JP2000512511A - 脱アシル化セファロスポリンの発酵による製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、７−アシル化対応物の発酵的生産により、Ｎ−脱アシル化セファロスポリン化合物を製造する方法を開示する。

Description

【発明の詳細な説明】 脱アシル化セファロスポリンの発酵による製造方法 発明の分野 本発明は、７−ＡＤＣＡ等のＮ−脱アシル化セファロスポリン化合物の発酵に よる製造の分野に関する。 発明の背景 β−ラクタム抗生物質は、臨床的使用の長い歴史を有する最も重要な抗生物質 化合物のグループを構成する。このグループの中で、著名なものはペニシリン及 びセファロスポリンである。これらの化合物は、それぞれ、糸状菌、ペニシリウ ム・クリソゲナム(Penicillium chrysogenum)及びアクレモニウム・クリソゲナ ム(Acremonium chrysogenum)によって天然に生産される。 古典的な株改良技術の結果として、ペニシリウム・クリソゲナム及びアクレモ ニウム・クリソゲナムにおける抗生物質の生産レベルは過去10年間に劇的に増大 した。ペニシリン及びセファロスポリンを導く生合成経路の増加した知識、及び 組換えＤＮＡ技術の出現により、生産株の改良及びin vivoにおける化合物の誘 導のための新しい手段が利用できるようになった。 Ingolia及びQueener，Med．Res．Rev．9(1989)，245-264(生合成経路及び酵素 )、及びAharonowitz，Cohen，及びMartin，Ann．Rev．Microbiol．46(1992)，46 1-495（遺伝子クローニング）に記載されたように、β−ラクタム生合成に必要 とされるほとんどの遺伝子が同定され、それらの対応する遺伝子がクローニング された。 ペニシリン生合成における最初の２段階は、３種のアミノ酸、Ｌ−５−アミノ −５−カルボキシペンタン酸（Ｌ−α−アミノアジピン酸）(A)、Ｌ−システイ ン(C)及びＬ−バリン(V)のトリペプチドＬＬＤ−ＡＣＶへの縮合、次いでこのト リペプチドの環化によるイソペニシリンＮの形成である。この化合物は典型的な β−ラクタム構造を含む。 ペニシリン生合成における上記最初の２段階は、ペニシリン、セファマイシン 及びセファロスポリン生産真菌及び細菌においては通常である。 第三の段階は、酵素アシルトランスフェラーゼ（ＡＴ）の作用による、Ｌ−５ −アミノ−５−カルボキシペンタン酸によるイソペニシリンＮのＤ−α−アミノ アジピン酸側鎖の交換を含む。EP-A-0448180に記載されたように、ＡＴによって 仲介される酵素的交換反応は細胞小器官、微小体の中で生じる。 セファロスポリン生産生物においては、第三の段階はエピメラーゼによるイソ ペニシリンＮのペニシリンＮへの異性化であり、ペニシリンに特徴的な５員環構 造が酵素エキスパンダーゼ(expandase)により、セファロスポリンに特徴的な６ 員環構造に拡大する。 唯一の直接発酵される工業上重要なペニシリンは、それぞれ、疎水性側鎖前駆 体、フェノキシ酢酸又はフェニル酢酸をペニシリウム・クリソゲナムの発酵中に 添加し、それによって天然のβ−ラクタムの側鎖がフェノキシ酢酸又はフェニル 酢酸に置換されることにより生産される、ペニシリンＶ及びペニシリンＧである 。 セファロスポリンはペニシリンより高価である。一つの理由は、セファロスポ リン（例えばセファレキシン）が多くの化学変換によりペニシリンから製造され る。