ES2290965T3 - Biocatalizadores con actividad de amina acilasa. - Google Patents
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Abstract
ESTA INVENCION PERTENECE AL CAMPO DE LA BIOTECNOLOGIA. SE REFIERE A UN BIOCATALIZADOR, ES DECIR UN POLIPEPTIDO O UN MICROORGANISMO MUERTO O VIVO, PREFERENTEMENTE, EN FORMA AISLADA, QUE MUESTRA UNA ACTIVIDAD ENZIMATICA DE ACILASA SIN LIPASA O UNA ACTIVIDAD DE ESTERASA. ESTE BIOCATALIZADOR ES CAPAZ DE HIDROLIZAR DE UN MODO ESTEREOSELECTIVO UN ACILAMIDO RACEMICO QUE TIENE UN RESIDUO ACILICO ALIFATICO Y QUE NO ES UN DERIVADO DE UN AMINOACIDO NATURAL.
Description
Biocatalizadores con actividad de amina
acilasa.
Existe una necesidad grande y continua de
disponer de fármacos farmacéuticos y agroquímicos enantioméricamente
puros que eviten los efectos secundarios activados por el
enantiómero terapéuticamente ineficaz. La presente invención ayuda
a satisfacer esta necesidad al proporcionar nuevas enzimas capaces
de hidrolizar de forma estereoselectiva una acilamida racémica.
Hasta ahora las reacciones enzimáticas sobre
aminas o derivados de aminas han sido ofrecidas en la bibliografía
al respecto únicamente para penicilinas, cefalosporinas,
glucosaminas, aminoácidos y sus derivados. Entre los ejemplos
conocidos en este campo figura la resolución de
2-aminobutanol racémico por vía de la hidrólisis de
N-acil-derivados adecuados por
acilasas de origen microbiano (Kokai japonesa JP
58-198.296 y JP 59-39.294) y el
enriquecimiento enantiomérico de diferentes aminas que poseen el
grupo amino en un átomo de carbono secundario a través de un
proceso que implica la acción de transaminasas de
omega-aminoácidos (Stirling et al., Patente
US No. 5.300.437). En JP 06-253.875 se describe la
transferencia estereoespecífica del grupo amino de
L-alanina a acetofenona en presencia de, por
ejemplo, Acinetobacter sp. MBA-15 (FERM
P-13432) para la producción de
S-1-feniletilamina. La Patente US
5.360.724 describe la producción de
1-aril-2-aminopropano
ópticamente activo por transferencia enantioselectiva del grupo
amino del racemato por medio de transaminasa de aminoácido
procedente de Bacillus megaterium. En DE 4332738 se describe
la producción de aminas primarias y secundarias ópticamente
activas; el procedimiento utiliza acilación enantioselectiva de una
amina racémica con un éster activo como donante de acilo en
presencia de una hidrolasa. La
EP-A-399589 describe un
procedimiento para la preparación de
N-acetil-1-metil-omega-fenilalquilaminas
predominantemente en forma del enantiómero R. En JP 06211847 se
describe el uso de una acilasa para proporcionar un aminoácido de
tipo no natural. Hummel et al. (Applied Microbiol.
Biotechnol 27 (1987) 283-291 describen una nueva
acilasa que cataliza la desacetilación del ácido acetamidocinámico
(ACA) encontrado en las cepas de Brevibacterium sp.
Sin embargo, la presente invención proporciona
nuevos biocatalizadores para la hidrólisis enantioselectiva.
Un objeto de la invención consiste en
proporcionar nuevos catalizadores para la hidrólisis
estereoselectiva de enantiómeros en una acilamida racémica. Dichos
biocatalizadores son microorganismos capaces de producir enzimas
(acilasas) capaces de hidrolizar de forma estereoselectiva
enantiómeros en una acilamida racémica, o las propias enzimas.
Además, un objeto consiste en proporcionar un
procedimiento para la hidrólisis estereoselectiva de
acilamidas.
La invención se refiere a un biocatalizador, es
decir, un microorganismo muerto o vivo o un polipéptido,
preferentemente en forma aislada, que exhibe actividad enzimática
de acilasa sin actividad de lipasa o esterasa. El biocatalizador es
capaz de hidrolizar de forma estereoselectiva una acilamida racémica
que tiene un residuo acilo alifático y que no es un derivado de un
aminoácido natural.
En consecuencia, la invención se refiere también
a cepas microbianas capaces de producir una enzima de la invención.
Quedan incluidos tanto los microorganismos genéticamente
modificados como los microorganismos de origen natural. Las cepas de
origen natural según la invención son microorganismos que se pueden
obtener mediante un proceso de selección que comprende inocular un
medio de selección con una muestra natural.
Otro aspecto de la invención consiste en un
procedimiento para la hidrólisis de una N-acilamida
racémica que tiene un residuo acilo alifático y que no es un
derivado de un aminoácido natural, caracterizado porque se utiliza
una enzima de acuerdo con la invención.
El procedimiento de la invención se puede
realizar con la enzima libre o inmovilizada, la cual se puede
emplear en forma enriquecida o purificada o en forma de un extracto
celular en bruto. En otra modalidad de la invención, se emplea un
microorganismo que expresa una acilasa de la invención para llevar
a cabo la reacción, es decir, la enzima se encuentra en una forma
unida a las células.
El procedimiento de la invención se puede
emplear para separar racematos, en el caso de que se hidrolice
específicamente un estereoisómero de la acilamida racémica. Sin
embargo, si la hidrólisis no es estereoselectiva (por ejemplo,
puesto que la acilamida no es un racemato o puesto que la enzima
hidroliza ambos enantiómeros de una determinada acilamida racémica),
el procedimiento de la invención se puede emplear también para
otros fines, por ejemplo en la química de grupos protectores.
\newpage
La invención se refiere a un biocatalizador que
exhibe actividad enzimática de amina acilasa sin actividad de
lipasa o esterasa, cuyo biocatalizador es capaz de hidrolizar de
forma estereoselectiva una acilamida racémica de fórmula (1)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
en
donde
R^{2} es arilo o arilo
C_{1}-C_{4}; o R^{1} y R^{2} juntos forman
un anillo de 5 a 7 miembros sustituido por o condensado a
arilo;
R^{3} es un residuo acilo alifático; y
R^{1} y R^{3} juntos se eligen con el fin de
formar un compuesto de fórmula (1) que no es un derivado de un
aminoácido natural; en donde cada uno de los residuos puede estar
sustituido o insustituido.
Una modalidad preferida es un biocatalizador,
cuyo sustrato puede ser hidrolizado a una amina primaria. El
biocatalizador según la invención se elige preferentemente del grupo
consistente en (a) un polipéptido con dicha actividad enzimática y
(b) un microorganismo vivo o microorganismo muerto que contiene un
polipéptido con dicha actividad enzimática o un extracto celular de
dicho microorganismo. Un microorganismo muerto en el contexto de la
presente invención es, por ejemplo, un microorganismo en una forma
desintegrada en donde la pared celular y/o membrana celular se
rompe o elimina de forma mecánica o química.
La expresión "sin actividad de lipasa o
esterasa" en el contexto de la presente invención significa que
no puede detectarse actividad enzimática en el ensayo Api Zym Test
(Bio Mérieux SA, Marcy-L'Etoile, France). En este
ensayo, la actividad C4 esterasa se ensaya con
2-naftilbutirato, la actividad de C8 esterasa con
2-naftilcaproato y la actividad de C14 lipasa con
2-naftilmiristato.
En particular, la invención se refiere a una
enzima con actividad de amina acilasa y sin actividad de lipasa o
esterasa y mutantes, variantes y fragmentos de dicha acilasa, que
exhiben actividad de acilasa y sin actividad de lipasa o esterasa.
Una modalidad preferida es un polipéptido, cuyo sustrato puede ser
hidrolizado a una amina primaria.
El polipéptido de la invención se denomina aquí
también "acilasa de la invención" o "enzima de la
invención". Salvo que se indique otra cosa, todos estos términos
incluyen no solo la secuencia auténtica de origen natural de un
polipéptido de la invención, que constituyen las modalidades
preferidas de la invención, sino también todos los mutantes,
variantes y fragmentos de las mismas que exhiben actividad
enzimática de acilasa, preferentemente la misma actividad
estereoselectiva que la enzima natural. El polipéptido de la
invención se puede emplear en forma enriquecida o, preferentemente,
purificada.
