DE69232581T2 - Adipoyl 7-aminodeacetyl-Cephalosporansäure - Google Patents

Adipoyl 7-aminodeacetyl-Cephalosporansäure

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Description

  • Die vorliegende Erfindung betrifft Adipoyl-7-aminodesacetylcephalosporansäure als wertvolles Zwischenprodukt zur Herstellung von 7-Aminodesacetylcephalosporansäure.
    • Hintergrund der Erfindung 1. Gebiet der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung betrifft das Gebiet der synthetischen Verfahren zur Herstellung von gewerblichen Cephalosporin-Antibiotika. Derzeit gibt es eine große Anzahl derartiger Antibiotika. Diese therapeutischen Mittel liegen nun in ihrer vierten Generation vor. Die große Vielzahl von Seitenketten, die in gewerblichen Cephalosporinen auftreten, und die erhebliche wirtschaftliche Bedeutung der Cephalosporine haben dazu geführt, daß der Bereitstellung wirtschaftlicherer und wirksamerer Verfahren zur Herstellung von Schlüsselzwischenprodukten, die eine einfache Synthese der verschiedenen Cephalosporine ermöglichen, erhöhte Bedeutung beigemessen wird.
  • Eines dieser Schlüsselzwischenprodukte ist 7-Aminocephalosporansäure (7-ACA), die sich durch folgende Formel wiedergeben läßt:
  • Derzeit wird 7-ACA aus Cephalosporin C gebildet. Cephalosporin C selbst ist ein Fermentationsprodukt, das das Ausgangsmaterial für nahezu alle derzeit auf dem Markt befindlichen Cephalosporine darstellt. Jedoch beginnt die synthetische Manipulation zur Herstellung dieser verschiedenen gewerblichen Cephalosporine im Grunde in den meisten Fällen mit 7- Aminocephalosporansäure, die von Cephalosporin C durch Spaltung der 7- Aminoadipoylseitenkette abgeleitet werden muß. Zu typischen gewerblichen Cephalosporinen, die sich synthetisch von 7-ACA ableiten und die somit die 3-Acetyloxymethylen-Seitenkette aufweisen, gehören Cefotaxim, Cephaloglycin, Cephalotin und Cephapirin.
  • Derzeit wird 7-ADAC ebenfalls aus Cephalosporin C durch Entfernung der 7-D-α-Aminoadipoyl-Seitenkette zusammen mit der Umwandlung der 3-Acetyloxymethylen-Seitenkette zu 3-Hydroxymethyl hergestellt. 7-ADAC stellt ein wertvolles Zwischenprodukt bei der Synthese von Cephalosporinen mit einem Gehalt an modifizierten Substituenten in der C-3-Stellung dar.
  • Derzeit verläuft das Verfahren der Wahl auf dem Gebiet der Spaltung der 7-Aminoadipoyl-Seitenkette auf chemischem Wege. Das grundlegende Iminohalogenid-Verfahren erfordert das Blockieren der Amino- und Carboxylgruppen an der 7-Aminoadipoyl-Seitenkette. Zur Erreichung dieses Ziels werden derzeit mehrere Verfahren eingesetzt. Jedoch hat das chemische Spaltungsverfahren, wie es derzeit eingesetzt wird, ernsthafte Nachteile. Dazu gehören die Erfordernisse eines mehrstufigen und komplexen Verfahrens, äußerst niedrige Arbeitstemperaturen, teure Reagenzien, erhebliche Mengen an Verfahrensnebenprodukten, die zu Abwasserbehandlungsproblemen führen, und die Reinigung eines hochgradig unreinen Ausgangsmaterials, bevor die chemische Behandlung beginnt. Infolgedessen sucht man ständig nach einem mikrobiologischen oder fermentativen Verfahren, das die enzymatische Desacylierung von Cephalosporin C unter Bereitstellung von 7-Aminocephalosporansäure auf einer im Vergleich zum derzeit angewandten chemischen Verfahren wirtschaftlicheren Basis ermöglicht.
  • Jedoch hat sich diese Suche nach einem erfolgreichen mikrobiologischen Verfahren weitgehend als vergeblich erwiesen. Wie aus der Literatur klar wird, ist dies auf die Struktur und insbesondere auf die stereochemische Beschaffenheit der Aminoadipoyl-Seitenkette des Cephalosporin C- Moleküls zurückzuführen, da Penicillin erfolgreich durch enzymatische Spaltung unter Verwendung von Penicillin-acylase, die von einer Vielzahl von Mikroorganismen gebildet wird, desacyliert wurde. Berichte über eine erfolgreiche einstufige, enzymatische Desacylierung von Cephalosporin C in der Literatur haben sich andererseits häufig als unreproduzierbar erwiesen oder ergeben nur marginale Ausbeuten. Demzufolge betrifft die vorliegende Erfindung insbesondere das Gebiet der Herstellung des Cephalosporin-Schlüsselzwischenprodukts 7-ACA und ganz besonders das Gebiet der biologischen Verfahren zur Herstellung von 7-ACA.
  • Bisher hat sich die Suche nach einem erfolgreichen biologischen Verfahren zur Herstellung von 7-ACA weitgehend als vergeblich erwiesen, was mit Sicherheit für ein Verfahren im gewerblichen Maßstab gilt. Während es beispielsweise möglich ist, 6-Aminopenicillansäure (6-APA) durch direkte Fermentation und/oder durch enzymatische Behandlung von Penicillin G herzustellen, wobei nur noch eine Ringerweiterung zur Bildung von 7-ADCA erforderlich ist, hat es sich ungünstigerweise herausgestellt, daß Cephalosporium- oder Streptomyces-Enzyme, die eine Ringerweiterung in den normalen Stoffwechselwegen dieser Mikroorganismen durchführen, 6-APA als Substrat nicht annehmen. Diese Enzyme, die im Stand der Technik kollektiv als DAOCS oder Expandase-Enzym bezeichnet werden, sind als Enzyme definiert, die die Erweiterung von penam-Ringstrukturen, die in Molekülen vom Penicillin-Typ auftreten, zu ceph-3-em-Ringen, die in Cephalosporinen auftreten, katalysieren. Nachstehend werden diese Enzyme kollektiv als "das Expandase-Enzym" bezeichnet.
  • Ein Substrat, auf das das Expandase-Enzym einwirkt, ist Penicillin N, das bei Ringerweiterung und Hydroxylierung Desacetylcephalosporansäure (DAC) ergibt. Hier ist es lediglich erforderlich, die (D)-α-Aminoadipoyl- Seitenkette unter Bildung von 7-ADAC zu spalten, jedoch hat sich diese Seitenkette als außerordentlich widerstandsfähig gegen eine enzymatische Spaltung erwiesen, so daß nur unannehmbar niedrige Ausbeuten erzielt werden.
  • Erfindungsgemäß ist es möglich, ein wirksames biologisches Verfahren bereitzustellen, bei dem eine Penicillin-Verbindung (mit einer Adipoyl- Seitenkette) durch ein neuartiges Fermentationsverfahren in hohen Titern gebildet wird, wobei es sich bei der Penicillin-Verbindung um ein annehmbares Substrat für das Expandase-Enzym handelt, das in situ durch den gleichen Mikroorganismus, der die Penicillin-Verbindung erzeugt, gebildet wird, nachdem der Mikroorganismus so transformiert worden ist, daß er das Expandase-Enzym bildet. Das Expandase-Enzym bewirkt sodann eine Ringerweiterung der Penicillin-Verbindung zu einer Cephalosporin-Verbindung in hohen Ausbeuten.
  • Das durch eine in situ-Wirkung des Expandase-Enzyms gebildete Adipoyl-7-ADCA weist eine 3-Methyl (-CH&sub3;)-Seitenkette auf, während das Endprodukt 7-ACA eine 3-Acetyloxymethyl [-CH&sub2;OC(O)CH&sub3;]-Seitenkette besitzt. Um die 3-Methyl-Seitenkette erfindungsgemäß in eine 3-Acetyloxymethyl- Seitenkette umzuwandeln, werden in situ ferner zwei weitere Enzym-Aktivitäten neben der Expandase-Aktivität exprimiert. Der Reihenfolge nach handelt es sich um eine Hydroxylase und eine Acetyltransferase. Beide Enzyme sind Expressionsprodukte von Genen, mit denen der die Penicillin-Verbindung bildende Mikroorganismus ebenfalls transformiert worden ist. Das Hydroxylase-Enzym wandelt die 3-Methyl-Seitenkette von Adipoyl-7-ADCA in 3- Hydroxymethyl um und das Acetyltransferase-Enzym wandelt die 3-Hydroxymethyl-Seitenkette in die 3-Acetyloxymethyl-Seitenkette von 7-ACA um.
  • In der letzten kritischen Stufe des erfindungsgemäßen Verfahrens ist es wichtig, daß die Seitenkette der Penicillin-Verbindung, die nunmehr eine Cephalosporin-Verbindung darstellt, durch ein weiteres Enzymsystem in überraschend hohen Ausbeuten entfernbar ist. Das unerwartete Ergebnis dieses besonderen, vollständig biologischen Verfahrens, das die vorliegende Erfindung ausmacht, besteht in der Bildung von 7-ACA in überraschend hohen Ausbeuten und in ausreichend wirtschaftlicher Weise, so daß es eine vernünftige Alternative zu den derzeit angewandten Verfahren der chemischen und biochemischen Verarbeitung darstellt.
    • 2. Kurze Beschreibung des Stands der Technik
  • Das erfindungsgemäße neuartige biologische Verfahren stellt eine einzigartige und überraschend wirksame Methode zur Herstellung von 7-ACA als eine wirtschaftlich konkurrenzfähige Alternative zur derzeitigen chemischen Synthese bereit. Die fortlaufenden Anstrengungen auf dem einschlägigen Gebiet zur Bereitstellung eines derartigen biologischen Verfahrens haben zu wiederholten Fehlschlägen geführt. Beispielsweise beschreibt EP-A-0 422 790 eine für Isopenicillin N: Acyl-CoA-Acyltransferase-Aktivität von Aspergillus nidulans kodierende DNA und deren Verwendung bei der Erzeugung von wertvollen Cephalosporinen in Penicillin bildenden Pilzen, was bisher im Stand der Technik nicht erreicht wurde. Jedoch wird dort ein Weg zum Aufbrechen oder Ersetzen des Acyltransferase-Gens zusammen mit der Addition von Genen, die für die Epimerase- und Expandase-Enzyme aus Cephalosporin bildenden Organismen kodieren, beschrieben. Außerdem hat es den Anschein, daß tatsächlich kein geeignetes Transformations- und Expressionsergebnis erhalten worden ist. Ergäbe sich außerdem eine erfolgreiche Transformation, so wäre diese für die Zwecke der vorliegenden Erfindung immer noch nicht geeignet, da immer noch die Schwierigkeit bliebe, auf welche Weise die D-α-Aminoadipoyl-Seitenkette entfernt werden kann. Ein derartiger fehlgeschlagener Versuch gemäß dem Stand der Technik zur Bereitstellung von beachtenswerten Ergebnissen bei der Herstellung von gewerblichen Cephalosporin-Zwischenprodukten aus Penicillin erzeugenden Pilzkulturen steht in völligem Gegensatz zu dem mit dem erfindungsgemäßen Verfahren erreichten Ergebnissen.
  • Die erste enzymatische Stufe des erfindungsgemäßen biologischen Verfahrens besteht in der Ringerweiterung von Adipoyl-6-APA, die durch ein Expandase-Enzym vorgenommen wird, bei dem es sich um das Expressionsprodukt eines Expandase-Gens, mit dem der nicht-rekombinante P. chrysogenum- Wirt transformiert worden ist, handelt. Die Verwendung eines derartigen Expandase-Enzyms wurde im Stand der Technik untersucht. Beispielsweise haben Cantwell et al., Curr. Genet., Bd. 17 (1990), S. 213-221, ein biologisches Verfahren zur Herstellung von 7-ADCA durch Ringerweiterung von Penicillin V unter anschließender enzymatischer Hydrolyse des erhaltenen Desacetoxycephalosporins V zu 7-ADCA vorgeschlagen. Dieser Vorschlag beruht auf der Verfügbarkeit eines geklonten Penicillin N-Expandase-Gens (cefE) aus S. clavuligerus; Kovacevic et al., J. Bacteriol., Bd. 171 (1989), S. 754-760; und Ingolia et al., US-5 070 020. Da jedoch die Expandase auf Penicillin N, ihr natürliches Substrat, jedoch nicht auf Penicillin V einwirkt, erfordert der Vorschlag eine gentechnische Bearbeitung unter Bildung eines modifizierten Expandase-Gens, das zur Ringerweiterung von Penicillin V befähigt ist. Die erforderliche Modifikation wurde von Cantwell et al. jedoch nicht erreicht. Ihnen gelang lediglich die Transformation von Penicillium chrysogenum mit dem cefE-Gen aus Streptomyces clavuligerus und die Expression auf niedrigem Niveau des DAOCS (Expandase)-Enzyms.
  • Das Expandase-Enzym wurde im Stand der Technik gründlich untersucht, sowohl in bezug auf seine Aktivität als auch in bezug auf seine genetische Sequenz. Beispielsweise wurden gemäß US-4 510 246 und 4 536 476 (Wolfe) Cyclase-, Epimerase- und Ringexpansions-Enzyme separat aus einem zellfreien Extrakt von prokaryontischen, β-Lactam-Produkte bildenden Organismen, einschließlich Streptomyces clavuligerus, isoliert, um stabile Enzymreagenzien bereitzustellen. US-5 082 772 (Dotzlaf) (EP-A-0 366 354) beschreibt ein isoliertes und gereinigtes Expandase-Enzym aus S. clavuligerus, das durch einen terminalen Rest und die Aminosäurezusammensetzung charakterisiert ist. Für dieses Enzym wird ein Molekulargewicht von etwa 34 600 Dalton angegeben. Dies steht jedoch im Gegensatz zu dem Molekulargewicht von 29 000, das für offensichtlich das gleiche Enzym in US- 4 536 476 angegeben wird. EP-A-0 233 715 beschreibt die Isolierung und Endonuclease-Restriktionskartencharakterisierung des Expandase-Gens aus S. clavuligerus und die Expression von rekombinanter, für Expandase kodierender DNA (die ein aktives Expandase-Enzym ergibt) in einem S. clavuligerus-Stamm, dem die Fähigkeit zur Cephalosporin-Bildung fehlt. US- 5070 020 (Ingolia et al.) (EP-A-0 341 892) beschreibt die für das Expandase-Enzym kodierende DNA-Sequenz aus S. clavuligerus und die Transformation eines P. chrysogenum-Stamms mit einem diese DNA-Sequenz enthaltenden Expressionsvektor, wodurch man die Expression des Expandase-Enzyms erreicht. Obgleich darauf hingewiesen wird, daß dieses Enzym für die Expansion von Substraten, die von Penicillin N abweichen, geeignet ist, findet sich kein tatsächlicher Nachweis für eine derartige Expansion.
  • Die vorstehend beschriebene Arbeit konzentriert sich auf das von prokaryontischem S. clavuligerus abgeleitete Expandase-Enzym. Ein Enzym mit offensichtlich der gleichen Ringerweiterungsaktivität wird auch durch Stämme von eukaryontischem Cephalosporium acremonium (auch als Acremonium chrysogenum bezeichnet) exprimiert. Jedoch wird in derartigen Stämmen die Expandase-Aktivität durch ein bifunktionelles Gen (cefEF) exprimiert, das auch die DACS (Hydroxylase)-Aktivität exprimiert, dessen natürliche Funktion es ist, das Desacetoxycephalosporansäure (DAOC)-Produkt des Expandase-Enzyms in Desacetylcephalosporin C (DAC) umzuwandeln. Das Ergebnis dieser Expression ist ein einziges, aber bifunktionelles Expandase- Hydroxylase-Enzym. Obgleich es Anstrengungen zur Trennung der Aktivitäten dieser beiden Genprodukte gegeben hat, waren diese bisher nicht erfolgreich. Beispielsweise beschreibt EP-A-0 281 391 die Isolierung und Identifizierung der DNA-Sequenz des DAOCS/DACS-Gens aus C. acremonium ATCC 11550 zusammen mit der entsprechenden Aminosäuresequenz des Enzyms. Ein Penicillium wird transformiert und exprimiert die Enzyme, jedoch wurde die angestrebte Umwandlung von Penicillinen G und V zu den entsprechenden Cephalosporinen nie nachgewiesen. Außerdem wurde trotz eines Hinweises, daß gentechnische Bearbeitungen ein einfaches Mittel zur Trennung der für DAOCS kodierenden genetischen Information von DACS und zu deren getrennter Expression führen könnte, kein tatsächlicher Nachweis für eine derartige Trennung geliefert.
  • Das DAOCS/DACS (Expandase/Hydroxylase)-Enzym von C. acremonium wurde ebenfalls im Stand der Technik gründlich untersucht, und zwar sowohl im Hinblick auf seine Aktivität als auch im Hinblick auf seine Eigenschaften und seine genetische Sequenz. Beispielsweise werden gemäß US-4 178 210, US-4 248 966 und US-4 307 192 (Demain) verschiedene Ausgangsmaterialien vom Penicillin-Typ mit einem zellfreien Extrakt von C. acremonium behandelt, der den Ring epimerisiert und erweitert, wodurch ein Cephalosporin- Antibiotikum-Produkt gebildet wird. US-4 753 881 (Wu-Huang Yeh) beschreibt das C. acremonium-Enzym unter Angabe von isoelektrischem Punkt, Molekulargewicht, Aminosäureresten, Verhältnis von Hydroxylase- zu Expandase-Aktivität und Peptidfragmenten.
  • Das Acetyltransferase-Enzym von C. acremonium wurde ebenfalls im Stand der Technik in bezug auf Aktivität, Eigenschaften, Restriktionskartierung sowie Nucleotid- und Aminosäuresequenzen beschrieben. Es wird beispielsweise auf EP-A-0 437 378 und EP-A-0 450 758 verwiesen.
  • Der vorstehend erörterte Stand der Technik befaßt sich nur mit der Transformation eines P. chrysogenum-Stamms mit Genen, die Expandase- und Expandase/Hydroxylase-Enzyme exprimieren, sowie die Expression dieser Enzyme. Gemäß dem Stand der Technik werden jedoch die exprimierten Enzyme nur zur Ringerweiterung von Penicillin N und nicht von Penicillin G und V eingesetzt. Selbst in diesem Fall hat Penicillin N eine Seitenkette in der 7-Stellung, die nicht enzymatisch unter Bildung einer freien Aminogruppe gespalten werden kann. Die vorliegende Erfindung beruht auf den überraschenden Befunden, daß eine Adipoyl-Seitenkette in wirksamer Weise durch einen P. chrysogenum-Stamm addiert werden kann, daß das in situ exprimierte Expandase-Enzym diese Verbindung in wirksamer Weise als Substrat für die Ringerweiterung zu Adipoyl-7-ADCA verwerten kann, daß ebenfalls in situ exprimierte Hydroxylase- und Acetyltransferase-Enzyme die Adipoyl-7-ADCA als Substrat zur Bildung der 3-Acetoxymethyl-Seitenkette von 7-ACA verwerten können und daß die Adipoyl-Seitenkette anschließend in wirksamer Weise durch ein weiteres Enzym unter Bildung von 7-ACA entfernt werden kann. Während verschiedene isolierte einzelne Elemente der vorliegenden Erfindung im Stand der Technik aufgefunden werden können, gab es keinen Hinweis, daß diese einzelnen Elemente so kombiniert werden können, daß die durch das erfindungsgemäße Verfahren erzielten unerwarteten Ergebnisse erreicht werden.
  • Beispielsweise ist die Bildung von 6-Adipoylpenicillansäure aus dem Stand der Technik bekannt; vergl. A. Ballio et al., Nature, Bd. 185 (1960), S. 97-99. Die enzymatische Erweiterung von 6-Adipoylpenicillansäure ist ebenfalls aus dem Stand der Technik bekannt, jedoch nur auf einer in vitro-Basis; vergl. Baldwin et al., Tetrahedron, Bd. 43 (1987), S. 3009-3014; und EP-A-0 268 343. Ferner ist die enzymatische Spaltung von Adipoyl-Seitenketten aus dem Stand der Technik bekannt; vergl. beispielsweise Matsuda et al., J. Bact., Bd. 169 (1987), S. 5815-5820.
