HU217171B - Eljárás, expressziós vektor és gazdasejt 7-ADCA előállítására - Google Patents

Abstract

A találmány tárgya eljárás a cefalőspőrin antibiőtikűmők egy főntősintermedierjének, a 7-aminő-dezacetőxi-kefalőspőránsav (7-ADCA)előállítására egy új biőlógiai eljárással, melynek sőrán egytranszfőrmált Penicilliűm chrysőgenűm törzset tenyésztenekadipátfőrrás jelenlétében, ezáltal adipőil-6-APA-t (6-aminő-penicillánsavat) állítanak elő; majd egy, példáűl Streptőmycesclavűligerűsból származó expandáz gén in sitű expreszsziójával – amelygénnel a Penicilliűm chrysőgenűm törzset előzőleg transzfőrmálták –,az adipőil-6-APA-t a gyűrű tágítása útján adipőil-7-ADCA-vá alakítják.A végterméket, a 7-ADCA-t az adipőil őldallánc adipőil-acilázzal valóhasításával állítják elő. A találmány tárgyát képezik az expandáz génttartalmazó expressziós vektőrők és az expressziós vektőrt tartalmazóPenicilliűm chrysőgenűm gazdasejtek is. A teljes szintézis biőlógiaiútőn játszódik le, és hatékőny, valamint gazdaságős. ŕ

Description

A találmány tárgya egy új bioszintetikus eljárás kereskedelmi forgalomban levő cefalosporin antibiotikumok előállítására. A találmány tárgyát képezik az expandáz gént tartalmazó expressziós vektorok és az expressziós vektort tartalmazó gazdasejtek is.

A cefalosporin antibiotikumokat nagy mennyiségben használják, és ezeknek a terápiás hatóanyagoknak a negyedik generációját állítják már elő. A kereskedelmi forgalomban levő cefalosporinok oldalláncainak változatossága, és a cefalosporinok nagy gazdasági jelentősége miatt nagy jelentősége van annak, hogy sokkal gazdaságosabb és hatékonyabb módszereket találjunk a kulcsintermedierek előállítására, amelyek lehetővé teszik a különböző cefalosporinok szintézisét.

A kulcsintermedierek egyike a 7-amino-dezacetoxicefalosporánsav (7-ADCA), amelyet az (1) képlettel lehet leírni. A 7-ADCA-t jelenleg penicillin G-ből állítják elő, és négy vagy öt kémiai lépés szükséges ahhoz, hogy a penicillin gyűrűrendszerét öttagúról a cefalosporinokra jellemző hattagúra tágítsák ki. Amint az a kémiai totálszintézisekre igaz, ennek az eljárásnak is rengeteg a hátránya. Ezek közé tartozik például egy többlépéses és komplex folyamatra való igény, drága reagensek, a jelentős mennyiségű melléktermék a folyamatban, ami az elfolyó oldatok kezelésének problémáját veti fel, valamint egy nagyon szennyezett kiindulási anyag tisztítása, mielőtt a kémiai kezelést megkezdik. Ennek következtében folyamatos kutatások folynak egy olyan mikrobiológiai vagy fermentációs folyamat irányában, amellyel enzimatikus gyűrűzárást és oldallánchasítást lehet elérni, így lehet előállítani a 7ADCA-t sokkal gazdaságosabban, mint a jelenleg alkalmazott kémiai eljárással.

A jelen találmány tárgya tehát a 7-ADCA kulcsintermedier előállítása, pontosabban biológiai eljárások a 7-ADCA előállítására.

A mai napig nem nagyon sikerült a 7-ADCA előállítására jó eljárást találni, különösen nem ipari méretekben. Például míg a 6-amino-penicillánsavat (6-APA) elő lehet állítani közvetlen fermentációval és/vagy a penicillin G enzimatikus kezelésével, és csak a gyűrűtágítás hiányzik ahhoz, hogy a 7-ADCA-t kapjuk, kiderült, hogy sajnos a Cephalosporium vagy Streptomyces enzimek, amelyek ezeknek a mikroorganizmusoknak a normál bioszintézis útjában a gyűrűtágítást végzik, nem fogadják el a 6-APA-t szubsztrátként. Ezeket az enzimeket, amelyeket a szakirodalomban DAOCS vagy expandáz enzim gyűjtőnéven említik, olyan enzimekként határozzák meg, amelyek katalizálják a penicillin típusú molekulákban található penam gyűrűszerkezetet cef-3-em gyűrűkké alakítják, amilyenek a cefalosporinokban találhatók. A továbbiakban ezeket az enzimeket „expandáz enzimek” néven említjük.

Az expandáz enzim szubsztrátja a penicillin G, amely a gyűrűtágulás után adja a cefalosporin C-t (DAOC). Itt csak arra van szükség, hogy lehasitsuk a (D)-a-aminoadipoil oldalláncot, így kapjuk a 7-ADCA-t, de ez az oldallánc rendkívül ellenálló az enzimatikus hasításnak, és csak elfogadhatatlanul alacsony termelési szintet ad.

A jelen találmány szerint lehetséges olyan hatékony biológiai eljárás kidolgozása, amelyben egy penicillinvegyületet (amelynek adipoil oldallánca van), egy új fermentációs eljárással lehet előállítani, magas termelési szinttel, és ez az említett penicillinvegyület elfogadható szubsztrátja az expandáz enzimrendszereknek, amelyeket ugyanaz a mikroorganizmus termel in situ, mint amelyik a penicillinvegyületet termeli, miután genetikai transzformáció következtében expresszálja az említett expandáz enzimrendszert. Ezután az expandáz enzim működésbe lép, és kitágítja a gyűrűt, és ezzel a penicillinvegyületből jó kitermeléssel cefalosporin vegyületet lehet előállítani. Lényeges, hogy a második, kritikus lépésben a penicillinvegyület (amely most már egy cefalosporin vegyület) oldalláncát egy másik enzimrendszerrel meglepően magas kitermeléssel el lehet távolítani. Ennek az egyedülálló biológiai eljárásnak a váratlan eredménye, amely a jelen találmány tárgyát képezi, a 7-ADCA előállítása meglepően magas kitermeléssel.

Cantwell és munkatársai [Curr. Génét., 17, 213-221 (1990)] javasoltak egy biológiai eljárást a ΊADCA előállítására, oly módon, hogy a penicillin V gyűrűrendszerét kell kitágítani, majd a keletkező dezacetoxicefalosporin V enzimatikus hidrolízisével lehet a 7ADCA-t előállítani. Ez a javaslat a Streptomyces clavuligerusból származó, klónozott penicillin N expandáz gén (cefE) hozzáférhetőségén alapul [Kovacevic et al., Journal of Bacteriology, 171, 754-760 (1989); US 5,070,020]. Mivel azonban ez az expandáz csak a természetes szubsztrátjával, a penicillin N-nel működik, a penicillin V-vel nem, ezért a javaslathoz olyan génsebészeti beavatkozásra van szükség, amellyel a penicillin V gyűrűtágítására is képes, módosított expandáz gént lehet előállítani. A szükséges módosítást Cantwell és munkatársainak nem sikerült elérniük, csak azt tudták elérni, hogy a Penicillin chrysogenumot a Streptomyces clavuligerusból származó cefE-génnel transzformálták, és a DAOCS (DAOC-szintetáz vagy expandáz) enzim alacsony szintű expresszióját kapták.

Az expandáz enzimet a szakterületen alaposan tanulmányozták, mind az aktivitását, mind a genetikai szekvenciáját illetően. Például Wolfe [US 4,510,246 és 4,536,476] cikláz, epimeráz és gyűrűtágító enzimeket izolált prokarióta β-laktámot termelő szervezetek, beleértve a Streptomyces clavuligerust is, sejtmentes sejtkivonatából, hogy így stabil enzimreagenseket kapjon. Az ΕΡ-Α-0366354-es számú közzétételi iratban egy Streptomyces clavuligerusból származó izolált és tisztított expandáz enzimet írnak le, amelyet jellemeztek, beleértve a terminális csoportot és az aminosav-összetételt, és azt találták, hogy molekulatömege körülbelül 34,600 dalton. Ez azonban ellentmond annak a 29,000-es molekulatömegnek, amelyet a valószínűleg ugyanezen enzim esetében mértek, és az US 4,536,476 számú szabadalmi leírásban ismertettek. Az EP-A-0 233 715 közzétételi iratban leírják a Streptomyces clavuligerusból kapott expandáz enzim izolálását és endonukleáz restrikciós emésztését, transzformációt és expressziót az említett enzim egy gazdaszervezetében, és a penicillin N gyű2

HU217 171 Β

Kitágításának igazolását, ugyanennek az enzimnek a felhasználásával. Az US 5,070,020 számú szabadalmi leírásban közük a Streptomyces clavuügerusból kapott expandáz enzimet kódoló DNS-szekvenciát, és leíqák egy Penicillin chrysogenum törzs transzformációját egy, az említett DNS-szekvenciát tartalmazó expressziós vektorral. Miközben az a véleményük, hogy ez az enzim hasznos lehet a penicillin N-től eltérő szubsztrátok gyűrűtágítására is, ilyen gyűrűtágítást nem igazoltak.

A fentiekben ismertetett munka a prokarióta Streptomyces clavuügerusból származó expandáz enzimre koncentrált. Ugyanezt az enzimet, vagy legalábbis egy ugyanilyen gyűrűtágító aktivitással rendelkező enzimet az eukarióta Cephalosporium acremonium törzsek (amelyeket Acremonium chrysogenum néven is említenek) is expresszálnak. Azonban ezekben a törzsekben az expandáz aktivitású enzimet egy bifunkciós gén (cefEF) expresszálja, amely expresszálja a DACS aktivitású hidrolázt is, amelynek az a szerepe a természetben, hogy az expandáz enzim dezacetoxi-cefalosporánsav (DAOC) termékét dezacetil-cefalosporin C-vé alakítsa (DAC). Az eredmény egy expandáz/hidroxiláz bifunkciós enzim. Jóllehet voltak erőfeszítések, hogy elválasszák ennek a génterméknek a két aktivitását, eddig egyik sem bizonyult sikeresnek. Például az EP-A-0281 391 számú közzétételi iratban leírják a Cephalosporium acremonium ATCC 11550-ből nyert DAOCS/DACS gén izolálását és DNS-szekvenciájának meghatározását, az enzimek megfelelő aminosav-szekvenciáinak meghatározásával. Egy Penicilliumot transzformáltak, és az enzimeket abban expresszálták, azonban a penicillin G-nek és a penicillin V-nek a megfelelő cefalosporinná való átalakulását soha nem igazolták. Továbbá, annak az elképzelésnek ellenére, mely szerint a génsebészeti technikák kész eszközöket szolgáltatnak ahhoz, hogy a DAOCS, illetve DACS aktivitást kódoló genetikai információkat elválasszuk egymástól, és egymástól elkülönítve expresszáljuk, az ilyen elválasztást még nem igazolták.

A Cephalosporium acremonium DAOCS/DACS (expandáz/hidroxiláz) enzimét is alaposan tanulmányozták a szakterületen, mind az aktivitását, mind jellemzőit és genetikai szekvenciáját illetően. Például az US 4,178,210; 4,248,966 és 4,307,192 számú szabadalmi leírásokban (Demain) különböző penicillin típusú kiindulási anyagokat kezelnek Cephalosporium acremonium sejtmentes kivonatával, amely epimerizálja és kitágítja a gyűrűt, és cefalosporin antibiotikum-terméket eredményez. Wu-Kuang Yeh az US 4,773,881 számú szabadalmi leírásban jellemzi a Cephalosporium acremonium enzimet, az izoelektromos pontja, molekulatömege, aminosav-szekvenciája, hidroxiláz-expandáz aktivitásának aránya és peptidffagmentjei szempontjából.

Az előzőkben ismertetett irodalmi előzmény a jelen találmánynak csak egyetlen aspektusával foglalkozik, azaz a Penicillium chrysogenum törzsnek egy olyan génnel való transzformációjával, amely az expandáz enzimet expresszálja, és az említett enzim expressziójának igazolásával. A szakirodalomban az expresszált enzimet azonban csak arra használták, hogy a penicillin N gyűrűjét kitágítsák, a penicillin G és a penicillin V gyűrűjét meg sem próbálták kitágítani. Még abban az esetben is, a penicillin N-nek a 7-es pozícióban egy olyan oldallánca van, amelyet enzimatíkusan nem lehet lehasítani, hogy 7-ADCA-t kapjunk, ami a jelen találmány tárgyát képezi. A találmány azon a meglepő felismerésen alapul, hogy Penicillium chrysogenum törzzsel a kiindulási vegyülethez adipoil oldallánc addicionáltatható, majd az in situ expresszált expandáz enzim, amelynek a kapott vegyület szubsztrátja, azt gyűrűtágítással adipoil-7ADCA-vá képes átalakítani, és ezután egy újabb enzimmel az adipoil oldallánc is eltávolítható, amivel végül a 7-ADCA-hoz jutunk. Míg az előző szakirodalomban a jelen találmány különböző izolált töredékei találhatók meg, eddig nem tettek javaslatot arra, hogy kombinálhatok, hogy ezáltal a jelen találmány szerinti váratlan eredményeket kapjuk.

Például a 6-adipoil-penicillánsav előállítása ismert a szakterületen [Ballio, A. et al., Natúré, 185, 97-99 (1960)]. A 6-adipoil-penicillánsav enzimatikus tágítása in vitro alapon szintén ismert a szakirodalomban (Baldwin et al., Tetrahedron, 43, 3009-3014(1987); EP-A-0268 343], Az adipoil oldalláncok enzimatikus hasítása szintén ismert a szakterületen [Matsuda et al., Journal of Bacteriology, 769, 5815-5820 (1987)]. Az adipoil oldalláncszerkezete a következő:

COOH-(CH₂)₄-CO, míg egy rokon szerkezetű oldallánc, a glutaril oldalláncszerkezete az alábbi:

COOH-(CH₂)₃-CO.