En una modalidad preferida de la invención, un
polipéptido de la invención es en particular capaz de catalizar la
siguiente reacción estereoselectiva (A)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
en donde la acilamida racémica de
fórmula (1) es hidrolizada de forma estereoselectiva con una amina
acilasa de la invención, que es un polipéptido con actividad
enzimática de amina acilasa pero sin actividad de lipasa o
esterasa, y que es capaz de hidrolizar de forma estereoselectiva la
acilamida racémica de fórmula (1), y en donde dicha hidrólisis da
lugar a la amina R (o S) de fórmula (2) y al ácido de fórmula (3) y
la amida S (o R) de fórmula
(4),
en donde en las fórmulas (1) a (4)
R^{1} es hidrógeno, alquilo
C_{1}-C_{8}, alquenilo
C_{2}-C_{8}, alcoxi
C_{1}-C_{8},
alquil(C_{2}-C_{8})carboxi o
carboxi; preferentemente alquilo C_{1}-C_{4},
alquenilo C_{2}-C_{4}, alcoxi
C_{1}-C_{4} o
alquil(C_{2}-C_{4})carboxi; más
preferentemente alquilo C_{1}-C_{3}, alquenilo
C_{2}-C_{3}, alcoxi
C_{1}-C_{3} o
alquil(C_{2}-C_{3})carboxi; y con
suma preferencia elegido del grupo consistente en hidrógeno, metilo,
etilo, n-propilo, isopropilo,
propil-1-eno,
propil-2-eno,
prop-2-ileno y metoxi;
R^{2} es arilo o arilo
C_{1}-C_{4}; insustituido o sustituido por
alquilo C_{1}-C_{4}, alcoxi
C_{1}-C_{4}, hidroxialquilo
C_{1}-C_{4}, aminoalquilo
C_{1}-C_{4}, haloalcoxi
C_{1}-C_{4}, hidroxi, amino, halógeno, nitro,
sulfo o ciano;
o en donde R^{1} y R^{2} juntos forman un
anillo de 5 a 7 miembros sustituido por o condensado a arilo, en
donde los anillos pueden contener 1 o 2 heteroátomos seleccionados
entre nitrógeno, azufre y oxígeno; preferentemente indano,
tetralina o cromano, insustituidos o sustituidos con metoxi, etoxi,
halógeno, metilo, etilo, nitro, ciano, amino, hidroxi,
trifluormetilo; y
R^{3} es un residuo acilo alifático;
preferentemente alquilo C_{1}-C_{4}; y más
preferentemente metilo.
Arilo es, por ejemplo, un homo- o heterociclo.
Un sistema de anillos adecuado es, por ejemplo, un sistema de un
solo o doble anillo que tiene de 3 a 10 átomos en el anillo, está
enlazado por vía de un átomo de carbono o por vía de un átomo de
nitrógeno y contiene hasta 4 heteroátomos seleccionados entre
oxígeno, nitrógeno, azufre y azufre enlazado a 1 o 2 átomos de
oxígeno; que, además, puede también estar condensado con 1 o 2
radicales fenilo o con 1 o 2 radicales cicloalquilo, teniendo el
cicloalquilo preferentemente de 5 a 7 átomos en el anillo; y que
puede estar insaturado o parcial o totalmente saturado.
Ejemplos de arilo son fenilo, naftilo,
bifenililo, antrilo, fluorenilo, tienilo, furilo, pirrolilo,
imidazolilo, pirazolilo, oxazolilo, tiazolilo, tetrazolilo,
piridilo, pirazinilo, pirimidinilo, piridazinilo, indolilo,
bencimidazolilo, quinolilo, isoquinolilo,
3,1-benzofuranilo, cromanilo,
ciclohexa[b]pirrolilo,
ciclohexa[b]piridilo, [b]pirimidinilo,
pirrolidinilo, pirrolinilo, ciclohexa[b]pirazinilo,
ciclohexa[b]pirimidinilo, imidazolilo, piperidilo,
piperazinilo, morfolinilo, tiomorfolinilo,
S,S-dioxo-tiomorfolinilo,
indolinilo, isoindolinilo,
4,5,6,7-tetrahidroindolilo,
1,2,3,4-tetrahidroquinolilo o
1,2,3,4-tetrahidroisoquinolilo, por ejemplo estando
uno de los radicales últimamente mencionados insustituidos o
sustituidos por uno o más sustituyentes elegidos entre alquilo
inferior, por ejemplo metilo, fenilo, 1- o
2-naftilo, fenil-alquilo inferior,
por ejemplo bencilo, hidroxi-alquilo inferior, por
ejemplo hidroximetilo o 2-hidroxietilo, hidroxi,
alcoxi inferior, por ejemplo metoxi o etoxi, amino,
alquil(inferior)amino, por ejemplo metil-, etil- o
terc-butilamino,
di-alquil(inferior)amino, por ejemplo
dimetil- o dietil-amino, carboxi,
alcoxi(inferior)carbonilo, por ejemplo metoxi-,
isopropoxi-, sec-butoxi- o
terc-butoxi-carbonilo, fenil- o
naftil-alcoxi(inferior)carbonilo, por
ejemplo benciloxicarbonilo, halógeno, por ejemplo fluor, cloro,
bromo o yodo, especialmente cloro o bromo, alcanoilo inferior, por
ejemplo acetilo o pivaloilo, nitro, oxo y/o por ciano.
En una modalidad preferida, arilo está
insustituido o sustituido por uno o más sustituyentes elegidos
entre metilo, hidroximetilo, 2-hidroxietilo,
hidroxi, metoxi; etoxi, amino, metilamino, etilamino,
terc-butilamino, dimetilamino, dietilamino, carboxi,
metoxicarbonilo, isopropoxicarbonilo,
sec-butoxicarbonilo,
terc-butoxicarbonilo, fluor, cloro, bromo, acetilo o
pivaloilo, nitro, oxo y/o por ciano.
En una modalidad preferida de la reacción
anterior A, se hidroliza una acilamida racémica en donde R^{3} es
alquilo C_{1}-C_{3}, más preferentemente alquilo
C_{1}, en particular, en el caso de una acilasa obtenible a
partir de Rhodococcus globerulus, R^{3} es con suma
preferencia alquilo C_{1}-C_{3}.
El término "sustituido" significa que la
mitad en cuestión puede estar sustituida por 1 a 3 sustituyentes
idénticos o diferentes, preferentemente 1 o 2 sustituyentes
idénticos o diferentes, con suma preferencia por un sustituyente
seleccionado del grupo consistente en alquilo
C_{1}-C_{8} (preferentemente metilo),
haloalquilo (preferentemente trifluormetilo), halógeno
(preferentemente fluor o cloro), amino, nitro y alcoxi
C_{1}-C_{8} (preferentemente metoxi).
De acuerdo con la presente invención, arilo
considerado por sí solo o como un miembro o una mitad aralquilo, es
un radical carbocíclico en donde al menos un anillo se encuentra en
forma de un anillo aromático de 6 miembros (es decir, un anillo
benceno). Se prefieren fenilo, naftilo, tal como 1- o
2-naftilo, bifenililo, tal como, especialmente,
4-bifenililo, antrilo y fluorenilo, y también
aquellos sistemas de anillos que tienen uno o más anillos saturados
condensados.
En una modalidad preferida, aralquilo representa
un radical alifático sustituido por una mitad arilo, en donde el
radical alifático es un alquileno C_{1}-C_{8}
sin ramificar o ramificado (preferentemente alquileno
C_{1}-C_{3}, con suma preferencia metileno o
etileno) y la mitad alquilo es un radical carbocíclico como se ha
definido anteriormente. En una modalidad más preferida, aralquilo
representa un radical de fórmula 10, 11 o 12
en
donde
R^{4} es hidrógeno o alquilo
C_{1}-C_{4}; preferentemente hidrógeno o metilo;
más preferentemente hidrógeno;
n es un número entero seleccionado entre 0, 1,
2, 3 y 4, preferentemente 0, 1, 2 y 3, más preferentemente 0, 1 y
2;
R^{5} y R^{6} son cada uno
independientemente entre sí hidrógeno, alquilo
C_{1}-C_{4}, haloalquilo
C_{1}-C_{4}, halógeno, amino, ciano, nitro o
alcoxi C_{1}-C_{4}; preferentemente hidrógeno,
metilo, etilo, trifluormetilo, fluor, cloro, bromo, yodo, amino,
nitro, ciano o metoxi; más preferentemente hidrógeno, metilo,
fluor, cloro, ciano, nitro o metoxi.
Otros compuestos preferidos son de fórmulas 13,
14 y 15
en donde n es un número entero
seleccionado entre 0, 1 y 2; R^{5} y R^{6} son cada uno
independientemente entre sí hidrógeno o
ciano.
Otros compuestos preferidos son aquellos de
fórmulas 16 y 17
en
donde
X es oxígeno, carbono o nitrógeno;
preferentemente oxígeno y carbono; y
R^{5} y R^{6} son cada uno
independientemente entre sí hidrógeno, alquilo
C_{1}-C_{4}, haloalquilo
C_{1}-C_{4}, halógeno, amino, ciano, nitro o
alcoxi C_{1}-C_{4}; preferentemente hidrógeno,
metilo, etilo, yodo, bromo, trifluormetilo, cloro, fluor, amino,
ciano, nitro, metoxi o etoxi.
Si R^{1} y R^{2} juntos forman un radical
heteroalifático cíclico insustituido o sustituido, dicho radical
representa preferentemente un compuesto de fórmula (18)
Otros ejemplos de compuestos adecuados son:
La acilasa de la invención se puede obtener a
partir de un microorganismo seleccionable mediante un procedimiento
que comprende inocular un medio de selección con muestras naturales
tales como abono, agua o ensilaje vegetal, comprendiendo dicho
medio de selección una acilamida como única fuente de carbono. La
acilamida se puede emplear como racemato o, se contempla una
preselección sobre una cilasa enantiómera R o S específica, como el
enantiómero R o S. En las modalidades preferidas del procedimiento
de selección, se emplean, para la selección, las acilamidas
descritas anteriormente en relación con la reacción de
hidrólisis.
Además de la fuente de carbono, el medio de
selección también contiene todos los ingredientes esenciales
necesarios para permitir el crecimiento de microorganismos, tales
como sales minerales, fuentes de N y trazas de elementos.
En las modalidades sumamente preferidas, el
medio de selección comprende una acilamida elegida del grupo
consistente en
N-acetil-1-feniletilamina
como racemato o enantiómero S o R y
N-acetil-2-amino-1-fenil-4-penteno
como racemato o enantiómero S o R.