  • Die Adipoyl-Seitenkette weist folgende Struktur auf: COOH-(CH&sub2;)&sub4;- CO-, während es sich bei zwei Seitenketten mit nahe verwandter Struktur um Glutaryl der Formel COOH-(CH&sub2;)&sub3;-CO- und (D)-α-Aminoadipoyl der Formel COOH-CH(NH&sub2;)-(CH&sub2;)&sub3;-CO- handelt. Die enzymatische Spaltung von Glutaryl- Seitenketten ist aus dem Stand der Technik bekannt; vergl. beispielsweise Shibuya et al., Agric. Biol. Chem., Bd. 45 (1981), S. 1561-1567 sowie US- 3 960 662; Matsuda und Komatsu, J. Bact., Bd. 163 (1985), S. 1222-1228; Matsuda et al., J. Bact., Bd. 169 (1987), S. 5815-5820; JP-53-086084 (1978, Banyu Pharmaceutical Co., Ltd.); und JP-52-128293 (1977, Banyu Pharmaceutical Co., Ltd.). Ferner beschreibt EP-A-0 453 048 Verfahren zur Verbesserung der Adipoyl-Spaltungsaktivität der durch Pseudomonas SY-77-1 gebildeten Glutaryl-acylase. Bei Substitution verschiedener Aminosäuren an bestimmten Stellen innerhalb der α-Untereinheit wurde eine 3 bis 5 mal höhere Geschwindigkeit der Adipoyl-Spaltung (von Adipoyl-serin) beobachtet. Es ist darauf hinzuweisen, daß EP-A-0 453 048 zwar offensichtlich einen Beleg für eine Acylase mit verbesserter Aktivität gegenüber Adipoyl-Seitenketten liefert, jedoch keinerlei Wege (weder chemisch noch über ein biologisches Verfahren, das in irgendeiner Weise analog zum in der vorliegenden Beschreibung beschriebenen Verfahren ist) beschreibt, nach denen in erster Linie ein Adipoylcephalosporin erzeugt werden könnte.
  • Wenn eine (D)-α-Aminoadipoyl-Seitenkette vorhanden ist, ist es bekannt, zunächst enzymatisch die Aminogruppe zu entfernen und die Seitenkette mit einer (D)-Aminosäure-oxidase zu verkürzen, wodurch die Glutaryl (GL-7)-Seitenkette verbleibt, wonach die Glutaryl-Seitenkette durch ein zweites Enzym (Glutaryl-acylase) entfernt wird. Eine derartige zweistufige Spaltung ist in US-3 960 662 (Matsuda); EP-A-0 275 901; JP-61-218057 (1988, Komatsu, Asahi Chemical Industry Co.); WO-90/12110 (1990, Wong, Biopure Corp.); und EP-A-0 436 355 (Isogai et al.) sowie Bio/Technology, Bd. 9 (1991), S. 188-191 beschrieben.
  • Ferner ist es aus dem Stand der Technik bekannt, eine einstufige Spaltung der (D)-α-Aminoadipoyl-Seitenkette durchzuführen, insbesondere unter Anwendung rekombinanter Techniken; vergl. z. B.:
    • Einstufige Spaltung der (D)-α-Aminoadipoyl-Seitenkette:
  • - JP-53-94093 (Meiji, Pseudomonas sp. BN-188);
  • - JP-52-143289 (= US-4 141 790, Meiji, Aspergillus sp.);
  • - US-4 774 179 (Asahi, 1988, Pseudomonas sp. SE-83 und SE-495) (= JP-61-21097 und JP-61-152286);
  • - FR-2 241 557 (Aries, 1975, Bacillus cereus var. Fluorescens);
  • - JP-52-082791 (Toyo Jozo, 1977, Bacillus megaterium NRRL B 5385);
  • - EP-A-0 321 849 (Hoechst, Pseudomonas, Bacillus subtilis, g-Glutamyl-transpeptidase);
  • - EP-A-0 322 032, EP-A-0 405 846 und US-5 104 800 (Merck, Bacillus megaterium);
  • EP-A-0 283 218 und US-4 981 789 (Merck, Arthrobacter viscosus);
    • Einstufig rekombinant: Ceph C → 7-ACA:
  • - JP-60-110292 (Asahi, 1985, Comamonas, rekombinantes E. coli mit dem Gen von Comamonas sp. SY-77-1, einstufige Umwandlung);
  • - JP-61-152286 (Asahi, 1986, Pseudomonas, rekombinantes E. coli mit dem Gen von Pseudomonas sp. SE83, die genetischen Sequenzen sind beschrieben und beansprucht, einstufiges Verfahren, bereits beansprucht in US-4 774 179);
  • - JP-63-74488 (Asahi, 1988, Trigonopsis variabilis, Comamonas, rekombinante E. coli-Expression eines D-Aminosäure-oxidase- und GL-7-ACA- Acylase-Konstrukts);
  • - EP-A-0 475 652 (Fujisawa, Cephalosporin C-acylase und deren Bildung durch rekombinante Technik).
  • Verschiedene Aspekte für Verfahren zur Bildung von 7-ADAC sind aus dem Stand der Technik bekannt; vergl. beispielsweise US-3 304 236 und 3 972 774 (Eli Lilly & Co.); EP-A-0 454 478 (Shionogi & Co., Ltd.); und JP-A-04-53499 (Shionogi & Co., Ltd.).
  • Um das erfindungsgemäße Verfahren und die Lehre der vorstehend erörterten Literaturstellen leichter verständlich zu machen, findet sich nachstehend eine Darstellung, in der die verschiedenen Stufen der Stoffwechselwege, die zu Adipoyl-6-APA, Adipoyl-7-ADCA, Adipoyl-7-ACA und 7- ACA führen, die Zwischenprodukte und die Enzyme, die die beteiligten Umwandlungen ausführen, wiedergegeben sind.
    • Zusammenfassende Darstellung der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung betrifft Adipoyl-7-aminodesacetylcephalosporansäure als wertvolles Zwischenprodukt zur Herstellung von 7- Cephalosporansäure.
  • Die Verbindung wird als Produkt in einem biologischen Verfahren zur Herstellung von 7-Cephalosporansäure (7-ADAC) erhalten, das folgende Stufen umfaßt:
  • 1) ein Stamm von Penicillium chrysogenum, der Isopenicillin N bildet, wird in einem Kulturmedium, das zum Unterhalt des Wachstums dieses Stammes befähigt ist, gehalten und das Kulturmedium wird mit einem Adipat-Einsatzmaterial, das einen oder mehrere der Bestandteile Adipinsäure, Salze und Ester davon, die von diesem Stamm von Penicillium chrysogenum unter Bildung von Adipoyl-6-aminopenicillansäure (Adipoyl-6-APA) assimiliert und verwertet werden können, enthält, wodurch die Adipoyl-6-APA gebildet wird;
  • 2) es werden die folgenden enzymatischen Umwandlungen durch in situ- Expression des entsprechenden Gens durchgeführt:
  • a) Adipoyl-6-APA wird in situ durch das Enzym Expandase einer Ringerweiterung unter Bildung von Adipoyl-7-aminodes- acetoxycephalosporansäure (Adipoyl-7-ADCA) unterworfen, wobei der Stamm von P. chrysogenum durch DNA, die für die Aktivität des Enzyms Expandase, dem die Adipoyl-6-APA als Substrat dienen kann, kodiert, transformiert worden ist, wobei als Ergebnis von deren Expression die durch den Stamm gebildete Adipoyl-6-APA ferner anschließend einer in situ-Ringerweiterung unter Bildung von Adipoyl-7-ADCA unterworfen wird;
  • b) die 3-Methyl-Seitenkette von Adipoyl-7-ADCA wird in situ durch das Enzym Hydroxylase unter Bildung von Adipoyl-7-aminodesacetylcephalosporansäure (Adipoyl-7-ADAC) hydroxyliert, wobei der Stamm von P. chrysogenum durch DNA, die für die Aktivität des Enzyms Hydroxylase, dem die Adipoyl-7-ADCA als Substrat dienen kann, kodiert, transformiert worden ist, wobei als Ergebnis von deren Expression die durch den Stamm gebildete Adipoyl-7-ADCA anschließend in situ unter Bildung von Adipoyl-7-ADAC hydroxyliert wird; und
  • 3) die Adipoyl-7-ADAC wird mit einer Adipoyl-amidase in Kontakt gebracht, wodurch die Adipoyl-Seitenkette entfernt und das 7-ADAC-Produkt gebildet wird; und dieses Produkt wird anschließend isoliert.
  • Die Verbindung wird als Zwischenprodukt in einem biologischen Verfahren zur Herstellung von 7-Aminocephalosporansäure (7-ACA) erhalten, das folgende Stufen umfaßt:
  • 1) ein Stamm von Penicillium chrysogenum, der Isopenicillin N bildet, wird in einem Kulturmedium, das zum Unterhalt des Wachstums dieses Stammes befähigt ist, gehalten und das Kulturmedium wird mit einem Adipat-Einsatzmaterial, das einen oder mehrere der Bestandteile Adipinsäure, Salze und Ester davon, die von diesem Stamm von Penicillium chrysogenum unter Bildung von Adipoyl-6-aminopenicillansäure (Adipoyl-6-APA) assimiliert und verwertet werden können, enthält, wodurch die Adipoyl-6-APA gebildet wird;
  • 2) es werden die folgenden enzymatischen Umwandlungen durch in situ- Expression des entsprechenden Gens durchgeführt:
  • a) Adipoyl-6-APA wird in situ durch das Enzym Expandase einer Ringerweiterung unter Bildung von Adipoyl-7-aminodesacetoxycephalosporansäure (Adipoyl-7-ADCA) unterworfen, wobei der Stamm von P. chrysogenum durch DNA, die für die Aktivität des Enzyms Expandase, dem die Adipoyl-6- APA als Substrat dienen kann, kodiert, transformiert worden ist, wobei als Ergebnis von deren Expression die durch den Stamm gebildete Adipoyl- 6-APA ferner anschließend einer in situ-Ringerweiterung unter Bildung von Adipoyl-7-ADCA unterworfen wird;
  • b) die 3-Methyl-Seitenkette von Adipoyl-7-ADCA wird in situ durch das Enzym Hydroxylase unter Bildung von Adipoyl-7-aminodesacetylcephalosporansäure (Adipoyl-7-ADAC) hydroxyliert, wobei der Stamm von P. chrysogenum durch DNA, die für die Aktivität des Enzyms Hydroxylase, dem die Adipoyl-7-ADCA als Substrat dienen kann, kodiert, transformiert worden ist, wobei als Ergebnis von deren Expression die durch den Stamm gebildete Adipoyl-7-ADCA anschließend in situ unter Bildung von Adipoyl-7-ADAC hydroxyliert wird; und
  • c) die Adipoyl-7-ADAC wird in situ durch das Enzym Acetyltransferase unter Bildung von Adipoyl-7-aminocephalosporansäure (Adipoyl-7-ACA) acetyliert, wobei der Stamm von P. chrysogenum durch DNA, die für die Aktivität des Enzyms Acetyltransferase, dem die Adipoyl-7-ADAC als Substrat dienen kann, kodiert, transformiert worden ist, wobei als Ergebnis von deren Expression die durch den Stamm gebildete Adipoyl-7-ADAC anschließend in situ unter Bildung von Adipoyl-7-ACA acetyliert wird; und
  • 3) die Adipoyl-7-ACA wird mit einer Adipoyl-amidase in Kontakt gebracht, wodurch die Adipoyl-Seitenkette entfernt und das 7-ACA-Produkt gebildet wird; und dieses Produkt wird anschließend isoliert.
  • Nachstehend wird die Bedeutung von hier verwendeten Ausdrücken erläutert:
  • "7-ACA" bedeutet 3-[(Acetoyloxy)-methyl]-7-amino-8-oxo-5-thia-1-azabicyclo[4.2.0]oct-2-en-2-carbonsäure;
  • "Adipoyl-6-APA" bedeutet [2S-(2 ,5 ,6β)]-3,3-Dimethyl-7-oxo-6- [(hexan-1,6-dioyl)-amino]-4-thia-1-azabicyclo[3.2.0]heptan-2-carbonsäure.
  • "Adipoyl-7-ADCA" bedeutet 3-Methyl-7-[(hexan-1,6-dioyl)-amino]-3-methyl-8-oxo-5-thia-1-azabicyclo[4.2.0]oct-2-en-2-carbonsäure und
  • "Adipoyl-7-ADAC" bedeutet 3-Hydroxymethyl-7-[(hexan-1,6-dioyl)- amino]-3-methyl-8-oxo-5-thia-1-azabicyclo[4.2.0]oct-2-en-2-carbonsäure.
  • Insbesondere betrifft die Erfindung das neuartige biologische Verfahren zur Herstellung von 7-Aminodesacetylcephalosporansäure (7-ADAC) und 7-Aminocephalosporansäure (7-ACA) gemäß den vorstehenden Angaben, wobei es sich beim Adipat-Einsatzmaterial um Dinatriumadipat handelt, wobei die DNA-, die für die Aktivität des Expandase-Enzyms, des Hydroxylase-Enzyms und des Acetyltransferase-Enzyms kodiert, sich jeweils von Cephalosporium acremonium ableitet, und wobei die Adipoyl-acylase sich von einer Pseudomonas-Spezies ableitet.
    • Ausführliche Beschreibung der Erfindung
  • Der primäre Aspekt der vorliegenden Erfindung ist ein neuartiges Zwischenprodukt zur Herstellung von 7-Aminocephalosporansäure (7-ACA) und 7-Aminodesacetylcephalosporansäure (7-ADAC), Schlüsselprodukten bei der Herstellung von synthetischen, gewerblichen Cephalosporinen, die sich durch folgende Strukturformeln wiedergeben lassen:
  • Zusätzlich zum Cephalosporin-Kern handelt es sich bei Unterscheidungsmerkmalen von 7-ACA um die 7-Aminogruppe und die 3-Acetyloxymethylgruppe (oder 3-Acetoxymethylgruppe, wie sie häufiger genannt wird). Die 7-Aminogruppe stellt eine Gruppe dar, die in eine beliebige Anzahl von Derivat-Seitenketten umgewandelt werden kann. Diese Gruppe bildet somit die Grundlage für die Synthese verschiedener gewerblicher Cephalosporine. Die 3-Acetyloxymethylgruppe wird häufig in einige andere Seitenketten umgewandelt, um ein gewerbliches Cephalosporin zu synthetisieren.
  • Dem 7-ACA-Endprodukt und dem Adipoyl-7-ACA-Zwischenprodukt des erfindungsgemäßen Verfahrens läßt sich Cephalosporin C, ein weiteres Cephalosporin-Schlüsselzwischenprodukt der nachstehend angegebenen Strukturformel, gegenüberstellen:
  • Bei diesem Zwischenprodukt ist die 7-(D)-α-Aminoadipoyl-Seitenkette für eine weitere synthetische Derivatbildung nicht akzeptabel und muß zur akzeptablen 7-Aminogruppe gespalten werden. Ungünstigerweise hat es sich immer als schwierig erwiesen, die 7-(D)-α-Aminoadipoyl-Seitenkette zu entfernen, unabhängig davon, ob dies durch chemische oder biochemische Maßnahmen geschieht.
    • Definitionen
  • In der vorliegenden Beschreibung und insbesondere in dem Abschnitt, der mit "Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen" überschrieben ist, haben die folgenden Ausdrücke die nachstehend angegebenen Bedeutungen:
  • 7-ACA 7-Aminocephalosporansäure
  • 7-ADAC 7-Aminodesacetylcephalosporansäure
  • 7-ADCA 7-Aminodesacetoxycephalosporansäure
  • 6-APA 6-Aminopenicillansäure
  • DAOC Desacetoxycephalosporansäure
  • DAOCS DAOC-Synthetase
  • DAC Desacetylcephalosporin C
  • DACS DAC-Synthase
  • IPNS Isopenicillin-N-synthetase
  • Tris Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan
  • EDTA Ethylendiamintetraessigsäure
  • DEPC Diethylpyrocarbonat
  • TE Tris/EDTA-Puffer
  • SSC Salz (Natriumchlorid)-Natriumcitrat-Puffer
  • SDS Natriumdodecylsulfat
  • PEG Polyethylenglykol
    • Penicillium chrysogenum-Kultur
  • Die erste Stufe des vorliegenden Verfahrens umfaßt die Stufe der Aufrechterhaltung eines Stamms von Penicillium chrysogenum, der Isopenicillin N bildet, in einem Kulturmedium, das zum Unterhalt des Wachstums dieses Stamms befähigt ist, und die Zugabe eines Adipat-Einsatzmaterials, das einen oder mehrere der Restbestandteile Adipinsäure oder deren Salze und Ester umfaßt, zum Kulturmedium. Das Adipat-Einsatzmaterial kann nach Inokulation mit P. chrysogenum zum Kulturmedium gegeben werden, jedoch ist es bevorzugt, daß es bereits zum Zeitpunkt der Inokulation im Kulturmedium vorhanden ist.
  • Andere Gattungen als Penicillium, z. B. Aspergillus nidulans, sowie von der Chrysogenum-Spezies abweichende Spezies der Gattung Penicillium bilden Isopenicillin N. Jedoch wurden historisch gesehen die Stämme mit der stärksten Bildung von Isopenicillin N alle nach bekannten Techniken einer Stamm-Optimierung aus den Chrysogenum-Spezies entwickelt. Aus praktischen Gründen wurde die vorliegende Erfindung somit auf Stämme von Penicillium chrysogenum begrenzt, obgleich ihre Anwendbarkeit auf andere Spezies offensichtlich ist. Beliebige hinterlegte Stämme von Penicillium chrysogenum oder andere öffentlich zugängliche Quellen für einen derartigen Stamm eignen sich als Ausgangspunkt zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens.
  • Das Kulturmedium, das zur Aufrechterhaltung des Wachstums eines Stamms von Penicillium chrysogenum, der Isopenicillin N bildet, befähigt ist, gehört dem Typ an, mit dem der Fachmann auf dem einschlägigen Gebiet ohne weiteres vertraut ist. Beispielsweise wird die Züchtung unter aeroben Submersfermentationsbedingungen durchgeführt. Das verwendete Medium wird aus einer Anzahl von geeigneten verfügbaren Medien ausgewählt. Typische Medien verwerten Kohlenstoffquellen, wie Saccharose, Glucose und Stärke; Stickstoffquellen, wie Sojamehl und -schrot, Baumwollsamenöl, Erdnußmehl, verschiedene Aminosäuren, Gemische davon und Peptone. Bezüglich der Herstellungsanforderungen wird besonderer Wert auf Ausbeute und einfache Isolierung gelegt. Somit sind für derartige Situationen als Kohlenstoffquelle Melassen und als Stickstoffquelle Sojamehl und Aminosäuren bevorzugt.
  • Anorganische Nährsalze werden üblicherweise dem Kulturmedium zugesetzt. Hierzu gehören Salze, die zur Bereitstellung der folgenden Ionenkomponenten befähigt sind: Natrium, Kalium, Ammonium, Calcium, Phosphat, Sulfat, Chlorid, Bromid, Nitrat, Carbonat, Eisen(III), Eisen(II), Magnesium, Mangan und dergl. Ferner sind üblicherweise Spurenelemente für das Wachstum, die Entwicklung und den Stoffwechsel von Penicillium chrysogenum wesentlich und können dem Kulturmedium direkt zugesetzt werden, sofern sie nicht bereits als verunreinigende Bestandteile in wesentichem Umfang mit den übrigen Bestandteilen des Kulturmediums zugeführt werden.
  • Die Penicillium chrysogenum-Stämme können in einer Einrichtung von geringem Volumen, z. B. 1 Liter fassende Schüttelkolben, gezüchtet werden, sofern es erwünscht ist, nur geringe Mengen an Adipoyl-7-ACA und gegebenenfalls 7-ACA zu bilden. Wenn größere Mengen an Adipoyl-7-ACA erwünscht sind, werden jedoch Fermentationstanks im Großmaßstab unter aeroben Submersfermentationsbedingungen eingesetzt.