この点で、最も重要な出発材料であるセファロスポリンＣはいずれのｐＨに おいても非常に溶解性であり、従って扱いにくく高価なカラム技術を用いた、長 く高価な分離工程を暗示させる。この方法により得られたセファロスポリンＣは 、多くの化学及び酵素的変換により、治療的に用いられるセファロスポリンに変 換される。 現在、セファロスポリン中間体７−ＡＤＣＡはペニシリンＧの化学誘導により 製造される。７−ＡＤＣＡを製造するために必要な化学工程は、５員環ペニシリ ン環構造を６員環セファロスポリン環構造に拡大することを含む。 最近、７−ＡＤＣＡを得るための発酵によるプロセスが開示された。 EP-A-0532341において、アジペート（５−カルボキシペンタン酸）供給原料の 応用が、アジピル側鎖を有するペニシリン誘導体、すなわちアジピル−６−アミ ノペニシラン酸を生じることが見られる。この取り込みは、アシルトランスフェ ラーゼが広い基質特異性を証明するという事実による（Behrensら、 J.Biol.Chem．175(1948),751-809;Cole，Process.Biochem．1(1966)，334-338;B allioら、Nature 185(1960)，97-99)。更に、エキスパンダーゼを発現する組換 えペニシリウム・クリソゲナム株にアジペートを与えた場合、アジピル−６−Ａ ＰＡは対応するセファロスポリン誘導体に拡大される。最終的に、アジピル側鎖 の除去が示され、最終生成物として７−ＡＤＣＡが得られる。 特許出願EP-A-0540210は、ＡＤＣＡ環の３−メチル基をＡＣＡの３−アセトキ シメチル基に変換する余分な工程を含む、７−ＡCＡを製造するための同様のプ ロセスを開示している。 WO95/04148及びWO95/04149は、エキスパンダーゼを発現するペニシリウム・ク リソゲナムへの６又は７原子長の鎖を有する特定のチオ基を含むジカルボン酸の 供給原料を、上記前駆体のペニシリンバックボーンへの導入及びそれに続く対応 ７−ＡＣＤＡ誘導体への拡大を開示している。 しかし、一般に、ペニシリンＮ及びセファロスポリン生合成の間の重大な関連 を供給するエキスパンダーゼは狭い特異性を有し、不自然な側鎖を有するペニシ リンＮの酸化的環拡大を触媒する可能性を阻止する(Maeaら、Enzyme and Microb ial Technology(1995)17:231-234;Baldwinら、J.Chem.Soc.Chem.Commun．374-37 5，1987)。 今や驚くことに、７炭素原子より長い鎖を有するジカルボン酸の供給原料が６ 又は７原子長の鎖を有する側鎖を導入したβ−ラクタム誘導体を製造することを 見出した。 発明の要約 本発明は、以下の工程を含む、Ｎ−脱アシル化セファロスポリンの製造方法を 開示する。 β−ラクタムを製造し、アシルトランスフェラーゼ及びエキスパンダーゼを発現 する能力を有し、任意にアセチルトランスフェラーゼ及び／又はヒドロキシラー ゼ活性を発現する微生物株を下記式(1)の側鎖前駆体又はその塩、それらのエス テルまたはアミドの存在下で発酵させ； ＨＯＯＣ−Ｘ−（ＣＨ₂）_n−ＣＯＯＨ (1) （式中、ｎは２以上の偶数であり、 Ｘは（ＣＨ₂）_p−Ａ−（ＣＨ₂）_qであり、 式中、ｐ及びｑは、それぞれ０、１、２、３又は４であり、ＡはＣＨ＝ＣＨ、Ｃ ≡Ｃ、ＣＨＢ、Ｃ＝Ｏ、Ｏ、Ｓ、ＮＨ、任意に置換されている窒素又は任意に酸 化されているイオウであり、Ｂは水素、ハロゲン、Ｃ_1-3アルコキシ、ヒドロキ シ又は任意に置換されているメチルであり、ただしＡがＣＨ＝ＣＨ又はＣ≡Ｃで ある場合はｐ＋ｑは２又は３であり、ＡがＣＨＢ、Ｃ＝Ｏ、Ｏ、Ｓ又はＮＨであ る場合はｐ＋ｑは３又は４であり、上記側鎖前駆体がアシル−６−ＡＰＡ誘導体 を産生し、該アシルグループが下記式(2)の構造を有し、 ＨＯＯＣ−Ｘ−ＣＯ− (2) 上記式において、Ｘは上述した通りであり、 上記アシル−６−ＡＰＡ誘導体はin situで対応するアシル−７−ＡＤＣＡ誘 導体に拡大し、更に任意にアシル−７−ＡＤＡＣ又はアシル−７−ＡＣＡ誘導体 と反応する） 上記発酵培養液からアシル−７−セファロスポリン誘導体を回収し； 上記アシル−７−セファロスポリン誘導体を脱アシル化し； 結晶性７−セファロスポリン化合物を回収する。 発明の詳細な説明 本発明は、新規な側鎖前駆体の飼料を与えながらアシル化対応物の発酵による 生産により、Ｎ−脱アシル化セファロスポリン化合物（７−ＡＤＣＡ、７−ＡＤ ＡＣ又は７−ＡＣＡ）を製造する方法を開示する。 意外なことに、本発明は、β−ラクタム生産及びアシルトランスフェラーゼ及 びエキスパンダーゼ活性の発現能力を有する微生物株の７原子以上の長さの鎖を 有するジカルボン酸の存在下における発酵が、それぞれ６又は７原子長さの鎖を 有するアシル基を導入したアシル−７−ＡＤＣＡを製造することを見出した。 本発明によれば、アシル−７−ＡＤＣＡよりも付加的な７−アシル化セファロ スポリン、すなわちアシル−ＡＤＡＣ又はアシル−７−ＡＣＡが、それぞれ、ヒ ドロキシラーゼ又はヒドロキシラーゼ＋アセチルトランスフェラーゼを付加的に 発現すれば、β−ラクタム生産及びアシルトランスフェラーゼ及びエキスパンダ ーゼの発現能力を有する微生物株によって生産される。 本発明の方法において用いられるジカルボン酸は以下の式(1)の構造を有する 。 ＨＯＯＣ−Ｘ−（ＣＨ₂）_n−ＣＯＯＨ (1) 式中、ｎは２以上の偶数であり、 Ｘは（ＣＨ₂）_p−Ａ−（ＣＨ₂）_qであり、 式中、ｐ及びｑは、それぞれ０、１、２、３又は４であり、ただし、ｐ＋ｑは２ 、３又は４であり、ＡはＣＨ＝ＣＨ、Ｃ≡Ｃ、ＣＨＢ、Ｃ＝Ｏ、Ｏ、Ｓ、ＮＨ、 任意に置換されている窒素又は任意に酸化されているイオウであり、Ｂは水素、 ハロゲン、Ｃ_1-3アルコキシ、ヒドロキシ又は任意に置換されているメチルであ る。 本発明によれば、式(1)の側鎖前駆体又は塩、又はそれらのエステル又はアミ ドの存在下における上記微生物の発酵は、アシル基が以下の式(2)の構造を有す るアシル−７−セファロスポリン誘導体を生じる。 ＨＯＯＣ−Ｘ−ＣＯ− (2) 上記式において、Ｘは上述した通りである。 ６又は７原子長の鎖を有するアシル基を有するアシル−７−セファロスポリン 誘導体を得るためには、ＡがＣＨ＝ＣＨ又はＣ≡Ｃである場合はｐ＋ｑはそれぞ れ２又は３であり、ＡがＣＨＢ、Ｃ＝Ｏ、Ｏ、Ｓ、ＮＨである場合はｐ＋ｑはそ れぞれ３又は４であり、窒素は任意に置換されているか、イオウは任意に酸化さ れており、Ｂは上述した通りである。 従って、式(1)で示される前駆体化合物の存在下でβ−ラクタム生産、アシル トランスフェラーゼ及びエキスパンダーゼ活性の発現能力を有する微生物株の発 酵は式(2)で示されるアシル基を有するアシル−６−ＡＰＡ誘導体を産生し、次 いで拡大しin situにおいて対応するアシル−７−ＡＤＣＡ誘導体を産生する。 言い換えれば、上記式(1)で示される前駆体化合物は微生物株に代謝され式(2)の アシル基を生産する。