Un medio de selección adecuado empleado para
llevar a cabo la invención comprende 3 g de la acilamida y además
contiene 3 ml de solución de trazas de elementos
SL-6 y 1 litro de solución de sales minerales ML 1
(pH 7,0), en donde la composición de la solución de sales minerales
ML 1 consiste en 5 g K_{2}HPO_{4}, 0,2 g MgSO_{4}7H_{2}O,
20 mg CaCl_{2}, 20 mg FeSO_{4}7H_{2}O, 1,5 g
(NH_{4})_{2}SO_{4} y 1 litro agua desionizada (pH
7,0); y la composición de la solución de trazas de elementos
SL-6 consiste en 20 mg NiCl_{2}x6H_{2}O, 200 mg
CoCl_{2}6H_{2}O, 30 mg MnCl_{2}4H_{2}O, 10 mg
CuCl_{2}2H_{2}O, 300 mg H_{3}BO_{3}, 30 mg
Na_{2}MoO_{4}2H_{2}O, 100 mg ZnSO_{4}7H_{2}O y 1 litro
agua desionizada. Sin embargo, esta receta puede variarse como es
lógico en tanto en cuanto se proporcionen suficientes trazas de
elementos, sales minerales y fuente de N.
Preferentemente, una acilasa de la invención se
puede obtener a partir de un microorganismo seleccionado del grupo
consistente en Rhodococcus globerulus, más preferentemente a
partir de un microorganismo seleccionado del grupo consistente en
Rhodococcus globerulus K1/1, DSM 10337.
El término "biocatalizador" de acuerdo con
la presente invención también incluye microorganismos vivos o
muertos que exhiben la actividad enzimática de una acilasa de la
invención. Por tanto, la invención también se refiere a un
microorganismo que expresa una acilasa de la invención. Quedan
incluidos los microorganismos genéticamente modificados y también
aquellos de origen natural. Si bien los primeros se pueden producir
por mutación o por ingeniería genética, es decir por transformación
de un microorganismo tal como bacterias, por ejemplo E. coli,
o una levadura, por ejemplo Hansenula o Saccharomyces, con un gen
que codifica una acilasa de la invención, los últimos pueden
obtenerse a partir de fuentes naturales mediante un proceso de
selección que comprende inocular un medio de selección con muestras
naturales, por ejemplo abono, agua, ensilaje vegetal.
El gen que codifica una acilasa de la invención
se puede obtener, por ejemplo, por identificación de al menos una
parte de la secuencia de una acilasa aislada de la invención,
deducción de secuencias de DNA que codifican la secuencia parcial
de la proteína, preparación de un oligonucleótico o una mezcla de
oligonucleóticos (teniendo en cuenta la degeneración del código
genético, sondeo de una librería de DNA derivada de la cepa
microbiana que expresa de forma natural la acilasa deseada,
aislamiento del gen y clonación del mismo en un vector adecuado para
la transformación del microorganismo que ha de ser modificado
genéticamente. Según otro enfoque, se puede determinar la secuencia
completa de la acilasa aislada y se puede producir por vía sintética
un DNA que codifica la proteína. También es fácilmente posible
examinar una librería de DNA adecuada en E. coli, por
ejemplo, respecto al crecimiento de la amida
correspondiente como única fuente de carbono con el fin de obtener un clon transformado que expresa la acilasa.
correspondiente como única fuente de carbono con el fin de obtener un clon transformado que expresa la acilasa.
Se puede obtener un microorganismo de origen
natural que tiene actividad de acilasa mediante un procedimiento
como el indicado a continuación y se puede convertir por mutación
de manera conocida per se, por ejemplo usando mutágenos
generalmente conocidos, tales como rayos UV o rayos X, o compuestos
químicos mutágenos, a mutantes que son diferenciados de sus
precursores por presentar propiedades mejoradas, por ejemplo,
menores demandas de medio nutriente, mayores velocidades de
crecimiento y, especialmente, mayor actividad de acilasa. Dichos
mutantes también pueden presentarse de forma espontánea. La
identificación y aislamiento de dichos mutantes se efectúa también
de manera conocida per se: se determina la actividad de
acilasa de colonias de tales mutantes, por ejemplo, después de la
desintegración de las células, por adición de cantidades
especificas de un sustrato de acilamida adecuado a porciones
alícuotas del residuo celular y determinación cualitativa o
cuantitativa de los productos de reacción que se forman por medio de
cromatografía, especialmente HPLC.
El aislamiento de un microorganismo que expresa
de forma natural una acilasa de la invención se puede conseguir
mediante un proceso de selección que comprende inocular un medio de
selección con muestras naturales tales como abono, agua o ensilaje
vegetal, comprendiendo dicho medio de selección una acilamida como
única fuente de carbono. La acilamida se puede emplear como racemato
o, si se contempla una preselección en una acilasa enantiómera R o
S específica, como el enantiómero R o S. en las modalidades
preferidas del proceso de selección, se emplean, para la selección,
las acilamidas descritas anteriormente en relación con la reacción
de hidrólisis.
Además de la fuente de carbono, el medio de
selección también contiene todos los ingredientes esenciales
necesarios para permitir el crecimiento de microorganismos, tales
como sales minerales, fuentes de N y trazas de elementos.
En las modalidades sumamente preferidas, el
medio de selección comprende una acilamida elegida del grupo
consistente en
N-acetil-1-feniletilamina
como racemato o enantiómero S o R y
2-amino-1-fenil-4-penteno
como racemato o enantiómero S o R.
Un medio de selección adecuado empleado para
llevar a cabo la invención comprende 3 g de la acilamida y además
contiene 3 ml de solución de trazas de elementos
SL-6 y 1 litro de solución de sales minerales ML 1
(pH 7,0), en donde la composición de la solución de sales minerales
ML 1 consiste en 5 g K_{2}HPO_{4}, 0,2 g MgSO_{4}7H_{2}O, 20
mg CaCl_{2}, 20 mg FeSO_{4}7H_{2}O, 1,5 g
(NH_{4})_{2}SO_{4} y 1 litro agua desionizada (pH 7,0);
y la composición de la solución de trazas de elementos
SL-6 consiste en 20 mg NiCl_{2}x6H_{2}O, 200 mg
CoCl_{2}6H_{2}O, 30 mg MnCl_{2}4H_{2}O, 10 mg
CuCl_{2}2H_{2}O, 300 mg H_{3}BO_{3}, 30 mg
Na_{2}MoO_{4}2H_{2}O, 100 mg ZnSO_{4}7H_{2}O y 1 litro
agua desionizada. Sin embargo, esta receta puede variarse como es
lógico en tanto en cuanto se proporcionen suficientes trazas de
elementos, sales minerales y fuente de N.
Un microorganismo preferido se elige entre
Rhodococcus globerulus, más preferentemente entre
Rhodococcus globerulus K1/1, DSM 10337.
La acilasa se aísla del microorganismo por
métodos bien conocidos en la técnica, en particular por los métodos
descritos en los ejemplos.
Se prefiere un biocatalizador sustancialmente
purificado según la reivindicación 1, aislado a partir de un
microorganismo como se ha definido anteriormente; comprendiendo más
preferentemente la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO 1.
Un aspecto importante de la invención se refiere
a un procedimiento que comprende la hidrólisis de una
N-acilamida racémica que tiene un residuo acilo
alifático y que no es un derivado de un aminoácido natural,
caracterizado porque se emplea una acilasa de la invención. El
procedimiento comprende la reacción A mostrada anteriormente. En
las modalidades preferidas del procedimiento, los residuos R^{1},
R^{2} y R^{3} y la acilasa tienen los significados anteriormente
definidos. En el caso de la acilasa de Rhodococcus
globerulus K1/1, DSM 10337, R^{1} también puede ser urea.
El procedimiento de la invención (véase el
procedimiento A anterior) se puede efectuar con cualquier
"biocatalizador" que tenga la actividad de una enzima de la
invención. Un "biocatalizador" según la invención es, por
ejemplo, un microorganismo que expresa una acilasa de la invención,
por ejemplo un microorganismo de origen natural, mutado o
recombinante como se ha definido anteriormente, un extracto celular
en bruto de dicho microorganismo, una enzima enriquecida o
purificada según la invención. El término microorganismo en este
contexto incluye el microorganismo vivo o el microorganismo muerto,
por ejemplo en una forma desintegrada en donde la pared de la célula
y/o membrana de la célula se rompe o elimina por medios mecánicos o
químicos.
El "biocatalizador" para utilizarse en el
procedimiento de la invención puede estar inmovilizado. La
inmovilización de dicho "biocatalizador" se puede efectuar de
manera análoga a los procedimientos conocidos per se, por
ejemplo, por acoplamiento a un soporte sólido o inclusión en un
reactor de membrana enzimática.
El microorganismo que expresa actividad
enzimática de acilasa puede ser un microorganismo de origen
natural, opcionalmente convertido por mutación como se ha descrito
anteriormente, o un microorganismo transformado por técnicas de
ingeniería genética con un gen que codifica una acilasa de la
invención para que pueda producir la acilasa deseada. La hidrólisis
del sustrato de acilamida con extracto celular microbiano se
efectúa preferentemente en solución acuosa homogénea a un pH de 5 a
10,5, más preferentemente a un pH de 6 a 9,5. Para la estabilización
del valor pH, la reacción se efectúa de manera conocida per
se en solución tamponada o empleando un pH-stat.