  • Bei der Durchführung der Herstellung von Adipoyl-7-ACA im Großmaßstab werden Sporen des Penicillium chrysogenum-Stamms auf einer Agar- Schrägkultur gehalten. Die Sporen der Schrägkultur werden zur Inokulation eines vegetativen Mediums mit einem geringen Volumen verwendet. Das vegetative Medium wird zur Bildung einer schweren, frischen, aktiv wachsenden Kultur des Mikroorganismus inkubiert. Dieses vegetative Wachstum wird sodann als Inokulum für das Fermentationsmedium im Großmaßstab verwendet. In bestimmten Fällen kann es erwünscht sein, noch ein weiteres vegetatives Medium als Inokulum für das Fermentationsmedium einzusetzen. Derartige vegetative Medien in der zweiten Stufe werden üblicherweise verwendet, wenn das Volumen des Fermentationsmediums erheblich größer als das des ersten vegetativen Mediums ist. Auf diese Weise werden zunächst die Sporen des Mikroorganismus in einem geringen Volumen an vegetativem Medium gezüchtet, wodurch man ein Inokulum für ein vegetatives Medium mit einem größeren Volumen erhält. Das vegetative Medium mit dem größeren Volumen liefert sodann eine ausreichende Konzentration des Mikroorganismus, um ein rasches Einsetzen der Fermentation im Fermentationstank vom Großmaßstab einzuleiten. Das vegetative Medium kann die gleiche Zusammensetzung wie das Fermentationsmedium aufweisen oder es kann zusätzliche Bestandteile enthalten, die das Wachstum und die Entwicklung des Mikroorganismus im Kleinmaßstab fördern.
  • Die im erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Penicillium chrysogenum-Stämme werden in besonders wirksamer Weise bei Temperaturen von etwa bis 30ºC gezüchtet, wobei aber optimale Ausbeuten bei Temperaturen von etwa 22 bis 28ºC und vorzugsweise bei etwa 25ºC erreicht werden.
  • Eine maximale Bildung von Adipoyl-7-ACA erfolgt, wenn der Penicillium chrysogenum-Stamm in Großmaßstab-Tanks für eine Zeitspanne von etwa bis 30 Tage und vorzugsweise von 15 bis 25 Tage gezüchtet werden. Wird die Züchtung jedoch in einer Kleinmaßstab-Vorrichtung, z. B. in 250 ml fassenden Schüttelkolben, durchgeführt, so verläuft das Wachstum des Mikroorganismus rascher und Adipoyl-7-ACA wird innerhalb kürzerer Zeit, z. B. in 4 bis 15 Tagen und häufig in 5 bis 7 Tagen, gebildet.
  • Wenn der endgültige pH-Wert in Großmaßstab-Fermentationstanks 8,0 oder mehr erreicht, kann es zu einer Beeinträchtigung der Ausbeute an Adipoyl-7-ACA kommen. In derartigen Situationen ist es erwünscht, den pH- Wert des Kulturmediums während der gesamten Fermentation zu überwachen. Es ist offensichtlich, daß dann, wenn der pH-Wert vor dem Zeitpunkt der maximalen Bildung an Adipoyl-7-ACA eine derartige Höhe erreicht, der pH- Wert zweckmäßigerweise nach unten korrigiert wird, indem man eine geeignete Säure oder Pufferungsmittel zum Fermentationsmedium gibt.
  • Die Bildung von Adipoyl-7-ACA kann durch Testen von Proben der Fermentationsbrühe auf chromatographischem Wege verfolgt werden.
  • Wie bei den meisten aeroben Submersfermentationen wird sterile Luft durch das Kulturmedium geleitet, um ein wirksameres Wachstum des Penicillium chrysogenum-Stamms und eine erhöhte Bildung an Adipoyl-7-ACA zu erreichen. Das Volumen der durch das Kulturmedium geleiteten Luft beträgt üblicherweise mindestens etwa 0,2 Volumenteile Luft pro Minute pro 1 Volumenteil des Kulturmediums. Jedoch kann eine erhöhte Geschwindigkeit der Luftdurchleitung häufig einen günstigen Einfluß auf die Bildung von Adipoyl-7-ACA ausüben.
  • Der Penicillium chrysogenum-Stamm bildet typischerweise neben Adipoyl-7-ACA zahlreiche Nebenprodukte und Metaboliten. Da einige Produkte darunter säurelabil sind, ist es erwünscht, bei der Gewinnung der Adipoyl-7-ACA aus dem Fermentationsmedium die gesamte Fermentationsbrühe für eine kurze Zeitspanne bei einem sauren pH-Wert zu behandeln, um einige der gleichzeitig gebildeten Verunreinigungen zu zerstören. Das Adipoyl-7- ACA-Fermentationsprodukt wird aus der auf diese Weise behandelten, filtrierten Fermentationsbrühe gewonnen und kann gegebenenfalls von den übrigen Komponenten des Fermentationsmediums durch Chromatographie über ein Ionenaustauscherharz getrennt und gegebenenfalls einer zusätzlichen chromatographischen Reinigung unterzogen werden, bevor die anschließende Stufe der enzymatischen Spaltung der Adipoyl-Seitenkette durchgeführt wird. Ferner ist es möglich, eine derartige Ionenaustauschchromatographie-Trennung nach der Abspaltung der Seitenkette durchzuführen. Eines der hauptsächlichen Nebenprodukte, die Trennungsprobleme verursachen, ist Adipoyl-6-APA. Es ist möglich, dieses Nebenprodukt chemisch oder enzymatisch abzubauen, um die Trennung zu erleichtern. Zunächst wird die filtrierte Fermentationsbrühe einem Vorreinigungsverfahren unterzogen, das eine anfängliche Extraktion mit einem mit Wasser nicht-mischbaren organischen Lösungsmittel, wie n-Butanol oder Amylacetat, beinhalten kann, um Verunreinigungen zu entfernen. Die extrahierte Brühe kann ferner auf vorläufige Weise durch Chromatographie über Aktivkohle gereinigt werden.
    • Zugabe von Adipat-Einsatzmaterial
  • Vorzugsweise wird zum Zeitpunkt der Bereitstellung der Fermentationskultur für Penicillium chrysogenum auf die vorstehend beschriebene Weise, d. h. vor der Inokulation, ein Adipat-Einsatzmaterial zu den übrigen Bestandteilen des Fermentationskulturmediums gegeben. Gegebenenfalls kann das Adipat-Einsatzmaterial eine gewisse Zeitspanne nach der Inokulation zugesetzt werden, z. B. 1, 2 und/oder 3 Tage nach der Inokulation. Das Adipat-Einsatzmaterial ist als Adipinsäure oder als ein oder mehr beliebige Salze oder Ester von Adipinsäure definiert, die durch den der Züchtung unterzogenen Penicillium chrysogenum-Stamm unter Bildung von Adipoyl-6-APA assimiliert und verwertet werden können. Die Adipinsäure, deren Salze und Ester können jeweils allein oder in einer beliebigen Kombination eingesetzt werden. Das Dinatriumsalz wird bevorzugt, obgleich auch Kaliumsalze und gemischte Salze mit Natrium geeignet sind. Der Methylester kann verwendet werden, jedoch ist der Ethylester in Wasser unlöslich. Das Adipinsäuresalz oder der Ester davon müssen so beschaffen sein, daß sie durch den Penicillium chrysogenum-Stamm unter Bildung von Adipoyl-6-APA assimiliert und verwertet werden können. Beispielsweise kann Adipinsäure selbst geeignet sein, (obgleich sie in Wasser unlöslich ist), wenn unter geeigneten pH-Bedingungen ein assimilierbares Salz entsteht.
    • Geeignete Expandase- und/oder Hydroxylase-Enzyme
  • Der Penicillium chrysogenum-Stamm, der auf die vorstehend beschriebene Weise gezüchtet und mit einem Adipat-Einsatzmaterial versehen worden ist, so daß er Adipoyl-6-APA bildet, kann auch ein Stamm sein, der mit DNA, die für die Aktivität der Expandase- und Hydroxylase-Enzyme kodiert, transformiert worden ist, wonach als Ergebnis von deren Expression die Adipoyl-6-APA in situ einer Ringerweiterung unter Bildung von Adipoyl-7- ADCA unterzogen wird und ferner die 3-Methyl-Seitenkette in 3-Hydroxymethyl übergeführt wird.
  • Das Adipoyl-6-APA wird intrazellulär durch das auf dem Adipat-Einsatzmaterial gezüchtete Penicillium chrysogenum gebildet. Bei dieser intrazellulären Einstellung, d. h. auf einer in situ-Bais, exprimiert das transformierte Penicillium chrysogenum auch DNA, die für die Aktivität der Expandase- und Hydroxylase-Enzyme kodiert, wonach das Enzym auf das Adipoyl-6-APA als Substrat einwirkt und es unter Bildung von Adipoyl-7- ADCA einer Ringerweiterung unterzieht, das dann zu Adipoyl-7-ADAC (Adipoyl-7-aminodesacetylcephalosporansäure) hydroxyliert wird.
  • Das neue biologische Verfahren der Erfindung umfaßt die Transformation eines Penicillium chrysogenum-Stamms des vorstehend beschriebenen Typs mit einer beliebigen DNA, die für die Aktivität des Expandase- und Hydroxylase-Enzyms kodiert, wobei als Ergebnis von deren Expression Adipoyl-6-APA in situ einer Ringerweiterung unter Bildung von Adipoyl-7-ADCA unterworfen und anschließend unter Bildung von Adipoyl-7-ADAC hydroxyliert wird. Somit muß die DNA, mit der Penicillium chrysogenum transformiert worden ist, ein Enzym exprimieren, das nicht nur die Aktivität des Expandase-Enzyms aufweist, wie es aus dem Stand der Technik bekannt ist, d. h. die Fähigkeit zur Ringerweiterung von Isopenicillin N zu DAOC, sondern auch die Fähigkeit zur Ringerweiterung von Adipoyl-6-APA unter Bildung von Adipoyl-7-ADCA. Ferner muß das Hydroxylase-Enzym dazu befähigt sein, die Adipoyl-7-ADCA zu Adipoyl-7-ADAC zu hydroxylieren.
  • Zwei alternative Möglichkeiten kommen im Rahmen der vorliegenden Erfindung als geeignete Ausführungsformen bezüglich der Art und Weise, wie die Expandase- und Hydroxylase-Enzymaktivitäten bereitgestellt werden, in Frage. Gemäß einer Ausführungsform, die bevorzugt ist, werden die Expandase- und Hydroxylase-Funktionen durch die von einem einzelnen, jedoch im wesentlichen bifunktionellen Gen von Cephalosporium acremonium, mit dem das P. chrysogenum transformiert worden ist, exprimierte Aktivität bereitgestellt. Dieses Gen, das für die Expandase- und die Hydroxylase- Aktivität gemeinsam exprimiert, wird als Expandase/Hydroxylase-Gen bezeichnet, während sein Genprodukt als Expandase/Hydroxylase-Enzym bezeichnet wird. Typischerweise wird bei Transformation von P. chrysogenum mit der DNA aus C. acremonium, die für die Expandase/Hydroxylase-Aktivität kodiert, die Expression dieser Aktivität durch eine einzige Promotorsequenz kontrolliert, was auf die Anwesenheit eines einzigen Gens hinweist.
  • Eine alternative Ausführungsform der vorliegenden Erfindung, die gleichermaßen geeignet ist, beinhaltet die Transformation des P. chrysogenum-Wirts mit DNA, die für die Expandase- und Hydroxylase-Aktivitäten in Form von getrennten Genen im Gegensatz zu einem einzigen Expandase/Hydroxylase-Gen kodiert. Es ist darauf hinzuweisen, daß die getrennten Expandase- und Hydroxylase-Gene und die entsprechenden enzymatischen Aktivitäten, für die sie kodieren, eher in prokaryontischen Mikroorganismen, wie S. clavuligerus, und weniger in eukaryontischen Mikroorganismen, wie C. acremonium, die für das einzige Expandase/Hydroxylase- Gen und Enzym kodieren, wie bereits erwähnt, auftreten.
  • Die Sequenz des prokaryontischen Hydroxylase-Enzyms und der dafür kodierenden Nucleotide werden von Kovacevic et al., J. Bacteriol., Bd. 173 (1) (1991), S. 398-400 und in EP-A-0 465 189 beschrieben, was auch für Maßnahmen zur Isolierung des Enzyms gilt. Der Fachmann erkennt aus der Sequenz der Hydroxylase, daß es möglich ist, nach bekannten manuellen Verfahren oder mit DNA-Syntheseautomaten die für das Hydroxylase-Enzym kodierende DNA zu synthetisieren. Die DNA-Verbindung oder alternative Sequenzen, die für die gleiche Aminosäuresequenz der Hydroxylase oder für Fragmente oder Derivate davon kodieren und eine gleichwertige Hydroxylase-Aktivität besitzen, können ihrerseits als Grundlage zur Herstellung verschiedener Klonierungs- und Expressionsvektoren verwendet werden, wenn sie mit Promotor- und anderen Regulationssequenzen kombiniert werden, mit denen es sodann möglich ist, den P. chrysogenum-Wirt zu transformieren, so daß er das Hydroxylase-Enzym exprimiert. Dadurch läßt sich das erfindungsgemäße Verfahren ausführen. Ferner ist es möglich, die DNA- Verbindung als eine Sonde zu verwenden, mit der die Genombank eines in Frage kommenden Stammes, der möglicherweise ein geeignetes Hydroxylase- Enzym enthält, abgesucht wird, um durch Hybridisierung homologe Sequenzen zu identifizieren. Die Aktivität einer auf diese Weise identifizierten, mutmaßlichen Hydroxylase kann sodann unter Verwendung des aktuellen Adipoyl-7-ADCA-Substrats des erfindungsgemäßen Verfahrens bestätigt werden und dessen Hydroxylierungsprodukt durch HPLC isoliert werden.
  • Wenn man diese Vorgehensweise einschlägt, d. h. sich eines einzelnen Gens, das nur die Hydroxylase-Aktivität exprimiert, bedient, ist es anschließend erforderlich, getrennt auch eine DNA bereitzustellen, die für die Aktivität des Expandase-Enzyms kodiert, so daß P. chrysogenum durch einen geeigneten Expressionsvektor transformiert werden kann, der die in situ-Expression der Expandase-Funktion unter Bewerkstelligung der Ringerweiterungsstufe des erfindungsgemäßen Verfahrens ermöglicht. Zahlreiche Expandase-Enzyme sind bekannt. Auf der Basis der Seitenketten-Ähnlichkeit kommt es in Betracht, daß im neuen erfindungsgemäßen biologischen Verfahren zahlreiche Expandase-Enzyme funktionsfähig sind.
  • Weitere geeignete Ausführungsformen des vorliegenden Verfahrens beruhen auf der Tatsache, daß DNA, die für die Aktivität von mehr als einer Expandase und/oder mehr als einer Hydroxylase kodiert, verwendet werden kann, um den nicht-rekombinanten P. chrysogenum-Stamm zu transformieren. Mit derartigen Ausführungsformen ist es möglich, eine verstärkte Expandase und/oder Hydroxylase-Aktivität zu erzielen, da erhöhte Mengen an enzymatischem Protein exprimiert werden.
  • Es wurde bereits unter dem Abschnitt, der den Stand der Technik wiedergibt, ausgeführt, daß das aus Streptomyces clavuligerus ATCC 27064 abgeleitete Expandase-Enzym vollständig sequenziert und durch Endonuclease- Restriktionskartierung charakterisiert worden ist. Es hat jedoch den Anschein, daß für das gleiche Enzym, das von S. clavuligerus NRRL 3585 abgeleitet worden ist, ein unterschiedliches Molekulargewicht angegeben wurde, jedoch ist dieses Enzym noch nicht sequenziert worden. Ferner wurde vorstehend ebenfalls in dem Abschnitt bezüglich des Stands der Technik ausgeführt, daß das DAOCS/DACS-Enzym aus Cephalosporium acremonium ATCC 11550 sequenziert worden ist (Samson et al., Bio/Technology, Bd. 5 (1987), S. 1207-1214 uhd EP-A-0 281 391).
  • Diese Expandase-Enzyme, die gemäß dem Stand der Technik bereits identifiziert worden sind, sind im erfindungsgemäßen neuartigen biologischen Verfahren geeignet. Weitere Expandase-Enzyme, die noch nicht identifiziert worden sind und sich von anderen Stämmen von S. clavuligerus oder C. Acremonium oder auch von Mikroorganismen anderer Gattungen ableiten, können sich als geeignet zur Durchführung des erfindungsgemäßen neuartigen biologischen Verfahrens erweisen. Die Verfahren zur Identifizierung derartiger neuer Stämme und Gattungen von geeigneten Mikroorganismen und zur Isolierung der mutmaßlichen Expandase-Enzyme sowie zur Feststellung, daß sie zur Anwendung im erfindungsgemäßen Verfahren geeignet sind, sind komplikationslos auffindbar und liegen im Wissen des Fachmanns. Das Screening von zellfreien Extrakten von in Frage kommenden neuen Stämmen und Gattungen von geeigneten Mikroorganismen kann in zuverlässiger und reproduzierbarer Weise durchgeführt werden, indem man die Extrakte zum Adipoyl-6-APA-Substrat in Gegenwart von bekannten DAOCS-Kofaktoren gibt, zu denen Eisen(II) (Fe²&spplus;)-Ionen, Ascorbat, α-Ketoglutarat und Adenosintriphosphat (ATP) gehören. Das Adipoyl-6-APA-Substrat kann in ausreichenden Mengen hergestellt werden, indem man ein Adipat-Einsatzmaterial in analoger Art und Weise, wie es nachstehend ausführlich beschrieben ist, zu untransformiertem Penicillium chrysogenum gibt. Das gewünschte Expandase- oder Expandase/Hydroxylase-Enzym ist vorhanden, wenn Adipoyl- 7-ADCA und/oder Adipoyl-7-ADAC gebildet wird, deren Anwesenheit chromatographisch nachgewiesen werden kann.
  • Ferner ist es möglich, unter Anwendung bekannter rekombinanter Techniken DNA-Sonden beispielsweise auf der Grundlage der Nucleotidsequenzen der Expandase-Gene von S. clavuligerus und C. acremonium zu erzeugen, um den DNA-Anteil eines in Frage kommenden Mikroorganismus aufzufinden, bei dem die Wahrscheinlichkeit besteht, daß er eine zur Anwendung im erfindungsgemäßen Verfahren geeignete Expandase bildet.
    • Mögliche Quellen für Expandase-, Hydroxylase und Expandase/Hydroxylase-Enzyme
  • Expandase-Enzyme sind, wie bereits erwähnt, Enzyme, die die Erweiterung von penam-Ringstrukturen (die in Molekülen vom Penicillin-Typ auftreten) zu ceph-3-em-Ringen (die in Cephalosporinen auftreten) katalysieren. Beliebige Organismen, die Metaboliten bilden, die einen cephem-Ring enthalten, stellen somit eine potentielle Quelle für eine für Expandase kodierende DNA dar. Gleichermaßen stellen beliebige Organismen, die Cephalospsorine mit einer 3-Hydroxymethylgruppe bilden eine potentielle Quelle für DNA, die für Hydroxylasse (oder Expandase/Hydroxylase) kodiert, dar. Beispiele für derartige Organismen sind nachstehend aufgeführt. Diese Liste ist aber nur beispielhaft und soll nicht als erschöpfend angesehen werden.
    • Pilze
  • Cephalosporium acremonium
  • Cephalosporium sp.
  • Emericellopsis
  • Paecilomyces
  • Scopulariopsis
  • Diheterospora
  • Spiroidium
  • Anoxiopsis
    • Actinomyzeten
  • Streptomyces clavuligerus
  • S. lipmanii
  • S. wadayamensis
  • S. todorominensis
  • S. filipinensis cephamycini
  • S. heteromorphus
  • S. panayensis
  • S. griseus
  • S. cattleya
  • Nocardia lactamdurans
    • Weitere Bakterien
  • Flavobacterium sp.
  • Alcaligenes denitrificans
  • Mycoplana bullata
  • Providencia rettgeri
  • Lysobacter lactamgenus
  • Die Expandasen und Hydroxylasen der vorstehend aufgeführten Mikroorganismen stellen lediglich Kandidaten für weitere Untersuchungen dar. Es kann sein, daß nicht alle diese Mikroorganismen für das neuartige Verfahren der Erfindung geeignet sind.
