence: sekvence ID č. 5:

Ser Asn Ser Gly Ala Val Ala Pro Gly Lys Thr Ala Asn Gly Asn A1A 15 10 15

Leu Leu Leu Gin Asn Pro (2) Informace pro sekvenci ID č. 6:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 22 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (C) Struktura: jednovláknová (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: peptid (xi) Popis sekvence: sekvence ID č. 6:

-27CZ 287357 B6

Ser Asn Ser Trp Ala Val Ala Pro Gly Lys Thr Ala Asb Gly Asn Ala 15 10 15

Leu Leu Leu Gin Asn Pro (2) Informace pro sekvenci ID č. 7:

(1) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 22 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (C) Struktura: jednovláknová (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: peptid (xi) Popis sekvence: sekvence ID č. 7:

Ser Asn Asn Trp Ala Val Ala Pro Gly Arg Thr Ala Thr Gly Arg Pro 15 10 15

Ile Leu Ala Gly Asp Pro (2) Informace pro sekvenci ID č. 8:

(1) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 34 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Struktura: jednovláknová (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: genomová DNA (xi) Popis sekvence: sekvence ID č. 8:

CGAGAGGATC AGTGAGAGTC CATGGACACG ACGG (2) Informace pro sekvenci ID č. 9:

(1) Charakteristiky sekvence (A) Délka: 47 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Struktura: jednovláknová (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: genomová DNA (xi) Popis sekvence: sekvence ID č. 9:

ATCTCTTTTC TAATACCTTC ACCATGGGTTG AGATTGTACG TGATCCC (2) Informace pro sekvenci ID č. 10:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 33 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Struktura: jednovláknová (D) Topologie: lineární

-28CZ 287357 B6 (ii) Typ molekuly: genomová DNA (xi) Popis sekvence: sekvence ID č. 10:

CGCGGATCCC GGCATCAACG GCTTCGGTCG TAT (2) Informace pro sekvenci ID č. 11:

(1) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 34 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Struktura: jednovláknová (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: genomová DNA (xi) Popis sekvence: sekvence ID č. 11:

CGCGGATCCG GGCACGCGCA TGGACATGCC AGTG (2) Informace pro sekvenci č. 12:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 26 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Struktura: jednovláknová (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: genomová DNA (xi) Popis sekvence: sekvence ID č. 12:

Claims (7)

1. Bioproces pro přípravu 7-aminodeacetoxycefalosporanové kyseliny (7-ADCA) enzymově katalyzovanou expanzí adipoyl-6-aminopenicilanové kyseliny (adipoyl-6-APA) na adipoyl-7ADCA a odstraněním adipoylového řetězce enzymově katalyzovanou hydrolýzou adipoyl-7ADCA, vyznačený tím, že při kultivaci transformovaného kmene Penicillium chrysogenum v médiu obsahujícím adipátový přípravek je produkována adipoyl-6-APA a kmen Penicillium chrysogenum je transformován pomocí DNA kódující expandázu využívající adipoyl-6-APA jako substrát, přičemž výsledkem exprese je produkce expandázy, jejíž enzymová aktivita katalyzuje expanzi kruhu adipoyl-6-APA na adipoyl-7-ADCA a k hydrolýze adipoyl-7-ADCA se použije adipoylacyláza.

2. Bioproces podle nároku 1, vyznačený tím, že adipátový přípravek je adipát dvoj sodný.

3. Bioproces podle nároku 1, vyznačený tím, že DNA se zakódovanou aktivitou expandázy se odvodí ze Streptomyces clavuligerus ATCC 27064.

-29CZ 287357 B6

4. Bioproces podle nároku 1, vyznačený tím, že adipoylacyláza se odvodí z Pseudomonas species.

5. Bioproces podle nároku 1, vyznačený tím, že kmen Penicillium chrysogenum se transformuje rekombinantním DNA expresním vektorem, jímž je plazmid pPenFTSO, na rekombinantní Penicillium chrysogenum PC 100, ATCC 74182.

6. Rekombinantní DNA expresní vektor, kterým je plazmid pPenFTSO použitý v bioprocesu podle nároku 1, integrovaný do chromozomální DNA hostitelské buňky Penicillium chrysogenum za vzniku rekombinantního Penicillium chrysogenum PC 100, ATCC 74182, je tvořen DNA kódující aktivitu enzymu expandázy odvozené ze Streptomyces clavuligerus ATCC 27064 a promotorem řídícím expresi DNA kódující aktivitu expandázy, jímž je promotor IPNS genu Penicillium chrysogenum.

7. Transformovaná buňka Penicillium chrysogenum označená PC 100, ATCC 74182 použitá v bioprocesu podle nároku 1, kde rekombinantní DNA expresní vektor je plazmid pPenFTSO, který je integrovaný do transformované buňky Penicillium chrysogenum PC 100, ATCC 74182 a je tvořen DNA kódující aktivitu expandázy odvozené ze Streptomyces clavuligerus ATCC 27064 a promotorem řídícím expresi DNA kódující aktivitu expandázy, jímž je promotor IPNS genu Penicillium chiysogenum.