次いで上記アシル基は、アシルトランスフェラーゼが仲介 する反応によってβ−ラクタム主鎖に組み入れられる。 式１の前駆体化合物の鎖長の上限、すなわちｎの上限は臨界的でない。上記上 限は、上記前駆体が微生物株に代謝される効率によって主に決定される。都合の いいことに、前駆体は、微生物株によって代謝され得る脂肪酸の最も長い鎖長と 同一の最も長い鎖を有する。 本発明の一態様において、ジカルボン酸の存在下における発酵により、アジピ ル−７−ＡＤＣＡ誘導体を産生するジカルボン酸が用いられる。アジピル−７− ＡＤＣＡを産生するために適したジカルボン酸は式(1)の構造を有し、式中、ｎ は２以上の偶数であり、Ｘは（ＣＨ₂）_p−Ａ−（ＣＨ₂）_qであり、式中、ｐは１ であり、１は２であり、ＡはＣＨ₂である。好ましくは、アジピル−７−ＡＤＣ Ａを産生するジカルボン酸はスベリン酸又はセバシン酸（それぞれ、ｎ＝２又は ４）である。 本発明の他の態様においては、式(2)のアシル基中にチオ基を含むアシル−７ −ＡＤＣＡ誘導体を産生するジカルボン酸が用いられる。このようなアシル−７ −ＡＤＣＡ化合物を産生するのに適したジカルボン酸は式(1)の構造を有し、ｎ は２以上の偶数であり、Ｘは（ＣＨ₂）_p−Ａ−（ＣＨ₂）_qであり、ＡはＳである 。好ましくはｐ及びｑは１、２又は３であり、ｐ＋ｑは３又は４である。最も好 ましくは、ｐは１であり、ｑは２であり、又はｐは２でありｑは１又は２である 。 本発明の他の２つの態様においては、新規なアシル−７−セファロスポリン誘 導体を産生するジカルボン酸が用いられる。 初めに、上記ジカルボン酸の存在下における発酵によりピメリル−７−ＡＤＣ Ａ誘導体を産生するジカルボン酸が用いられる。ピメリル−７−ＡＤＣＡを産生 するのに適したジカルボン酸は式(1)の構造を有し、式中、ｎは２以上の偶数で あり、Ｘは（ＣＨ₂）_p−Ａ−（ＣＨ₂）_qであり、ｐ及びｑは２でありＡはＣＨ₂ である。好ましくは、ピメリル−７−ＡＤＣＡを産生するジカルボン酸はアゼラ イン酸である(ｎ＝２)。 更に、式(2)のアシル基において不飽和結合を含むアシル−７−ＡＤＣＡ誘導 体を産生するジカルボン酸が用いられる。このようなアシル−７−ＡＤＣＡ化合 物を産生するのに適したジカルボン酸は式(1)の構造を有し、式中、ｎは２以上 の偶数であり、Ｘは（ＣＨ₂）_p−Ａ−（ＣＨ₂）_qであり、ＡはＣＨ＝ＣＨ又はＣ ≡Ｃである。好ましくはＡはＣＨ＝ＣＨであり、ｐ及びｑは両方とも１である。 その結果、後者の化合物のトランス異性体が最も好ましい。 本発明の方法に使用することのできる微生物株はβ−ラクタム生産、アシルト ランスフェラーゼ及びエキスパンダーゼ活性の発現能力を有する株である。任意 に、上記微生物株は更にヒドロキシラーゼ又はヒドロキシラーゼ及びアセチルト ランスフェラーゼ活性を発現する。前者の株はアシル−７−ＡＤＣＡ誘導体を産 生し得るが、後者の株はアシル−７−ＡＤＡＣ又はアシル−７−ＡＣＡ誘導体を 産生し得る。 そのような微生物株の例は、エキスパンダーゼ発現を提供する発現カセットを 提供するペニシリン生産株、及びアシルトランスフェラーゼ発現を提供する発現 カセットを提供するセファロスポリン生産株を含む。 都合よく用いられるエキスパンダーゼ遺伝子は、アクレモニウム・クリソゲナ ム(Acremonium chrysogenum)、ストレプトミセス・クラブリゲラス(Streptonyce sclavuligerus)、ストレプトミセス・アンチバイオテイクス(Stroptomycesantib ioticus)又はノカルディア・ラクタムドウランス(Nocardia lactamdurms)に由来 する。