A glutaril oldallánc enzimatikus hasítása ismert a szakterületen [Shibuya et al., Agric. Bioi. Chem., 45, 1561-1567 (1981); Matsuda and Komatsu, Journal of Bacteriology, 163, 1222-1228 (1985); Matsuda et al., Journal of Bacteriology, 769, 5815-5820 (1987); Jap. 53-086084 (1978 - Banyu Pharmaceutical Co. Ltd.) és Jap. 53-128293 (1977 - Banyu Pharmaceutical Co. Ltd.).

Emellett az EP-A-0 453048 közzétételi iratban is leírnak eljárásokat a Pseudomonas Szintetikus-77-1 által termelt glutaril-aciláz adipoilhasító aktivitásának fokozására. Ha az α-alegységben bizonyos pontokon különböző aminosavakat helyettesítenek, akkor az adipoilhasítás háromszor-ötször nagyobb aktivitása figyelhető meg (az adipoilszerinről). Meg kell jegyezni, hogy jóllehet az EP-A-0 453 048-ban leírnak egy olyan acilázt, amelynek az adipoil oldalláncokkal szemben fokozott az aktivitása, nem imák le viszont semmi olyan módot (sem kémiai, sem biológiai eljárást, amely bármely módon analóg lehetne a jelen leírással), amellyel egy adipoil-cefalosporin lehetne előállítható először.

Ahol egy (D)-a-aminoadipoil oldallánc van jelen, ott a szakirodalomból ismert módon az történik, hogy az aminocsoport enzimatíkusan lehasad, majd az oldallánc egy (D)-aminosav-oxidáz révén megrövidül, és egy glutaril (GL-7) oldallánc marad vissza, majd a glutaril oldalláncot egy második enzim távolítja el (glutaril-aciláz). Egy ilyen kétlépéses hasítást írnak le több szabadalomban és publikációban [Matsuda, US 3,960,662; EP-A-0275901; Jap. 61218057 (1988

HU 217 171 B

- Komatsu, Asahi Chemical Industry Co.); WO 90/12110 (1990 - Wong, Biopure Corp.); és Isogai et al., Bio/Technology 9, 188-191 (1991)].

Abból a célból, hogy a jelen találmány szerinti eljárást és az előzőkben tárgyalt szakirodalmi hivatkozások kitanítását jobban érthetővé tegyük, a leíráshoz képletsort is mellékeltük, amelyet az alábbiakban röviden ismertetünk.

Az 1. képlet a 7-amino-dezecetoxi-defalosporánsavat (7-ADCA) mutatja be.

A 2. képlet a cefalosporin C szerkezeti képlete.

Az 1. reakcióvázlatban megadjuk a penicillin G-hez és cefalosporin C-hez vezető bioszintézis út különböző lépéseit, a közbenső termékeket és az enzimeket, amelyek a szükséges transzformációkat végzik.

A jelen találmány tárgya új biológiai eljárás 7amino-dezacetoxi-cefalosporánsav (7-ADCA) előállítására, amely során az alábbi lépéseket alkalmazzuk:

1. egy olyan Penicillium chrysogenum törzset szaporítunk egy, a szaporodást lehetővé tevő táptalajban, amely izopenicillin N-t termel, és az említett táptalajhoz adipátforrást adunk, amely adipinsavat, illetve annak egy vagy több sóját és/vagy észterét tartalmazza, és amelyeket az említett Penicillium chrysogenum törzs képes asszimilálni és felhasználni, hogy így adipoil-6-amino-penicillánsavat (adipoil-6-ΑΡΑ) állítsunk elő;

az említett Penicillium chrysogenum törzset olyan DNS-sel transzformáljuk, amely az említett adipoil-6APA-t szubsztrátként elfogadni képes expandázenzimaktivitást kódol, és expressziójának eredményeképpen az említett törzs által termelt adipoil-6-ΑΡΑ azután in situ gyűrűtágításon megy át, adipoil-7-ADCA keletkezésével; és

2. az említett adipoil-7-ADCA-t egy adipoilacilázzal hozzuk érintkezésbe, amelynek következtében az adipoil oldallánc lehasad, és a 7-ADCA termék keletkezik; az említett terméket azután izoláljuk.

A továbbiakban a használt szakkifejezéseket definiáljuk:

az „adipoil-6-APA” jelentése [2S-(2a, 5a, 6β)]-3, 3dimetil-7-oxo-6-[(hexán-l,6-dioil)amino]-4-tia-lazabiciklo-[3.2.0]heptán-2-karbonsav; és az „adipoil-7-ADCA” jelentése 7-[(hexán-l,6dioil)amino-3-metil-8-oxo-5-tia-l-azabiciklo-(4.2.0)okt-2-én-2-karbonsav.

Pontosabban, a jelen találmány tárgya egy új biológiai eljárás 7-amino-dezacetoxi-cefalosporánsav (7ADCA) előállítására, amely eljárásban az adipátforrás dinátrium-adipát, és az expandázenzim-aktivitást kódoló DNS Streptomyces clavuligerus ATCC 27064-ből származik, és amelyben az adipoil-aciláz aktivitás egy Pseudomonas fajból származik.

A jelen találmány tárgya továbbá egy rekombináns DNS-expressziós vektor, amely a Streptomyces clavuligerus ATCC 27064-ből származó, expandázenzim-aktivitást kódoló DNS-t tartalmazza, valamint egy promotert, amely vezérli a későbbiekben ismertetett pPenFTSO plazmidon levő említett, expandázaktivitást kódoló DNS expresszióját.

A jelen találmány tárgya továbbá egy Penicillium chrysogenum gazdasejt, amely a Streptomyces clavuligerus ATCC 27064-ből származó expandázenzim-aktivitást kódoló DNS-t, és az említett expandázaktivitást kódoló DNS expresszióját vezérlő promotert, amely a Penicillium chrysogenum IPNS-génből származik, tartalmazó rekombináns DNS expressziós vektorral van transzformálva. Pontosabban, a jelen találmány tárgya egy, az alábbiakban ismertetett pPenFTSO plazmid rekombináns DNS expressziós vektorral transzformált Penicillium chrysogenum gazdasejt.

A jelen találmány tárgya továbbá eljárás rekombináns Penicillium chrysogenum gazdasejt tenyésztésére, olyan körülmények között, amelyek megfelelnek a gén expressziójának, és amely eljárásban a gazdasejt egy rekombináns DNS expressziós vektort tartalmaz, amely a Streptomyces clavuligerus ATCC 27064-ből származó expandázenzim-aktivitást kódoló DNS-t tartalmazza, valamint egy promotert, amely vezérli az említett expandázaktivitást kódoló DNS expresszióját, amely promoter a Penicillium chrysogenum IPNS-génjéből származik. Pontosabban, a jelen találmány tárgya eljárás egy rekombináns Penicillium chrysogenum gazdasejt tenyésztésére olyan körülmények között, amelyek lehetővé teszik a gén expresszióját, és amely eljárásban az említett rekombináns gazdasejt egy rekombináns DNS expressziós vektort, az alábbiakban ismertetett pPenFTSO plazmidot tartalmazza.

A jelen találmány fő tárgya egy új biológiai eljárás 7-amino-dezacetoxi-cefalosporánsav (7-ADCA) előállítására, amely egy kulcsintermedier a szintetikus, kereskedelmi forgalomban levő cefalosporinok előállításában, és amelyeket a (1) szerkezeti képlettel lehet leírni. A cefalosporin mag mellett a 7-ADCA megkülönböztető szubsztituensei közé tartozik a 7-aminocsoport és a 3-metilcsoport. A 7-aminocsoport az, amelyet számos különböző oldalláncszármazékká lehet átalakítani, és így a különböző kereskedelmi forgalomban levő cefalosporinok szintézisének alapjául szolgálhat. A 3metilcsoportot általában, de nem mindig, mint például a kefalexin esetében, át kell alakítani valamely más oldallánccá, hogy egy kereskedelmi forgalomban levő cefalosporint állítsunk elő.

A jelen találmány szerinti 7-ADCA termék, a cefalosporin C-vel ellentétbe állítható, mint egy másik cefalosporin-köztitermék, amelyet (2) szerkezeti képlettel lehet leírni. Ennél a köztiterméknél a 3-acetoximetil-oldallánc elfogadható a kereskedelmi forgalomban levő cefalosporinokhoz. Azonban a 7-(D)-a-aminoadipoil oldallánc nem fogadható el a további szintetikus származékokhoz, és le kell hasítani, hogy az elfogadható 7-aminocsoportot kapjuk. Sajnos a 7-(D)-aamino-adipoil oldalláncot mindig nehezen lehetett eltávolítani, akár kémiai, akár biokémiai módszerek alkalmazásával.

A leírásban, főleg az előnyös megvalósítási módok leírásában az alábbi meghatározások jelentése az alábbi:

7-ADCA 7-amino-dezacetoxi-cefalosporánsav

6-APA 6-amino-penicillánsav

DAOC dezacetoxi-cefalosporánsav

HU 217 171 Β

DAOCS DAOC szintetáz

DAC dezacetil-cefalosporin C

DACS DAC szintetáz

IPNS izopenicillin N szintetáz

TRIS tris(hidroximetil)-aminometán

EDTA etiléndiamin-tetraecetsav

DEPC dietil-piro-karbonát

TE TRIS/EDTA puffer

SSC nátrium-klorid/nátrium-citrát puffer

SDS nátrium-dodecil-szulfát

PEG polietilénglikol

Penicillium chrysogenum tenyészet

A jelen találmány szerinti eljárás első lépése egy olyan Penicillium chrysogenum törzs növekedésének fenntartása egy erre alkalmas tenyésztő táptalajban, amely izopenicillin N-t termel, majd az említett táptalajhoz adipát forrást adunk, amely adipinsavat vagy sóit és észtereit tartalmazza. Az adipát forrást a Penicillium chrysogenummal való beoltás után lehet a tenyésztő táptalajhoz adni, de előnyös, ha már a beoltás pillanatában benne van a táptalajban. Az adipinsav, illetve sói és észterei olyanok, hogy az említett Penicillium chrysogenum képes arra használni, hogy adipoil-6-APA-t állítson elő; az említett Penicillium chrysogenum törzset egy expandázenzim-aktivítást kódoló DNS-sel transzformáltuk, és expressziójának eredményeképpen az említett adipoil-6-ΑΡΑ in situ gyűrűtáguláson esik át, az adipoil7-ADCA keletkezése közben.

A Penicillium chrysogenum faj mellett egyéb, a Penicillium nembe tartozó fajok is termelnek izopenicillin N-t. Történelmileg azonban a legtöbb izopenicillin N-t termelő törzset a chrysogenum fajból fejlesztették ki, a törzsfejlesztés jól ismert módszereivel. Gyakorlati okokból a jelen találmány a Penicillium chrysogenum törzsekre korlátozódik, jóllehet más fajokra való alkalmazhatósága nyilvánvaló. Bármely letétbe helyezett Penicillium chrysogenum törzs, vagy bárki számára hozzáférhető ilyen törzs megfelelő kiindulási pont a jelen találmány szerinti módszer végrehajtásához.

A tenyésztő táptalaj, amely képes arra, hogy egy izopenicillin N-t termelő Penicillium chrysogenum törzs szaporodását biztosítsa, olyan jellegű, amelyet a szakterületen jártas szakember jól ismerhet. Például a tenyésztést süllyesztett, levegőztetett fermentációval végezhetjük, és a használt táptalajt számos megfelelő táptalaj közül választhatjuk ki. Egy tipikus táptalajban a szénforrás szacharóz, glükóz és keményítő, a nitrogénforrás szójaliszt, gyapotmagolaj, mogyoróliszt, különböző aminosavak, ezek keveréke és peptonok. A termelés szempontjából lényeges a termelési szint, az izolálás egyszerűsége, tehát az ilyen helyzetekben az előnyös táptalaj szénforrásként melaszt és szójalisztet tartalmaz, valamint aminosavakat nitrogénforrásként.

Szervetlen tápsókat is adnak általában a tenyésztő táptalajhoz, ide tartoznak azok a sók, amelyek az alábbi ionkomponenseket képesek szolgáltatni: nátrium, kálium, ammónium, kalcium, foszfát, szulfát, klorid, bromid, nitrát, karbonát, vas(II), vas(III), magnézium, mangán stb. A nyomelemek is általában lényegesek a Penicillium chrysogenum növekedése, fejlődése és metabolizmusa szempontjából, és közvetlenül hozzá lehet adni a tenyésztő táptalajhoz, hacsak szennyezőként már nem jutott bele, lényegében más táptalajkomponenssel.

A Penicillium chrysogenum törzseket kis térfogatú berendezésekben lehet tenyészteni, például egyliteres rázott lombikokban, ha csak kis mennyiségű 7-ADCA-t kell előállítani. Ha nagy mennyiségű adipoil-7-ADCAra van szükség, akkor azonban nagy térfogatú fermentorokat kell használni, süllyesztett, levegőztetett fermentációs körülmények között.