    • Isolierung von DNA-Fragmenten, die für Expandase-Aktivität kodieren
  • Nachdem die Anwesenheit eines gewünschten Expandase-Enzyms auf die vorstehend beschriebene Art und Weise nachgewiesen worden ist, ergeben sich die Verfahren für die Isolierung der für die Expandase-Enzymaktivität kodierenden DNA ebenfalls problemlos und in an sich bekannter Art und Weise. DNA-Sonden auf der Basis bekannter Sequenzen und partieller Sequenzen der für die Expandase-Enzyme kodierenden Gene werden konstruiert, die mit der zu isolierenden, für das gewünschte Enzym kodierenden DNA hybridisieren. Die Konstruktion von derartigen Sonden basiert auf der Kenntnis der Aminosäuresequenz und der für das Expandase-Enzym kodierenden Nucleotid-Basensequenz sowie auf den Codon-Präferenzen des beteiligten speziellen Mikroorganismus. Eine ausführliche Beschreibung für typische Vorgangsweisen dieses Typs zur Anwendung auf genomische DNA von Streptomyces clavuligerus ATCC 27064 wird nachstehend näher erläutert.
  • Die Isolierung der für die Expandase-Enzymaktivität kodierenden DNA wird durch Restriktions- und Ligationsvorgänge, die auf dem Gebiet der rekombinanten DNA-Technik bekannt sind, erreicht. Es ist erforderlich, über eine Endonuclease-Restriktionskarte des Genoms des beteiligten Mikroorganismus zu verfügen, so daß das geeignete Restriktionsfragment erzeugt und isoliert werden kann. Restriktionskarten für S. clavuligerus und C. acremonium sind bereits verfügbar. Für den erstgenannten Stamm werden die Restriktionsenzyme BamHI und SalI verwendet. Eine Elektrophorese ergibt die gewünschten Fragmente mit einer Größe von 1,8 bis 2,2 kb.
    • Quellen für das Acetyltransferase-Enzym und Isolierung von für diese Aktivität kodierenden DNA-Fragmenten
  • Die Klonierung des C. acremonium-DAC-Acetyltransferase-Gens kann nach aus dem Stand der Technik bekannten rekombinanten Techniken, die nachstehend allgemein beschrieben werden, vorgenommen werden.
  • Um das Acetyltransferase-Gen zu klonen, müssen zunächst Mutanten von C. acremonium, denen die Fähigkeit zur Umwandlung von Desacetylcephalosporansäure (DAC) zu Cephalosporin C fehlt, erzeugt werden. Bei einem derartigen Verfahren werden C. acremonium-Zellen Mutagenen, wie N-Nitrosoguanidin (NTG), salpetrige Säure oder UV-Licht, ausgesetzt, was die Gewinnung auf einem geeigneten Wachstumsmedium und das anschließende Testen, beispielsweise durch chromatographische oder biologische Maßnahmen, auf die Anreicherung von DAC ermöglicht.
  • Bei der Identifizierung einer geeigneten Mutante besteht die nächste Stufe der Identifizierung des für die Acetyltransferase kodierenden Gens in der Isolierung von C. acremonium-DNA aus einem Cephalosporin C erzeugenden Stamm. Im Anschluß an eine Spaltung (entweder durch Restriktionsendonuclease-Verdau oder durch mechanische Schereinwirkung) in Fragmente von geeigneter Größe erfolgt der Einbau in ein Plasmid oder Cosmid, die Transformation von Vektoren, die ferner ein geeignetes dominantes Markergen, wie das auf Hygromycin- oder Phleomycin-Resistenz, enthalten. Der Vektor sollte auch DNA-Sequenzen enthalten, um die anschließende Gewinnung der inserierten DNA zu erleichtern, beispielsweise lambda (Phagen)- cos-Stellen, die die Gewinnung der klonierten DNA durch in vitro-Packung und die anschließende Infektion von E. coli, was nach anerkannten Verfahrensweisen durchgeführt werden kann, ermöglichen.
  • Protoplasten des mutanten Stammes mit einem Mangel an Acetyltransferase werden sodann unter Verwendung von Vektoren, die willkürliche Fragmente von genomischer DNA enthalten, transformiert und Transformanten werden auf der Basis der antibiotischen Resistenz ausgewählt. Die Transformanten können in bezug auf die Wiederherstellung der Cephalosporin C- Bildung getestet werden, was einen Hinweis auf eine erfolgreiche Vervollständigung durch ein in einem Vektor enthaltenes Acetyltransferase-Gen darstellt. Mutanten, von denen angenommen wird, daß sie geklonte Kopien des Gens beinhalten, können sodann gezüchtet werden. Gemäß dem vorstehend dargestellten Verfahren kann ihre DNA isoliert und die Vektor-DNA gewonnen werden. Die Bestätigung, daß der Vektor tatsächlich das Acetyltransferase-Gen enthält, wird erhalten, indem man eine Subklonierung in E. coli durchführt, wobei man sich standardmäßiger Verfahrensweisen und leicht verfügbarer Vektoren bedient. Anschließend erfolgt eine Retransformation der Mutante ohne Acetyltransferase. Das Gen kann sodann gemäß den Angaben in den Ausführungsbeispielen isoliert, sequenziert und manipuliert werden, wobei man Techniken anwendet, die dem Fachmann auf dem Gebiet der Molekulargenetik routinemäßig zur Verfügung stehen.
  • Durch alternative Verfahrensmaßnahmen, die ebenfalls aus dem Stand der Technik bekannt sind, führten Matsuda et al. die Isolierung und Sequenzierung des für die Acetyltransferase-Aktivität von C. acremonium kodierenden Gens durch und leiteten die Aminosäuresequenz des Enzyms selbst ab, wie in EP-A-0 450 758 beschrieben ist. Diese alternativen Vorgehensweisen bestanden in der Isolierung des Acetyltransferase-Enzyms, der Nterminalen Aminosäuresequenzierung und aufgrund dieser Information der Ableitung der Nucleotidsequenz, die für diesen Teil des Enzyms kodiert. Aufgrund dieser Information wurden wiederum Sonden erzeugt, die mit der vollständigen Kodierungssequenz hybridisierten, was die Isolierung ermöglichte.
    • Transformation des Penicillium chrysogenum-Stamms
  • Nachdem die für die Expandase/Hydroxylase-, Expandase- und Hydroxylase- sowie Acetyltransferase-Aktivitäten kodierenden DNA-Fragmente erhalten worden sind, können sie in ein Plasmid oder einen anderen Expressionsvektor inseriert (ligiert) werden, und zwar zusammen mit DNA-Fragmenten, die Promotoren, translationale Aktivierungssequenzen, Resistenzmarker, regulatorische Segenzen, Cosmid-Bildner und beliebige andere DNA- Sequenzen, die eine Transformation ermöglichen oder fördern, die Expression des Genprodukts antreiben und die Isolierung der Transformanten erleichtem. Der Expressionsvektor, der auf diese Weise konstruiert worden ist, wird sodann zur Erzielung der Transformation des Penicillium chrysogenum-Stamms und zur intrazellulären Expression der Expandase/Hydroxylase-, Expandase- und Hydroxylase- sowie Acetyltransferase-Enzyme verwendet. Die zur Erzielung der Transformation und Expression verwendeten Techniken sind aus dem Stand der Technik bekannt. Eine ausführliche Beschreibung typischer Vorgangsweisen findet sich in den nachstehenden Ausführungen.
  • Wie bereits vorstehend ausführlich erwähnt, exprimiert der transformierte Penicillium chrysogenum-Stamm die Aktivität der Expandase/Hydroxylase-, Expandase- und Hydroxylase- sowie Acetyltransferase-Enzyme intrazellulär, die anschließend in situ auf das Adipoyl-6- APA-Substrat unter Ringerweiterung zu Adipoyl-7-ADCA, Hydroxylierung des letztgenannten Produkts zu Adipoyl-7-ADAC und dessen Acylierung zu Adipoyl-7-ACA einwirken.
    • Neue Transformante
  • Die spezifischen Penicillium chrysogenum-Transformanten, die für die Aktivitäten der durch die Expandase/Hydroxylase- und Expandase/Hydroxylase- plus Acetyltransferase-Gene kodieren, die bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung darstellen, sind neuartig im Vergleich zu ähnlichen Konstruktionen des Stands der Technik, z. B. gemäß Cantwell et al., Current Genetics, Bd. 17 (1990), S. 213-221, EP-A-0 281 391 und EP- 15 A-0 437 378. Bei der Cantwell-Konstruktion ist das Streptomyces clavuligerus-Expandase-Gen unter der Kontrolle des P. chrysogenum-Isopenicillin N-synthetase (IPNS)-Promotors plaziert und unterscheidet sich somit von den Konstrukten des vorliegenden Falls im Fehlen jeglicher DNA, die für Hydroxylase- oder Acetyltransferase-Aktivitäten kodiert.
  • Ingolia et al. beschreiben in EP-A-0 281 391 P. chrysogenum-Transformationsvektoren, die DNA enthalten, die für das bifunktionelle C. acremonium-Expandase/Hydroxylase-Enzym kodieren, wobei die Expression durch den Penicillium-IPNS-Promotor angetrieben wird. Bei einer dieser Konstruktionen (pPS62) ist das Expandase/Hydroxylase-Gen stromabwärts und im Raster mit dem Hygromycin-phosphotransferase-Gen fusioniert. Das Genprodukt, ein Hygromycin-phosphotransferase:: Expandase/Hydroxylase-Fusionsprotein, unterscheidet sich vom erfindungsgemäßen Produkt, einem Expandase/Hydroxylase-Enzym, das im wesentlichen identisch mit dem in C. acremonium gebildeten Produkt ist. Der andere, in EP-A-0 281 391 beschriebene Vektor wurde aufgrund einer umfangreichen Reihe von molekularen Manipulationen konstruiert, wozu die Verwendung von synthetischen DNA-Linkem gehört. Die endgültige Konstruktion (pPS61) bedient sich des 1,2 kb-NcoI-Fragments des Penicillium IPNS-Promotors, um das Expandase/Hydroxylase-Gen zu exprimieren, und des Aspergillus nidulans- Acetamidase-Gens als selektierbarem Marker zur Transformation von Penicillium. Die Sequenz der Codons 9 und 10 im Expandase/Hydroxylase-Gen, die für Arginin bzw. Leucin kodieren, werden von CGTCTC zu CGCCTA verändert, was die kodierte Aminosäuresequenz nicht verändert.
  • Bei der erfindungsgemäßen Konstruktion wurde das 1,2 kb-NcoI-IPNS- Promotorfragment mit dem Expandase/Hydroxylase-Gen ohne Veränderung der nativen Expandase/Hydroxylase-Gensequenz fusioniert. Der für die erfindungsgemäße Konstruktion verwendete IPNS-Promotor weist im Vergleich zum nativen Promotor zwei separate Vierbasen-Duplikationen auf, eine an der SalI-Stelle 760 bp stromaufwärts vom ATG-Startcodon und die andere an der XbaI-Stelle, fünf Basenpaare stromaufwärts vom Startcodon und innerhalb der 5'-nicht-translatierten Leadersequenz. Diese Veränderungen beeinträchtigen den hohen Expressionsgrad des Expandase/Hydroxylase-Gens nicht.
  • Ein weiterer Unterschied in den Vektoren liegt in den verwendeten selektierbaren Markern. Die in EP-A-0 281 391 beschriebenen Konstrukte verwenden Acetamidase und Hygromycin als selektierbare Marker. Dies steht im Gegensatz zum erfindungsgemäß verwendeten Expandase/Hydroxylase-Penicillium-Transformationsvektor (pPEN/CEPH-1), der den Phleomycin-Resistenzmarker enthält. Ein mit dem Vektor pPEN/CEPH-1 transformierter Penicillium chrysogenum-Stamm, der zur Expression der Expandase/Hydroxylase-Aktivität befähigt ist, wurde als PC200 identifiziert. Seine taxonomischen Merkmale umfassen typischerweise die Bildung von sich breit verteilenden Kolonien, blaugrüne bis grüne Färbung, glatte samtartige Beschaffenheit mit gelben Tropfen; gelbe, in das Agar diffundierende Rückseite; verzweigte Konidienköpfe, wobei sämtliche Teile glatt sind; elliptische bis kugelförmige Konidien von 3-4 um Länge. Für eine akzeptable Züchtung von P. chrysogenum wird ein festes Medium mit einem Gehalt an folgenden Bestandteilen verwendet: Lactose-monohydrat 1,5% (Gew./Vol.); Maisquellflüssigkeit 0,5% (Vol./Vol.); Pepton 0,5% (Gew./Vol.); NaCl 0,4% (Gew./Vol.); MgSO&sub4;·7H&sub2;O 0,05% (Gew./Vol.); KH&sub2;PO&sub4; 0,06% (Gew./Volj; FeCl&sub3;·6H&sub2;O 0,0005% (Gew./Vol.); CuSO&sub4;·5H&sub2;O 0,0002% (Gew./Vol.); Agar 3,0% (Gew./Vol.); in 1 Liter destilliertem Wasser, pH- Wert 4,8. Das vorstehend beschriebene P. chrysogenum mit der Bezeichnung PC200 wurde bei der American Type Culture Collection (ATCC) 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, unter der Hinterlegungsnummer ATCC 74186 hinterlegt (Hinterlegungsdatum: 23. September 1992).
  • Die zweite neuartige erfindungsgemäße Penicillium chrysogenum-Transformante, die zur Bildung von Adipoyl-7-ACA befähigt ist, exprimiert sowohl Expandase/Hydroxylase- als auch Acetyltransferase-Aktivitäten aufgrund der Tatsache, daß sie mit einem einzigen Vektor (pTS-8) transformiert worden ist, der für diese beiden Enzyme kodierende DNA umfaßt. Dieser Vektor unterscheidet sich daher von den in EP-A-0 437 378 beschriebenen Penicillium-Transformationsvektoren, die DNA umfassen, die entweder für die C. acremonium-Acetyltransferase allein oder in Verbindung mit einer für ein mutantes Expandase/Hydroxylase-Polypeptid kodierenden DNA- Sequenz kodiert. Bei der pTS-8-Konstruktion wird die Expression der Expandase/Hydroxylase- und Acetyltransferase-Gene jeweils durch getrennte Kopien des P. chrysogenum-IPNS-Promotors angetrieben. Eine dritte Kopie des IPNS-Promotors wird zur Transkription des Phleomycin-Resistenzgens als selektierbarer Marker verwendet.
  • In einer alternativen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung können die Expandase/Hydroxylase- und Acetyltransferase-Gene in getrennte Vektoren eingebaut und in den Penicillium-Wirtsstamm sequentiell eingeführt werden. Die Reihenfolge, mit der die für die Expandase/Hydroxylase- und Acetyltransferase-Enzymaktivitäten kodierenden DNA-Fragmente in den Penicillium-Stamm eingeführt werden, ist nur unter praktischen Gesichtspunkten von Bedeutung. Vorzugsweise sollte der Transformation von Penicillium mit dem oder den Expandase/Hydroxylase-Gen(en) die Insertion des Acetyltransferase-Gens vorausgehen, da dies die Reihenfolge ist, in der die Enzyme in vivo arbeiten. Daher kann die Expression der Expandase/Hydroxylase durch Bestimmung der Adipoyl-7-ADAC-Bildung überwacht werden. Adipoyl-7-ADAC stellt das Substrat für das Acetyltransferase-Enzym dar. Die Expression des anschließend eingeführten, für Acetyltransferase kodierenden Gens wird durch die Bildung von Adipoyl-7-ACA angezeigt. Unter Anwendung eines geeigneten in vitro-Tests für Acetyltransferase ist es möglich, Penicillium zunächst mit dem Acetyltransferase-Gen zu transformieren, anschließend die Expression durch den in vitro-Test zu bestätigen und sodann mit der Einführung des Expandase/Hydroxylase-Gens fortzufahren. Beide Wege stellen somit eine geeignete Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Herstellung von 7-ACA dar.
  • Bei der bevorzugten Ausführungsform werden jedoch sämtliche drei Enzymaktivitäten gleichzeitig durch die Konstruktion eines einzigen Plasmidvektors eingeführt, der die DNA umfaßt, die für die Expandase/Hydroxylase- und Acetyltransferase-Aktivitäten von C. acremonium kodiert. Ein mit einem derartigen einzigen Plasmidvektor, dem Vektor pTS- 8, transformierter Penicillium chrysogenum-Stamm, der zur Expression von Expandase/Hydroxylase- und Acetyltransferase-Aktivität befähigt ist, wurde als PC300 bezeichnet. Seine taxonomischen Merkmale sind die gleichen, wie sie vorstehend für PC200 angegeben wurden. Akzeptable Züchtungsbedingungen für PC300 sind die gleichen, wie sie vorstehend für PC200 beschrieben wurden. Der P. chrysogenum-Stamm mit der Bezeichnung PC300 wurde bei der American Type Culture Collection (ATCC), 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, unter der Hinterlegungsnummer ATCC 74187 (Hinterlegungsdatum: 23. September 1992) hinterlegt.
  • Der spezifische Penicillium chrysogenum-Stamm, der mit dem Vektor pPenFTSO, der die Aktivität des S. clavuligerus-Expandase-Gens exprimiert, transformiert worden ist, was eine bevorzugte Ausführungsform der Erfindung darstellt, erweist sich als neuartig im Vergleich zu Konstruktionen des Stands der Technik, z. B. von Cantwell et al., Current Genetic, Bd. 17 (1990), S. 213-221. Bei beiden Konstruktionen wird eine in vitro-Mutagenese zur Verknüpfung des Promotors mit dem Expandase-Gen herangezogen. Bei der Cantwell-Konstruktion wird durch die Manipulation eine NdeI-Stelle am ATG des Expandase-Gens eingeführt, das dann durch einen XbaI/NdeI-Linker mit der XbaI-Stelle am 3'-Ende des IPNS-Promotors verknüpft wird. Bei der vorliegenden Konstruktion wird eine NcoI-Stelle am ATG des Expandase-Gens geschaffen und mit der NcoI-Stelle am 3'-Ende des IPNS-Linkers verknüpft. Dies erzeugt die folgenden Sequenzen um die Promotor-Genverbindungsstellen in diesen Konstruktionen:
  • Die Cantwell-Konstruktion ersetzt ein C durch ein T, während im erfindungsgemäßen Konstrukt das C erhalten bleibt. Somit stimmt die Sequenz des IPNS-Promotors unmittelbar neben dem ATG-Startcodon genau mit der Sequenz überein, die im natürlich auftretenden IPNS-Gen gefunden wird. Es ist möglich, daß der Promotor des Stands der Technik sich zwar nur durch eine einzige Nucleotidbase unterscheidet, jedoch zu einem geringeren Wirkungsgrad der Translation und infolgedessen zu einem geringeren Grad der Expression des Expandase-Gens führt.
  • Weitere Unterschiede liegen in den Regionen des in den Konstruktionen enthaltenen Promotors oder Gens. Die Cantwell-Konstruktion enthält die 5'-BamHI- bis XbaI-3'-Region des IPNS-Promotors, während der erfindungsgemäße Vektor die 5'-NcoI- bis NcoI-3'-Region des Promotors enthält (Diez et al., J. Biol. Chem., Bd. 265 (1990), S. 16358-16365). Dies führt zu etwa 250 zusätzlichen bp am 5'-Ende des IPNS-Promotors bei der Cantwell-Konstruktion. Jedoch befindet sich diese Region im offenen Leseraster des ACV-Synthetase-Gens stromaufwärts vom IPNS-Gen.
  • Die Cantwell-Konstruktion enthält auch das Streptomyces-Gen vom ATG bis zur BamHI-Stelle in 3'-Richtung des Gens, während der erfindungsgemäße Vektor das Gen von AT6 bis zur SalI-Stelle in 3'-Richtung des Gens enthält (Kovacevic et al., J. Bacteriol., Bd. 171 (1989), S. 754-760). Dies führt zu etwa 1000 zusätzlichen bp der 3'-Endsequenz an der Cantwell-Konstruktion. Die vorliegende Konstruktion enthält noch die stromaufwärtige Region des Expandase-Gens bis zur BamHI-Stelle in 5'- Richtung des ATG. Jedoch ist diese Region vom Leseraster des Expandase- Gens durch den IPNS-Promotor getrennt.
  • Ein weiterer Unterschied des erfindungsgemäßen pPenFTSO-Konstrukts gegenüber dem im Stand der Technik beschriebenen Konstrukt betrifft den verwendeten selektierbaren Marker. Die Verwendung einer Penicillium-IPNS- Promotor : Phleomycin-Gen-Fusion im erfindungsgemäßen Konstrukt führt tendenziell zur Selektion der Integration von Mehrfachkopien oder der Integration an Loci, die einen hohen Grad der Expression ermöglichen und somit potentiell einen höheren prozentualen Anteil an Transformanten ergeben, die das Expandase-Gen in hohem Maße exprimieren.