La temperatura de reacción es de aproximadamente 10 a 65ºC, más
preferentemente de 20 a 50ºC, incluso más preferentemente de 20 a
30ºC. El sustrato de acilamida se emplea preferentemente en una
concentración de 1 nM a 1 M, más preferentemente de 10 mM a 100 mM.
Sin embargo, si el sustrato es menos soluble, también es posible
emplear una suspensión de sustrato.
También se describen las enzimas aisladas a
partir de Rhodococcus equi Ac6, DSM 10278 y Arthrobacter
aurescens AcR5b, DSM 10280, que difieren en cuanto a los valores
óptimos de pH y temperatura. Para la enzima de Rhodococcus
equi Ac6, DSM 10278, el intervalo de pH preferido es de 5 a
10,5, más preferentemente de 6 a 8, incluso más preferentemente de
6,5 a 7,5, y el intervalo de temperatura preferido es de 10 a 65ºC,
más preferentemente de 20 a 37ºC, incluso más preferentemente de 25
a 30ºC. Para la enzima de Arthrobacter aurescens AcR5b, DSM
10280, el intervalo de pH preferido es de 5,5 a 10,5, más
preferentemente de 7 a 9,5 y el intervalo de temperatura preferido
es de 10 a 65ºC, más preferentemente de 45 a 50ºC (si se desea la
actividad máxima) o de 20 a 30ºC (si se desea la estabilidad máxima
de la enzima).
El procedimiento según la invención puede
realizarse de forma discontinua o continua en un reactor enzimático
de membrana (EMR). En este último caso, el reactor enzimático de
membrana está equipado preferentemente con una membrana de
ultrafiltración que tiene un límite de separación menor de
aproximadamente 30.000, de manera que las enzimas contenidas en la
mezcla de reacción quedan retenidas mientras que los productos de
bajo peso molecular y los reactantes sin reaccionar pasan a través
de la membrana y el producto puede ser aislado a partir del flujo de
salida. El reactor se esteriliza preferentemente antes de su uso,
de manera que se puede prescindir de la adición de sustancias
antibacterianas. Las reacciones se efectúan de manera análoga a la
descrita anteriormente.
El procedimiento según la invención también se
puede efectuar mediante percolación de la solución que contiene el
sustrato de acilamida, que ha sido ajustado a un valor pH adecuado,
a través de un soporte sólido sobre el cual ha sido inmovilizada la
acilasa contenida en el extracto microbiano en bruto (el preparado
de enzima enlazada a matriz puede contenerse, por ejemplo, por
percolación del extracto microbiano en bruto a través de
Sepharose eupergita acticvada con CNBr o similar).
La elaboración de la mezcla de reacción y la
purificación de los productos y reactantes no hidrolizados o del
enantiómero no hidrolizable de acuerdo con la invención, siguieron
a cabo a través de los métodos usuales conocidos por el estado de la
técnica. Por ejemplo, la mezcla de reacción puede ser clarificada
por filtración o, preferentemente, centrifugado, y luego la enzima
puede ser separada por ultrafiltración (membrana con un límite de
separación de
\leq 30.000 Daltons) y el resto del producto puede ser lavado del retentato por diafiltración. Se lleva a cabo entonces la purificación real, por ejemplo, por métodos cromatográficos, por ejemplo cromatografía en gel (inter alia Sephadex G-25), cromatografía por intercambio iónico, por ejemplo cromatografía por intercambio aniónico, cromatografía de capa delgada, HPCL o similar. La extracción selectiva de amida se efectúa, por ejemplo, preferentemente a valores pH bajos y a continuación la amina puede ser extraída a valores pH preferentemente alcalinos.
\leq 30.000 Daltons) y el resto del producto puede ser lavado del retentato por diafiltración. Se lleva a cabo entonces la purificación real, por ejemplo, por métodos cromatográficos, por ejemplo cromatografía en gel (inter alia Sephadex G-25), cromatografía por intercambio iónico, por ejemplo cromatografía por intercambio aniónico, cromatografía de capa delgada, HPCL o similar. La extracción selectiva de amida se efectúa, por ejemplo, preferentemente a valores pH bajos y a continuación la amina puede ser extraída a valores pH preferentemente alcalinos.
Con el fin de obtener el extracto celular usado
de acuerdo con el procedimiento, un microorganismo que tiene
actividad de acilasa, especialmente uno de los mencionados
anteriormente, se cultiva en un medio nutriente acuoso que contiene
fuentes asimilables de carbono y nitrógeno y también sales
minerales, a un valor pH de aproximadamente 6 a 9, con preferencia
de aproximadamente 6,5 a 7, y a una temperatura de aproximadamente
28-40ºC, especial aproximadamente 28 a 30ºC, se
separa la biomasa y se obtiene el extracto celular. El tiempo de
fermentación se elige de manera que se consigan los títulos óptimos
con respecto a la actividad de acilasa.
Cuando la densidad celular ha logrado un valor
adecuado, se interrumpe el cultivo. El caldo de cultivo se separa de
manera conocida, por ejemplo por centrifugado, y las células
sedimentadas se rompen del modo usual, por ejemplo, sacudiendo con
perlas de vidrio finas, mediante tratamiento con ultrasonidos o
utilizando una prensa French. Los componentes celulares insolubles
y, si se utilizan las perlas de vidrio, se separan, por ejemplo por
centrifugado, y el residuo se emplea como la fuente de enzima
(extracto en bruto). El residuo, como un extracto en bruto que
contiene acilasa, se puede emplear directamente en el procedimiento
según la invención. Convenientemente, sin embargo, con el fin de
separar ácidos nucleicos (soluciones viscosas !), el extracto en
bruto se trata con un agente policatiónico, por ejemplo
polietilenimina, una poliamina tal como espermidina, sulfato de
estreptomicina o ribonucleasa o sales de Mn^{2+}, y los ácidos
nucleicos precipitados se separan por centrifugado.
Preferentemente, el extracto celular en bruto
se somete a una o más etapas de purificación convencionales con el
fin de separar del extracto los componentes molestos.
El procedimiento de la invención se puede
emplear para separar racematos, en el caso de que se hidrolice
concretamente un estereoisómero de la acilamida racémica. Sin
embargo, si la hidrólisis no es estereoselectiva (por ejemplo, dado
que la acilamida no es un racemato o dado que la enzima hidroliza
ambos enantiómeros de una determinada acilamida racémica), el
procedimiento de la invención se puede emplear en la química de
grupos protectores. En este caso, el átomo de C al cual están
enlazados R^{2} y R^{3} en los sustratos no es necesario que
sea quiral. En este caso, se puede hidrolizar el 100% del sustrato.
En un ejemplo, R^{2} y R^{3} están conectados covalentemente
para formar un anillo benceno. Según otro ejemplo, R^{2} y
R^{3} están conectados covalentemente para formar un anillo de
ciclopentano condensado con benceno. En ambos casos, R^{1} es
preferentemente metilo.
Los siguientes ejemplos son ilustrativos, sin
embargo, no deberán ser considerados como limitativos de la presente
invención.
Se suspenden 16 muestras de abono en la solución
de sales minerales ML 1 descrita a continuación, la cual ha sido
esterilizada con anterioridad por autoclaveado a 120ºC durante 20
minutos. Para la inoculación de 4 ml de medio líquido (= medio de
enriquecimiento) se emplean 0,1 ml de estas soluciones y 12 muestras
de agua de origen natural y de una planta de purificación de
residuos. Paralelamente, se inoculan cultivos de control con medio
de enriquecimiento que no contienen
N-acetil-1-feniletilamina
racémica. La composición de la solución de sales minerales ML 1
es:
El medio de enriquecimiento consiste en:
La solución de trazas de elementos
SL-6 está constituida por:
Antes de la inoculación, el medio se introduce
en tubos de ensayo de 16 ml y se esteriliza en un autoclave durante
20 minutos a 121ºC.
Los tubos se incuban en posición inclinada a
28ºC en una máquina sacudidora rotativa a 220 rpm. Los cultivos con
crecimiento, observado como turbidez, en presencia de
N-acetil-1-feniletilamina,
pero no en su ausencia, son inoculados además en 4 ml de medio de
enriquecimiento estéril y también en tubos de control sin sustrato
(= segunda propagación).
Los cultivos de la quinta propagación fueron
diluidos 10^{5} y 10^{6} veces en tampón de fosfato sódico 69
mM estéril, pH 7, y depositado sobre medio sólido consistente en el
medio de enriquecimiento más 20 g/l agar y sobre placas de control
sin
N-acetil-1-feniletilamina.
Las colonias morfológicamente diferentes de aquellas de las placas
de control son rayadas - para el aislamiento de células y
determinación de la enantioselectividad de la utilización de
N-acetil-1-feniletilamina
- sobre placas de agar selectivas que contienen medio de
enriquecimiento más 20 g/l de agar, en donde la
N-acetil-1-feniletilamina
racémica es sustituida por a) 3 g/l
(S)-N-acetil-feniletilamina
o b)
(R)-N-acetil-1-feniletilamina.