Az adipoil-7-ADCA nagy mennyiségben való előállításához a Penicillium chrysogenum spóráit ferdített agaron tartjuk fenn. A ferde agárról származó spórákat használjuk kis térfogatú vegetatív táptalaj beoltására. A vegetatív táptalajt inkubálva kapunk a mikroorganizmusból friss, aktívan osztódó tenyészetet. Azután ezt a vegetatív tenyészetet használjuk oltóanyagként a nagy térfogatú fermentációs táptalaj beoltására. Bizonyos esetekben szükséges lehet egy további oltási lépcső beiktatása egy nagy térfogatú fermentációs táptalajhoz. Ezt a második vegetatív tenyészetet általában akkor használják, amikor a fermentációs táptalaj térfogata sokkal nagyobb, mint az első vegetatív tenyészeté. Ily módon a mikroorganizmus spóráit először kis térfogatú vegetatív táptalajban szaporítjuk, hogy egy nagyobb térfogathoz oltóanyagot állítsunk elő. A nagyobb térfogatú vegetatív tenyészet azután megfelelő koncentrációban szolgáltatja a mikroorganizmusokat ahhoz, hogy a fermentáció gyorsan beinduljon egy nagy térfogatú fermentációs berendezésben. A vegetatív táptalaj összetétele ugyanaz lehet, mint a fermentációs táptalajé, illetve tartalmazhat további adalékanyagokat, hogy elősegítse a mikroorganizmusok kis térfogatban való szaporodását és fejlődését. A jelen találmány szerinti eljárásban alkalmazott Penicillium chrysogenum törzseket leghatékonyabban körülbelül 20-30 °C között lehet szaporítani, de az optimális eredményt akkor kapjuk, ha a hőmérséklet körülbelül 22 °C és 28 °C között van, előnyösen körülbelül 25 °C.

Az adipoil-7-ADCA maximális termelése akkor érhető el, ha a Penicillium chrysogenum törzset nagy térfogatú berendezésekben tenyésztjük 10-30 napig, előnyösen 15-25 napig. Ha azonban kis térfogatú berendezésben végezzük a fermentációt, például 250 ml-es rázott lombikban, akkor a mikroorganizmusok szaporodása sokkal gyorsabb, és sokkal rövidebb idő alatt termelik az adipoil-7-ADCA-t, például 4-15 nap alatt, gyakran 5-7 nap alatt.

Ha a nagy térfogatú fermentorokban a leállási pH értéke-8,0 vagy magasabb, akkor ez hátrányosan érinti az adipoil-7-ADCA-termelést. Ilyen esetekben kívánatos, hogy kövessük a tenyésztő táptalaj pH-ját a fermentáció során. Ha úgy tűnik, hogy a pH ezt a szintet az adipoil-7-ADCA maximális szintje előtt eléri, akkor a ρΗ-t kényelmesen csökkenthetjük, megfelelő savnak vagy pufferelő ágensnek a fermentációs táptalajhoz való adásával.

HU 217 171 Β

Az adipoil-7-ADCA termelését követhetjük oly módon, hogy a fermentációs táptalajból vett mintákat kromatográfiásan vizsgáljuk.

Csakúgy, mint a legtöbb süllyesztett, levegőztetett fermentáció esetében, steril levegőt bocsátunk át a tenyészeten, hogy a Penicillium chrysogenum jobban növekedjen, és fokozódjon az adipoil-7-ADCA termelése. A fermentlén átnyomott levegő térfogata általában legalább 0,2 térfogat levegő per perc per fermentlé térfogat. Azonban a nagyobb mennyiségű levegőnek gyakran előnyös hatása van az adipoil-7-ADCA termelésére.

A Penicillium chrysogenum törzs jellemző módon, az adipoil-7-ADCA mellett számos mellékterméket és metabolitot termel. Mivel ezek közül néhány savra érzékeny, ezért kívánatos az adipoil-7-ADCA fermentléből való kinyerése során, hogy a teljes fermentlevet savas pH-η kezeljük egy rövid ideig, hogy néhány mellékterméket elroncsoljunk. Az adipoil-7-ADCA fermentációs terméket kinyerjük a szűrt fermentléből, mind így kezelve, adott esetben elválaszthatjuk a fermentlé egyéb komponenseitől ioncserélő gyantával végzett kromatográfiával, és tovább tisztíthatjuk kromatográfiás módszerekkel, ha szükséges, az adipoil oldallánc enzimatikus lehasítása előtt. Az is lehetséges, hogy ilyen ioncserélő kromatográfiás elválasztást az oldallánc lehasítása után végzünk. Az egyik fő melléktermék, amely elválasztási problémákat jelenthet, az adipoil-6-ΑΡΑ, és ezt a mellékterméket kémiai vagy enzimatikus módszerekkel le lehet bontani, hogy az elválasztást könnyebbé tegyük. Először a szűrt fermentlevet előzetes tisztítási eljárásnak vetjük alá, ami magába foglalhat egy kiindulási extrakciót egy vízzel nem elegyedő oldószerrel, például n-butanollal vagy amil-acetáttal, a szennyeződések eltávolítására. Az extrahált fermentlevet azután tovább tisztíthatjuk, még előzetes jelleggel, aktivált szénen végzett kromatográfiával.

Az adipát forrás hozzáadása

A Penicillium chrysogenum fermentációs tenyészetének az előzőkben leírt módon való létrehozásával egy időben, azaz az inokulálás előtt, egy adipát forrást adunk a többi adalékanyaghoz, amelyet a fermentációs táptalajba teszünk. Adott esetben az adipát forrást valamennyi idővel az inokulálás után is bevihetjük, azaz például 1, 2 és/vagy 3 nappal az inokulálás után. Az adipát forrás lehet adipinsav, az adipinsavnak egy és/vagy több sója vagy észtere, amelyeket az adipoil-6APA előállítására képes Penicillium chrysogenum törzs asszimilálni és felhasználni képes. Az adipinsav, sói és észterei használhatók önmagukban vagy kombinációban. A dinátriumsó az előnyös, jóllehet a kálium- és a nátriummal vegyes sók is alkalmasak. A metil-észter használható, míg az etil-észter vízben oldhatatlan. Az adipinsav sója vagy észtere olyan legyen, amelyet az adipoil-6-ΑΡΑ előállítására képes Penicillium chrysogenum törzs asszimilálni és felhasználni képes. Például az adipinsav önmagában alkalmas lehet, jóllehet, ha vízben való oldhatatlansága esetén megfelelő pH mellett asszimilálható, és só képződik belőle.

Alkalmas expandáz enzimek

Az előzőkben ismertetett módon, adipát forrás hozzáadásával adipoil-6-ΑΡΑ előállítására tenyésztett Penicillium chrysogenum egy olyan törzs, amelyet az expandáz enzimet kódoló DNS-sel transzformáltunk, miközben az expresszió hatására az említett adipoil-6APA in situ gyűrűtáguláson esik át, adipoil-7-ADCA keletkezése közben.

Az adipoil-6-ΑΡΑ intracellulárisan keletkezik az adipát forrás jelenlétében tenyésztett Penicillium chrysogenum törzzsel. Ebben az intracelluláris felállásban, azaz in situ alapon, a transzformált Penicillium chrysogenum olyan DNS-t is expresszál, amely expandáz enzimaktivitást kódol, amely enzim az adipoil-6-ΑΡΑ mint szubsztráton működik, a gyűrűt kitágítja, adipoil7-ADCA keletkezése közben.

A jelen találmány szerinti új biológiai eljárás oltalmi körébe tartozik az előzőkben ismertetett típusú Penicillium chrysogenum törzs transzformálása bármely, az expandáz enzim aktivitását kódoló DNS-sel, amely expressziójának az az eredménye, hogy az adipoil-6-ΑΡΑ in situ gyűrűtáguláson esik át, adipoil-7ADCA keletkezése közben. Tehát a DNS-nek, amellyel a Penicillium chrysogenum sejteket transzformáljuk, olyan enzimet kell expresszálnia, amely nemcsak a szakterületen ismert aktivitással rendelkezik, azaz azzal a képességgel, hogy az izopenicillin N-t DAOC-vé alakítja gyűrűtágítás útján, hanem azzal a képességgel is, hogy az adipoil-6-APA-t adipoil-7-ADCA-vá alakítja át gyűrűtágítás útján. Az azonban elfogadható, hogy az oldallánc-hasonlóság alapján bármely expandáz enzim képes lesz működni a jelen találmány szerinti új biológiai folyamatban.

A szakirodalom helyzetét ismertető részben már megjegyeztük, hogy a Streptomyces clavuligerus ATCC 27064 törzsből származó expandáz enzim teljes szekvenciáját meghatározták, és restrikciós endonukleázos emésztéssel térképezték. Amelyik azonban ugyanannak az enzimnek tűnik, és a Streptomyces clavuligerus NRRL 3585 törzsből származik, de leírták róla, hogy molekulatömege eltér az előzőétől, annak még nem határozták meg a szekvenciáját.

Ezek, a szakterületen korábban azonosított expandáz enzimek jól használhatók a jelen találmány szerinti új biológiai eljárás során. Más, eddig még nem azonosított expandáz enzimek, amelyek a Streptomyces clavuligerus különböző törzseiből származnak, vagy éppen egy más nembe tartozó mikroorganizmusból, szintén hasznosnak bizonyulhatnak a jelen találmány szerinti új biológiai eljárás kivitelezésében. Az ilyen új mikroorganizmusok törzseinek és nemeinek azonosítása, valamint a feltételezett expandáz enzimek izolálása és annak megállapítása, hogy alkalmasak a jelen találmány szerinti eljárásban, viszonylag egyszerű dolog, és a szakterületen jártas szakember számára nyilvánvalóak. A hasznos mikroorganizmusok új törzsei és nemei sejtmentes kivonatainak átvizsgálását megbízható és reprodukálható módon végezhetjük oly módon, hogy az említett kivonathoz adipoil-6-ΑΡΑ szubsztrátot adunk ismert DAOCS kofaktorok jelenlétében, amelyek le6

HU217 171 Β hetnek vas(II)-ionok, aszkorbinsav, α-ketoglutarát és adenozin-trifoszfát (ATP). Az adipoil-6-ΑΡΑ szubsztrátot megfelelő mennyiségben elő lehet állítani, ha egy nem transzformált Penicillium chrysogenum törzsnek adipát forrást biztosítunk, az alábbiakban ismertetettel analóg módon. A kívánt expandáz enzim jelen van, ha az adipoil-7-ADCA létrejön, amelynek jelenlétét kromatográfiával lehet igazolni.

Az is lehetséges, jól ismert rekombináns technikák alkalmazásával, hogy DNS-próbákat hozunk létre, például a Streptomyces clavuligerus és a Cephalosporium acremonium expandáz szekvenciája alapján, hogy átvizsgáljuk egy jelölt mikroorganizmus DNS-tartalmát, amelyről elképzelhető, hogy egy olyan expandázt termel, amely használható a jelen találmány szerinti eljárásban.

Az expandáz enzimek lehetséges forrásai

Az expandáz enzimek, amint azt már megjegyeztük, olyan enzimek, amelyek katalizálják a penam gyűrűszerkezetek (amelyeket a penicillin típusú molekulákban találunk meg) cef-3-említett gyűrűvé való átalakulását (amelyeket a cefalosporinokban találunk meg). Bármely olyan szervezet tehát, amely cefém gyűrűt tartalmazó metabolitot termel, az expandázt kódoló DNS potenciális forrása. Az ilyen mikroorganizmusok listáját az alábbiakban adjuk meg, de a lista nem teljes.

Gombák

Cephalosporium acremonium

Cephalosporium sp.

Emericellopsis

Paecilomyces

Scopulariopsis

Diheterospora

Spiroidium

Anoxiopsis

Aktinomicéták

Streptomyces clavuligerus

Streptomyces lipmanii

Streptomyces wadayamensis

Streptomyces filipinensis cephamycini

Streptomyces heteromorphus

Streptomyces panayensis

Streptomyces griseus

Streptomyces cattleya

Nocardia lactamdurans

Más baktériumok

Flavobacterium sp.

Alcaligenes denitrificans

Mycoplana bullata

Providencia rettgeri

Lysobacter lactamgenus

Az előzőkben leírt organizmusok expandázai csupán jelöltek a további vizsgálatokhoz, és lehetséges, hogy nem mindegyik alkalmas a jelen találmány szerinti új biológiai eljárásban való alkalmazáshoz. Azoknak az enzimeknek az alkalmazása például, amelyek mind expandáz-, mind hidroxilázaktivitással rendelkeznek, amilyen például a Cephalosporium acremoniumból származó enzim, hidroxilezett adipoil-7-ADCA szintézisét eredményezhetik, azaz egy adipoil oldallánccal rendelkező DAC szintézisét.

Expandáz aktivitást kódoló DNS-fragmentek izolálása

Ha egyszer egy keresett expandáz enzim jelenlétét sikerült kimutatni az előzőkben leírt módon, akkor az expandázenzim-aktivitást kódoló DNS izolálása is egyszerű a szakterületen jártas szakember számára. Olyan DNS-próbákat készítünk, amelyek az expandáz enzimek génjeinek ismert szekvenciáin és részleges szekvenciáin alapulnak, és ezek hibridizálnak a kiválasztott, izolálandó enzimet kódoló DNS-hez. Az ilyen próbák készítése az aminosav-szekvencián és az expandáz enzimet kódoló nukleotid szekvencián alapul, valamint az adott mikroorganizmus kodonhasznosítási gyakoriságán. A Streptomyces clavuligerus ATCC 27064 genomiális DNS-ére alkalmazott ilyen típusú jellemző eljárások részletes leírását az alábbiakban adjuk meg.