    • Spaltung der Adipoyl-Seitenkette
  • Die letzte Stufe des erfindungsgemäßen neuartigen biologischen Verfahrens besteht in der Abpaltung der Adipoyl-Seitenkette von Adipoyl-7- ADAC oder Adipoyl-7-ACA, die die Behandlung der Produkte der vorstehenden Stufen mit einem Adipoyl-amidase-Enzym erfordert. Wie vorstehend erwähnt, besteht eine der wichtigen Errungenschaften der Erfindung darin, daß es möglich ist, sämtliche Stufen, die zur Bildung von Adipoyl-7-ADAC und Adipoyl-7-ACA führen, in einer einzigen Fermentationskultur durchzuführen. Dadurch wird eine außerordentlich verbesserte Effizienz erreicht, da es nicht erforderlich ist, Zwischenprodukte, die von Stufe zu Stufe im Verfahren anfallen, zu isolieren und partiell zu reinigen. In dieser letzten Stufe ist jedoch das Adipoyl-amid-Enzymsystem nicht vorhanden, d. h. es ist nicht in situ in der ursprünglichen Fermentationskultur entweder durch natürliche oder rekombinante Expression der Gene von P. chrysogenum erzeugt worden.
  • Wird das erfindungsgemäße neuartige biologische Verfahren absatzweise durchgeführt, so ist es erforderlich, das Produkt der ersten Stufe zu isolieren und partiell zu reinigen. Die dafür erforderlichen vorgeschalteten Verfahrensstufen wurden vorstehend beschrieben.
  • Dennoch kann das erfindungsgemäße Verfahren auf jede beliebige Weise durchgeführt werden, bei der die Adipoyl-amidase in Kontakt mit der Adipoyl-7-ADAC oder Adipoyl-7-ACA kommt, so daß die enzymatische Umwandlung dieser Verbindung zu 7-ADAC oder 7-ACA stattfinden kann. Dies stellt die Definition des Ausdrucks "Kontakt" im breitesten Sinne dar. Es ist möglich, eine zellfreie Brühe von rohem Adipoyl-7-ADAC oder Adipoyl-7-ACA als Einsatzmaterialstrom zu verwenden und diesen absatzweise mit roher Adipoyl-amidase-Brühe zu behandeln. Diese Verfahrensweise erweist sich als wirkungsvoll, da es nicht erforderlich ist, zu Beginn die Reaktanten in wesentlichem Umfang zu reinigen. Selbstverständlich sind aber Modifikationen möglich. Beispielsweise können die Reaktanten in beliebigem Umfang gereinigt werden, bevor sie miteinander in Kontakt gebracht werden. Ferner ist es auch möglich, das Verfahren kontinuierlich und nicht absatzweise durchzuführen. Das Kontaktieren der Reaktanten selbst kann auf verschiedene Weise modifiziert werden, wobei man sich den Entwicklungen der Verfahrenstechnologie anpaßt. So kann ein immobilisiertes Enzym verwendet werden, beispielsweise in Form einer Säule, die die Adipoylacylase enthält, wobei die Adipoyl-7-ADAC oder Adipoyl-7-ACA über die Säule gegeben wird. Das immobilisierte Enzym kann auch in Form einer Suspension zu der Adipoyl-7-ADAC- oder Adipoyl-7-ACA-Lösung gegeben werden. Derartige immobilisierte Enzymsysteme haben den Vorteil, daß sie leicht gewonnen und mehrfach verwendet werden können. Ein weiteres Beispiel für eine derartige Verfahrenstechnik sind Membranreaktoren. Das bevorzugte Verfahren zum Kontaktieren der Reaktanten besteht in der Verwendung einer Säule mit immobilisiertem Enzym.
    • In der Spaltungsstufe geeignete Adipoyl-amidase-Enzyme
  • Es gibt eine Anzahl von Enzymen, deren Spezifität gegenüber Adipoyl- Seitenketten bekannt ist. Die Ergebnisse, die mit einer handelsüblichen Adipoyl-amidase der Fa. RAEV Corp. erzielt wurden, sind in den nachstehenden Ausführungsbeispielen aufgeführt. In der Literatur finden sich Berichte über sieben weitere Enzyme, die Adipoyl-Seitenketten von Molekülen vom Cephalosporin-Typ entfernen. Sechs dieser sieben Enzyme stammen von Pseudomonas-Spezies und das siebte von einer Bacillus-Spezies. Es gibt gewisse Ähnlichkeiten unter den Pseudomonas-Enzymen, wobei aber alle sieben Enzyme sich in gewissem Umfang bezüglich ihrer physikalischen/biologischen Eigenschaften unterscheiden. Einige dieser Eigenschaften sind nachstehend zusammengestellt:
  • * Aramori et al., J. Ferment. Bioeng., Bd. 72 (1991), S. 232-243.
  • ** Aramori et al., J. Bacteriol., Bd. 173 (1991), S. 7848-7855.
  • Alle vorgenannten Adipoyl-amidase-Enzyme sind im erfindungsgemäßen neuartigen biologischen Verfahren geeignet. Weitere Adipoyl-amidasen, die im erfindungsgemäßen Verfahren geeignet sind, lassen sich leicht auffinden, indem man das in Frage kommende Enzym gegenüber Adipoyl-7-ACA und Adipoyl-7-ADAC testet, d. h. dem tatsächlichen Substrat, gegenüber dem das Enzym wirken muß. Ein positives Ergebnis ergibt ein zuverlässiges und reproduzierbares Verfahren zur Feststellung, daß ein in Frage kommendes Enzym tatsächlich für das erfindungsgemäße Verfahren geeignet ist. Das Substrat kann problemlos durch Umsetzung von Adipinsäureanhydrid mit 7- ACA unter Anwendung einer Modifikation gemäß dem Verfahren von Szewczuk und Wellman-Bednawska, Clin. Chim. Acta, Bd. 84 (1978), S. 19-26, hergestellt werden. Ferner ist es möglich, das in Agric. Biol. Chem., Bd. 45 (7) (1981), S. 1561-1567, beschriebene Verfahren, das zur Herstellung von Gluraryl-7-ACA dient, anzupassen. Das Adipinsäureanhydrid kann gemäß dem Verfahren von Albertson und Lundmark, J. Macromol. Sci. Chem., Bd. A27 (1990), S. 397-412 hergestellt werden. 7-ACA kann von mehreren gewerblichen Quellen bezogen werden, einschließlich Sigma Chemical Co.
  • Wenn es erwünscht ist, ein grobes Screening von in Frage kommenden Enzymen unter Anwendung eines raschen kolorimetrischen Verfahrens durchzuführen, kann man das Adipoyl-7-ACA-Substrat durch ein kolorimetrisches Substrat ersetzen, z. B. durch Adipoyl-PABA (p-Aminobenzoesäure) oder Adipoyl-PNA (p-Nitroanilin). Für dieses Verfahren kann das von Szewczuk et al., Clinica Chimica Acta, Bd. 84 (1978), S. 19-26, für die Herstellung von g-Glutamyl-PABA beschriebene Verfahren angepaßt werden. Die Spaltung der Seitenkette ergibt eine farberzeugende Spezies, deren Anwesenheit und Konzentration sich leicht unter Verwendung eines Kolorimeters feststellen läßt. Bezüglich ausführlicherer Informationen über diese und andere geeignete kolorimetrische Verfahren wird verwiesen auf L. P. Marelli, J. Pharm. Sci., Bd. 57 (1968), S. 2172-2173; G. Szasz, Clin. Chem., Bd. 15 (1969), S. 124-136; A. Szewczuk et al., Anal. Biochem., Bd. 103 (1980), S. 166-169; und F. Reyes et al., J. Pharma. Pharmacol., Bd. 41 (1989), S. 136-137.
  • Ein Vergleich wurde für die N-terminalen Aminosäuresequenzen des RAEV-Enzyms mit den großen Untereinheiten von acyll und der GK16-Enzyme gemäß der Aufstellung in der vorstehenden Tabelle vorgenommen. Die Ergebnisse des Vergleichs sind nachstehend aufgeführt (wobei die Angaben in Klammern nicht-schlüssige Zuordnungen bezeichnen):
  • Aus den dargestellten Sequenzen ist ersichtlich, daß alle diese drei Peptide verwandt sind. Jedoch muß ein Protein mit einer N-terminalen Sequenz, die den vorstehend dargestellten Sequenzen ähnlich ist, nicht notwendigerweise eine Adipoyl-amidase-Aktivität besitzen, wie das bei einer durch einen Stamm von Arthrobacter erzeugten Penicillin G-acylase der Fall ist. Andererseits gibt es für das erfindungsgemäße Verfahren geeignete Adipoyl-amidasen, die keine signifikante Homologie zu der vorerwähnten n-terminalen Sequenz zeigen. Beispielsweise haben das Asahi-Enzym acyl und die Fujisawa-B. laterosporus J1-Acylasen, die in der vorstehenden Tabelle aufgeführt sind und von denen gezeigt worden ist, daß sie eine gewisse Adipoyl-7-ACA-acylase-Aktivität aufweisen, keinerlei Sequenzhomologie zu den übrigen, vorstehend aufgeführten Enzymen. Infolgedessen wird der Schutzumfang der vorliegenden Erfindung bezüglich der in der letzten Stufe des neuartigen biologischen Verfahrens geeigneten Adipoyl-amidasen durch die Tatsache bestimmt, ob ein in Frage kommendes Enzym dazu befähigt ist, die Adipoyl-Seitenkette von Adipoyl-7-ACA zu spalten oder nicht, eine Feststellung, die sich leicht und zuverlässig treffen läßt, wie vorstehend ausführlich dargelegt wurde.
    • Beschreibung von bevorzugten Ausführungsformen
  • Nachstehend findet sich eine ausführliche Beschreibung bestimmter bevorzugter Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung, die jedoch nur beispielhaft sind und in keiner Weise die Erfindung beschränken sollen.
    • Beispiel 1 Penicillium chrysogenum - Züchtungsbedingungen
  • Die bei diesen Verfahrensmaßnahmen verwendeten Penicillium chrysogenum-Stämme wurden auf Platten mit einem Gehalt an LCSB-Medium erhalten. Dieses Medium wies folgende Zusammensetzung auf: Lactose-monohydrat 1,5% (Gew./Vol.); Maisquellflüssigkeit 0,5% (Vol./Vol.); Pepton 0,5% (Gew./Vol.); NaCl 0,4% (Gew./Vol.); MgSO&sub4;·7H&sub2;O 0,05% (Gew./Vol.); KH&sub2;PO&sub4; 0,06% (Gew./Vol.); FeCl&sub3;·6H&sub2;O 0,0005% (Gew./Vol.); CuSO&sub4;·5H&sub2;O 0,0002% (Gew./Vol.); Agar 3,0% (Gew./Vol.); in 1 Liter destilliertem Wasser, pH- Wert 4,8. Nach 12 Tagen bei 25ºC und 65% relativer Feuchtigkeit wurden einzelne Kolonien entfernt und zu 2 ml sterilisiertem Wasser in einem Glaskügelchen enthaltenden Röhrchen mit Schraubverschluß gegeben. Die nach Mazerieren des Kulturwachstums durch heftiges Rühren erhaltene Suspension wurde zur Inokulation von Reis-Kolben verwendet. Die Reis-Kolben enthielten 25 g/250 ml-Kolben verarbeiteten Uncle Ben's-Reis (natürlicher Langkornreis), den man mit 3 bis 4 Volumenteilen destilliertem Wasser 7 Minuten wusch, jeweils 30 Minuten vermischte und sodann abtropfen ließ, bis die Wasseraufnahme des Reises etwa 25% betrug. Nach 12 Tagen bei 25ºC und 65% Feuchtigkeit wurden die Sporen vom Reis mit 50 ml sterilem Wasser abgewaschen. Die Sporensuspension wurde zur Inokulation von flüssigen Kulturen und auch zur Bereitstellung von Lyophilisaten der Kulturen zur Lagerung bei 4ºC verwendet. Die Sporen wurden zu einem gleichen Volumen an 5% Magermilch gegeben und in sterilen Ampullen lyophilisiert.
  • Eine 2-stufige Fermentation des Stamms in Schüttelkolben wurde zur Herstellung von Penicillinen oder zur Herstellung von Myzel als eine Quelle für RNA oder DNA verwendet. Die Anzuchtstufe wurde durch Zugabe von 1 · 10&sup8; Sporen zu 50 ml/500 ml-Kolben eines Mediums der folgenden Zusammensetzung verwendet: Glucose 3,0% (Gew./Vol.); Pharmamedia 1,0% (Gew./Vol.; Maisquellflüssigkeit 3,0% (Vol./Vol.); Ammoniumsulfat 0,2% (Gew./Vol.); CaCO&sub3; 0,5% (Gew./Vol.); wasserfreies Monokaliumphosphat 0,05% (Gew./Vol.); Lactose 1,0% (Gew./Vol.); primäre Trockenhefe 1,0% (Gew./Vol.); in 1 Liter destilliertem Wasser. Die Inkubation wurde bei 25ºC und 65% relativer Feuchtigkeit mit einem Drehschüttler von 70 mm Amplitudendurchmesser bei 220 U/min durchgeführt. Nach 48-stündiger Inkubation wurde das Produktionsstadium durch Übertragen von 2 ml einer vegetativen Anzuchtkultur auf 35 ml/500 ml-Kolben eines Mediums der folgenden Zusammensetzung eingeleitet: KH&sub2;PO&sub4; 0,05% (Gew./Vol.); K&sub2;SO&sub4; 0,5% (Gew./Vol.); (NH&sub4;)&sub2;SO&sub4; 1,0% (Gew./Vol.); Lactose 12,0% (Gew./Vol.); Pharmamedia 2,75% (Gew./Vol.); CaCO&sub3; (gefällt) 1,0% (Gew./Vol.); Specköl 1,0% (Vol./Vol.); in 1 Liter destilliertem Wasser, pH-Wert 6,6. Im Anschluß an die Autoklavisierung, aber vor der Inokulation wurde 25% steriles Natriumadipat (pH-Wert 6,6) bis zu einer endgültigen Konzentration an Natriumadipat von 2,5% zugesetzt. Im Anschluß an die Inokulation wurde die Inkubation unter den gleichen Bedingungen wie beim Anzuchtstadium 5 bis 7 Tage fortgesetzt.
  • Wenn Myzel zur Erzeugung von Protoplasten für die Transformation oder als eine DNA-Quelle erforderlich ist, wurde der Stamm in 50 ml/250 ml-Kolben komplettem Medium (cm) der folgenden Zusammensetzung gezüchtet: 50 ml 20x Clutterbuck-Salze (120 g Na&sub2;NO&sub3;, 10,4 g KCl, 10,4 g MgSO&sub4;·7H&sub2;O, 30,4 g KH&sub2;PO&sub4;), 2,0 ml Vogel-Spurenelemente (0,3 M Citronensäure, 0,2 M ZnSO&sub4;, 25 mM Fe(NH&sub4;)&sub2;(SO&sub4;)&sub2;·6H&sub2;O, 10 mM CuSO&sub4;, 3 mM MnSO&sub4;, 8 mM Borsäure, 2 mM Na&sub2;MoO&sub4;·2H&sub2;O), 5 g Trypton, 5 g Hefeextrakt, 10 g Glucose, in 1 Liter destilliertem Wasser. Die Inkubation wurde bei 25ºC auf einem Drehschüttler mit 220 U/min durchgeführt.
    • Beispiel 2 Cephalosporium acremonium-Züchtungsbedingungen
  • C. acremonium-Stämme wurden auf Schrägkulturen, die ein vollständiges Medium der nachstehend angegebenen Zusammensetzung enthielten, gehalten: Saccharose 20 g; Agar 20 g; Pepton 4 g; Hefeextrakt 4 g; NaNO&sub3; 3 g; KH&sub2;PO&sub4; 0,5 g; K&sub2;HPO&sub4; 0,5 g; KCl 0,5 g; MgSO&sub4;·7H&sub2;O 0,5 g; FeSO&sub4;·7H&sub2;O 0,01 g; in 1 Liter destilliertem Wasser, pH-Wert 6,6. Nach 10-tägiger Züchtung bei 28ºC und 66% relativer Feuchtigkeit wurden die Schrägkulturen mit 6 ml sterilisiertem Wasser versetzt. Das Kulturwachstum wurde von der Agaroberfläche abgeschabt. Die erhaltene Suspension wurde in ein steriles Schraubverschlußröhrchen mit einem Gehalt an Glaskügelchen übertragen. Nach Mazerieren des Kulturwachstums durch heftiges Rühren für einige Minuten wurden 3,5 ml der erhaltenen Suspension zur Inokulation von flüssigen Kulturen verwendet. Diese Suspension wurde ferner zur Bereitstellung von Lyophilisaten der Kulturen für eine Lagerung bei 4ºC verwendet. Die Suspension des mazerierten Kulturwachstums wurde zentrifugiert. Das Pellet wurde in 5% Magermilch resuspendiert. Aliquotanteile wurden in sterilen Fläschchen lyophilisiert.
  • Eine zweistufige Fermentation der Stämme in Schüttelkolben wurde zur Herstellung von Cephalosporinen oder zur Bildung von Myzelen als DNA- und RNA-Quelle verwendet. Die Anzuchtkultur wurde durch Zugabe des Inokulums zu 250 ml fassenden Kolben, die jeweils 15 ml eines Mediums der nachstehend angegebenen Zusammensetzung enthielten, eingeleitet: Glucose 5 g; Saccharose 40 g; Maisstärke 30 g; Rübenmelasse 50 g; Sojamehl 65 g; CaSO&sub4;·2H&sub2;O 15,8 g; Ammoniumacetat 8 g; CaCO&sub3; (gefällt) 5 g; (NH&sub4;)&sub2;SO&sub4; 7,5 g; MgSO&sub4;·7H&sub2;O 3,5 g; KH&sub2;PO&sub4; 1 g; Sojaöl 0,15 ml, pro Kolben in 1 Liter destilliertem Wasser, pH-Wert 6,2. Die Inkubation wurde bei 25ºC und 65% relativer Feuchtigkeit auf einem Drehschüttler mit einem Amplitudendurchmesser von 70 mm bei 220 U/min durchgeführt. Nach 96-stündiger Inkubation wurde die Produktionsstufe durch Übertragung von 2 ml einer vegetativen Anzuchtkultur in einen 250 ml fassenden Kolben mit einem Gehalt an 15 ml frischem Medium der vorstehend angegebenen Zusammensetzung eingeleitet. Die Inkubation wurde weitere 96 Stunden unter den gleichen Bedingungen fortgesetzt.
  • Wenn Myzel als DNA-Quelle für die Transformation benötigt wurde, werden die Stämme in 100 ml Komplettmedium der nachstehend angegebenen Zusammensetzung in 500 ml fassenden Kolben gezüchtet: Glycerin 20 g; Pepton 4 g; Hefeextrakt 4 g; KH&sub2;PO&sub4; 0,5 g; K&sub2;HPO&sub4; 0,5 g; KCl 0,5 g; MgSO&sub4;·7H&sub2;O l g; NaNO&sub3; 3 g; FeSO&sub4;·7H&sub2;O 0,01 g, in 1 Liter destilliertem Wasser. Die Inkubation wurde bei 30ºC auf einem Drehschüttler mit 200 U/min durchgeführt.