Las placas son incubadas durante 3 a 10 días a 28ºC. Las cepas que
crecen únicamente sobre uno de los enantiómeros de
N-acetil-1-feniletilamina
y que aparecen puras según la morfología de las colonias, se
cultivan durante 24-48 horas a 28ºC en un aparato
sacudidor a 220 rpm en 25 ml de medio (matraces de 100 ml) de la
siguiente composición (= medio básico con (R) o
(S)-N-acetil-1-feniletilamina):
Se emplean 0,5 ml de estos precultivos para
inocular los cultivos principales que poseen el mismo medio y
escala. Después de 24-48 horas de incubación a 220
rpm y 28ºC, el contenido de los matraces se centrifuga (15 minutos,
9.000 x g) en una centrífuga Superspeed refrigerada (Dupont Co.,
Welmington, Delaware, USA), y las células sedimentadas se suspenden
en 1 ml de tampón de fosfato potásico 69 mM con pH 7. En viales
Eppendorf, se mezclan 0,6 ml de estas suspensiones con 1,2 g de
perlas de vidrio (diámetro de 0,1-0,25 mm, Carl Roth
GMBH, Karlsruhe, Alemania) y se sacuden durante 10 minutos en un
molino de perlas de vidrio (Retsch Co, Haan, Alemania) a velocidad
máxima. Después de enfriar los viales en un baño de hielo y
centrifugar a 11.500 rpm en una Biofuge 15 (Heraeus Sepatech,
Osterode, Alemania) con el fin de separar los restos de células y
las perlas de vidrio, los sobrenadantes (= extracto de células en
bruto) se emplean como la fuente enzimática.
Los ensayos respecto a la actividad de acilasa
se preparan en viales Eppendorf como sigue:
Después de una incubación a 30ºC durante un
periodo de tiempo que permite la liberación de 0 a 3 mM de
1-feniletilamina, se añaden 400 \mul de acetona
enfriada con hielo para detener la reacción. El tubo se mezcla
vigorosamente, se coloca en hielo durante alrededor de 15 minutos y
luego se centrifuga durante 4 minutos a 11.500 rpm en una Biofuge
15 (Heraeus Sepatech, Osterode, Alemania). El sobrenadante se somete
a análisis HPLC cuantitativo. Si los ensayos de actividad contienen
extractos en bruto de células que han crecido en presencia de
N-acetil-1-feniletilamina,
paralelamente ha de prepararse un ensayo de control sin sustrato
con el fin de determinar el contenido en
1-feniletilamina del extracto en bruto. Para el
análisis HPLC, se inyectan volúmenes de muestra de 20 \mul en una
columna RP-8 (LiChroCART 125-4,
LiChrospher 100 RP8 (5 mm), columna de protección: LiChroCART
4-4, LiChrospher 100 RP-8 (5 mm),
Merck Co., Darmstadt, Alemania). Se aplica el siguiente gradiente
con una velocidad de flujo de 1,25 ml/min para la separación del
sustrato
N-acetil-1-feniletilamina
y del producto 1-feniletilamina:
Disolvente A: tampón de fosfato potásico, 3 mM,
pH 3
Disolvente B: 10% v/v de disolvente A 90% v/v
de acetonitrilo
Las sustancias del eluado son detectadas
midiendo la absorbancia UV a 215 nm. Las concentraciones del
producto de reacción, 1-feniletilamina, se calculan
por medio de área pico empleando una curva de calibración de 0 a 5
mM.
Una unidad (U) de actividad de acilasa se define
como la cantidad de enzima que cataliza la liberación de 1 \mumol
de 1-feniletilamina por minuto. La concentración de
acilasa en las muestras se calcula según la siguiente fórmula:
U/ml
[\mumol/mlxmin)] = concentración de
1-feniletilamina en el vial HPLC [mM]/(tiempo de
incubación[min] x volumen de la muestra que contiene acilasa
[20 \mul]) x volumen de ensayo final [800 \mul] x factor
de dilución (dilución del preparado de acilasa antes del
ensayo).
La actividad específica se expresa como Unidades
de actividad de acilasa por mg de proteína en el preparado
enzimático, determinada por el BioRad Protein Assay (Biorad Co.,
Glattbrugg, Suiza). La concentración de proteína de la muestra se
calcula empleando una curva de calibración con 0-1
mg/ml de albúmina de suero bovino. Se aislaron 26 cepas bacterianas
que poseen actividad de
(S)-N-acetil-1-feniletilamina
acilasa. No se obtuvo ninguna cepa conteniendo una enzima
(R)-específica. La tabla 1 muestra las actividades
específicas de los 4 mejores organismos. Rhodococcus equi
Ac6 (= DSM 10728) muestra la actividad específica más alta en el
extracto en crudo y también el rendimiento más alto en enzima (45,2
U/l de caldo de cultivo) y, por tanto, es seleccionado como
productor de una
(S)-1-feiniletilamina acilasa. De
aquí en adelante, la acilasa de la cepa Ac6 es referida como
Ac6-acilasa. En los ejemplos ofrecidos a
continuación, el tiempo de incubación estándar para los cultivos en
matraz sacudido con la cepa Ac6 es de 48 horas.
Se hace crecer R. equi Ac6 en medio básico
conteniendo 3 g/l
(S)-N-acetil-1-feniletilamina
o 3 g/l
(R)-N-acetil-1-feniletilamina
o nada de
N-acetil-1-feniletilamina
durante 91 horas mediante la técnica de cultivo en matraz sacudido
descrita en el ejemplo 1. Por aplicación de los métodos ofrecidos
en el ejemplo 1, los extractos en bruto se preparan y se someten a
la medición de la concentración de proteína y actividad de acilasa
empleando
(S)-N-acetil-1-feniletilamina
y
(R)-N-acetil-1-feniletilamina
como sustratos.
Los datos indicados en la tabla 2 demuestran que
la
(S)-N-acetil-1-feniletilamina
ha de estar presente en el medio de crecimiento para inducir la
expresión de acilasa. La
(R)-N-acetil-1-feniletilamina
no es eficaz como inductor de la acilasa de la cepa Ac6 e inhibe el
crecimiento de la bacteria. Además, la acilasa actúa de un modo
altamente (S)-enantioespecífico.
Se inoculan células de R. equi Ac6 en 3
matraces Erlenmeyer de 1 litro conteniendo cada uno de ellos 100 ml
de medio básico con 10 g/l de extracto de levadura y 10 g/l de
extracto de carne como nutrientes adicionales. Las células se hacen
crecer (técnica del matraz sacudido, véase el ejemplo 1) hasta que
la OD_{660} alcanza un valor de 2 aproximadamente. Se divide
entonces el cultivo en 8 porciones de 25 ml y se añade
(S)-N-acetil-1-feniletilamina
a los matraces sacudidos en concentraciones finales de
0-7 g/l en etapas de 1 g/l. Las células se incuban
adicionalmente durante 25 horas. Se miden entonces, en la forma
descrita en el ejemplo 1, las concentraciones de proteína y las
actividades de acilasa de los extractos en bruto.
Una cantidad mayor de 2 g/l de
(S)-N-acetil-1-feniletilamina
en el medio afecta negativamente a la producción de acilasa. La
(S)-N-acetil-1-feniletilamina
inhibe el crecimiento de las células: el valor OD_{660} disminuye
a medida que aumentan las concentraciones de
(S)-N-acetil-1-feniletilamina
en el medio.
En otro experimento, se añade
(S)-N-acetil-1-feniletilamina
al medio de cultivo en concentraciones finales de 1 a 5 g/l en
etapas de 1 g/l directamente después de la inoculación en una serie
de matraces sacudidos (véase ejemplo 1) y después de 72 horas de
crecimiento en otra serie. Se emplea medio básico sin peptona
suplementado con 20 g/l de extracto de carne y 20 g/l de extracto
de levadura. Transcurridas 96 horas desde la inoculación, las
células se recogen por centrifugado y se miden la concentración de
proteína y la actividad de acilasa en el extracto en bruto (véase
ejemplo 1).
Una cantidad de 3 g/l de
(S)-N-acetil-1-feniletilamina
se traduce en el máximo rendimiento de acilasa (60 U/l de medio de
cultivo) en el caso de que el inductor de añada al medio
directamente después de la inoculación, mientras que 2 g de
(S)-N-acetil-1-feniletilamina
conduce a la producción máxima de acilasa (20 U/l de medio de
cultivo) en el caso de que el inductor se añada 72 horas después de
la inoculación. Iniciando el cultivo en presencia de
(S)-N-acetil-1-feniletilamina,
el rendimiento en acilasa es 3 veces mayor que en el cultivo en
donde el inductor se añade después de 72 horas de crecimiento.
Se hacen crecer durante 65 horas cultivos en
matraz sacudido conteniendo medio básico con 3 g/l de
(S)-N-acetil-1-feniletilamina
variando el pH de 2,5 a 9,5 en etapas de 0,5 unidades de pH. Se
miden entonces el valor OD_{660} de los cultivos y también las
concentraciones de proteína y actividades de acilasa de los
extractos en bruto (véase ejemplo 1).
El crecimiento óptimo de Rhodococcus equi
Ac6 y el rendimiento máximo en acilasa se obtienen ambos a un pH
comprendido entre 5,5 y 7. Sin embargo, la actividad específica de
acilasa es bastante constante en un amplio intervalo de pH 5,5 a pH
9,0.
Se incuban durante 45 y 111 horas,
respectivamente, cultivos en matraz sacudido conteniendo medio
básico sin peptona, con un contenido más bajo en extracto de
levadura de 0,5 g/l, 3 g/l de
N-acetil-1-feniletilamina
racémica, y 2 g/l de un nutriente adicional. Después de la
determinación del valor OD_{660}, las células se recogen, se
rompen y se determinan las concentraciones de proteína y las
actividades de acilasa de los extractos en bruto (véase ejemplo
1).