Az expandázenzim-aktivitást kódoló DNS izolálását a rekombináns DNS-technológia területén jól ismert restrikciós és ligálási eljárásokkal hajtjuk végre. Az eljárásban szereplő mikroorganizmus genomjáról kell lenni egy restrikciós endonukleázos hasítási térképnek, hogy a megfelelő Y restrikciós fragmentet elő lehessen állítani és izolálni is lehessen. A Streptomyces clavuligerus és a Cephalosporium acremonium restrikciós térképei már hozzáférhetők; az előző esetében a BamHI és Sáli restrikciós enzimeket használjuk, és gélelektroforézissel kapjuk meg a keresett 1,8-2,2 kb méretű fragmenteket.

A Penicillium chrysogenum törzs transzformálása

Ha egyszer megkaptuk az expandázaktivitást kódoló DNS-fragmenteket, akkor azokat beépíthetjük (ligálhatjuk) egy plazmidba vagy egyéb expressziós vektorba, olyan DNS-fragmentekkel együtt, amelyek promotereket, transzlációs aktiválószekvenciákat, rezisztenciamarkereket, szabályozószekvenciákat, kozmidképzőket, illetve bármely egyéb DNS-szekvenciát, amely lehetővé teszi, illetve elősegíti a transzformációt, vezérli a géntermék expresszióját, és megkönnyíti a transzformánsok izolálását. Az így készített expressziós vektort azután a Penicillium chrysogenum törzs transzformálására, valamint az expandázenzimaktivitás intracelluláris expressziójára használjuk. A transzformáció és expresszió elérésére használt technikák jól ismertek a szakterületen, és egy ilyen tipikus eljárás részletes leírását az alábbiakban adjuk meg.

Amint az előzőkben már részleteztük, a transzformáit Penicillium chrysogenum törzs az expandáz enzimaktivitást intracellulárisan expresszálja, ami azután in situ működik az adipoil-6-ΑΡΑ szubsztráton, és gyűrűtágítás révén adipoil-7-ADCA termelését eredményezi.

Új transzformáns

A specifikus Penicillium chrysogenum transzformáns, amely a jelen találmány egy előnyös megvalósítási módja szerinti expandáz gén aktivitását expresszálja, újszerű, a szakirodalomban korábban ismertetett ilyen konstrukciókhoz viszonyítva [Cantwell et al., Curr. Génét., 17, 213-221 (1990)]. Mindkét konstrukcióban in vitro mutagenezist használnak a promoternek az expandáz génhez való kapcsolására. A Cantwell-konstrukcióban a manipulációval egy

HU 217 171 Β

Ndel-hasítási helyet juttatnak be az expandáz gén ATG-kodonja elé, amely gént azután az IPNSpromoter 3’ végének Xbal-hasítási helyére ligáinak egy Xbal/Ndel-linkerrel. A jelen találmány szerinti konstrukcióban egy Ncol-hasítási helyet hozunk létre az expandáz gén ATG-kodonjánál, és az IPNS-linker 3’ végének Ncol-hasítási helyéhez ligáljuk. Ezzel az alábbi szekvenciákat hozzuk létre az említett konstrukciók promoter-gén kapcsolatánál:

Xbal Ncol

IPNS-promoter 5’ TCTAGACACCATGG 3’ SEQ ID NO. 1

Strep expandáz 5’ GTGAGAGTTGATGGAC 3’ SEQ ID NO. 2

Cantwell 5’ TCTAGACACTATGGAC 3’ SEQ ID NO. 3

Jelen találmány 5’ TCTAGACACCATGGAC 3’ SEQ ID NO. 4

A Cantwell-konstrukcíóban a C-t egy T helyettesíti, míg a jelen találmány szerinti konstrukcióban a C megmarad; tehát az IPNS-promotemek az ATG-kodonnal közvetlenül szomszédos szekvenciája pontosan ugyanaz, mint amit a természetben előforduló IPNS-génnél találhatunk. Lehetséges, hogy a szakirodalomban szereplő promoter, jóllehet csak egyetlen nukleotid bázisban különbözik, alacsonyabb transzlációs hatékonyságot eredményez, és ennek következtében az expandáz gén expressziója is alacsonyabb lesz.

Az egyéb különbségek a konstrukcióban található gén vagy promoter régióiban találhatók. A Cantwellkonstrukció tartalmazza az IPNS-promoter 5’ BamHI Xbal 3’ régiót, míg a jelen találmány szerinti vektor a promoter 5’ Ncol - Ncol 3’ régiót tartalmazza [Diez et al., Journal of Biological Chemistry, 265, 16358-16365 (1990)]. Ennek eredménye egy körülbelül 250 bp hosszabbítás az IPNS-promoter 5’ végén a Cantwell-féle konstrukcióban. Ez a régió azonban az IPNS-gén előtt levő ACV-szintetáz gén nyitott leolvasási keretében található.

A Cantwell-konstrukció tartalmazza a Streptomyces gént a gén ATG-jétől a 3’ BamHI hasítási helyéig, míg a jelen találmány szerinti vektor az ATG-től a gén 3’ Sáli hasítási helyéig tartalmazza [Kovacevic et al., Journal of Bacteriology, 171, 754-760 (1989)]. Ennek eredménye egy körülbelül 1000 bp hosszúságú toldalék a Cantwell-konstrukcíóban. A jelen találmány szerinti konstrukció tartalmaz még egy upstream régiót az expandáz génből az ATG-től 5’ irányban levő BamHI hasítási helyig; ezt azonban az IPNS-promoter elválasztja az expandáz gén leolvasási keretétől.

A jelen találmány szerinti konstrukció és a szakirodalomban közölt konstrukció közötti egyéb különbség a használt szelekciós markerekre vonatkozik. A Penicillium chrysogenum IPNS-promoter: fleomicin génfúzió használata a jelen találmány szerinti konstrukcióban arra teszi hajlamossá a konstrukciót, hogy több kópia integrálódjon, illetve az integráció azokban a lókuszokban játszódjon le, ahol magasabb expressziós szint lehetséges, és így potenciálisan magasabb százalékban eredményezhet olyan transzformánsokat, amelyek az expandáz gént magas szinten expresszálják.

Az előzőkben leírt típusú, új transzformáns egy PC 100 jelű Penicillium chrysogenum. A tipikus taxonómiai tulajdonságai közé tartozik a szélesen elterülő telepek, kékeszöldtől zöldig terjedő színárnyalat, sima bársonyos felszín sárga pöttyökkel, a telepből az agarba diffundáló, és így hátulról látható sárga szín, elliptikusgömb alakú konídiumok, amelyeknek a mérete 3-4 mm között változik. A Penicillium chrysogenum szaporítására elfogadható táptalaj összetétele: 1,5 tömeg/térfogat% laktóz monohidrát, 0,5 térfogat/térfogat% kukoricalekvár; 0,5 tömeg/térfogat% pepton, 0,4 tömeg/térfogat% NaCl, 0,05 tömeg/térfogat% MgSO₄x7H₂O, 0,06 tömeg/térfogat% KH₂PO₄, 0,0005 tömeg/térfogat% FeCl₃x6H₂O, 0,0002 tömeg/térfogat% CuSO₄ x 5H₂), 3,0 tömeg/térfogat% agar; egy liter desztillált vízben, pH=4,8. Az imént ismertetett, PC100 jelű Penicillium chrysogenum törzset az American Type Culture Collectionnál (ATCC) helyeztük letétbe (12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852), ATCC 74182 letéti szám alatt (a letétbe helyezés időpontja: leadva 1992. augusztus 21-én, az életképesség igazolva 1992. augusztus 27-én).

Az Adipoil oldallánc hasítása

A jelen találmány szerinti új biológiai eljárás következő lépése az adipoil oldallánc lehasítása az adipoil-7ADCA-ról, amihez az előző lépés termékének egy adipoil aciláz enzimrendszerrel való kezelése szükséges. Amint azt az előzőkben már megjegyeztük, a jelen találmány egyik jelentős eredménye az a képesség, hogy az adipoil-7-ADCA keletkezéséhez vezető összes lépést egyetlen fermentációs tenyészetben lehet végrehajtani. Ez az eredmény kivételesen magas hatékonyságot biztosít, mivel nem kell izolálni és részlegesen tisztítani a köztitermékeket a folyamat minden lépésében. Az utolsó lépésben azonban az adipoil-aciláz enzimrendszer nincs jelen, azaz nem keletkezik in situ, az eredeti fermentációs tenyészetben.

Ha a jelen találmány szerinti új biológiai eljárást sarasonként akarjuk végrehajtani, akkor az első lépés termékének izolálására és részleges tisztítására van szükség, és az ennek végrehajtásához szükséges előzetes eljárásokat már máshol leírták.

Mindazonáltal a jelen találmány szerinti eljárást bármely olyan módon végrehajthatjuk, amely az adipoil-acilázt hatékonyan érintkezésbe hozza az adipoil7-ADCA-val, hogy a vegyület 7-ADCA-vá való alakulása lejátszódhasson. Ez az „érintkezés” legszélesebb értelemben való meghatározását jelenti. Lehetséges a nyers adipoil-7-ADCA sejtmentes kivonatának alkalmazása betáplálásként, és ennek kezelése sarasonkénti módon, nyers adipoil-acilázt tartalmazó fermentlével. Ennek a megközelítésnek van bizonyos hatékonysága, mivel nem szükséges a reaktánsok lényeges tisztítása az elején. Módosítások természetesen lehetségesek. Például a reakciópartnereket valamilyen szükséges mértékben tisztíthatjuk, mielőtt érintkezésbe hoznánk őket. Emellett az is lehetséges, hogy az eljárást sarasonként való feldolgozás helyett folyamatosan hajtsuk végre.

HU 217 171 B

A reakciópartnerek érintkeztetését is számos módosított módon végezhetjük, a feldolgozási technológia előnyeinek figyelembevételével. Tehát például immobilizált enzim használható, olyan oszlop formájában, amely az adipoil-acilázt tartalmazza, és az adipoil-7ADCA-t bocsátjuk át az oszlopon. Az immobilizált enzimet szuszpenzió formájában is hozzáadhatjuk az adipoil-7-ADCA-oldathoz. Az ilyen immobilizált enzimrendszerek az enzim könnyű kinyerésének és többszörös használhatóságának előnyeit nyújtják. Egy ilyen technológiai folyamatra egy másik példa a membránreaktorokhoz kapcsolódik. A reakciópartnerek érintkeztetésének előnyös módszere az immobilizált enzimoszlop alkalmazása.

A hasítási lépésben használható adipoil-aciláz enzimek

Számos olyan enzim ismert, amely specifikusan hat az adipoíl oldalláncokra. A RAEV Corp.-től kereskedelmi forgalomban beszerezhető adipoil-acilázzal végzett eredményeket az alább következő példákban részletesen ismertetjük. Hét másik enzimet is leírtak a szakirodalomban, amelyek eltávolítják az adipoil oldalláncot a cefalosporin típusú molekulákról. A hét említett enzim közül hat Pseudomonas fajból származik, a hetedik egy Bacillus fajból. Van bizonyos hasonlóság egyes Pseudomonas enzimek között, de mind a hét különbözik egymástól bizonyos mértékben a fizikai/biológiai tulajdonságaikat illetően. Néhány jellemzőt az alábbiakban foglalunk össze.

Enzim (Pseudomonas cs Bacillus törzsek)	Referencia	Hozzávetőleges molekulasúly (alegység)
P. SY-77-1	Shibuya et al.	Látszólag ugyanannyi, mint az alábbi GK-nak
(Toyo Jozo)	(1981)
P. GK16	Matsuda, Komatsu	16,000
(Asahi)	(1985)	54,000
P.SE83(acyI)	Matsuda et al.	38,200
(Asahi)	(1987)	19,900
P.SE83(acyII)	Matsuda et al.	25,400
(Asahi)	(1987)	58,200
P. diminutaNI76	Aramori et al.	58,000
(Fujisawa)	(1991a)*	26,000
P. diminuta V22	Aramori et al.	?
(Fujisawa)	(1991a)*
Bacillus laterosporus J1	Aramori et al. (1991b)**	70,000 (monomer)
Pseudomonas sp.	—	16,000
(RAEV Corp.)		54,000

* Aramon ct al., J. Fcrmcnt. Biocng., 72, 232-243 (1991) ** Aramon ct al., Journal of Bactcriology, 173, 7848-7855 (1991)

Az összes fent említett adipoil-aciláz enzim jól használható a jelen találmány szerinti új biológiai eljárásban. Más, a jelen találmány szerinti eljárásban használható adipoil-acilázok könnyen azonosíthatók, ha a jelölt enzimet adipoil-7-ADCA ellen használjuk, ami egy olyan szubsztrát, amin ennek hatnia kell. Egy pozitív eredmény megbízható és reprodukálható módszert ad annak meghatározására, hogy egy jelölt enzim valóban hasznos-e a jelen találmány szerinti eljárásban. A szubsztrátot egyszerűen előállíthatjuk, ha adipinsavanhidridet reagáltatunk 7-ADCA-val, a Szewczuk és Wellman-Bednawska által közölt eljárást módosítva [Clin. Chim. Acta, 84, 19-26 (1978)]. Az adipinsavanhidridet Albertson és Lundmark eljárását módosítva állítjuk elő [Macromol. Sci. Chem., A27, 397-412 (1990)]. A 7-ADCA számos kereskedelmi forrásból beszerezhető, beleértve az E. R. Squibb & Sons, Ltd., NJ.-től és az Interchem Corp., NJ-től.