    • Beispiel 3 Isolierung von genomischer DNA und gesamter RNA von Penicillium und Cephalosporium
  • Das vegetative Myzelwachstum einer auf die vorstehend beschriebene Weise erhaltenen 48-stündigen Kultur wurde durch Filtration durch ein Käsetuch gewonnen, in flüssigem Stickstoff eingefroren und über Nacht lyophilisiert. Das getrocknete Myzel wurde mit Sand mit Mörser und Pistill gemahlen und in 25 ml 100 mM LiCl, 50 mM EDTA, 10 mM Tris, pH-Wert 8,0, 4% SDS resuspendiert. Nach Erwärmen der Suspension auf 50-55ºC in einem Wasserbad von 60ºC wurde das Gemisch zunächst mit phenolgesättigtem 1 M Tris (pH-Wert 8), anschließend mit phenolgesättigtem Tris: Chloroform (1 : 1, Vol./Vol.) und sodann mit Chloroform extrahiert. RNA wurde aus der wäßrigen Phase durch Zugabe eines gleichen Volumens an kaltem 6 M LiCl ausgefällt, wonach man anschließend das Gemisch 2-3 Stunden bei -20ºC stehenließ. Nach 20-minütiger Zentrifugation mit 12 000 g bei 4ºC wurde der Überstand auf einen Ethanolgehalt von 66% (Vol./Vol.) gebracht und 15 Minuten auf -20ºC gekühlt, um die DNA auszufällen. Nach Zentrifugation auf die vorstehend beschriebene Weise wurde das DNA-Pellet mit 70% Ethanol gewaschen, getrocknet und in TE-Puffer (10 mM Tris-HCl, pH-Wert 7,5, 1 mM EDTA) resuspendiert. Die DNA-Konzentration wurde durch Vergleich mit bekannten DNA-Standards durch Agarose-Gelelektrophorese unter Färbung mit Ethidiumbromid bestimmt.
  • Für die RNA-Extraktion wurden Kulturen der vorstehend in den Beispielen 1 und 2 beschriebenen Penicillium chrysogenum und Cephalosporium acremonium 96 Stunden in 35 ml Fermentationsmedium (gemäß den vorstehend beschriebenen Fermentationsbedingungen) bei 25ºC auf einem Drehschüttler mit 220 U/min gezüchtet. Das Myzel wurde durch Filtration mit einem Whatman #1-Filter unter Vakuum gewonnen und mit etwa 50 ml Wasser gewaschen. Das Myzel wurde sofort vom Filter geschabt, in 5 ml "Aufbrechpuffer" (50 mM Tris-HCl, pH-Wert 7,4, 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, pH-Wert 8,0, 5% SDS) resuspendiert, in flüssigem Stickstoff eingefroren und lyophilisiert. Nach Lyophilisation über Nacht wurden 5 ml Wasser mit einem Gehalt an 0,1% DEPC und 5 ml phenolgesättigtes 1 M Tris (pH-Wert 8) : Chloroform : Isoamylalkohol (50 : 50 : 1) zugegeben. Das Gemisch wurde zum Auftauen 20 Minuten bei 37ºC unter Schütteln gehalten. Sodann wurde das Gemisch 10 Minuten mit 12 000 g bei 4ºC zentrifugiert. Die wäßrige Phase wurde entfernt und zunächst mit phenolgesättigtem 1 M Tris (pH-Wert 8) : Chloroform : Isoamylalkohol (50 : 50 : 1), anschließend mit phenolgesättigtem 1 M Tris (pH-Wert 8) und ein drittes Mal mit Chloroform reextrahiert. Ein gleiches Volumen an 6 M LiCl wurde mit der letzten wäßrigen Phase vereinigt. Die Lösung wurde mindestens 4 Stunden bei -20ºC belassen. Die gesamte RNA wurde durch 20-minütiges Zentrifugieren mit 12 000 g bei 4ºC pelletisiert. Das Pellet wurde in 0,3 ml TE-Puffer plus 0,03 ml 3 M Natriumacetat gelöst. 2,5 Volumina Ethanol wurden zugegeben, um die RNA erneut auszufällen. Das endgültige Pellet wurde in 0,1 ml TE-Puffer gelöst.
  • Die RNA-Konzentration wurde spektrophotometrisch aufgrund der Absorption bei 260 nm bestimmt.
    • Beispiel 4 Konstruktion einer Cephalosporium acremonium-Genbank und Isolierung der C. acremonium-Expandase/Hydroxylase- und Acetyltransferase-Gene Isolierung des C. acremonium-Expandase/Hydroxylase-Gens
  • C. acremonium-Genom-DNA wurde partiell mit Sau3AI verdaut, um ein Fragment mit einer durchschnittlichen Größe von 10 bis 20 kb zu erhalten. Dieser Größenbereich wurde durch Zentrifugation des Verdauungsprodukts mit einem 5 bis 20%-NaCl-Dichtegradienten angereichert. Die größenfraktionierte DNA wurde zur Erstellung einer C. acremonium-Genom-DNA-Bank durch Ligation in die BamHI-Stelle des 1 2001-Vektors, Packen in Phagenteilchen unter Verwendung von Gigapak (Stratagene) und Infektion von E. coli verwendet. Die erhaltenen Plaques wurden auf Nitrocellulose übertragen und durch Hybridisierung mit einer Oligonucleotidsonde, die mit dem 3'-Ende der veröffentlichten Sequenz des Expandase/Hydroxylase-Gens (Samson et al., 1987) komplementär war, einem Screening unterworfen. Die Sonde wurde mit [γ-³²P] ATP unter Verwendung von T4-Polynucleotid-kinase endmarkiert. Positive Klone wurden isoliert und einer Kartierung in bezug auf Restriktionsendonuclease-Stellen unterworfen. Die Orientierung des Gens wurde durch Southern-Blot-Hybridisierung mit dem vorstehenden Oligonucleotid und einem weiteren Nucleotid mit einer zum 5'-Ende des Gens komplementären Sequenz festgestellt.
    • Isolierung des C. acremonium-Acetyltransferase-Gens
  • Obgleich es sich nicht um das Verfahren handelt, das zur Isolierung des Acetyltransferase-Gens für die anschließenden, in den Beispielen 11 und 12 beschriebenen Vektorkonstruktionen verwendet wurde, könnte das nachstehend angegebene Verfahren vom Fachmann unter Heranziehung der derzeit verfügbaren veröffentlichten DNA-Sequenzinformation angewandt werden. Aus einer C. acremonium-Genombank, die auf die vorstehende Weise konstruiert wurde, wird ein Klon, der für das Acetyltransferase-Gen kodiert, auf der Basis der Hybridisierung mit synthetischen Oligonucleotidsonden, die mit der Acetyltransferase-Sequenz gemäß den Angaben von Matsuda et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., Bd. 182 (1992), S. 995- 1001, komplementär sind, ausgewählt.
    • Beispiel 5 Streptomyces clavuligerus - Züchtungsbedingungen
  • Bei dem bei diesem Verfahren verwendeten Stamm von Streptomyces clavuligerus handelte es sich um ATCC 27064. Der Stamm wurde auf Platten der folgenden Zusammensetzung erhalten: Hefeextrakt 4 g; Malzextrakt 10 g; Glucose 4 g; Agar 20 g; in 1 Liter destilliertem Wasser, pH-Wert 7,2. Nach 5-tägigem Wachstum bei 30ºC wurden die Platten mit 2 ml sterilem Wasser versetzt. Das Kulturwachstum wurde von der Agaroberfläche geschabt. Die erhaltene Suspension wurde in sterile Röhrchen mit Schraubverschluß, die Glaskügelchen enthielten, übertragen. Nach Mazerieren des Kulturwachstums unter heftigem Rühren wurde die Suspension zur Inokulation von Flüssigkulturen verwendet. Die Suspension wurde auch für eine permanente Kulturaufbewahrung bei -70ºC verwendet, wobei Glycerin in einem Endvolumen von 15% zugesetzt wurde.
  • Sofern Myzel zur Erzeugung von Protoplasten für eine Transformation oder für eine DNA-Quelle benötigt wurde, wurden die Stämme in 200 ml/l Liter-Kolben YEME-Medium der folgenden Zusammensetzung gezüchtet: Hefeextrakt 3 g; Pepton 5 g; Malzextrakt 3 g; Glucose 10 g; Saccharose 340 g; MgCl&sub2;·6H&sub2;O 1,02 g; Glycin 5 g; Agar 18 g; in 1 Liter destilliertem Wasser. Die Inkubation wurde auf einem Drehschüttler bei 28ºC mit 220 U/min durchgeführt.
    • Beispiel 6 Isolierung von Streptomyces-Genom-DNA
  • Das vegetative Wachstum einer 48-stündigen Kultur, die auf die vorstehend beschriebene Weise hergestellt worden war, wurde durch 10-minütige Zentrifugation mit 22 100 g gewonnen. Die Zellen wurden in 10 ml TE- Puffer resuspendiert und mit 10 mg Lysozym versetzt. Das Gemisch wurde 15 Minuten bei 30ºC inkubiert. 1 ml 20% SDS wurde sodann zugegeben, wonach sofort 10 ml phenolgesättigtes TE (pH-Wert 8) und 1,5 ml 5 M NaCl zugesetzt wurden. Das Gemisch wurde 20 Minuten lang vorsichtig durch Stürzen geschüttelt. Die Phasen wurden nach 10-minütiger Zentrifugation mit 12 000 g getrennt. Die wäßrige Phase wurde entfernt und in ein frisches Röhrchen übertragen. Ein gleiches Volumen Chloroform wurde zugegeben. Das Gemisch wurde 10 Minuten durch vorsichtiges Stürzen geschüttelt. Die Phasen wurden erneut durch 10-minütige Zentrifugation mit 12 000 g getrennt. Die wäßrige Phase wurde entfernt und erneut in ein frisches Röhrchen übertragen. 2 Volumina Isopropanol wurden sorgfältig zugegeben. Die ausgefällte DNA wurde aufgespult und in einem minimalen Volumen an TE-Puffer erneut in Lösung gebracht. RNAse A wurde bis zu einer Endkonzentration von 20 ug/ml zugegeben. Die Lösung wurde 1 Stunde bei 50ºC inkubiert. Sodann wurde Protease K bis zu einer endgültigen Konzentration von 100 ug/ml zusammen mit 100 mM NaCl und 0,4% SDS zugegeben. Das Gemisch wurde 1 Stunde bei 37ºC inkubiert. Die Lösung wurde erneut mit einem gleichen Volumen an phenolgesättigtem TE (pH-Wert 8) extrahiert, wonach sich eine weitere Chloroformextraktion anschloß. Die DNA der endgültigen Extraktion wurde nach Zugabe von 2 Volumina Isopropanol aufgespult. Die Konzentration wurde spektrophotometrisch aufgrund der Absorption bei 260 nm bestimmt.
    • Beispiel 7 Konstruktion einer Genbank und Isolierung eines DNA-Fragments mit einem Gehalt an den Streptomyces clavuligerus-Expandase- und Expandase- Gene Isolierung des S. clavuligerus-Expandase-Gens
  • Gemäß dem vorstehend beschriebenen Verfahren erhaltene Streptomyces clavuligerus-Genom-DNA wurde mit den Restriktionsenzymen BamHI und SalI verdaut. Die verdaute DNA wurde der Elektrophorese an 0,8% Agarosegel unterworfen. Fragmente mit 1,8 bis 2,2 kb wurden eluiert und mit pUC18-DNA, die vorher mit BamHI und SalI verdaut worden war, verknüpft. Verdünnungen des Ligationsgemisches wurden zur Transformation von kompetenten JM109- Zellen durch Elektroporation (Gene Pulser, Bio-Rad, Richmond, CA) verwendet. Die Präparation der kompetenten Zellen und die Elektroporationsbedingungen wurden gemäß den Empfehlungen des Herstellers durchgeführt. Das Transformationsgemisch wurde auf LB-Platten mit einem Gehalt an 100 ug/ml Ampicillin und 75 ul 2% X-Gal ausgestrichen. Nach Inkubation über Nacht bei 37ºC wurden rekombinante Kolonien aufgrund ihres farblosen Erscheinungsbilds, das auf die Inaktivierung der Plasmidvektor-β-Galactosidase- Gen-Aktivität zurückzuführen war, identifiziert. Die farblosen Kolonien wurden auf eine frische LB-Platte mit einem Gehalt an 100 ug/ml Ampicillin übertragen. Nach Züchtung über Nacht bei 37ºC wurden die Kolonien auf Nitrocellulose übertragen und mit einer durch Polymerase-Kettenreaktion erzeugten Sonde hybridisiert, die der veröffentlichten Streptomyces clavuligerus-Expandase-Gen-Sequenz von den Basen 52-918 entsprach (Kovacevic et al., J. Bacteriol., Bd. 171 (1989), S. 754-760, und US- 5 070 020 (Ingolia et al.). Die Markierung des Polymerase-Kettenreaktionsprodukts wurde durch eine willkürliche Primer-Erweiterungsreaktion mit [³²P]dCTP und einem "Oligolabelling Kit" gemäß den Angaben des Herstellers (Pharmacia, Piscataway, New Jersey) durchgeführt. Die Hybridisierungsreaktion wurde in Gegenwart von 106 cpm der radioaktiv markierten Sonde, 30% Formamid, 5x SSC (0,15 M NaCl, 0,015 M Natriumcitrat, pH-Wert 7), 0,1% SDS 5x Denhardt (5 g Ficoll, 5 g Polyvinylpyrrolidon und 5 g BSA auf 500 ml 50x Vorratslösung) und 100 ug/ml Kalbsthymus-DNA über Nacht bei 37ºC durchgeführt. Mehrere Transformanten zeigten eine starke Hybridisierung mit der Sonde. Bei einer Kolonie wurde durch Restriktionsenzymanalyse bestätigt, daß sie einen das Expandase-Gen tragenden Vektor enthielt. Dieses Plasmid erhielt die Bezeichnung pFTSO-1.
    • Isolierung des S. clavuligerus-Hydroxylase-Gens
  • Die Streptomyces clavuligerus-Genom-DNA wurde partiell mit BamHI verdaut und in den lambda-II-Vektor von Stratagene ligiert. Die erhaltene Genombank wurde durch Hybridisierung mit einem Oligonucleotid mit 30 Basen, das eine identische Sequenz mit den ersten 30 Basen der veröffentlichten Sequenz des Hydroxylase-Gens (Kovacevic und Miller, J. Bact., Bd. 173 (1991), S. 398) aufwies, einem Screening unterworfen. Durch Southern- Hybridisierung mit durch BamHI-verdauter DNA aus zwei positiven Phagenklonen erhielt man das erwartete 6 kb-Fragment, das subkloniert wurde. Dieser Subklon ergab nach Verdau mit KpnI einen Satz von Fragmenten in Übereinstimmung mit der veröffentlichten Restriktionskarte der Region um das Hydroxylase-Gen (Kovacevic und Miller, 1991).
    • Beispiel 8 Isolierung von Plasmid-DNA
  • E. coli-Kulturen, die das Plasmid enthielten, wurden in 500 ml LB- Brühe (20 g/Liter LB Broth Base (Gibco, Paisley, Schottland)) mit 15 ug/ml Tetracyclin) auf einem Drehschüttler mit 220 U/min 12-16 Stunden bei 37ºC gezüchtet. Die Zellen wurden durch 10-minütige Zentrifugation mit 4000 g bei 4ºC pelletisiert. Das Zellpellet wurde in 18 ml Glucose- Puffer (50 mM Glucose, 25 mM Tris, pH-Wert 8,0, 10 mM EDTA) resuspendiert und mit 2 ml 40 mg/ml Lysozym (Sigma, St. Louis, MO) in Glucose-Puffer versetzt und vermischt. Das Gemisch wurde 15 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. 40 ml einer frisch hergestellten Lösung von 0,2 N NaOH mit 1% SDS wurden zugesetzt. Das Gemisch wurde vorsichtig gerührt und 10 Minuten auf Eis gestellt. 30 ml 5 M Kaliumacetat vom pW-Wert 4,8 wurden sodann zugesetzt und gründlich vermischt. Das erhaltene Gemisch wurde weitere 10 Minuten auf Eis gestellt. Die Zellbruchstücke wurden durch 10-minütige Zentrifugation mit 4000 g bei 4ºC pelletisiert. Der erhaltene Überstand wurde durch ein Käsetuch-Filter filtriert. Isopropanol (0,6 Volumina) wurde zum geklärten Überstand gegeben, um die Plasmid-DNA auszufällen. Der Niederschlag bildete sich während einer 20-minütigen Inkubation bei Raumtemperatur. Die Plasmid-DNA wurde 20 Minuten mit 4000 g bei 4ºC pelletisiert und sodann mit 70% Ethanol gewaschen und kurz getrocknet. Anschließend wurde das Pellet in 9 ml TE-Puffer resuspendiert und sodann mit 10 g CsCl und 0,387 ml einer 10 mg/ml-Lösung von Ethidiumbromid versetzt. Diese Lösung wurde 24 Stunden mit 313 100 · g zentrifugiert. Die gebildete Plasmidbande im Cäsiumchlorid-Gradienten wurde mit UV-Licht sichtbar gemacht und isoliert. Anschließend wurde das Ethidiumbromid unter Verwendung von mit Wasser gesättigtem Butanol für die Extraktion entfernt. Das CsCl im Plasmidpräparat wurde sodann durch Dialyse gegen TE- Puffer entfernt. Schließlich wurde die DNA unter Verwendung von PEG (MG 8000) eingeengt. Die Konzentration der DNA wurde spektrophotometrisch aufgrund der Absorption bei 260 nm bestimmt.
    • Beispiel 9 Konstruktion des Penicillium-Transformationsvektors pPenFTSO Einbau des Phelomycin-Resistenzgens
  • Ein Penicillium-Transformationsvektor wurde mit einem phleomycinresistenten Gen als dominantem selektierbarem Marker konstruiert. Dies wurde erreicht, indem man zunächst ein 660 bp-Fragment, das das Phleomycin-Resistenzgen (ein Phleomycin bindendes Protein-Gen aus Streptoalloteichus hindustanus) enthielt und ferner an einen Hefe-Cytochrom C1-Terminator gekuppelt war, aus einem BamHI/BglII-Verdauungsprodukt von Plasmid pUT713 (CAYLA, Toulouse Cedex, Frankreich) durch Elektrophorese an Agarosegelen und anschließende Elution daraus isolierte. Das isolierte Fragment wurde in die BamHI-Stelle des Vektors pSELECTR 1 (Promega Corporation) ligiert. Die Orientierung des Gens wurde durch Restriktionsenzym-Analyse bestimmt. Die einzige HindIII-Stelle im erhaltenen Plasmid wurde durch Restriktion mit HindIII, Auffüllen mit Klenow-Polymerase und Religation entfernt. Anschließend wurde ein 550 bp-PstI-Fragment, das die lambda-cos-Stelle enthielt, inseriert, was es ermöglicht, den Vektor für die Cosmid-Bildung zu verwenden, wenn Inserts von geeigneter Größe enthalten sind. Dieser Vektor erhielt die Bezeichnung pSCP4.
  • P. chrysogenum-Genom-DNA wurde partiell mit Sau3A verdaut und zur Herstellung einer Bank im Phagenvektor lambda EMBL3 verwendet. Ein Klon, der das Isopenicillin N-synthetase (IPNS)-Gen enthielt, wurde aus dieser Bank isoliert und zur Herstellung einer Reihe von Unterklonen verwendet. Ein Klon davon enthielt ein 3,6 kb-Fragment von der ersten BamHI-Stelle stromaufwärts vom IPNS-Gen bis zur ersten HindIII-Stelle stromabwärts vom Gen. Die einzige SalI-Stelle in diesem Subklon wurde durch Restriktion mit SalI, Auffüllen der Ausnehmungsenden mit Klenow-Polymerase und Religation entfernt. Anschließend wurde die einzige XbaI-Stelle auf ähnliche Weise durch Restriktion mit XbaI, Auffüllen und Religation entfernt. Das erhaltene Plasmid erhielt die Bezeichnung pSXF-1. Der gentechnisch hergestellte IPNS-Promotor wurde durch Gelchromatographie aus pSXF-1 in Form eines 1,2 kb-NcoI-Fragments isoliert und in die NcoI-Stelle des vorstehend beschriebenen pSCP4 ligiert. Die durch Restriktionsverdau bestimmte Orientierung wurde so gewählt, daß der Promotor mit dem Phleomycin- Resistenzgen am ATG-Startcodon fusioniert war. Dieses Plasmid erhielt die Bezeichnung pUTZ-2.