El rendimiento más alto en acilasa después de 45
horas así como después de 111 horas de incubación se consigue con
extracto de levadura (véase tabla 3). La expresión de la acilasa se
ve influenciada positivamente por la presencia de
L-glutamato y nutrientes complejos en el medio, lo
cual conduce a mayores rendimientos en acilasa (U/l de medio), pero
no en un incremento de las actividades específicas. Los cultivos que
crecen sin nutriente adicional muestran la actividad de acilasa
específica más alta, pero un bajo rendimiento global de enzima (U/l
caldo cultivo) y una baja densidad celular (OD_{660}).
Para la fermentación de Rhodococcus equi
Ac6 a escala de 20 l, se emplea un biorreactor de 30 litros equipado
con regulación automática del pH, temperatura y concentración del
oxígeno disuelto (pO_{2}) y con un sistema antiespuma. El
fermentador se llena con 20 litros de medio básico conteniendo 3 g/l
de
N-acetil-1-feniletilamina
racémica y 5 g/l de extracto de levadura. Después del autoclaveado
del medio durante 30 min a 121ºC y enfriamiento a 28ºC, el
biorreactor es inoculado a una OD_{660} inicial de 0,05 por 1
litro de cultivo en matraz sacudido, que se ha hecho crecer con
anterioridad en 5 porciones de 200 ml en matraces Erlenmeyer de 1
litro durante 84 horas a 28ºC y 200 rpm. Las condiciones durante la
fermentación son:
En diferentes momentos de tiempo se toman
muestras de 25 ml de medio de cultivo. Se miden (véase ejemplo 1)
los valores OD_{660} del caldo de cultivo así como del contenido
en proteína y las actividades de acilasa de los extractos en
bruto.
El rendimiento máximo en enzima (U/l_{medio \
de \ cultivo}) se alcanza después de 30 horas de incubación y
permanece constante al menos durante las siguientes 18 horas.
Después de 48 horas de cultivo, el caldo de fermentación se enfría
a 15ºC. Mediante centrifugado en flujo continuo empleando un rotor
Sorvall TZ-28 en una centrífuga refrigerada Sorvall
RC5B Superspeed (Dupont Co., Wilmington, Delaware, USA), se recogen
41 g de células (peso en húmedo) conteniendo 680 U de
Ac6-acilasa con una actividad específica de 0,19
U/mg de proteína. Las células se resuspenden en 103 ml de tampón de
fosfato potásico 69 mM, pH 7, y se guardan a -20ºC.
Se descongelan 100 ml de la suspensión celular
preparada como se ha descrito en el ejemplo 3 y se vierten en un
vaso de precipitados de líquido de 600 ml conteniendo 150 ml de
perlas de vidrio (diámetro de 0,1-0,25 mm). El vaso
de precipitados se enfría en un baño de hielo durante la rotura de
las células con un mezclador manual profesional Philips HR1385, el
cual se hace funcionar 6-8 veces durante 2 minutos,
con interrupciones cada 5 minutos. Después de la sedimentación de
las perlas de vidrio, se retira el sobrenadante y se añaden a las
perlas de vidrio 150 ml de tampón de fosfato potásico 69 mM, pH 7,0.
Mediante una mezcla breve y sedimentación de las perlas de vidrio,
se obtiene un segundo sobrenadante. Los dos sobrenadantes se
combinan y se centrifugan (20 min, 9.000 rpm) en una centrífuga
refrigerada Sorvall RC5B Superspeed empleando un rotor de aluminio
Sorvall GS-3. El sobrenadante del centrifugado se
utiliza como el extracto celular en bruto para la purificación de
la acilasa. El extracto en bruto puede ser guardado a -20ºC durante
al menos 2 meses sin pérdida de actividad y la descongelación y
congelación intermedias solo se traduce en una pérdida de actividad
de 5%.
A 100 ml de extracto en bruto enfriado con hielo
(para la preparación véase el ejemplo 4a), se añade lentamente
sulfato amónico cristalino a una concentración final de 25% de
saturación. Una vez disuelto el sulfato amónico bajo una agitación
suave, la solución se mantiene en hielo durante alrededor de 30
minutos y luego la proteína precipitada es sedimentada por
centrifugado durante 60 minutos a 9.000 rpm en una centrífuga
refrigerada DuPont RC5B Superspeed empleando un rotor de aluminio
Sorvall GS-3. Se añadió más sulfato amónico al
sobrenadante a una concentración final de 85% y se efectuó una
segunda precipitación de proteína en la forma antes descrita. La
proteína precipitada que comprende la Ac6-acilasa se
disuelve en 150 ml de una solución de sulfato amónico
(concentración: 30% saturación) en tampón de fosfato potásico 69 mM,
pH 7.
Para la HIC se equilibra una columna Merck
Fraktogel TSK Butyl-650(S) (26 x 310 mm) con
solución saturada al 30% de (NH_{4})_{2}SO_{4} (en
tampón fosfato, 69 mM, pH 7,0). Después de cargar la columna con 75
ml de la solución de proteína final obtenida después de la
precipitación con sulfato amónico en el ejemplo 4b) la columna se
lava con una solución saturada al 30% de sulfato amónico (en tampón
fosfato 69 mM, pH 7,0) hasta que la señal del detector UV alcanza
de nuevo el nivel de la línea de referencia. Entonces se aplica a
la columna un gradiente descendente desde 30% a 0% de sulfato
amónico con un volumen total de 825 ml y una velocidad de flujo de
0,8 ml/min. El tamaño de la fracción es de 12 ml. Se mide (véase
ejemplo 1) la actividad de Ac6-acilasa de las
fracciones.
La Ac6-acilasa eluye de la
columna entre 8 a 14% de saturación del sulfato amónico. Las 5
fracciones más activas son rehuídas y desalificadas por
diafiltración y concentradas a un volumen final de 23 ml en un
concentrador de columna CEC equipado con una membrana YM30000
(Amicon Inc., Beverly, MA, USA). La diafiltración se consigue
añadiendo repetidamente tampón de fosfato potásico, 69 mM, pH 7, a
la solución concentrada de proteína y siendo una etapa de
reconcentración.
La tabla 4 resume los resultados de la
purificación. El preparado de Ac6-acilasa obtenido a
través de solo una etapa cromatográfica aparece homogéneo según
electrofóresis en SDS-gel de poliacrilamida
realizada con un sistema Phast que utiliza Phast Ges en gradiente
del tipo 10-15 (conteniendo 10-15%
de poliacrilamida) (Pharmacia Co., Dübendorf, Suiza) y tiñendo con
azul coomassie. Para la electrofóresis y el procedimiento de teñido,
se emplean los métodos estándar indicados por Pharmacia para medios
en gradiente Phast Gel (Pharmacia Phast System separation technique
file no. 110: "SDS-PAGE" y file no. 200:
"Fast Coomassie Blue Staining", Pharmacia, Uppsala,
Sweden).
Si se emplea un extracto en bruto de menor
actividad específica, es necesario someter la acilasa a otras etapas
de purificación cromatográfica para obtener un preparado de enzima
homogéneo (por ejemplo mediante cromatografía de intercambio amino
sobre Mono-Q o filtración en gel sobre Superose 12
HR (Pharmacia, Uppsala, Sweden) como se describe en el ejemplo
5.
Se emplea una columna de extracción en gel
Pharmacia Superose 12HR 10/30 (10 x 300 mm) para determinar el peso
molecular de la Ac6-acilasa natural. La elución se
efectúa empleando tampón de fosfato potásico 69 mM, pH 7,0,
suplementado con NaCl 100 mM, con una velocidad de flujo de 0,3
ml/min. A la columna se aplican 50 \mul de la
Ac6-acilasa purificada y concentrada obtenida en el
ejemplo 4. El peso molecular de la enzima natural se determina
usando una curva de calibración que representa los valores K_{AV}
de las proteínas de calibración (véase tabla 5) contra el logaritmo
del peso molecular. El valor K_{AV} se define como sigue:
K_{AV} =
(V_{elución}-V_{O})/(V_{columna}-V_{O})
V_{O} = volumen de vacíos = V_{elución} de
azul dextrano = 7,65 ml,
V_{columna} = volumen columna = 23,6 ml.
Se mide un peso molecular de 94.000\pm 3.000
(K_{AV} = 0,33 0,04) para la Ac6-acilasa
natural.
Con el fin de determinar la estructura
subunitaria se aplica electrofóresis en
SDS-poliacrilamida como se ha descrito en el
ejemplo 4C. El peso molecular de la acilasa desnaturalizada se
determina empleando una curva de calibración que muestra las
distancias de migración contra el logaritmo de los pesos moleculares
de las proteínas marcadoras de un Kit de Calibración de Peso
Molecular Bajo de Pharmacia.
La Ac6-acilasa desnaturalizada
tiene un peso molecular de 50.000\pm2.000. Este resultado, en
comparación con el peso molecular determinado para la enzima
natural, indica una estructura homodimérica para la
Ac6-acilasa.
La focalización isoeléctrica (IEF) se efectúa en
geles del tipo Pharmacia Phast Gel IEF 3-9 (formando
un gradiente de pH 3 a pH 9) empleando el Pharmacia Phast System.