アシルトランスフェラーゼ遺伝子は、ペニシリウム・クリソゲナム、ペニ シリウム・ナルギオベンス(P.nalgiovense)又はアスペルギルス・ニドウランス( A.nidulans)から生じる。 好ましい態様において、組換え的にエキスパンダーゼを発現するペニシリン生 産真菌株株が用いられる。更に好ましくは、アスペルギルス又はペニシリウム族 の真菌であり、最も好ましくはペニシリウム・クリソゲナムである。ペニシリウ ム・クリソゲナム株Panlabs P14-B10、DS18541（受け入れ番号455.95でＣＢＳに 寄託されたエキスパンダーゼ発現のための適当な宿主の例である。 組換えエキスパンダーゼ−発現株の構築は当業者の知識の範囲内である。組換 えエキスパンダーゼ−発現真菌株の構築に用いることのできる発現カセットの例 は、ＥＰ−Ａ−０５３２３４１、Crawfordら(Biotechnol．13(1995)，58-62)及 びWO95/04148に開示されている。十分に高い濃度のエキスパンダーゼ発現を有す る形質転換株を選択するために注意すべきである。そのような形質転換体は、例 えばCrawfordら（上述）によって記載されたアジピル−７−ＡＤＣＡの生産能力 を試験することによって選択することができる。 異なる態様においては、組換え的にアシルトランスフェラーゼを発現するセフ アロスポリン生産株、例えばアシルトランスフェラーゼ生産アクレモニウム・ク リソゲナムが用いられる。アクレモニウム・クリソゲナムは、本来ヒドロキシラ ーゼ及びアシルトランスフェラーゼを発現するので、このような組換え的にアシ ルトランスフェラーゼを発現する株は結果としてアシル−７−ＡＣＡ誘導体を生 産する。 更に、本発明は、特定の解決方法を用いた本発明の微生物発酵の発酵培養液か らアシル−７−セファロスポリン誘導体を回収する方法、例えば、エキスパンダ ーゼ発現ペニシリウム・クリソゲナム株の発酵培養液からアジピル−、ピメリル 、２−（カルボキシエチルチオ）アセチル−、３−カルボキシメチルチオ）プロ ピオニル−又はトランスβ−ヒドロムコニル−７−ＡＤＣＡ等のアシル−７−Ａ ＤＣＡ誘導体を回収する方法を開示する。 特に、培養ろ過物を水と混和しない有機溶媒で、約4.5より低いｐＨで抽出し 、４〜１０の間のｐＨで逆抽出することにより、発酵培養液から７−アシル化セ ファロスポリン誘導体が回収される。 培養液をろ過し、該ろ過液に水と混和しない有機溶媒を加える。水相から７− アシル化セファロスポリン誘導体を抽出するために、ｐＨを調製する。ｐＨの範 囲は４．５より低くなければならず、好ましくは１〜４であり、更に好ましくは １〜２である。この方法において、７−アシル化セファロスポリン誘導体が発酵 培養液中に存在する他の不純物から分離される。好ましくは、少量の有機溶媒、 例えば水相の容積に対して半分の容積の有機溶媒が用いられ、７−アシル化セフ ァロスポリン誘導体の濃縮溶液が得られ、体積流量の減少が達成される。第二の 可能性は、４以下のｐＨにおける培養液の抽出である。好ましくは、培養液を水 と混和しない有機溶媒で１〜４のｐＨで抽出する。 セファロスポリン分子に干渉しない、いずれの溶媒も用いることができる。適 当な溶媒は、例えば酢酸ブチル、酢酸エチル、メチルイソブチルケトン、ブタノ ール等のアルコール等である。好ましくは１−ブタノール又はイソブタノールが 用いられる。 