Ha arra van szükség, hogy a jelölt enzimeket gyorsan átvizsgáljuk, egy durva vizsgálattal, gyors kolorimetriás módszert alkalmazva, akkor az adipoil-7ADCA szubsztrát helyettesíthető egy kolorimetriás szubsztráttal, például az adipoil-PABA-val (paraamino-benzoesav), vagy adipoil-PNA-val (para-nitroanilin). Az oldallánc hasítása egy színt keltő molekulát eredményez, amelynek a jelenléte és koncentrációja könnyen meghatározható egy kolorimétert alkalmazva. A részletesebb, ezekre és egyéb megfelelő kolorimetriás módszerekre vonatkozó információkat a szakirodalomban megtalálhatjuk [Marelli, L. P., J. Pharm. Sci., 57, 2172-2173 (1968); Szász, G„ Clin. Chem., 75, 124-136 (1969); Szewczuk, A. et al., Analytical Biochemistry, 703, 166-169 (1980); Reyes, F. et al., J. Pharma. Pharmacol., 41, 136-137 (1989)].

Összehasonlítottuk a RAEV enzim N-terminális szekvenciáját az acyll és a GK16 enzim nagy alegységével, amelyeket az alábbiakban közlünk. Az összehasonlítás eredményeit az alábbiakban mutatjuk be (ahol a zárójelek azt mutatják, hogy nem lehet megfelelő összerendelést végezni):

RAEV - SEQ ID NO. 5

SN(S) (G)AVAPGKTANGNAL(L)LQN(P)

GK16 -SEQ ID NO. 6

SNSWAVAPGKTANGNALLLQNP acylI-SEQ ID NO. 7

SNNWAVAPGRTATGRPILAGDP

Ezekből a bemutatott szekvenciákból látható, hogy mind a három peptid rokonságban áll egymással. Azonban egy olyan fehéije, amely az előzőkben bemutatott N-terminális szekvenciához hasonló szekvenciával rendelkezik, nem szükségszerűen rendelkezik adipoil-aciláz aktivitással csakúgy, mint egy Arthrobacter törzs által termel penicillin G aciláz esetében. Másrészt, vannak olyan adipoil-acilázok, amelyek jól használhatók a jelen találmány szerinti eljárásban, és nem mutatnak jelentős homológiát az előzőkben bemutatott N-terminális szekvenciával. Például az Asahi acyl enzim és a Fujisawa Bacillus laterosporus J1 aciláz, amelyeket az előzőkben ismertetett táblázatban mutattunk be, és rendelkeznek valamennyi adipoil-7-ACA acilázaktivitással, nem rendel9

HU 217 171 Β keznek szekvenciahomológiával a többi bemutatott enzimet figyelembe véve. Ennek következtében a jelen találmány oltalmi köre, ami az új biológiai eljárás második lépésében használható adipoil-acilázokat illeti, úgy határozható meg, hogy egy jelölt enzim képes-e elhasítani az adipoil-7-ADCA adipoil oldalláncát, ami nagyon könnyen és megbízhatóan meghatározható, az előzőkben leírt módon.

Egyéb megközelítések is lehetségesek megfelelő adipoil-acilázok felfedezésére. Például az EP-A-0453 048 számú közzétételi iratban módszert írnak le a Pseudomonas Szintetikus-77-1 által termelt aciláz adipoilhasító aktivitásának javítására. Az a-alegységben különböző aminosavakat adott helyeken helyettesítve háromszor-ötször magasabb adipoilhasítás érhető el (adipoil-szerinnel). Az ilyen javított enzim szintén használható lehet a jelen találmányban. Meg kell jegyeznünk, hogy jóllehet az EP-A-0453048 láthatólag egy olyan acilázt ír le, amelynek fokozott aktivitása van az adipoil oldalláncokkal szemben, de nem ír le semmilyen olyan módszert (akár kémiai akár biológiai eljárást, amely bármely módon analóg lenne a jelen szabadalom leírásával), amellyel egy adipoil-cefalosporint lehetne létrehozni elsősorban.

Az alábbiakban a jelen találmány egyes előnyös megvalósítási módjainak részletes leírását adjuk meg, de ezeket csak illusztráció céljából adjuk meg, és semmiképpen nem korlátozzák a jelen találmány oltalmi körét.

1. példa

Penicillium chrysogenum-tenyésztési körülmények

Az ezekben az eljárásokban használt Penicillium chrysogenum törzset LCSB táptalajt tartalmazó lemezeken tartjuk fenn (1,5 tömeg/térfogat% laktóz monohidrát, 0,5 térfogat/térfogat% kukoricalekvár; 0,5 tömeg/térfogat% pepton, 0,4 törneg/térfogat% NaCl, 0,05 tömeg/térfogat% MgSO₄x7H₂O, 0,06 tömeg/térfogat% KH₂PO₄, 0,0005 tömeg/térfogat% FeCl₃x6H₂O, 0,0002 tömeg/térfogat% CuSO₄x5H₂), 3,0 tömeg/térfogat% agar; egy liter desztillált vízben, pH=4,8). 12 napig tartjuk 25 °C-on 65% relatív nedvességtartalom mellett, majd az egyedi telepeket eltávolítjuk és 2 ml steril desztillált vízhez adjuk, üveggyöngyöket tartalmazó csavaros tetejű csőben. A tenyészetet vortexeljük, majd a szuszpenziót használjuk rizses lombikok beoltására. A rizses lombikok 25 g Uncle Ben-féle konvertált rizst tartalmaznak 250 ml-es lombikban. A rizs természetes hosszú szemű rizs, háromszor mossuk négy térfogat desztillált vízzel hét percig, félpercenként megkeverjük, majd addig szárítjuk, amíg a rizs vízfelvétele körülbelül 25%. 12 napig tartjuk 25 °C-on 65%-os nedvességtartalom mellett, majd a 50 ml steril desztillált vízzel a spórákat lemossuk a rizsről. A spóraszuszpenziót használjuk folyadéktenyészetek beoltására, valamint a tenyészet liofilezésére, amit azután 4 °C-on tárolunk. A spórákat azonos térfogatú 5%-os fölözött tejhez adjuk, majd steril ampullákban liofilezzük.

A törzset két lépésben fermentáljuk rázott lombikokban, majd ezt használjuk penicillin előállítására, illetve az RNS vagy DNS forrásául szolgáló micéliumtömeg előállításában. Az oltást úgy végezzük, hogy 1x108 spórát adunk 50/500 ml lombikhoz, amely az alábbi összetételű táptalajt tartalmazza: 3,0 tömeg/térfogat% glükóz; 1,0 tömeg/térfogat% farmamédia; 3,0 tömeg/térfogat% kukoricalekvár; 0,2 tömeg/térfogat% ammónium-szulfát; 0,5 tömeg/térfogat% CaCO₃; 0,05 tömeg/térfogat% vízmentes kálium-dihidrogénfoszfát; 1,0 tömeg/térfogat% laktóz; 1,0 tömeg/térfogat% szárított élesztő; egy liter desztillált vízben. Az inkubálást 25 °C-on végezzük 65% relatív nedvességtartalom mellett, forgó rázóberendezésen (70 mm-es kitérés, 220/perc fordulatszám). 48 óráig tartó inkubálás után a termelési fázist azzal indítjuk, hogy 2 ml vegetatív oltóanyagot 35/500 ml-es lombikba teszünk, amely az alábbi összetételű táptalajt tartalmazza: 0,05 tömeg/térfogat% KH₂PO₄; 0,5 tömeg/térfogat% K₂SO₄; 1,0 tömeg/térfogat% (NH₄)₂SO₄; 12,0 tömeg/térfogat% laktóz; 2,75 tömeg/térfogat% farmamédia; 1,0 tömeg/térfogat% CaCO₃ (kicsapott); 1,0 térfogat/térfogat% disznózsír egy liter desztillált vízben (pH=6,6). Az autoklávozást követően, de az inokulálás előtt annyi steril 25%-os nátrium-adipátot (pH=6,6) adunk a táptalajhoz, hogy a végső nátrium-adipát-koncentráció 2,5% legyen. A beoltást követően az inkubálást ugyanolyan körülmények között végezzük, mint az inokulumkészités során, 5 -7 napig.

Ha micéliumra van szükség, hogy protoplasztokat készítsünk transzformáláshoz, vagy DNS-előállításhoz, a törzset 5O/5OO-es lombikban komplett táptalajon szaporítjuk [összetétele: 50 ml 20X Clutterbuck-féle sók (120 g NaNO₃, 10,4 g KC1, 10,4 g MgSO₄x7H₂O, 30,4 g KH₂PO₄); 2,0 ml Vogel-féle nyomelemek (0,3 mol/1 citromsav, 0,2 mol/1 ZnSO₄, 25 mmol/1 Fe (NH₄)₂(SO₄)₂x6H₂O, 10 mmol/1 CuSO₄, 3 mmol/1 MnSO₄, 8 mmol/1 bórsav, 2 mmol/1 Na₂MoO₄x2H₂O], 5 g tripton, 5 g élesztőkivonat, 10 g glükóz, egy liter desztillált vízben. Az inkubálást 25 °C-on rotációs vázán végezzük, 220/perc fordulatszámmal.

2. példa

A Penicillium genomiális DNS és össz-RNS izolálása

Egy, az előzőek szerint szaporított 48 órás tenyészet vegetatív micéliumát gézen átszűrve szűréssel kinyerjük, cseppfolyós nitrogénben lefagyasztjuk, majd éjszakán át liofilezzük. A szárított micéliumot dörzsmozsárban homokkal dörzsöljük, majd 25 ml 100 mmol/1 LiCl, 50 mmol/1 EDTA, 10 mmol/1 TRIS-HC1 pH=8,0, 4% SDS összetételű oldatban szuszpendáljuk. A szuszpenziót 60 °C-os vízfürdőben 50-55 °C-ra melegítjük, majd a keveréket először 1 mol/1 TRIS-szel (pH=8) telített fenollal, majd TRIS-szel telített fenol-kloroform 1:1 térfogatarányú elegyével, végül pedig kloroformmal extraháljuk. Az RNS-t kicsapjuk a vizes fázisból azonos térfogatú hideg LiCl hozzáadásával, majd a keveréket két-három óra hosszat -20 °C-on hagyjuk állni. 20 percig 4 °C-on centrifugáljuk 12 OOOxg-vel, majd a felülúszóhoz annyi etanolt adunk, hogy végkoncentrációja 66 térfogat/térfogat% legyen, majd a DNS kicsa10

HU 217 171 B pására 15 percre -20 °C-ra tesszük. A fentiekben leírt módon végzett centrifugálás után a DNS-üledéket 70%os etanollal mossuk, szárítjuk, majd TE-pufferben szuszpendáljuk (10 mmol/1 TRIS-HC1, pH = 7,5, 1 mmol/1 EDTA). A DNS-koncentrációt úgy becsüljük meg, hogy ismert DNS-standardokkal hasonlítjuk össze agaróz gélelektroforézis után etídium-bromiddal festve a gélt.

Az előző, 1. példában leírtak alapján készült Penicillium chrysogenum-tenyészeteket 96 óra hosszat 35 ml fermentációs táptalajon növesztjük (a fermentációs körülményeket az előzőkben ismertettük), 25 “Γόη forgó rázón 220/perc fordulatszámmal rázatva. A micéliumokat szűréssel nyerjük ki (Whatman #1 szűrőpapír) vákuumot alkalmazva, majd körülbelül 50 ml vízzel mossuk. A micéliumot azonnal eltávolítjuk a szűrőpapírról, 5 ml „feltáró puffer”-ben szuszpendáljuk (50 mmol/1 TRIS-HC1 pH = 7,4, 150 mmol/1 NaCl, 5 mmol/1 EDTA, pH=8,0, 5% SDS), cseppfolyós nitrogénben lefagyasztjuk, majd liofílezzük. Éjszakán át tartó liofilezés után 5 ml, 0,1% DEPC-t tartalmazó vizet és 5 ml 1 mol/1 TRIS-szel (pH = 8) telített fenol kloroform :izoamilalkoholt (50:50:1) adunk hozzá, majd a keveréket hagyjuk megolvadni 37 °C-on 20 percig, rázatás közben. Az elegyet 12 OOOxg-vel centrifugáljuk tíz percig 4 °C-on, majd a vizes fázist eltávolítjuk, és újra extraháljuk 1 mol/1 TRIS-szel (pH=8) telített fenol: kloroform .izoamil-alkohol (50:50:1) eleggyel, majd másodszor 1 mol/1 TRIS-szel (pH=8) telített fenollal, majd harmadszor kloroformmal. Azonos térfogatú 6 mol/1 LiCl-t egyesítünk a végső vizes fázissal, majd az oldatot 20 °C-on hagyjuk állni legalább néhány óra hosszat. Az össz-RNS-t 12 OOOxg-vel ülepítjük 4 °C-on 20 percig, majd az üledéket 0,3 ml TE-pufferben oldjuk, majd 0,03 ml nátrium-acetátot adunk hozzá, végül 2,5 térfogat etanolt, hogy újra kicsapjuk az RNS-t. A végső üledéket 0,1 ml TE-pufferben oldjuk, majd az RNS-koncentrációt spektrofotometriásán határozzuk meg, a 260 nm-en mért abszorbancia alapján.

3. példa

A Streptomyces clavuligerus tenyésztési körülményei

Az ezekben az eljárásokban használt Streptomyces clavuligerus az ATCC-nél 27064-es letéti számon szerepel (letétbe helyezés időpontja: 1971. május 18.). A törzset az alábbi összetételű agarlemezen tartjuk fenn: 4 g élesztőkivonat, 10 g malátakivonat, 4 g glükóz, 20 g agar, 1 liter desztillált vízben (pH=7,2). Öt napig növesztjük 30 °C-on, majd 2 ml steril vizet adunk a lemezekhez, majd a sejteket eltávolítjuk az agar felszínéről. A kapott szuszpenziót egy steril, csavaros tetejű csőbe visszük át, amelyben üveggyöngyök vannak. A sejteket vortexeljük, majd a szuszpenziót használjuk folyadéktenyészetek beoltására. Ezt a szuszpenziót használjuk a tenyészet folyamatos tárolására -70 °C-on, 15% glicerin hozzáadásával.