El IEP de la enzima se determina en comparación con las proteínas
del Kit de Calibración de Bajo peso Molecular de Pharmacia (pH
2,5-pH 6,5). Para la focalización isoeléctrica y
procedimiento de teñido, se emplean los métodos estándar indicados
por Pharmacia para métodos Phast Gel IEF (Pharmacia Phast System
separation technique file no. 100: "IEF and titration curve
analysis" y file no. 200: "Fast Coomassie Blue staining",
Pharmacia, Uppsala, Sweden). El IEP de la
Ac6-acilasa se encuentra alrededor de pH 3,5.
Se llevan a cabo ensayos enzimáticos como se ha
descrito en el ejemplo 1 en tampones que oscilan de pH desde 5,71 a
9,88 (pH 5,71, 6,09, 6,58, 7,0, 7,47: tampón de fosfato potásico, 69
mM; pH 7,48, 8,0, 8,4, 8,82, 9,10: tampón de
Tris-HCl, 100 mM; pH 9,38, 9,88: tampón de
glicina-NaOH, 100 mM). El tiempo de incubación es de
30 minutos empleando, como fuente de enzima, el preparado de
acilasa final obtenida en el ejemplo 4c diluido 20 veces.
La Ac6-acilasa muestra una
amplia actividad óptima entre pH 6,0 y pH 8,5 con un máximo entre pH
6,5 y pH 7,0.
En presencia de varios activadores e inhibidores
potenciales de la enzima se efectúan ensayos de actividad de
acuerdo con el esquema indicado en el ejemplo 1 por aplicación de
las siguientes condiciones y concentraciones finales:
Las actividades relativas mostradas entre
paréntesis indican la formación de precipitados durante los ensayos
enzimáticos.
Ninguno de los cationes metálicos ensayados,
salvo Ni^{2+} y en algún grado Zn^{2+}, en una concentración de
1 mM afectan mucho a la actividad de acilasa (véase tabla 6). En una
concentración de 10 mM, Zn^{2+}, Ni^{2+}, Cu^{2+} y Cd^{2+}
muestran una inhibición considerable de la acilasa. Los agentes
quelantes y los agentes reductores tiónicos no afectan a la
actividad de acilasa, mientras que la yodoacetamida 10 mM y el
fluoruro de fenilmetilsulfonilo ya en una concentración de 0,01 mM,
resultan ser fuertemente inhibidores. La fuerte inhibición exhibida
por el fluoruro de fenilmetilsulfonilo sugiere un mecanismo de
reacción de serina proteasa para la Ac6-acilasa.
Muestras del preparado de acilasa final obtenido
en el ejemplo 4c se diluye en 45 veces con tampón de fosfato
potásico 69 mM, pH 7 y se incuban durante varios periodos de tiempo
a diferentes temperaturas. Después del tratamiento a temperatura,
se efectúan ensayos de actividad estándar (véase ejemplo 1) a
3ºC.
Como puede verse en la tabla 6, la acilasa
retiene la casi totalidad de su actividad inicial después de 4
horas en incubación a 30 y 37ºC, mientras que a 39,5 y 44ºC, la
enzima se desactiva de forma considerable. A 30ºC, incluso después
de 34 días, está presente todavía el 94% de la actividad de acilasa
inicial.
Se efectúan ensayos de actividad bajo las
condiciones estándar indicadas en el ejemplo 1 con un tiempo de
incubación de 10 minutos empleando diferentes concentraciones
iniciales de
(S)-N-acetil-1-feniletilamina
y el preparado de Ac6-acilasa final obtenido en el
ejemplo 4d, el cual ha sido diluido 5 veces con tampón de fosfato
potásico 69 mM, pH 7, como la fuente de enzima. Se calcula la
constante de Michaelis K_{m} a partir de las concentraciones de
sustrato y de las correspondientes velocidades de reacción por
regresión no lineal con el programa "SigmaPlot for Windows"
(Jandel Scientific GMBH, Schimmelbusch, Germany) a la fórmula: v =
V_{m} x S/(S + K_{m}). v: velocidad de reacción
(U/ml = mM/min), V_{m}: velocidad de reacción máxima (U/ml). S = concentración de (S)-N-acetil-1-feniletilamina (mM).
(U/ml = mM/min), V_{m}: velocidad de reacción máxima (U/ml). S = concentración de (S)-N-acetil-1-feniletilamina (mM).
El valor K_{m} para
(S)-N-acetil-1-feniletilamina
es de 0,6 mM \pm 0,1 mM.
En general se aplica el procedimiento indicado
en el ejemplo 1 con las siguientes modificaciones:
\bullet Se investigan 43 muestras de abono y
agua.
\bullet El medio líquido para los cultivos de
enriquecimiento y las placas de agar selectivas, sobre las cuales
se depositan los cultivos de enriquecimiento diluidos para obtener
colonias individuales, contienen 3 g/l de
(S)-N-acetil-1-feniletilamina
en lugar de
N-acetil-1-feniletilamina
y, además, 2 ml/l de la siguiente solución de vitaminas:
\bullet El medio líquido para la primera
propagación está suplementado con 0,5 g/l, para la segunda
propagación con 0,2 g/l de acetato sódico con el fin de facilitar
el crecimiento de microorganismos consumidores de ácido acético al
comienzo del enriquecimiento.
\bullet Solo se efectúan 3 propagaciones del
cultivo de enriquecimiento.
\bullet El medio básico para crecer las
células para los ensayos de actividad solo contiene 1 g/l de
extracto de levadura y peptona.
\bullet Se emplea
(R)-N-acetil-2-feniletilacetamina
como el sustrato para los ensayos de actividad con la
AcR5b-acilasa.
Solo se pudieron aislar 3 cepas con una
actividad de acilasa (R)-específica (véase la tabla
7). Arthrobacter aurescens AcR5b (=DSM 10280) muestra la
actividad específica más alta y se selecciona como el producto de
la
(R)-N-acetil-2-feniletilacetamina
acilasa, que de aquí en adelante es referida como
AcR5b-acilasa. En los ejemplos ofrecidos a
continuación, el tiempo de incubación estándar para cultivos en
matraz sacudido con la cepa AcR5b es de 23 horas.
\vskip1.000000\baselineskip
Se cultivó Arthrobacter aurescens AcR5b
en matraces sacudidos (véase ejemplo 11) empleando el medio básico,
en donde la concentración de
(R)-N-acetil-2-feniletilacetamina
se varió entre 0,5 y 4 g/l en etapas de 0,5 g/l. En la forma
descrita en el ejemplo 11, se midieron la O.D. 660, la actividad de
acilasa y el contenido en proteína de los extractos en bruto.
La cantidad máxima de
AcR5b-acilasa es producida en el medio sin
(R)-N-acetil-2-feniletilacetamina.
Por tanto, la enzima se expresa de forma constitutiva. Además, la
actividad específica de la acilasa disminuye con el incremento de
concentraciones de
(R)-N-acetil-2-feniletilacetamina
en el caldo de cultivo.
Se hacen crecer durante 23 horas cultivos en
matraz sacudido que contienen medio residuo sin
(R)-N-acetil-2-feniletilacetamina
variando el pH de 3,5 a 11 en etapas de 0,5 unidades de pH. Se
miden entonces (véase el ejemplo 11) el valor OD_{660} de los
cultivos así como las concentraciones de proteína y actividades de
acilasa de los extractos en bruto.
El crecimiento óptimo de Arthrobacter
aurescens AcR5b y el rendimiento máximo en acilasa (U/l de
caldo de cultivo) se obtienen ambos entre pH 5,5 y 9. No ocurre
crecimiento alguno por debajo de pH 4,5 y pH 10. Para el cultivo
adicional de la cepa AcR5b se elige pH 7.
Se efectúan cultivos en matraz sacudido
incluyendo la medición del valor O.C.660, de la actividad de acilasa
y del contenido en proteína de los extractos en bruto, con la cepa
AcR5b de acuerdo con el ejemplo 11 variando la temperatura entre 22
y 36ºC en etapas de 2ºC. Se emplea el medio básico sin
(R)-N-acetil-2-feniletilacetamina.
La cepa AcR5b muestra el crecimiento más rápido
entre 28 y 32ºC. No ocurre crecimiento a 36ºC. A 28ºC, se obtiene
el rendimiento máximo en enzima (U/l_{caldo \ de \ cultivo}).
En cultivos en matraz sacudido con la cepa
AcR5b, el medio básico sin
(R)-N-acetil-2-feniletilacetamina
se suplementa con diferentes nutrientes a una concentración de 5
g/l, respectivamente. Se determinan en la forma descrita en el
ejemplo 11 el valor O.D.660, la actividad de acilasa y el contenido
en proteína de los extractos en bruto.
Entre los mejores resultados respecto al
rendimiento total en enzima (U/l de caldo de cultivo) son aquellos
obtenidos con sorbitol y extracto de carne, los cuales se eligen
para el cultivo adicional de la cepa AcR5b.
\vskip1.000000\baselineskip
En cultivos en matraz sacudido con la cepa
AcR5b, la solución de minerales ML 1 sin sulfato amónico es
suplementada con sorbitol y extracto de carne en diferentes
proporciones, pero la concentración total de ambos nutrientes se
mantuvo constante en 7 g/l. En la forma descrita en el ejemplo 11 se
determina el valor OD660, la actividad de acilasa y el contenido en
proteína de los extractos en crudo.
El rendimiento óptimo de la
AcR5b-acilasa (375 U/L de caldo de cultivo) se
obtuvo en una relación de sorbitol a extracto de carne en 4:3.