今後は、７−アシル化セファロスポリン誘導体は４〜１０，好ましくは６〜９ のｐＨにおいて水で抽出される。再び最終容量を減少することができる。回収は ０〜５０℃の温度で、好ましくは周囲温度で実施することができる。 ７−アミノ基が適当なアシル側鎖の存在により適切に保護されるので、本発明 の方法により製造された７−アシル化セファロスポリン誘導体が半合成セファロ スポリンの化学合成のための中間体として都合よく用いられる。 また、適当な酵素、例えばシュードモナスSE83アシラーゼを用いた一工程酵素 的方法において７−アシル化セファロスポリン誘導体が脱アシル化される。 好ましくは、酵素を繰り返し用いるために、固定化酵素が用いられる。このよ うな粒子の調製及び酵素の固定化のための方法論は、EP-A-0222462に広範に開示 されている。水溶液は、例えばｐＨ４〜ｐＨ９の値を有し、セファロスポリンの 分解反応は最小化され、酵素による望ましい変換が最適化される。従って、例え ば、水酸化カルシウム溶液等の無機塩基を加えるか、陽イオン交換樹脂に適用し てｐＨを適当なレベルに維持しながら酵素をセファロスポリン溶液に加える。反 応が完了した時に、固定化酵素をろ過により除去する。他の可能性は、固定又は 流動化ベッドカラムにおける固定化酵素の応用、又は溶液中における酵素の使用 及びメンブランろ過による生産物の除去である。次いで、水と混和する有機溶媒 の存在下で反応混合物を酸性化する。ｐＨを約０．１〜１．５に調整した後、水 相のｐＨを２〜５に調整する。次いで、結晶化Ｎ−脱アシル化セファロスポリン をろ過する。 脱アシル化は、当業界で知られているように、例えば１０℃以下の温度で五塩 化リンを加え、次いで周囲温度以下でイソブタノールを加え、イミノクロライド 側鎖を形成し、化学的に実施される。 実施例１ アシル−７−ＡＤＣＡの発酵的製造 受託番号455.95でＣＢＳに寄託されたペニシリウム・クリソゲナム株Panlabs P14-B10を、エキスパンダーゼ発現カセット構築物のための宿主株として用いた 。 ペニシリウム・クリソゲナムIPNS遺伝子転写性及び翻訳性制御シグナルを含む 、用いられる発現カセットがCrawfordら（上述）に記載されている。形質転換及 び培養条件は、Crawfordら（上述）に記載された通りである。形質転換体 を生成し、Crawfordら（上述）に記載されたように、アジピル−７−ＡＤＣＡの 生産能力を試験することによりエキスパンダーゼ酵素の発現を解析した。 アシル−７−ＡＤＣＡ生産形質転換体を、グルコース,30g/l：ファルマメディ ア（コットンシードミール）,10g/l；コーンスチープリカー,20g/l；(NH₄)₂SO₄, 20g/l；CaCO₃,5g/l；KH₂PO₄,0.5g/l；ラクトース,10g/l；イーストエキストラク ト,10g/lを含み、滅菌前のｐＨが５．６の種培地に2.106分生子／ｍｌに接種し た。 上記種培養（綿栓で閉じた250mlの三角フラスコ中の20ml）を220rpmで25℃で インキュベートした。４８時間後、1mlを、KH₂PO₄,0.5g/l；K₂SO₄,5g/l；(NH₄)₂ SO₄,17.5g/l；ラクトース,140g/l；ファルマメディア,20g/l；CaCO₃,10g/l；ラ ード油,10g/lを含み、滅菌前のｐＨが6.6の生産培地15mlに接種した。 種培養による接種後、選択され、KOHでｐＨを6.5に調整された前駆体の２０％ 溶液を最終濃度が０．