Ha a micéliumra protoplasztok készítésére transzformációhoz, vagy DNS-forrásként van szükség, akkor a sejteket 200ml/1000 ml-es lombikokban YEME-táptalajon szaporítjuk, amelynek az összetétele: 3 g élesztőkivonat, 5 g pepton, 3 g malátakivonat, 10 g glükóz, 340 g szacharóz, 1,02 g MgCl₂x6H₂O, 5 g glicin, 18 g agar, egy liter desztillált vízben. Az inkubálását forgó rázón végezzük 220/perc fordulatszámmal.

4. példa

Streptomyces genomiális DNS izolálása

Az előzőkben leírt módon készített, 48 órás vegetatív tenyészetet centrifugálással nyerünk ki (22 100xg, 10 perc). A sejteket 10 ml TE-pufferben szuszpendáljuk, majd 10 mg lizozimet adunk hozzá, és az elegyet 30 °C-on inkubáljuk 15 percig. Egy ml 20%-os SDS-t adunk hozzá, majd azonnal hozzáadunk 10 ml TE-vel (pH=8) telített fenolt és 1,5 ml 5 mol/l-es NaCl-t, és az elegyet 20 percig nagyon óvatosan kevertetjük. A fázisokat 12 OOOxg-vel választjuk szét (10 perc), azután a vizes fázist eltávolítjuk, és egy friss csőbe visszük át. Azonos térfogatú kloroformot adunk hozzá, és az elegyet 10 percig nagyon óvatosan kevertetjük. A fázisokat ismét elválasztjuk 12 000xg-vel 10 percig végzett centrifugálással, majd a vizes fázist ismét eltávolítjuk, és egy friss csőbe visszük át. Két térfogat izopropanolt adunk hozzá óvatosan, majd a kicsapódott DNS-t feltekerjük, és minimális térfogatú TE-pufferben oldjuk. RN-áz A-t adunk hozzá 20 mg/ml végkoncentrációban, majd az oldatot egy óra hosszat 50 °C-on inkubáljuk. Az oldatot ismét extraháljuk azonos térfogatú TE-vel (pH = 8) telített fenollal, majd kloroformmal. A végső extrakcióból származó DNS-t két térfogat izopropanol hozzáadása után feltekerjük, majd a koncentrációját spektrofotometriásán meghatározzuk, a 260 nm-en mért abszorbancia alapján.

5. példa

Génkönyvtár készítése és a Streptomyces clavuligerus expandáz gént tartalmazó DNSfragment izolálása

Az előzőkben leírt eljárással kapott Streptomyces clavuligerus genomiális DNS-t BamHI és Sáli restrikciós enzimmel emésztjük. Az emésztett DNS-t 0,8%-os agaróz gélen gélelektroforézisnek vetjük alá, majd az 1,8-2,2 kb méretű fragmenteket eluáljuk, és pUC18 DNS-be ligáljuk, amelyet előzőleg BamHI és Sáli restrikciós enzimekkel emésztettünk. A ligáló elegyből készült hígításokat használjuk arra, hogy kompetens JM109 sejteket transzformáljunk, elektroporáció segítségével (Gene Pulser, Bio-Rad, Richmond, CA). A kompetens sejtek előkészítését és az elektroporációs körülmények beállítását a gyártó előírásai szerint végezzük. A transzformációs keveréket LB-lemezekre szélesztjük, amelyek 100 mg/1 ampicillint és 75 ml 2%os X-Gal-t tartalmaznak. Éjszakán át 37 °C-on végzett inkubálás után a rekombináns telepeket azon az alapon azonosítjuk, hogy színtelenek, mivel a plazmid vektor β-galaktozidáz génjének aktivitását inaktiváltuk. A színtelen telepeket izoláljuk friss LB-lemezre, amely 100 mg/1 ampicillint tartalmaz. Éjszakán át inkubáljuk 37 °C-on, majd a telepeket nitrocellulóz szűrőlapra visszük át, és egy olyan próbával hibridizáltatjuk, ame11

HU 217 171 B lyet polimeráz láncreakcióval állítottunk elő, és amely megfelel a publikált Streptomyces clavuligerus expandáz gén szekvenciájának az 52-918 bázisok között [Kovacevic et al., Journal of Bacteriology, 171, 754-760 (1989); US 5,070,020]. A polimeráz láncreakció termékének jelzését random-primer extenziós reakcióval végezzük 32P-dCTP és egy Oligolabelling Kit felhasználásával, a gyártó előírásai szerint (Pharmacia, Piscataway, New Jersey). A hibridizációs reakciót 106 cpm radioaktívan jelzett próba jelenlétében végezzük, 5xSSC (0,15 mol/1 NaCl, 0,015 mol/1 nátriumcitrát, pH = 7), 0,1% SDS, 5 χ Denhardt-oldat (5 g Ficoll, 5 g polivinil-pirrolidon és 5 g BSA, 500 ml 50 χ tömény törzsoldatra számítva) és 100 mg/ml borjútimusz DNS-összetételű oldatban, éjszakán át, 37 °Con. Számos transzformáns erősen hibridizált a próbához. Egy telepről restrikciós endonukleázos elemzéssel igazoltuk, hogy tartalmazza azt a vektort, amely az expandáz gént hordozza, ennek a plazmidnak a pFTSO-1 jelzést adtuk.

6. példa

A plazmid DNS izolálása

A plazmidot tartalmazó Escherichia coli-tenyészeteket 500 ml LB-táptalajon növesztjük (20 g/1 LB Broth Base, Gibco, Paisley, Skócia) 15 mg/ml tetraciklin jelenlétében forgó rázón, 220/perc fordulatszámmal, 12-16 óra hosszat 37 °C-on. A sejteket centrifugálással ülepítjük (4000 χ g, tíz perc, 4 °C). A sejtüledéket 18 ml glükózpufferben szuszpendáljuk (50 mol/1 glükóz, 25 mmol/1 TRIS pH = 8,0, 10 mmol/1 EDTA), majd 2 ml 40 mg/ml koncentrációjú lizozimet (Sigma, St. Louis, MO) adunk hozzá glükózpufferben oldva, összekeverjük, majd a keveréket 15 percig szobahőmérsékleten inkubáljuk. Negyven ml frissen készített 0,2 mol/1 NaOH, 1% SDS összetételű oldatot adunk hozzá, majd az elegyet enyhén rázogatjuk, és tíz percre jégre helyezzük. Harminc ml 5 mol/1 káliumacetátot (pH=4,8) adunk hozzá, jól összekeverjük, majd a kapott elegyet további tíz percre jégre tesszük. A sejttörmeléket centrifugálással ülepítjük (4000 xg, tíz perc, 4 °C), majd a kapott felülúszót gézen átszűrjük. 0,6 térfogat izopropanolt adunk a szűrt felülúszóhoz, hogy a plazmid DNS-t kicsapjuk, a csapadék létrejötte szobahőmérsékleten történik 20 perc alatt. A plazmid DNS-t ülepítjük (4000xg, 20 perc, 4 °C), majd 70%-os etanollal mossuk, és röviden szárítjuk. Az üledéket 9 ml TE-pufferben oldjuk, majd 10 g CsCl-t és 0,387 ml 10 mg/ml koncentrációjú etídiumbromid-oldatot adunk hozzá. Ezt az oldatot centrifugáljuk 313,100xg-vel 24 óra hosszat. A cézium-klorid-gradiensen kapott plazmidcsíkot ultraibolya fényben láthatóvá tesszük, izoláljuk, majd az etídium-bromidot vízzel telített butanollal végzett extrakcióval eltávolítjuk. A plazmidpreparátumban levő CsCl-t TEpufferrel szemben végzett dialízissel távolítjuk el, majd végül a DNS PEG-gel (molekulatömeg 8000) töményítjük. A DNS koncentrációját spektrofotometriásán határozzuk meg, a 260 nm-en mért abszorbancia alapján.

7. példa

A pPenFTSO Penicillium transzformációs vektor készítése

Egy Penicillium transzformációs vektort készítünk, amely domináns szelekciós markerként fleomicinrezisztencia-gént tartalmaz. Ezt úgy végezzük el, hogy először egy 660 bp méretű fragmentet izolálunk, amely a fleomicinrezisztencia-gént tartalmazza (egy fleomicint megkötő fehérje génje Streptoalloteichus hindustanusból), majd kapcsoljuk egy élesztő-, citokróm Cl terminátorhoz, amely a pUT713 plazmid BamHI/BglII emésztéséből származik (CAYLA, Toulouse Cedex, Franciaország), elektroforézis és az agaróz gélből való elektroelúció után. Az izolált fragmentet a pSELECT*l vektor (Promega Corporation) BamHI hasítási helyére ligáljuk, majd a gén orientációját restrikciós enzimes elemzéssel határozzuk meg. Ezután egy 550 bázispár méretű PstI fragmentet építünk be, amely a lambda cos régióját tartalmazza, amely lehetővé teszi, hogy a vektort kozmid készítéséhez lehessen használni, ha megfelelő méretű inszertet építünk bele. Ezután egy 1,5 kb méretű NcoI/BamHI fragmentet, amely tartalmazza a Penicillium chrysogenum izopenicillin N szintetáz (IPNS) gén promoter régióját, izolálunk (elektroforézis és az agaróz gélből való elúció után) az IPNS-gént tartalmazó genomiális klón NcoI/BamHI restrikciós enzimmel végzett emésztése után. Az izolált IPNS-promoter-fragmentet a BamHI/NcoI restrikciós enzimekkel emésztett vektorba ligáljuk. Az Ncol hasítási hely a fleomicin rezisztenciagén ATG-startkodonjánál található. Ennek a vektornak a jele pUTZ-2.

A Streptomyces clavuligerus expandáz gént tartalmazó 1,645 kb méretű fragmentet a pFTSO-1 plazmid (egy előzőkben ismertetett vektor) BamHI és Sáli restrikciós enzimekkel való emésztése után tisztítjuk elektroforézissel és 0,8%-os agaróz gélből való elúcióval. Az izolált fragmentet a pSELECT vektorba (Promega Corporation) ligáljuk, amelyet szintén BamHI és Sáli enzimekkel emésztettünk. Ennek a vektornak a jelzése pFTSO-8. Egy új Ncol hasítási helyet hoztunk létre az expandáz gén ATG-startkodonjánál a pFTSO-8 plazmidban, az Altered Sites* in vitro mutagenezis-rendszer (Promega Corporation) alkalmazásával. A mutagenezist a gyártó előírásai szerint végezzük. Egy oligonukleotidot készítünk, amely a Streptomyces expandáz publikált szekvenciájának [Kovacevic et al., Journal of Bacteriology, 171, 3952-3958 (1990)] az ATG-startkodonnál levő DNSrégióval komplementer. Az oligonukleotidot cianoetilfoszforamidit-kémia alkalmazásával (Pharmacia Gene Assembler berendezés) szintetizáljuk, az oligonukleotid szekvenciája az alábbi:

SEQ ID NO. 8:

’ CGAGAGG ATC AGTGAGAGTCCATGGAC ACGACGG 5’

A mutagenezist restrikciós enzimes elemzéssel igazoljuk. Ezután egy 1,2 kb méretű Ncol fragmentet, amely a Penicillium chrysogenum izopenicillin N szintetáz gén promoter régióját tartalmazza, izoláljuk

HU217 171 Β egy, az IPNS-gén genomiális kiónjának Ncol restrikciós enzimmel végzett emésztése után (elektroforézis és agaróz gélből való elúció után). Az IPNS-promoter promoter régiót a pFTSO-8 vektorba ligáljuk arra az új Ncol hasítási helyre, amelyet az expandáz gén ATGstartkodonja előtt hoztunk létre mutagenezissel. A promotemek az expandáz génhez viszonyított orientációját restrikciós enzimes elemzéssel határozzuk meg. Ezt az IPNS-promoter:expandáz gén kazettát azután egy BamHI/Sall fragment formájában az előzőkben ismertetett pUTZ-2 Penicillium transzformációs vektor BamHI/Sall hasítási helyére építjük be. A végső konstrukció jelzése pPenFTSO.

8. példa

A Penicillium $-tubulin promoter klónozása

A Penicillium β-tubulin génjét egy Penicillium lambda genomiális könyvtárból klónozzuk, az Aspergillus niger β-tubulin génjét használva hibridizációs próbaként. Ennek a kiónnak a szekvenálása és az Aspergillus niger β-tubulin gén ismert aminosav-szekvenciájával való összehasonlítása egy 91%-os homológiát fedett fel, amely az ATG-kodonnál kezdődik. Egy funkcionális promotert tartalmazó szekvenciát lehetett izolálni az iniciációs kodon és az 1,4 kb távolságban (upstream) található BamHI hasítási hely között.