    • Einbau des S. clavuligerus-Expandase-Gens
  • Das 1,645 kb-Fragment, das das Streptomyces clavuligerus-Expandase- Gen enthielt, wurde aus einem BamHI- und SalI-Verdauungsprodukt des pFTSO-1 (vorbeschriebener Vektor) durch Elektrophorese an 0,8% Agarosegel und Elution daraus gereinigt. Das isolierte Fragment wurde in den Vektor pSELECT (Promega Corporation), der ebenfalls mit BamHI und SalI verdaut war, ligiert. Dieser Vektor erhielt die Bezeichnung pFTSO-8. Eine neue NcoI-Stelle wurde am ATG-Startcodon des Expandase-Gens durch positionsgerichtete Mutagenese von pFTSO-8 unter Verwendung des Altered SitesR-in vitro-Mutagenesis-System (Promega Corporation) geschaffen. Die Mutagenese wurde gemäß den Anweisungen des Herstellers durchgeführt. Ein Oligonucleotid wurde konstruiert, um die Kodierungssequenz der DNA-Region am ATG-Startcodon von der veröffentlichten Sequenz des Streptomyces-Expandase-Gens (Kovacevic et al., Journal of Bacteriology, Bd. 171 (1990), S. 3952-3958) zu vervollständigen. Das Oligonucleotid wurde durch Cyanoethylphosphoramidit-Chemie (Pharmacia Gene Assembler-Ausrüstung) synthetisiert. Es ergab sich folgende Oligonucleotidsequenz:
  • Die Mutagenese wurde durch Restriktionsenzym-Analyse bestätigt. Anschließend wurde das 1,2 kb-NcoI-Fragment aus pUT2-2, das die gentechnisch hergestellte Penicillium chrysogenum-PNS-Promotorregion enthielt, durch Restriktion mit NcoI und anschließende Elektrophorese an Agarosegel isoliert. Die IPNS-Promotorregion wurde in den pFTSO-8-Vektor an der durch die Mutagenese am ATG-Startcodon des Expandase-Gens geschaffenen neuen NcoI-Stelle ligiert. Die Orientierung des Promotors zum Expandase- Gen wurde durch Restriktionsenzym-Analyse bestimmt. Diese IPNS-Promotor: Expandase-Gen-Kassette wurde sodann als ein BamHI/SalI-Fragment entfernt und in den vorstehend beschriebenen, mit BamHI/SalI geschnittenen Penicillium-Transformationsvektor pUTZ-2 eingesetzt. Das fertige Konstrukt erhielt die Bezeichnung pPenFTSO.
    • Beispiel 10 Konstruktion des Penicillium-Transformationsvektors pPEN/CEPG-1 Einbau der IPNS-Promotorregion
  • Die IPNS-Promotorregion wurde aus dem im vorstehenden Beispiel 9 beschriebenen pUTZ-2 durch Verdau mit XhoI/SmaI isoliert. Der pUTZ-2-Vektor wurde mit BamHI geschnitten. Die vorstehenden Enden wurden unter Verwendung von dNTPs und Klenow-Fragment unter Schaffung von stumpfen Enden aufgefüllt und sodann mit XhoI verdaut. Das isolierte XhoI/SmaI-IPNS-Promotorfragment wurde in diesen geschnittenen Vektor ligiert, wodurch man ein Konstrukt erhielt, das die beiden IPNS-Promotorregionen enthielt. Dieser Vektor erhielt die Bezeichnung pUTZ-7.
    • Einbau des C. acremonium-Expandase/Hydroxylase-Gens
  • Eine der IPNS-Promotorregionen wurde sodann (durch Elektrophorese an Agarosegelen und Elution hieraus) aus pUTZ-7 als ein XhoI/XbaI-Fragment isoliert und in den XhoI/XbaI-geschnittenen Vektor pBluescript II SK (Stratagene, La Jolla, CA) ligiert. Dieser Vektor erhielt die Bezeichnung pIPNSp/blue.
  • Das Cephalosporium-Expandase/Hydroxylase-Gen wurde (durch Elektrophorese an Agarosegelen und Elution hieraus) als ein 1,6 kb-HindIII/XbaI- Fragment aus einem derartigen, vorstehend identifizierten Genomklon isoliert und in einen HindIII/XbaI-verdauten Vektor pSELECT ligiert. Eine neue BspHI-Stelle wurde am ATG-Startcodon des Expandase/Hydroxylase-Gens durch positionsgerichtete Mutagenese unter Verwendung des Altered SitesRin vitro-Mutagenesesystems (Promega Corporation) geschaffen. Die Mutagenese wurde gemäß den Angaben des Herstellers durchgeführt. Ein Oligonucleotid wurde konstruiert, um die Kodierungssequenz der DNA-Region am ATG-Startcodon von der veröffentlichten Sequenz des Cephalosporium acremonium-Expandase/Hydroxylase-Gens (Samson et al., Bio/Technology, Bd. 5, November 1987) zu vervollständigen. Das Oligonucleotid wurde durch Cyanoethylphosphoramidit-Chemie (Pharmacia Gene Assembler-Einrichtung) synthetisiert. Es handelte sich um die folgende Oligonucleotidsequenz:
  • Die Mutagenese wurde durch Restriktionsenzym-Analyse bestätigt. Das Cephalosporium acremonium-Expandase/Hydroxylase-Gen wurde sodann (durch Elektrophorese an Agarosegelen und Elution hieraus) als ein BspHI/XbaI- Fragment isoliert und in den im vorstehenden Beispiel beschriebenen, NcoI/XbaI-verdauten Vektor pIPNSp/blue ligiert. Dieser Vektor enthielt nunmehr den Penicillium-IPNS-Promotor am ATG des Cephalosporium acremonium-Expandase/Hydroxylase-Gens. Dieser Vektor erhielt die Bezeichnung pIPNSp/EXP/blue. Diese IPNS-Promotor : Expandase/Hydroxylase-Kassette wurde partiell mit XhoI verdaut und vollständig mit XbaI verdaut. Das isolierte Fragment (durch Elektrophorese an Agarosegelen und Elution hieraus) wurde in den im vorstehenden Beispiel beschriebenen, XhoI/XbaI-verdauten Vektor pUTZ-2 ligiert, wodurch man den endgültigen Transformationsvektor pPEN/CEPH-1 erhielt.
    • Beispiel 11 Konstruktion eines Penicillium-Transformationsvektors zur Expression sowohl des Expandase- als auch des Hydroxylase-Gens von S. clavuligerus
  • Das P. chrysogenum-β-Tubulin-Gen wurde aus einer lambda-Genombank unter Verwendung des Aspergillus niger-β-Tubulin-Gens als Hybridisierungssonde geklont. Ein 2,0 kb-XbaI/HindIII-Fragment, das den Penicillium-β-Tubulin-Promotor enthielt, wurde in die XbaI/HindIII-Stellen von pSELECT (Promega) ligiert. Eine NcoI-Stelle wurde am ATG-Startcodon durch positionsgerichtete Mutagenese der Sequenz AAAATGCGT zu ACCATGGGT eingeführt. Aus dem erhaltenen Vektor wurde ein 1,4 kb-BamHI/NcoI-Fragment durch Gelbehandlung isoliert und zwischen die BamHI- und NcoI-Stellen von pUTZ-2 (vorstehend beschrieben) ligiert, um den Vektor pCI-6 zu erzeugen. Aus einem P. chrysogenum-Genomklon wurde ein 5,1 kb-SalI-Fragment, das sowohl das IPNS- als auch das Acyltransferase-Gen enthielt, durch Gelbehandlung isoliert und in die SalI-Stelle von pUTZ-2 zur Erzeugung von pUTZ-5 ligiert. Die 3'-Terminatorsequenz des IPNS-Gens wurde aus pUTZ-5 durch Restriktion mit BamHI und Hindlil unter anschließender Gelbehandlung des 1,3 kb-Fragments, das dann zwischen die BamHI- und HindIII- Stelle von pCI-6 (vorstehend beschrieben) unter Bildung von pCI-13 ligiert wurde. Die einzige SalI-Stelle nahe der BamHI-Stelle in pCI-13 wurde durch Restriktion, Auffüllen mit Klenow-Polymerase und Religation entfernt. Eine neue SalI-Stelle wurde auf der anderen Seite der BamHI- Stelle durch positionsgerichtete Mutagenese der Sequenz GGAAGACG zu GGTCGACG eingeführt. Das Ampicillin-Resistenzgen wurde sodann aus dem Plasmid durch Restriktion mit PvuI, Gelisolation des größeren Fragments und Religation unter Bildung von pCI-15 entfernt. Schließlich wurde die IPNS-Promotor : Expandase-Gen-Kassette durch Gelbehandlung aus pPENFTSO als ein 2,4 kb-BamHI/SalI-Fragment durch Gelbehandlung isoliert und in pCI-15 unter Bildung von pEXP-1 ligiert.
  • Die Konstruktion eines Vektors zur Expression sowohl des Hydroxylase- als auch des Expandase-Gens von S. clavuligerus umfaßt die folgenden Stufen. Das 2,9 kb-KpnI-Fragment mit einem Gehalt an dem Hydroxylase-Gen wird in pSELECT subkloniert, so daß die EcoRI-Stelle im Polylinker sich neben dem 5'-Ende des Gens befindet. Die einzige NcoI-Stelle innerhalb des Plasmids wird durch positionsgerichtete Mutagenese der Sequenz TCCATGGGC zur Sequenz TCGATGGGC entfernt und gleichzeitig wird eine neue NcoI-Stelle am Startcodon durch Veränderung der Sequenz AACATGGC zu ACCATGGC eingeführt. Bei beiden Veränderungen bleibt die kodierte Aminosäuresequenz erhalten. Das 1,0 kb-EcoRI-NcoI-Fragment, das den gentechnisch bearbeiteten IPNS-Promotor enthält, wird durch Gelbehandlung aus pUTZ-2 isoliert und zwischen die EcoRI- und NcoI-Stelle des vorstehenden Vektors, der das veränderte Hydroxylase-Gen enthält, ligiert. Anschließend wird die einzige EcoRI-Stelle im erhaltenen Vektor durch positionsgerichtete Mutagenese in eine HindIII-Stelle abgeändert. Das 5'- IPNS : Hydroxylase-Fusionskonstrukt wird aus dem erhaltenen Vektor als ein HindIII-Fragment isoliert, das sodann in die einzige HindIII-Stelle des vorstehend beschriebenen Vektors pEXP-1 ligiert wird. Der endgültige Vektor enthält das Expandase- und das Hydroxylase-Gen, die jeweils vom IPNS- Promotor angetrieben werden, und den Phleomycin-Resistenzmarker, der durch den β-Tubulin-Promotor angetrieben wird.
    • Beispiel 12 Konstruktion des Penicillium-Transformationsvektors pPenCACT Einbau des Hygromycin-Resistenzgens
  • Ein Penicillium-Transformationsvektor wurde mit einem Hygromycin-resistenten Gen als dominanter selektierbarer Marker konstruiert. Ein E. coli-Hygromycin B-Phosphotransferase-Gen wurde (durch Elektrophorese an Agarosegelen und Elution hieraus) als ein 1,15 kb-BamHI-Fragment aus dem Vektor pHph-1 (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN) isoliert und in den BamHI-verdauten Vektor mp19 ligiert. Die Orientierung des Hygromycin-Resistenzgens in mp19 wurde durch Restriktionsenzymanalyse von RF-DNA bestimmt. Die 5'-BamHI-Stelle befindet sich nahe am ATG-Startcodon des Hygromycin-Resistenzgens. Um die Positionierung eines alternativen Promotors an dieser 5'-BamHI-Stelle zu erleichtern, wurde die 3'-BamHI-Stelle durch positionsgerichtete Mutagenese unter Verwendung des MutatorR Site Directed Mutagenesis Kit (Stratagene, La Jolla, CA) entfernt. Die Mutagenese wurde gemäß der Anleitung des Herstellers durchgeführt. Ein Oligonucleotid wurde zur Vervollständigung der DNA-Region an der 3'-BamHI- Stelle von der veröffentlichten Sequenz des E. coli-Hygromycin B-Phosphotransferase-Gens konstruiert (L. Gritz und J. Davies, Gene, Bd. 25 (1983), S. 179). Das Oligonucleotid wurde durch Cyanoethylphosphoramidit- Chemie (Pharmacia Gene Assembler-Einrichtung) synthetisiert. Es ergab sich folgende Oligonucleotidsequenz:
  • Die Mutagenese wurde durch Restriktionsenzymsanalyse bestätigt. Das mutagenisierte Hygromycin-Resistenzgen wurde sodann als ein SmaI/XbaI- Fragment (durch Elektrophorese an Agarosegelen und Elution hieraus) isoliert und in den SmaI/XbaI-verdauten Vektor pUC18 ligiert.
  • Der Penicillium-IPNS-Promotor wurde (durch Elektrophorese an Agarosegelen und Elution hieraus) als ein 1,2 kb-NcoI-Fragment von dem NcoIgeschnittenen Vektor pUTZ-2 (vorstehend beschriebener Vektor) isoliert. Synthetische Oligonucleotid-Linker wurden hergestellt, um eine BamHI- Stelle von den NcoI-Stellen an den Enden des IPNS-Promotorfragments zu erzeugen, um den IPNS-Promotor an die 5'-BamHI-Stelle nahe dem ATG des Hygromycin-Resistenzgens zu positionieren. Die Oligonucleotide wurden durch Cyanoethylphosphoramidit-Chemie (Pharmacia Gene Assembler-Einrichtung) synthetisiert. Es ergaben sich folgende Oligonucleotidsequenzen:
  • In dieser Sequenz ist die native Sequenz des IPNS-Promotors enthalten, wobei aber Inserts von zwei Aminosäuren im Hygromycin-Resistenzgen vorhanden sind. Die Oligonucleotide wurden anelliert, phosphoryliert und in das NcoI-geschnittene IPNS-Promotorfragment ligiert, was zu BamHI- Stellen sowohl am 5'- als auch am 3'-Ende des IPNS-Promotorfragments führte. Dieser mit Linkem versehene Promotor wurde in das BamHI-geschnittene Hygromycin-Resistenzgen in pUC18 ligiert. Die Orientierung wurde durch Restriktionsenzymanalyse bestätigt. Diese IPNS-Promotor : Hygromycin-Resistenzgen-Kassette wurde sodann (durch Elektrophorese an Agarosegelen und Elution hieraus) als ein 2,1 kb-Xhol/SalI-Fragment isoliert (die XhoI-Stelle befindet sich am 5'-Ende des IPNS-Promotors, und die SalI-Stelle stammt aus dem pUC-Polylinker) und in den SalI- verdauten Vektor pSELECT ligiert. Die Orientierung der Kassette wurde durch Restriktionsenzymanalyse bestimmt. Dieser Vektor erhielt die Bezeichnung pIPNS/HYG.
    • Einbau des Cephalosporiunz acremonium-Acetyltransferase-Gens
  • Das Cephalosporium-Acetyltransferase-Gen wurde aus einem Genomklon (vorstehend beschrieben) als ein 1,8 kb-BglII/SalI-Fragment durch Elektrophorese an Agarosegelen und Elution hieraus isoliert. Das Acetyltransferase-Gen wurde in den BamHI/SalI-verdauten Vektor pSELECT ligiert. Um die Positionierung des Penicillium-IPNS-Promotors am ATG des Cephalosporium-Acetyltransferase-Gens zu erleichtern, wurde eine neuartige NcoI- Stelle am ATG des Acetyltransferase-Gens geschaffen. Eine interne NcoI- Stelle im Strukturgen wurde durch positionsgerichtete Mutagenese unter Verwendung des Altered SitesR-in vitro-Mutagenesesystems (Promega Corporation) entfernt. Die Mutagenese wurde gemäß der Anleitung des Herstellers durchgeführt. Die Oligonucleotide wurden konstruiert, um die Kodierungssequenz der in Frage stehenden DNA-Regionen aus der Sequenz des Cephalosporium-Acetyltransferase-Gens gemäß der Darstellung in den vorstehenden SEQ ID NR : 1 und 2 zu vervollständigen. Zur Entfernung der internen NcoI-Stelle im Strukturgen wurde das Oligonucleotid mit folgender Sequenz verwendet:
  • Zur Schaffung der neuen NcoI-Stelle am ATG-Startcodon wurde folgende Nucleotidsequenz verwendet:
  • Diese Oligonucleotide wurden durch Cyanoethylphosphoramidit-Chemie (Pharmacia Gene Assembler-Einrichtung) synthetisiert. Die Mutagenese wurde durch Restriktionsenzymanalyse bestätigt. Dieser Vektor erhielt die Bezeichnung pMUTACT.
  • Der Penicillium-IPNS-Promotor wurde (durch Elektrophorese an Agarosegelen und Elution hieraus) als ein 1,2 kb-NcoI-Fragment aus dem in einem vorstehenden Beispiel beschriebenen Vektor pUTZ-2 isoliert. Dieses Promotorfragment wurde in den NcoI-geschnittenen Vektor pMUTACT, bei dem nunmehr der IPNS-Promotor direkt am ATG des Cephalosporium acremonium- Acetyltransferase-Gens positioniert ist, ligiert. Die Orientierung des Promotors wurde durch Restriktionsenzymanalyse bestätigt. Diese IPNS-Promotor : Acetyltransferase-Gen-Kassette wurde mit XhoI/SalI (die XhoI-Stelle befindet sich am 5'-Ende des IPNS-Promotors und die SalI-Stelle befindet sich am 3'-Ende des Acetyltransferase-Gens) verdaut und in den mit SalIverdauten Vektor pSELECT ligiert. Die Orientierung des Fragments wurde durch Restriktionsenzymanalyse bestimmt. Dieser Vektor erhielt die Bezeichnung pMUTACT/IPNS.
  • Die Mutagenese, die zur Schaffung der neuen NcoI-Stelle am ATG des Acetyltransferase-Gens verwendet wurde, führte zu einer Veränderung der zweiten Aminosäure von Serin zu Alanin. Um die Kodierungssequenz identisch mit dem nativen Gen zu erhalten, wurde eine positionsgerichtete Mutagenese unter Verwendung des Altered SitesR-in vitro-Mutagenesesystems durchgeführt. Das Oligonucleotid wurde zur Vervollständigung der Kodierungssequenz der in Frage stehenden DNA-Region aus der Sequenz des Acetyltransferase-Gens, wie es vorstehend als SEQ ID NR : 1 und 2 dargestellt ist, konstruiert. Zur Veränderung der zweiten Aminosäure von Alanin zu Serin wurde folgende Oligonucleotidsequenz verwendet:
  • Das Oligonucleotid wurde unter Anwendung der Cyanoethylphosphoramidit-Chemie (Pharmacia Gene Assembler-Einrichtung) synthetisiert. Die Mutagenese wurde durch DNA-Sequenzierung unter Verwendung des USP-Sequenase Version 2.0-DNA-Sequenzierungskits (USB, Cleveland, Ohio) bestätigt. Die Sequenzierungsprimer wurden unter Anwendung der Cyanoethylphosphoramidit- Chemie (Pharmacia Gene Assembler-Einrichtung) synthetisiert. Dieser Vektor erhielt die Bezeichnung pMUTACT/IPNS-2.
  • Die IPNS-Promotor : Hygromycin-Resistenzgen-Kassette wurde aus dem Vektor pIPNS/HYG als ein XbaI-Fragment entfernt und in den XbaI-verdauten Vektor pMUTACT/IPNS-2 ligiert, wodurch man den endgültigen Transformationsvektor pPenCACT erhielt. Die Orientierung der Hygromycin-Kassette wurde durch Restriktionsenzymanalyse bestimmt.