５％になるように発酵に加えた。 生産培養を、ミルクフィルターで閉じた250mlの三角フラスコ中で220rpmで25 ℃、168時間培養した。蒸発水を、一日おきに補充した。 生産培養の終わりに、菌糸体を遠心又はろ過により除去し、アシル−７−ＡＤ ＣＡをＨＰＬＣで分析した。 実施例２ アシル−７−ＡＤＣＡ生産の分析 形質転換ペニシリウム株からの発酵生産物を、高速液体クロマトグラフィー( ＨＰＬＣ)で分析した。ＨＰＬＣシステムは、以下の構成要素からなる。P1000溶 媒デリバリーシステム(ＴＳＰ)、オートサンプラーモデルベーシックマラソン(S park Holland)(インジェクションボリューム3)、UV150（ＴＳＰ）可視波長検出 器（260nmにセットされた）及びPC1000データシステム(ＴＳＰ)。固定相は、YMC パックODS AQ 150*4.6mmカラムである。ｐＨ６．０の８４％リン酸バッファーを 含む移動相に、０.１７％テトラブチルアンモニウム硫酸水素塩及び１６％アセ トニトリルを加えた。生産物は、予想されるアシル−７−ＡＤＣＡの検量線との 比較により定量した。実施例３ アシル−７−ＡＤＣＡ生産物の同一性 組換えエキスパンダーゼ発現ペニシリウム・クリソゲナム株を、以下の前駆体 、すなわち、アジピン酸、スベリン酸、セバシン酸、ピメリン酸及びアゼライン 酸の存在下で実施例１に従って培養した。 上記発酵の発酵生産物の実施例２による分析は、アジピン酸、スベリン酸及び セバシン酸の存在下の発酵がアジピル−７−ＡＤＣＡを製造するが、ピメリン酸 又はアゼライン酸を接種した場合にはピメリル−７−ＡＤＣＡが製造されること を示した。 発酵の間に高濃度のスベリン酸を用いた場合(０．５％に代えて２．０％)、少 量であって、重要ではないスベリル−７−ＡＤＣＡがアジピル−７−ＡＤＣＡの 次に検出された。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ， ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，Ｌ Ｓ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ， ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，Ｅ Ｅ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＧＷ，ＨＵ ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ， ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，Ｍ Ｄ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ， ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，Ｕ Ｚ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者 デ フローム エリック オランダ エヌエル―2313イェーエム レ イデン デ メーイ ファン ストレーフ ケルクストラート 65 (72)発明者 リュフテン ブルグ ヨハニス オランダ エヌエル―2341エヌカー ウー ヘストヘースト ラーン ファン アウト プールヘースト 22 (72)発明者 シッペル ディルク オランダ エヌエル―2612ハーエル デル フト オーストシンヘル 205 (72)発明者 ヴォーレブレヒト アドリアヌス ウィル ヘルムス ヘルマヌス オランダ エヌエル―2671ウェーゼット ナールトウェイク ベレークラウ 13 (72)発明者 ボーフェンベルグ ルーロフ アリー ラ ンス オランダ エヌエル―3062ゼットデー ロ ッテルダム スフラーフェンウェッヒ 121