A Penicillium fi-tubulin promotert hordozó transzformációs vektor készítése Egy 2,0 kb méretű, a Penicillium β-tubulin promotert tartalmazó Xbal/HindlII fragmentet ligálunk a pSELECT vektorba (Promega Corporation), amelyet szintén Xbal/HindlII restrikciós enzimmel emésztettünk. Egy új Ncol hasítási helyet hozunk létre az ATG-startkodonnál helyspecifikus mutagenezissel, az Altered Sites in vitro mutagenezis rendszer alkalmazásával (Promega Corporation). A mutagenezist a gyártó előírásai szerint hajtjuk végre. Egy oligonukleotidot készítünk, amely az ATGstarthely környezetével komplementer, de amely számos változtatást tartalmaz, hogy egy Ncol hasítási hely jöjjön létre, majd ezt használjuk a mutagenezishez. Az oligonukleotidot cianoetil-foszforamidit kémia alkalmazásával szintetizáljuk (Pharmacia Gene Assembler berendezésen), és az oligonukleotid szekvenciája az alábbi:

SEQ ID NO. 9 ’ ATCTCTTTTCTAATACCTTCACCATGGGTGAG ATTGTACGTGATCCC 3’

A mutagenezis megtörténtét restrikciós enzimes elemzéssel igazoljuk. Ezután, egy 1,4 kb méretű, a Penicillium β-tubulin gén promoterét tartalmazó BamHI/NcoI fragmentet klónozunk a Streptomyces expandáz gén ATG-je előtt létrehozott Ncol hasítási helyre a BamHI/NcoI enzimekkel emésztett pFTSO-8 vektorba (ezt a vektort az előzőkben, a 7. példában ismertettük). Ennek a vektornak a jele btFTSO-8. A β-tubulin promotert tartalmazó, 1,4 kb méretű BamHI/NcoI fragmentet szintén ligáljuk a BamHI/NcoI restrikciós enzimekkel emésztett pUT2-2 vektorba (ezt a vektort az előzőkben, a 7. példában ismertettük). Ezzel a ligálással a β-tubulin promotert közvetlenül a fleomicinrezisztenciagén elé helyezzük. Ennek az új vektornak a jele pCI-6.

Ezután egy, a btFTSO-8 vektorból származó 2,4 kb méretű BamHI/HindlII fragmentet, amely a β-tubulin promoter expandáz génkazettát tartalmazza, a BamHI/HindlII restrikciós enzimekkel emésztett pCI-6 vektorba klónozzuk, így kapjuk a végső Penicillium transzformációs vektort, amelyben a Streptomyces expandáz gén és a fleomicinrezisztencia-marker a β-tubulin promoterről expresszálódik. Ennek a vektornak ajele pTS-2.

9. példa

A Penicillium (GAP) promoter klónozása

A Penicillium gliceraldehid-3-foszfát-dehidrogenáz (GAP) génjét egy Penicillium lambda genomiális könyvtárból klónozzuk, az Aspergillus niger GAP-génjét használva hibridizációs próbaként. Négy potenciális pozitív kiónt ismét átvizsgálunk egy PCR-eredetű próbával, amelyet a Cephalosporium GAP-gén [Kimura, H. et al., J. Ferm. and Bioeng., 71, 145-150 (1991)] 5’ régiójából származó indítómolekula segítségével állítottunk elő. A polimeráz láncreakció (PCR) indítómolekuláiként használt oligonukleotidokat cianoetilforszforamidit kémiával állítjuk elő (Pharmacia Gene Assembler berendezésen), szekvenciájuk az alábbi: SEQ IDNO. 10

5’ CGCGGATCCCGGCATCAACGGCTTCGGTCGTAT3’

SEQ ID NO. 11

5’CGCGGATCCGGGCACGCGCATGGACATGCCAGTG3’

A négy pozitív jelölt klón közül egy adott kereszthibridizációt a PCR-termékkel. Egy, ebből a genomiális klónból származó, négy kb méretű BamHI fragmentet ligálunk BamHI restrikciós enzimmel emésztett, pSELECT vektorba (Promega Corporation), szekvenálás céljából. Ennek a vektornak a jele pTS-0. Ennek a fragmentnek a szekvenálásával egy ATG iniciációs kodont lehetett azonosítani, a Cephalosporium ismert GAP-génjével való összehasonlítás alapján.

A Penicillium GAP-promotert tartalmazó transzformációs vektor készítése Ahhoz, hogy a Penicillium GAP-promotert a

Streptomyces expandáz génnel építsük össze, egy új Ncol hasítási helyet kell létrehozni a Penicillium GAPgén ATG-startkodonjánál, in vitro helyspecifikus mutagenezis és a pTS-0 vektor alkalmazásával. A mutagenezist a gyártó előírásai szerint végezzük. Egy oligonukleotidot készítünk, amely komplementer a GAP-gén ATG-startkodonjánál levő DNS-régió kódolószekvenciájával, de a benne levő változtatások révén egy Ncol hasítási helyet hozunk létre. Az oligonukleotidot cianoetil-forszforamidit kémia alkalmazásával szintetizáljuk (Pharmacia Gene Assembler berendezésen), és az oligonukleotid szekvenciája az alábbi:

SEQ IDNO. 12

5’ CAGTAAACGCAACCATGGTTGTCCAG 3’

A mutagenezis megtörténtét restrikciós enzimes emésztéssel igazoljuk. Ezután egy, a pTS-O-ból szárma13

HU217 171 Β zó, 1,9 kb méretű NcoI/BamHI fragmentet, amely a GAP-promotert tartalmazza, ligálunk az NcoI/BamHI restrikciós enzimekkel emésztett pFTSO-8 vektorba (ezt a vektort az előzőkben, a 7. példában ismertettük) oly módon, hogy a GAP-promotert a Streptomyces expandáz gén elé helyezzük. Ennek a vektornak a jelzése pTS-0-1. Ezután egy, a pTS-0-1 vektorból származó 3,0 kb méretű fragmentet, amely a GAP-promoter: expandáz kazettát tartalmazza, ligálunk a BamHI/HindlII restrikciós enzimekkel emésztett pCI-6 vektorba (ezt a vektort az előzőkben, a 8. példában ismertettük), így kapjuk a végső, pSD-1 jelű Penicillium transzformációs vektort, amelyben a Streptomyces expandáz gén a GAPpromoterről expresszál.

10. példa

A Penicillium chrysogenum transzformációja

A fentiekben ismertetett Penicillium chrysogenum törzs protoplasztjait úgy állítjuk elő, hogy 50 ml CM táptalajt oltunk 1 χ 107 spórával, majd 67 óra hosszat 25 °C-on rázatjuk 220/perc fordulatszámmal forgó rázóberendezésen. A micéliumot gézen átszűrve nyerjük ki, majd 500 ml-es lombikba tesszük át, és 25 ml KMPben szuszpendáljuk (0,7 mol/1 KC1, 0,8 mol/1 mannit, 0,02 mol/1 KPO₄, pH = 6,3), amely 100 mg Novozyme 234 enzimet tartalmaz (Novo Biolabs, Bagsvaerd, Dánia), és 30 °C-on 100/perc fordulatszámmal inkubáljuk. A szferoplasztokat szűréssel választjuk el (géz-üveggyapot szűrőkön), majd centrifugálással ülepítjük (350 x g, 10 perc). A szferoplasztokat ezután háromszor mossuk 10 ml KMP-pufferrel, és KMPC-ben szuszpendáljuk (KMP 50 mol/1 CaCl₂-vel) 5x 107 sejt/ml koncentrációban, majd 20 percig hagyjuk szobahőmérsékleten állni. A Penicillium transzformálásához a szferoplaszt szuszpenzióból 200 Sl-t hozzáadunk a DNS-oldathoz (5 Sg vektor DNS 6,2 ml KMPC-ben, 5 mg/ml heparin jelenlétében), 50 SÍ PPC-vel együtt (40% PEG, molekulatömege 3500, 20 mmol/1 KP04 pH=6,3, 5% CaCl₂ közvetlenül felhasználás előtt hozzáadva), majd az elegyet 30 percig jégen inkubáljuk. Egy ml frissen készített PPC-t adunk hozzá, majd az elegyet 50 ml olvasztott (50 °C) regeneráló agarba tesszük (CM plusz 1,3 mol/1 mannit és 3% agar). A transzformációs keveréket azután 5 Petri-csészére osztjuk szét. 24 órás regenerálás után (25 °C-on) a lemezeket OL-lel (1 % pepton, 1% agarban) rétegezzük le, amely 100 mg/50 ml fleomicint tartalmaz. A rétegző agar mennyisége azonos a regeneráló agar mennyiségével. A lemezeket 7-14 napig inkubáljuk 25 °C-on, majd figyeljük a transzformáns telepek keletkezését.

11. példa

Az adipoil-6-ΑΡΑ és adipoil-7-ADCA fermentációs termékek HPLC-vizsgálata

HPLC-t alkalmazunk a használt, transzformálatlan Penicillium chrysogenum törzs által termelt adipoil-6APA és a transzformált Penicillium chrysogenum által termelt adipoil-7-ADCA mérésére. Az elemzést Waters- rendszerrel végezzük, 625-ös oldószer-adagoló berendezés, 490E variábilis hullámhosszdetektor (220 nm-re és 254 nm-re állítva), 825-ös maxima adatkezelő rendszer, és egy Novo-C18 oszlop mint állófázis alkalmazásával. A mozgófázis (1 ml/perc áramlási sebesség mellett) 5 percig izokratikus 2% metanol/98% 0,01 mol/1 KH₂PO₄, pH=7,0, majd 15 percig 2-40%os lineáris metamol/0,01 mol/1 KH₂PO₄, pH=7,0 gradiens. Az adipoil-6-ΑΡΑ mennyiségi meghatározását a standard penicillinnel kapott standard görbe alapján végezzük, az adipoil-7-ADCS mennyiségi meghatározását standard dezacetoxi-cefalosporin C 254 nm-en felvett standard görbéje alapján végezzük.

Az adipoil-6-ΑΡΑ és az adipoil-7-ADCA penicillinázra való érzékenységének vizsgálatát 1 E/ml penicillináz I-nek vagy penicillináz ΙΙΓ-nak a szűrletekhez való hozzáadásával végezzük, szobahőmérsékleten 10-30 percig inkubálva a reakcióelegyet. Ezeket a mintákat az előzőkben leírt HPLC-körülményekkel azonos körülmények között futtatjuk.

Az adipoil-6-ΑΡΑ és az adipoil-7-ADCA UVspektrum elemzését Waters-rendszerrel végezzük, 510es oldószer-adagoló rendszer, 990-es fotodiódás detektor, és Novo-C18 oszlop, mint stacioner fázis alkalmazásával. A használt mobil fázis azonos az előzőkben leírt körülményekkel.

Az adipoil-7-ADCA termék nagy mennyiségben való izolálását teljes fermentációs közegből Watersrendszerrel végezzük, 510-es oldószer-adagoló rendszer, 990-es fotodiódás detektor, és 990-es adatgyűjtő rendszer, és egy mBondapak C18 preparatív oszlop, mint állófázis alkalmazásával. Az adipoil-7-ADCA termék retenciós idejének megfelelő abszorpciós csúcsot frakciószedővel gyűjtjük össze.

12. példa

Biológiai aktivitás vizsgálata

Agardiffúziós biológiai vizsgálatot alkalmazunk, hogy meghatározzuk a HPLC-vel izolált adipoil-6-ΑΡΑ és az adipoil-7-ADCA fermentációs termékek antibiotikus aktivitását. Az izolált termékből 20 Sl-t Bacillus subtilis ATCC 33677 vagy Escherichia coli Super Sensitive törzs [(Prof. Amold L. Demain, MIT) sejtekkel beoltott LB-agarlemez (20 g/1 LB Broth Base, 3% agar (Gibco, Paisley, Skócia)] 5 mm-es korongjaira visszük fel. A Bacillus subtilis törzset indikátortörzsként használjuk az adipoil-6-ΑΡΑ kimutatására, az Escherichia coli Super Sensitive törzset pedig az adipoil-7-ADCA termék kimutatására használjuk. 37 °C-on inkubáljuk 15 óra hosszat, ekkor a korong körül az indikátor mikroorganizmusgátolt növekedési udvara figyelhető meg, ez jelzi a biológiai aktivitást. Az ebben a kísérletben használható kontrollok közé tartozik a dezacetoxicefalosporin C, a cefalosporin C, a penicillin V, illetve a penicillinázt tartalmazó vagy nem tartalmazó agar kontrollként, a β-laktám struktúra igazolása céljából.

13. példa

RAEV-enzimvizsgálat

A teljes fermentációs közegből származó, tisztított adipoil-7-ADCA terméket használjuk szubsztrátként a RAEV-enzim specifikus aktivitásának meghatározá14

HU217 171 Β sára (a RAEV-enzim kereskedelmi forgalomban a RAEV Corp.-től szerezhető be). A reakcióelegy tartalmaz 10 mmol/1 szubsztrátot, 1 mg RAEV-enzimet, 5% glicerint, 0,16 mol/1 KH₂PO₄-ben 50 ml össztérfogatban, és 37 °C-on inkubáljuk. Ötmilliliteres alikvot részeket veszünk ki 0, 1, 3, 5, 10, 20 és 30 perc elteltével, 35 ml 0,01 mol/1 KH₂PO₄-gyel (pH=3,5) hígítjuk, majd -74 °C-ra lefagyasztva tároljuk a HPLC-elemzés előtt, az előzőkben leírt körülmények között.