    • Beispiel 13 Konstruktion eines Penicillium-Transformationsvektors pTS-8 zur Expression sowohl des Expandase/Hydroxylase- als auch des Acetyltransferase-Gens von Cephalosporium acremonium
  • Das Cephalosporium-Acetyltransferase-Gen wurde (durch Elektrophorese an Agarosegelen und Elution hieraus) als ein 1,8 kb-BglII/SalI-Fragment aus einem Genomklon isoliert und in einen BamHI/SalI-verdauten Vektor pSELECT (Promega Corporation) ligiert. Um die Positionierung des Penicillium-IPNS-Promotors an einem ATG des Cephalosporium-Acetyltransferase- Gens zu erleichtern, wurde eine neue NcoI-Stelle am ATG-Codon an der Base -42 (Mathison et al., Current Genetics, vorgelegt) geschaffen, und eine interne NcoI-Stelle im Strukturgen wurde durch positionsgerichtete Mutagenese unter Verwendung des Altered SitesR-in vitro-Mutagenesesystems (Promega Corporation) entfernt. Die Mutagenese wurde gemäß der Anleitung des Herstellers durchgeführt. Die Oligonucleotide wurden zur Vervollständigung der Kodierungssequenz der in Frage stehenden DNA-Regionen konstruiert, wobei aber mehrere Veränderungen eingebaut wurden, um eine NcoI- Stelle zu schaffen oder zu entfernen. Zur Entfernung der internen NcoI- Stelle im Strukturgen wurde folgende Oligonucleotidsequenz verwendet:
  • Zur Schaffung der neuen NcoI-Stelle am ATG an der Base -42 wurde folgende Oligonucleotidsequenz verwendet:
  • Die Oligonucleotide wurden durch Cyanoethylphosphoramidit-Chemie (Pharmacia Gene Assembler-Einrichtung) synthetisiert. Beide Mutageneseereignisse wurden durch Restriktionsenzymanalyse bestätigt. Dieser Vektor erhielt die Bezeichnung pMUTACT. Der Penicillium-IPNS-Promotor wurde (durch Gelelektrophorese an Agarosegelen und Elution hieraus) als ein 1,2 kb-NcoI-Fragment aus dem vorstehend beschriebenen Vektor pUTZ-2 isoliert. Dieses Promotorfragment wurde in den NcoI-geschnittenen Vektor pMUTACT, der nunmehr am IPNS-Promotor direkt am ATG -42 des Cephalosporium-Acetyltransferase-Gens positioniert war, ligiert. Die Orientierung des Promotors wurde durch Restriktionsenzymanalyse bestätigt. Dieser Vektor erhielt die Bezeichnung pMUTACT/IPNS. Ein 2,5 kb-XhoI/SalI-Fragment wurde (durch Elektrophorese an Agarosegelen und Elution hieraus) aus dem Vektor pMUTACT/IPNS, der die IPNS-Promotor : Acetyltransferase-Kassette enthielt, isoliert und in einen SalI-verdauten Vektor pUTZ-2 (vorstehend beschrieben) ligiert. Dieser Zwischenproduktvektor wurde sodann mit XbaI verdaut und in ein 2,1 kb-XbaI-Fragment aus dem Vektor pPEN/CEPH-1 (vorstehend beschrieben), der die IPNS-Promotor : Expandase/Hydroxylase-Kassette enthielt, ligiert, wodurch man den endgültigen Transformationsvektor pTS- 8 erhielt.
    • Beispiel 14 Transformation von Penicillium chrysogenum
  • Protoplasten des vorstehend beschriebenen Penicillium chrysogenum- Stamms wurden durch 67-stündiges Inokulieren von 50 ml cm-Brühe mit 1 · 107 Sporen bei 25ºC auf einem Drehschüttler mit 220 U/min erzeugt. Das Myzel wurde durch Filtration an Käsetuch-Filtern gewonnen, auf 500 ml fassende Kolben übertragen und in 25 ml KMP (0,7 M KCl, 0,8 M Mannit, 0,02 M KPO&sub4;, pH-Wert 6,3) mit einem Gehalt an 100 mg Novozyme 234 (Novo BioLabs, Bagsvaeerd, Dänemark) resuspendiert und bei 30ºC und 100 U/min inkubiert. Die Sphäroplasten wurden durch Filtration durch ein Käsetuch/Glaswolle-Filter abgetrennt und durch 10-minütige Zentrifugation mit 350 g pelletisiert. Die Sphäroplasten wurden sodann 3 mal mit 10 ml KMP- Puffer gewaschen und anschließend in KMPC (KMP mit 50 mM CaCl&sub2;) in einer Konzentration von 5 · 10&sup7; Zellen/ml resuspendiert und 20 Minuten bei Raumtemperatur belassen. Zur Transformation von Penicillium wurden 200 ul der Sphäroplasten-Suspension mit DNA (5 ug Vektor-DNA in 6,2 ul KMPC mit 5 mg/ml Heparin) zusammen mit 50 ul PPC (40% PEG, MG 3500, 20 mM KPO&sub4;, pH-Wert 6,3; unmittelbar vor der Verwendung wurden 5% CaCl&sub2; zugesetzt) versetzt. Das Transformationsgemisch wurde 30 Minuten auf Eis inkubiert. 1 ml frisch hergestelltes PPC wurde zugegeben. Das Gemisch wurde auf 50 ml geschmolzenen (50ºC) Regenerationsagar (cm plus 1,3 M Mannit und 3% Agar) übertragen. Sodann wurde das Transformationsgemisch auf 5 Petri- Schalen verteilt. Nach 24-stündiger Regeneration bei 25ºC wurden die Platten mit Öl (1% Pepton in 1% Agar) mit einem Gehalt an 100 ug/50 ml Öl Phleomycin überschichtet. Die Überschichtungsmenge entsprach der Menge des Regenerationsagars. Die Platten wurden sodann 7-14 Tage bei 25ºC inkubiert und in bezug auf die Bildung von Transformantenkolonien beobachtet.
    • Beispiel 15 Bioaktivitätstests
  • Ein biologischer Agar-Diffusionstest wurde herangezogen, um die antibiotische Aktivität der durch HPLC isolierten Adipoyl-6-APA- und Adipoyl-7-ADCA-Fermentationsprodukte zu bestimmen. 20 ul des isolierten Produkts wurden auf 5 mm-Scheiben auf einer LB-Agarplatte aufgetragen (20 g/Liter LB-Broth Base mit 3% Agar (Gibco, Paisley, Schottland), angeimpft mit Bacillus subtilis ATCC 33677 oder E. coli Super Sensitive- Stamm (zur Verfügung gestellt von Prof. Arnold L. Demain, MIT)). Bacillus subtilis wurde als Ihdikator-Stamm zum Test auf das Adipoyl-6-APA-Produkt und E. coli Super Sensitive-Stamm als Indikator-Stamm zum Test auf das Adipoyl-7-ADCA-Produkt verwendet. Nach 15-stündiger Inkubation bei 37ºC zeigte ein Hofvon gehemmtem Wachstum der Indikatorbakterien um die Scheibe, daß die Produkte eine biologische Aktivität entfalteten. Die Kontrollen in diesem Experiment umfaßten Desacetoxycephalosporin C, Cephalosporin C, Penicillin V und Agar mit einem Gehalt an Penicillinase oder ohne Penicillinase als Kontrolle zur Bestätigung von β-Lactamstrukturen.
    • Beispiel 16 HPhC-Verfahren zur gleichzeitigen Analyse von Adipoyl-: 6-APA, 7- ADCA, 7-ADAC und 7-ACA
  • Fermentationsprodukte aus transformierten Penicillium-Stämmen (Adipoyl-6-APA, Adipoyl-7-ADCA, Adipoyl-7-ADAC und Adipoyl-7-ACA) wurden gleichzeitig durch Hochleistungs-Flüssigchromatographie (HPLC) analysiert. Das HPLC-System bestand aus den folgenden Waters-Komponenten: Lösungsmittelabgabesystem 625, variabler Wellenlängendetektor 409E (eingestellt auf 220 nm und 260 nm) und Maxima-Datensystem 825. Bei der stationären Phase handelte es sich um eine Nova-Pak C&sub1;&sub8; 5 · 100 mm radiale Kompressionskartusche mit einem Nova-Pak C&sub1;&sub8; Guard-Pak-Insert. Die mobile Phase (mit 1 mm/min Fließgeschwindigkeit) bestand aus einem 10-minütigen linearen Gradienten, ausgehend von den Anfangsbedingungen mit 5% Methanol und 95% 10 mM KPO&sub4;, pH-Wert 5, bis 40% Methanol und 60% KPO&sub4;, pH-Wert 5. Die Adipoyl-6-APA wurde quantitativ durch Vergleich mit einer Eichkurve von Penicillin N bei 220 nm bestimmt. Die erweiterten Produkte wurden quantitativ durch Vergleich mit Eichkurven von synthetischem Adipoyl-7- ADCA und Adipoyl-7-ACA bei 260 nm verglichen.
    • Beispiel 17 RAEV-Enzymtests
  • Chemisch synthetisiertes Adipoyl-7-ADCA und Adipoyl-7-ACA wurden als Substrate zur Bestimmung der spezifischen Aktivität des RAEV-Enzyms verwendet (vertrieben von der RAEV-Corp.). Das Reaktionsgemisch enthielt 10 mM Substrat, 1 ug RAEV-Enzym und 5% Glycerin in 0,16 M KH&sub2;PO&sub4; bei einem Gesamtvolumen von 50 ul und wurde bei 37ºC inkubiert. (Optimalere Reaktionsbedingungen umfassen die Verwendung von 20 mM oder mehr Substrat in 20-50 mM Kaliumphosphatpuffer.) 5 ul-Aliquotanteile wurden zu den Zeitpunkten 0, 1, 3, 5, 10, 20 und 30 Minuten entnommen, mit 35 ul 0,010 M KH&sub2;PO&sub4;, pH-Wert 3,5, verdünnt und auf -70ºC eingefroren, bevor die Analyse unter den vorstehend angegebenen Bedingungen durch HPLC durchgeführt wurde.
  • Die Aktivität des RAEV-Enzyms gegen ein kolorimetrisches Adipoyl-p- aminobenzoesäure-Substrat wurde unter Verwendung von 5 mM Substrat, 8,25 ug RAEV-Enzym, 10% Glycerin, in 0,065 M KH&sub2;PO&sub4;, pH-Wert 7,0, in einem Gesamtvolumen von 50 ul 30 Minuten bei 37ºC getestet. Die Reaktion wurde auf einer Mikrotiterplatte mit 96 Vertiefungen durchgeführt. 50 ul einer 1/100-Verdünnung von 1 M NaNO&sub2; in 0,25 M Essigsäure wurden zur Beendigung der Reaktion zugesetzt. Das Reaktionsgemisch wurde 3 Minuten bei Raumtemperatur belassen. 100 ul einer 1/100-Verdünnung von 10 mg/ml 4-Amino-5-hydroxy-2,7-naphthalin-disulfonsäure-mononatriumsalz-hydrat in H&sub2;O in 0,5 M NaCO&sub3; wurde zugesetzt. Die Farbentwicklung wurde sofort bei 515 nm unter Verwendung eines EL 312-Bio-kinetics Plate Reader (BioTek Instruments) überwacht.
    • Beispiel 18 Beurteilung von alternativen Adipoyl-acylase-Enzymen
  • Zusätzlich zu den Untersuchungen unter Verwendung des RAEV-Enzyms wurde die Entfernung der Adipoyl-Seitenkette aus Adipoyl-7-ADCA (und anderen Adipoyl-Verbindungen) mit Enzymen aus einer Vielzahl von mikrobiellen Quellen nachgewiesen. In einer anfänglichen Untersuchung wurden die Asahi-Pseudomonas sp.-Stämme SE-83 und SE-495 (hinterlegt beim Fermentation Research Institute unter den Hinterlegungsnummern FERM BP-817 und FERM BP-818) und der Pseudomonas-Stamm SY-77-1 (hinterlegt beim Northern Regional Research Laboratory unter der Hinterlegungsnummer NRRL B-8070) 72 Stunden in einem Medium mit folgender Zusammensetzung gezüchtet: HyCase SF 2,0% (Gew./Vol.); Mononatriumglutamat 0,5% (Gew./Vol.); Hefeextrakt 0,5% (Gew./Vol.); Maisquellflüssigkeit-Pulver 0,2% (Gew./Vol.); Baumwollsamenöl 0,5% (Gew./Vol.) und Glutarsäure 0,1% (Gew./Vol.). Zellen wurden durch Zentrifugation geerntet und mit 50 mM Phosphatpuffer vom pH- Wert 8,0 gewaschen. Sodann wurden die Zellen in Puffer resuspendiert. Ihre äußeren Membranen wurden durch Zugabe eines geringen Volumens an Chloroform durchlässig gemacht. Aliquotanteile der Zellsuspension wurden sodann mit Adipoyl-p-nitroanilid (ad-PNA) vermischt und für Zeitspannen von 2 bis 18 Stunden bei 30ºC inkubiert. Im Anschluß an die Inkubation wurden die Gemische durch Zugabe von 10% (Vol./Vol.) Essigsäure angesäuert. Freigesetztes p-Nitroanilin wurde sodann auf kolorimetrischem Wege nach Umwandlung in eine Diazoverbindung unter Verwendung der von der Fa. Sigma Chemical Company in Form einer Testpackung für die Bestimmung von gamma-Glutamyl-transferase bereitgestellten Reagenzien (Sigma-Produkt Nr. 545-A) nachgewiesen. Die relativen Aktivitäten der drei Stämme betrugen 100%, 85,5% und 48% für SE-495, SE-83 bzw. SY-77-1. Unter Anwendung ähnlicher Verfahren, wie sie vorstehend für das RAEV-Enzym beschrieben wurden, wurde auch die Aktivität der SE-83- und SE-495-Enzyme gegenüber Adipoyl-7-ADCA nachgewiesen. Die Bildung von β-Lactamase durch SY-77-1 verhinderte den Nachweis der Desacylierungsaktivität dieses Stamms gegenüber Adipoyl-7-ADCA.
  • Durch ähnliche Maßnahmen wurde auch die Adipoyl-acylase-Bildung durch zwei Pilzstämme (Alternaria sp. MA-133, ATCC Nr. 20492 und Aspergillus sp. MA-13, ATCC Nr. 20491; US-4 141 790 (Meiji Seika Kaisha Ltd.)) und drei weitere Bakterienstämme (ein Brevibacterium, ATCC Nr. 14 649; und Achromobacterium, ATCC Nr. 14 648 und ein Flavobacterium, ATCC Nr. 14 650), die im US-Patent 3 239 394 (Merck & Co., Inc.) als Cephalosporin C-acylase-Bildner beschrieben sind, nachgewiesen.
    • SEQUENZPROTOKOLL (1) ALLGEMEINE ANGABEN:
  • (i) ANMELDER:
  • Conder, Michael J.
  • McAda, Phyllis
  • Rambosek, John
  • Reeves, Christopher D.
  • (ii) BEZEICHNUNG DER ERFINDUNG: Neuartiges biologisches Verfahren zur Herstellung von 7-ACA und 7-ADAC
  • (iii) ANZAHL DER SEQUENZEN: 17
  • (iv) KORRESPONDENZANSCHRIFT:
  • (A) ADRESSAT: Merck & Co., Inc.
  • (B) STRASSE: 126 E. Lincoln Ave
  • (C) ORT: Rahway
  • (D) STAAT: New Jersey
  • (E) LAND: USA
  • (F) POSTLEITZAHL: 07065
  • (v) COMPUTERLESBARE FASSUNG:
  • (A) DATENTRÄGER: Floppy Disk
  • (B) COMPUTER: IBM PC kompatibel
  • (C) BETRIEBSSYSTEM: PC-DOS/MS-DOS
  • (D) SOFTWARE: Patentln Release #1.0, Version #1.25
  • (vi) DATEN DER VORLIEGENDEN ANMELDUNG:
  • (A) ANMELDENUMMER:
  • (B) ANMELDETAG:
  • (C) KLASSIFIKATION
  • (viii) ANGABEN ÜBER DEN ANWALT/VERTRETER:
  • (A) NAME: Speer, Raymond M.
  • (B) REGISTRIERNUMMER: 26 810
  • (C) AKTENZEICHEN: 18572IA
  • (ix) TELEKOMMUNIKATIONSANGABEN:
  • (A) TELEFON: (908) 594-4481
  • (B) TELEFAX: (908) 594-4720
    • (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 1:
  • (i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
  • (A) LÄNGE: 14 Basenpaare
  • (B) ART: Nucleinsäure
  • (C) STRANGFORM: Doppelstrang
  • (D) TOPOLOGIE: linear
  • (ii) MOLEKÜLTYP: DNA (genomisch) (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 1:
    • (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 2
  • (i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
  • (A) LÄNGE: 16 Basenpaare
  • (B) ART: Nucleinsäure
  • (C) STRANGFORM: Doppelstrang
  • (D) TOPOLOGIE: linear
  • (ii) MOLEKÜLTYP: DNA (genomisch) (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 2:
    • (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 3:
  • (i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
  • (A) LÄNGE: 16 Basenpaare
  • (B) ART: Nucleinsäure
  • (C) STRANGFORM: Doppelstrang
  • (D) TOPOLOGIE: linear
  • (ii) MOLEKÜLTYP: DNA (genomisch) (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID Nr.: 3:
    • 2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 4:
  • (i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
  • (A) LÄNGE: 16 Basenpaare
  • (B) ART: Nucleinsäure
  • (C) STRANGFORM: Doppelstrang
  • (D) TOPOLOGIE: linear
  • (ii) MOLEKÜLTYP: DNA (genomisch) (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 4:
    • 2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 5:
  • (i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
  • (A) LÄNGE: 22 Aminosäuren
  • (B) ART: Aminosäure
  • (C) STRANGFORM: Einzelstrang
  • (D) TOPOLOGIE: linear
  • (ii) MOLEKÜLTYP: Peptid (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 5:
    • 2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 6:
  • (i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
  • (A) LÄNGE: 22 Aminosäuren
  • (B) ART: Aminosäure
  • (C) STRANGFORM: Einzelstrang
  • (D) TOPOLOGIE: linear
  • (ii) MOLEKÜLTYP: Peptid (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 6:
    • 2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 7
  • (i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
  • (A) LÄNGE: 22 Aminosäuren
  • (B) ART: Aminosäure
  • (C) STRANGFORM: Einzelstrang
  • (D) TOPOLOGIE: linear
  • (ii) MOLEKÜLTYP: Peptid (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 7:
    • 2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 8:
  • (i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
  • (A) LÄNGE: 34 Basenpaare
  • (B) ART: Nucleinsäure
  • (C) STRANGFORM: Einzelstrang
  • (D) TOPOLOGIE: linear
  • (ii) MOLEKÜLTYP: DNA (genomisch) (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 8:
    • 2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 9:
  • (i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
  • (A) LÄNGE: 33 Basenpaare
  • (B) ART: Nucleinsäure
  • (C) STRANGFORM: Einzelstrang
  • (D) TOPOLOGIE: linear
  • (ii) MOLEKÜLTYP: DNA (genomisch) (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 9:
    • 2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 10:
  • (i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
  • (A) LÄNGE: 21 Basenpaare
  • (B) ART: Nucleinsäure
  • (C) STRANGFORM: Einzelstrang
  • (D) TOPOLOGIE: linear
  • (ii) MOLEKÜLTYP: DNA (genomisch) (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 10
    • 2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 11.
  • (i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
  • (A) LÄNGE: 10 Basenpaare
  • (B) ART: Nucleinsäure
  • (C) STRANGFORM: Einzelstrang
  • (D) TOPOLOGIE: linear
  • (ii) MOLEKÜLTYP: DNA (genomisch) (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 11:
    • 2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 12:
  • (i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
  • (A) LÄNGE: 10 Basenpaare
  • (B) ART: Nucleinsäure
  • (C) STRANGFORM: Einzelstrang
  • (D) TOPOLOGIE: linear
  • (ii) MOLEKÜLTYP: DNA (genomisch) (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 12:
    • 2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 13:
  • (i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
  • (A) LÄNGE: 23 Basenpaare
  • (B) ART: Nucleinsäure
  • (C) STRANGFORM: Einzelstrang
  • (D) TOPOLOGIE: linear
  • (ii) MOLEKÜLTYP: DNA (genomisch) (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 13:
    • 2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 14
  • (i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
  • (A) LÄNGE: 22 Basenpaare
  • (B) ART: Nucleinsäure
  • (C) STRANGFORM: Einzelstrang
  • (D) TOPOLOGIE: linear
  • (ii) MOLEKOLTYP: DNA (genomisch) (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 14
    • 2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 15
  • (i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
  • (A) LÄNGE: 28 Basenpaare
  • (B) ART: Nucleinsäure
  • (C) STRANGFORM: Einzelstrang
  • (D) TOPOLOGIE: linear
  • (ii) MOLEKÜLTYP: DNA (genomisch) (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 15
    • 2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 16
  • (i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
  • (A) LÄNGE: 23 Basenpaare
  • (B) ART: Nucleinsäure
  • (C) STRANGFORM: Einzelstrang
  • (D) TOPOLOGIE: linear
  • (ii) MOLEKÜLTYP: cDNA zu mRNA (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 16
    • 2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 17
  • (i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
  • (A) LÄNGE: 35 Basenpaare
  • (B) ART: Nucleinsäure
  • (C) STRANGFORM: Einzelstrang
  • (D) TOPOLOGIE: linear
  • (ii) MOLEKÜLTYP: cDNA zu mRNA (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 17

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1. Adipoyl-7-aminodeacetylcephalosporansäure
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