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．以下の工程を含む、Ｎ−脱アシル化セファロスポリン化合物の製造方法。 β−ラクタムを製造し、アシルトランスフェラーゼ及びエキスパンダーゼを発 現する能力を有し、任意にアセチルトランスフェラーゼ及び／又はヒドロキシラ ーゼ活性を発現する微生物株を下記式(1)の側鎖前駆体又はその塩、それらのエ ステルまたはアミドの存在下で発酵させ； ＨＯＯＣ−Ｘ−（ＣＨ₂）_n−ＣＯＯＨ (1) （式中、ｎは２以上の偶数であり、 Ｘは（ＣＨ₂）_p−Ａ−（ＣＨ₂）_qであり、 式中、ｐ及びｑは、それぞれ０、１、２、３又は４であり、ＡはＣＨ＝ＣＨ、Ｃ ≡Ｃ、ＣＨＢ、Ｃ＝Ｏ、Ｏ、Ｓ、ＮＨ、任意に置換されている窒素又は任意に酸 化されているイオウであり、Ｂは水素、ハロゲン、Ｃ_1-3アルコキシ、ヒドロキ シ又は任意に置換されているメチルであり、ただしＡがＣＨ＝ＣＨ又はＣ≡Ｃで ある場合はｐ＋ｑは２又は３であり、ＡがＣＨＢ、Ｃ＝Ｏ、Ｏ、Ｓ又はＮＨであ る場合はｐ＋ｑは３又は４であり、上記側鎖前駆体がアシル−６−ＡＰＡ誘導体 を産生し、該アシルグループが下記式(2)の構造を有し、 ＨＯＯＣ−Ｘ−ＣＯ− (2) 上記式において、Ｘは上述した通りであり、 上記アシル−６−ＡＰＡ誘導体はin situで対応するアシル−７−ＡＤＣＡ誘 導体に拡大し、更に任意にアシル−７−ＡＤＡＣ又はアシル−７−ＡＣＡ誘導体 と反応する） 上記発酵培養液からアシル−７−セファロスポリン誘導体を回収し； 上記アシル−７−セファロスポリン誘導体を脱アシル化し； 結晶性７−セファロスポリン化合物を回収する。 ２．用いられる上記式(1)の側鎖前駆体が、ｎが２以上の偶数であり、Ｘが （ＣＨ₂）_p−Ａ−（ＣＨ₂）_qであり、ｐが１、ｑが２、ＡがＣＨ₂である、請求 の範囲第１項記載の方法。 ３．上記側鎖前駆体がスベリン酸又はセバシン酸である、請求の範囲第２項記載 の方法。 ４．用いられる上記式(1)の側鎖前駆体が、ｎが２以上の偶数であり、Ｘが （ＣＨ₂）_p−Ａ−（ＣＨ₂）_qであり、ｐ及びｑが２であり、ＡがＣＨ₂である、 請求の範囲第１項記載の方法。 ５．上記側鎖前駆体がアゼライン酸である、請求の範囲第４項記載の方法。 ６．上記微生物株が、エキスパンダーゼ発現のために供給される発現カセットを 供給するペニシリン生産株である、請求の範囲第１項〜第５項のいずれか１項記 載の方法。 ７．上記ペニシリン生産株がペニシリウム・クリソゲナムである、請求の範囲第 ６項記載の方法。 ８．上記結晶性セファロスポリン化合物が７−ＡＤＣＡである、請求の範囲第６ 項又は７項記載の方法。 ９．上記微生物株が、アシルトランスフェラーゼ発現を供給する発現カセットを 供給するセファロスポリン生産株である、請求の範囲第１項〜第５項のいずれか １項記載の方法。 10．セファロスポリン生産株がアクレモニウム・クリソゲナムである、請求の範 囲第９項記載の方法。 11．上記結晶性セファロスポリン化合物が７−ＡＣＡである、請求の範囲第９項 又は１０項記載の方法。