A RAEV-enzim aktivitását egy kolorimetriás adipoil-P-amino-benzoesav szubsztráttal szemben az alábbi körülmények között határozzuk meg: a reakcióelegy összetétele 5 mmol/1 szubsztrát, 8,25 mg RAEV-enzim, 10% glicerin, 0,065 mol/1 KH₂PO₄-ben (pH = 7,0), 50 ml össztérfogatban; az inkubálást 30 percig végezzük 37 °C-on. A reakciót 96 lukas mikrotiterlemezeken hajtjuk végre. 50 SÍ 1 mol/l-es NaNO₂0,25 mol/l-es ecetsavban készített 1/100-as hígítását adjuk a reakcióelegyhez a reakció leállítása céljából, majd a reakcióelegyet 3 óra hosszat hagyjuk állni szobahőmérsékleten. 100 SÍ 10 mg/ml koncentrációjú 4-amino-5-hidroxi-2,7-naftalindiszulfonsav mononátrium sója hidrátját vízben oldjuk, ennek 0,5 mol/1 NaHCO₃-ban készült 1/100-szoros hígítását adjuk hozzá, majd a szín kifejlődését azonnal mérjük, 515 nmen, EL 312 Bio-kinetics Plate Reader (BioTek Instruments) alkalmazásával.

14. példa

A RAEV-enzimreakció termékének

HPLC-vizsgálata

Az összes, az adipoil-7-ADCA szubsztrátot alkalmazó RAEV- (kereskedelmi forgalomban a RAEV Corp.-től szerezhető be) enzimvizsgálatot, amelyet HPLC-vel követtünk, Waters-rendszerrel végeztük, 625-os oldószer-adagoló rendszert, 490E változtatható hullámhosszúságú detektort (203 és 254 nm-re állítva), 825 Maxima adatgyűjtő rendszert, és Novo-C18 oszlopot állófázisként alkalmazva használtunk. A mozgófázis (1 ml/perc áramlási sebesség mellett) összetétele 5 percig izokratikus 2%-os metanol/98%-os 0,01 mol/1 KH₂PO₄ (pH=3,5), majd 15 percig metanol/0,01 mol/1 KH₂PO₄ (pH = 3,5) 2-40%-os lineáris gradiense. Standard 7-ADCA-t használunk a reakciótermék retenciós idejének mérésére. A reakciótermék mennyiségi meghatározását a standard 7-ADCA 254 nm-en felvett standard görbéje alapján végezzük.

15. példa

Az adipoil-7-ADCA fermentációs termék

13C-NMR elemzése

A 13C-NMR (széles sávú, protonszétcsatolásos) spektrumát 75,4 MHz-en (7,1T) egy lBM-Af-350 spektrométeren vesszük fel, Fourier-transzformációs módban. A minták összetétele 50 mg adipoil-7-ADCA tennék fermentációs közegből, 0,5 ml D20 (99,8% D, Aldrich), vagy 0,5 ml DMSO-d6 (99,0% D, Aldrich), 5 mm-es csövekben, 350 K°-on. Az NMR-adatok megerősítették, hogy a termék adipoil-7-ADCA.

16. példa

Alternatív adipoil-aciláz enzimek vizsgálata

A RAEV-enzimmel végzett vizsgálatok mellett az adipoil-7-ADCA-ról (illetve egyéb adipoil-vegyületekről) az adipoil oldallánc eltávolítását számos különböző mikroorganizmus-fonásból származó enzimmel is ki lehetett mutatni. Egy kezdeti vizsgálatban a Pseudomonas sp. SE-83 és SE-495 törzseket (letétbe helyezve a Fermentation Research Institute-nál, FERM BP-817 és FERM BP-818 szám alatt), valamint a Pseudomonas SY-77-1 törzset (letétbe helyezve a Northern Régiónál Research Laboratory-nál NRRL B-8070 szám alatt) 72 óra hosszat szaporítjuk 2,0 tömeg/térfogat% HyCase SF; 0,5 tömeg/térfogat% mononátrium-glutamát; 0,5 tömeg/térfogat% élesztőkivonat, 0,2 tömeg/térfogat% kukoricalekvár-por, 0,5 tömeg/térfogat% gyapotmagolaj és 0,1 tömeg/térfogat% glutársav összetételű táptalajban. A sejteket centrifugálással nyerjük ki, majd 50 mmol/1 foszfátpuffenel (pH=8,0) mossuk; azután a pufferben szuszpendáljuk, és a külső membránokat kis mennyiségű kloroform hozzáadásával tesszük átjárhatóvá. A sejtszuszpenzió alikvot részeit adipoil-paranitroanilinnel (ad-PNA) keverjük össze, majd 30 °C-on inkubáljuk 2-18 óra hosszat. Az inkubálást követően a keveréket 10 (térfogat/térfogat)%-os ecetsavval lesavanyítjuk. A felszabadult p-nitroanilint azután kolorimetriás módszerekkel mutatjuk ki, diazovegyületté való átalakítása után, a Sigma Chemical Company által a gamma-glutamiltranszferáz vizsgálatához kit formájában szállított reagensek felhasználásával (Sigma-termékszám 545-A). A három törzs relatív aktivitása 100%, 85,5% és 48%, az SE-495, SE-83 és az SY-77-1 sonendben. Az előzőekben a RAEV-enzimre leírt módszerekhez hasonló módszerek alkalmazásával az SE-83 és az SE-495 enzimeknek adipoil-7-ADCA-val szembeni aktivitását is igazolni lehetett. Az SY-77-1 által termelt β-laktamáz megakadályozta a törzs dezacetilező aktivitásának igazolását az adipoil-7-ADCA-n.

Hasonló módszerekkel az adipoil-aciláz-termelést ki lehetett mutatni két gombatörzsnél is (a dátumok a letétbe helyezés időpontját jelölik; Alternaria sp. MA-133, ATCC 20492, 1977. április és Aspergillus sp. MA-13, ATCC 20491, 1977. március; US 4,141,790, Meiji Seika Kaisha Ltd.), valamint három további baktériumtörzsnél (Brevibacterium, ATCC

14.649, 1962. március 26.; Achromobacterium ATCC 14,648, 1962. március 26. és Flavobacteríum ATCC

14.650, 1962. március 26.), amelyeket cefalosporin C aciláz-termelőként írtak le a Merck & Co. részére megadott US 3,239,394 számú szabadalmi leírásban.

Az alábbiakban közöljük a szekvenciákra vonatkozó információkat.

SZEKVENCIALISTA

AZ 1. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI: A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 14 bázispár TÍPUSA: nukleinsav HÁNY SZÁLÚ: kettős TOPOLÓGIÁJA: lineáris

HU217 171 Β

MOLEKULATÍPUS: genomi DNS

AZ 1. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

TCTAGACACC ATGG 14

A 2. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI: A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 16 bázispár

TÍPUSA: nukleinsav

HÁNY SZÁLÚ: kettős

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: genomi DNS

A 2. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA

LEÍRÁSA:

GTGAGAGTTG ATGGAC 16

A 3. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI: A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 16 bázispár TÍPUSA: nukleinsav HÁNY SZÁLÚ: kettős TOPOLÓGIÁJA: lineáris MOLEKULATÍPUS: genomi DNS

A 3. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

TCTAGACACT ATGGAC 16

A 4. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI: A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 16 bázispár TÍPUSA: nukleinsav HÁNY SZÁLÚ: kettős

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: genomi DNS

A 4. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA

LEÍRÁSA:

TCTAGACACC ATGGAC 16

AZ 5. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 22 aminosav

TÍPUSA: aminosav HÁNY SZÁLÚ: egy TOPOLÓGIÁJA: lineáris MOLEKULATÍPUS: peptid

AZ 5. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

Ser Asn Ser Gly Alá Va1 Alá Pro Gly Lys hr Alá Asn Gly Asn Alá 15 10 15

Leu Leu Leu Gin Asn Pro 20

A 6. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 22 aminosav

TÍPUSA: aminosav

Ser Asn Ser Trp Alá Va1 Alá Pro 1 5

Leu Leu Leu Gin Asn Pro 20

A 7. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 22 aminosav

TÍPUSA: aminosav

HÁNY SZÁLÚ: egy TOPOLÓGIÁJA: lineáris MOLEKULATÍPUS: peptid

A 6. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA 35 LEÍRÁSA:

Gly Lys Thr Alá Asn Gly Asn Alá 10 15

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: peptid

A 7. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA

LEÍRÁSA:

Ser Asn Asn Trp Alá Va1 Alá Pro Gly Arg Thr Alá Thr Gly Arg Pro 15 10 15

I le Leu Alá Gly Asp Pro 20

A 8. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI: A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 34 bázispár TÍPUSA: nukleinsav HÁNY SZÁLÚ: egy TOPOLÓGIÁJA: lineáris MOLEKULATÍPUS: genomi DNS

A 8. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

CGAGAGGATC AGTGAGAGTC CATGGACACG ACGG 34

A 9. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI: A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 47 bázispár

HU 217 171 Β

TÍPUSA: nukleinsav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: genomi DNS

A 9. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

ATCTCTTTTC TAATACCTTC ACCATGGGTTG AGATTGTACG TGATCC 47

A 10. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 33 bázispár

TÍPUSA: nukleinsav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: genomi DNS

A 10. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

CGCGGATCCC GGCATCAACG GCTTCGGTCG TAT 3 3

All. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 34 bázispár

TÍPUSA: nukleinsav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: genomi DNS

All. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

CGCGGATCCG GGCACGCGCA TGGACATGCC AGTG 34

A 12. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 26 bázispár

TÍPUSA: nukleinsav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: genomi DNS

A 12. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

CAGTAAACGC AACCATGGTT GTCCAG 26

Claims (14)

1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK

   1. Eljárás 7-amino-dezacetoxi-cefalosporánsav (7ADCA) előállítására, azzal jellemezve, hogy

   i) izopenicillin-N termelésére képes, adipoil-6-ΑΡΑ szubsztrátú, adipoil-6-APA-t adipoil-7-ADCA-vá átalakítani képes, expandáz aktivitású enzimet kódoló, DNS-sel transzformált Penicillium chrysogenum törzset szaporítunk olyan táptalajon, amely képes biztosítani a törzs szaporodását, majd az említett táptalajhoz adipát forrást adunk, amely adipinsavat és/vagy annak egy vagy több sóját, és/vagy észterét tartalmazza, és ii) az i) lépésben előállított adipoil-7-ADCA-t adipoil-acilázzal hozzuk érintkezésbe, majd a termelődött 7-ADCA-t izoláljuk.
2. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy adipátforrásként dinátrium-adipátot alkalmazunk.
3. 3. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy expandáz enzimet kódoló DNS-ként Streptomyces clavuligerus ATCC 27064-ből származó DNS-t alkalmazunk.
4. 4. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy Pseudomonas fajból származó adipoil-acilázt alkalmazunk.
5. 5. Rekombináns DNS-expressziós vektor, azzal jellemezve, hogy expandáz enzimet kódoló DNS-ként Streptomyces clavuligerus ATCC 27064-ből származó expandáz enzimet kódoló DNS-t, és expandáz aktivitást kódoló DNS expresszióját vezérlő promoterként Penicillium chrysogenum IPNS-génpromotert tartalmaz.

   (Módosítási elsőbbsége: 1994. július 1.)
6. 6. Az 5. igénypont szerinti expressziós vektor, azzal jellemezve, hogy a pPenFTSO plazmid.

   (Módosítási elsőbbsége: 1994. július 1.)
7. 7. Rekombináns DNS-expressziós vektorral transzformáit Penicillium chrysogenum gazdasejt, azzal jellemezve, hogy a vektor Streptomyces clavuligerus ATCC 27064-ből származó, expandáz enzimet kódoló DNS-t és egy, a Penicillium chrysogenum IPNS-gén promoterét tartalmazó, az expandázt kódoló DNS expresszióját vezérlő promotert tartalmaz.

   (Módosítási elsőbbsége: 1994. július 1.)
8. 8. A 7. igénypont szerinti transzformált gazdasejt, azzal jellemezve, hogy az ATCC 74182 nyilvántartási számú PC 100-as törzs sejtje, és expressziós vektorként a pPenFTSO plazmidot tartalmazza.

   (Módosítási elsőbbsége: 1994. július 1.)
9. 9. Eljárás rekombináns Penicillium chrysogenum gazdasejt tenyésztésére, azzal jellemezve, hogy vektorként Streptomyces clavuligerus ATCC 27064-ből származó expandáz aktivitású enzimet kódoló DNS-t, valamint a DNS expresszióját vezérlő promoterként a Penicillium chrysogenum IPNS-génjének promoterét tartalmazó rekombináns DNS-expressziós vektort tartalmazó gazdasejtet génexpresszióra alkalmas körülmények között tenyésztünk.
10. 10. A 9. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy rekombináns gazdasejtként egy, pPenFTSOplazmidot tartalmazó, rekombináns DNS-expressziós vektort hordozó gazdasejtet alkalmazunk.
11. 11. Eljárás rekombináns DNS-expressziós vektor előállítására, azzal jellemezve, hogy Streptomyces clavuligerus ATCC 27064-ből származó expandáz aktivitású enzimet kódoló DNS-t és expandáz aktivitású enzimet kódoló, DNS expresszióját vezérlő promoterként a Penicillium chrysogenum IPNS-gén-promotert egy vektorba építünk be.
12. 12. Az 11. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy vektorként a pPenFTSO-plazmidot állítjuk elő.
13. 13. Eljárás rekombináns DNS-expressziós vektorral transzformált Penicillium chrysogenum gazdasejt előállítására, azzal jellemezve, hogy vektorként Strepto17

    HU 217 171 Β myces clavuligerus ATCC 27064-ből származó, expandáz aktivitású enzimet kódoló DNS-t, valamint a DNS expresszióját vezérlő promoterként a Penicilliitm chrysogenum IPNS-génjének promoterét tartalmazó vektorral transzformáljuk a gazdasejtet.
14. 14. A 13. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy expressziós vektorként az ATCC 74182 nyilvántartási számon letétbe helyezett PClOO-sejtekből előállítható pPenFTSO-plazmidot tartalmazó expressziós vektor5 ral transzformáljuk a gazdasejtet.