La solución de minerales ML 1 sin sulfato
amónico es suplementada con sorbitol y una fuente compleja de
nitrógeno en una relación de concentración de 4:3 variando la
concentración total de ambos nutrientes (7, 14, 21, 28 42 g/l).
Como fuentes complejas de nitrógeno se utiliza extracto de carne,
peptona de caseína y extracto de levadura de calidad técnica. El
cultivo en matraz sacudido (véase ejemplo 11) se efectúa en matraces
Erlenmeyer de 1 litro conteniendo 200 ml de medio, que ha sido
inoculado con 3 ml de un precultivo. Después de 11, 20, 27, 35,
46,5 y 70 h de incubación se retiran muestras de 25 ml de los
matraces y se mide el valor OD660, la actividad de acilasa y el
contenido en proteína de los extractos en crudo.
El rendimiento máximo en
AcR5b-acilasa se obtuvo con peptona (tabla 8)
después de 70 horas de incubación.
La producción fermentativa de la
AcR5b-acilasa a escala de 20 l se efectúa en la
forma descrita en el ejemplo 3 con las siguientes
modificaciones:
\bullet La composición del medio de cultivo
consiste en peptona de caseína 12 g/l, sorbitol 16 g/l, agente
antiespumante SAG 471 1 ml/l, disuelto en la solución de sales
minerales ML 1 (ejemplo 1) sin solvato amónico, pH 7.
\bullet La velocidad del agitador se ajusta a
500-800 rpm, el punto establecido para la
concentración de oxígeno disuelto a 40% de saturación y la
velocidad de flujo del aire a 15 l/min (= 0,75 VVM).
\bullet El biorreactor es inoculado con 0,5
litros de precultivo crecido en porciones de 2 veces 250 ml en
matraces Erlenmeyer de 1 litro a 28ºC y 220 rpm durante 19
horas.
\bullet Las células son recogidas por
centrifugado continuo después de 33 horas de cultivo.
La actividad específica y también el rendimiento
total de acilasa aumentan todavía de manera importante en la fase
de crecimiento estacionario hasta 5,26 U/mg de proteína y 6.420 U/l
de caldo de cultivo, específicamente, a un valor OD660 de 25. La
masa celular húmeda se resuspende en tampón de fosfato potásico 69
mM, pH 7, a una concentración final de 40% en peso/volumen.
Se enfrían en un baño de hielo 100 ml de la
suspensión celular descongelada obtenida en el ejemplo 13 y se
somete a sonicación con un Sonicator W-385 (Heat
System Ultrasonics, Farmingdale, USA) empleando la cocina estándar
de 1/2'' bajo las siguientes condiciones: tiempo de ciclo 1 seg,
ciclo de trabajo 50%, control de salida 8 y tiempo de sonicación 25
min. Después de separar los restos celulares por centrifugado en una
centrífuga refrigerada a 13.400 g durante 20 min, el sobrenadante
se emplea como el extracto celular en bruto para la purificación
adicional.
El extracto en bruto obtenido en el ejemplo 14a)
se mezcla con una solución al 10% (peso/volumen) de polietilenimina
con un peso molecular de 30.000-40.000, pH 7, a una
concentración final del polímero de 0,3%. La solución se agita
durante 30 min a 0ºC y el precipitado se separa por centrifugado a
27.000 g y 4ºC durante 30 min.
Al sobrenadante del ejemplo 14b) se añade
sulfato amónico sólido a una concentración final de 30% de
saturación. La mezcla se agita suavemente a 0ºC y luego se
centrifuga a 4ºC y 27.000 g durante 30 min. Al sobrenadante se
añade más sulfato amónico a una concentración final de 70% de
saturación. La proteína precipitada que contiene la acilasa es
sedimentada por centrifugado (véase anteriormente) y disuelta en 40
ml de tampón de fosfato potásico 69 mM, pH 7.
Se disuelven 5,76 g de sulfato amónico en la
solución de proteína final del ejemplo 14c) para alcanzar una
concentración final de 25% de saturación. La HIC se efectúa de
acuerdo con el ejemplo 4c) con las únicas excepciones de que la
columna es equilibrada previamente con una solución al 25% de
sulfato amónico y el gradiente va desde 25 a 0% de saturación de
sulfato amónico.
Después de lavar la proteína no unida de la
columna con una solución al 25% de sulfato amónico, la
AcR5b-acilasa eluye entre 13 y 10% de sulfato
amónico. La enzima representa el único pico de proteína del
cromatograma entero. Las fracciones activas son reunidas,
desalificadas y concentradas en la forma descrita en el ejemplo
4c).
Una columna de 16 x 125 mm rellena con soporte
Macro Prep High-Q (Biorad, Glattbrugg, Switzerland)
es equilibrada con 250 ml de tampón de fosfato potásico 69 mM, pH
7. Después de cargar sobre el gel la mitad de la solución
concentrada de proteína obtenida en el ejemplo 14d), se aplica a la
columna un gradiente de 0 a 1 M de NaCl en tampón de fosfato
potásico 70 mM, pH 7, con un volumen de 125 ml. La velocidad de
flujo es de 1 ml/min, el tamaño de la fracción de 1,5 ml. La
concentración de proteína en el eluado se controla por vía de la
señal de un detector UV y se
miden la actividad de acilasa y el contenido en proteína de las fracciones activas en la forma descrita en el ejemplo 11.
miden la actividad de acilasa y el contenido en proteína de las fracciones activas en la forma descrita en el ejemplo 11.
La actividad de acilasa eluye entre 0,4 y 0,6 M
NaCl. El pico de actividad es idéntico al único pico del
cromatograma en el detector UV. Las fracciones activas son reunidas
y concentradas por ultrafiltración (véase ejemplo 4c) a una
concentración final de proteína de 2 mg/ml.
La tabla 10 resume la purificación de la
AcR5b-acilasa. Las fracciones de
AcR5b-acilasa obtenidas por cromatografía de
intercambio aniónico muestran todas ellas dos bandas por
electrofóresis en gel SDS-poliacrilamida
(SDS-PAGE, véase ejemplo 4c) y aparecen homogéneas
según PAGE natural, que también se realiza con un Phast System
usando Phast ges en gradiente del tipo 8-25
(conteniendo 8-25% de poliacrilamida) (Pharmacia
Co., Dübendorf, Switzerland). Los geles se tiñen con azul de
coomassie (véase ejemplo 4c). para la PAGE natural se emplea el
método estándar indicado por Pharmacia para Phast Gel como medio en
gradiente (Pharmacia Phast System separation technique file no.
120: "Native PAGE".
El peso molecular de la
AcR5b-acilasa natural es de 220.000\pm10.000
medido por cromatografía en gel según el ejemplo 5. En la
SDS-PAGE (véase ejemplo 5), la acilasa
desnaturalizada de Arthrobacter aurescens AcR5b muestra dos
bandas correspondientes a un peso molecular de 89.000\pm3.000 y
16.000\pm1.000. Estos resultados indican que la
AcR5b-acilasa es un tetrámero consistente en 2
subunidades grandes idénticas y 2 subunidades pequeñas idénticas
(estructura de la subunidad del tipo \alpha2\beta2).
\global\parskip0.900000\baselineskip
Se efectúan ensayos enzimáticos como los
descritos en el ejemplo 1 con
(R)-N-acetil-1-feniletilamina
en tampones que van desde pH 5,5 a pH 11,0 (pH 5,5, 6,0, 6,5, 7,0,
7,5, 8,0: tampón de fosfato potásico, 69 mM; pH 7,5, 8,0, 8,5, 9,0:
tampón de Tris-HCI, 100 mM; pH 8,5, 9,0, 9,5, 10,0,
10,5, 11,0: tampón de glicina-NaOH, 100 mM). El
tiempo de incubación es de 3 min usando el preparado de acilasa
final obtenido en el ejemplo 4d) como la fuente de enzima.
La actividad de acilasa muestra un intervalo
óptimo amplio de pH entre 7,5 y 9 con un máximo a pH 8.
Se mezclan 40 \mul de la solución de enzima
concentrada del ejemplo 4d) con 360 \mul de soluciones 1 y 10 mM
de los activadores/inhibidores potenciales en tampón 100 mM
Tris-HCl, pH 8 y se incuba a temperatura ambiente
durante 30 minutos. Estas soluciones de acilasa preincubadas se
emplean como la fuente de enzima para ensayos de actividad en
presencia del activador/inhibidor (véase ejemplo 8) en la
concentración usada para la preincubación. El tiempo de incubación
es de 12 min. Para la reactivación con EDTA, la acilasa se
preincuba primeramente con el catión metálico a una concentración de
1 mM (véase anteriormente). Después de añadir EDTA a una
concentración final de 10 mM en forma de una solución 110 mM en 100
mM Tris-HCl, pH 8, la acilasa se preincuba por
segunda vez durante 30 minutos antes de efectuar el ensayo de
actividad estándar.
Seis de los cationes metálicos bivalentes
inhiben la enzima de manera notable, pero en todos los casos la
actividad puede ser restaurada al menos parcialmente con EDTA. El
EDTA por sí solo y el FeCl_{3} acentúan la actividad de acilasa.
El ditiotreitol, la yodoacetamida y el fluoruro de
fenilmetilsulfonilo inhiben la enzima en un grado que va desde bajo
a moderado.
Muestras del preparado de acilasa final obtenido
en el ejemplo 14d) se diluyen 10 veces con tampón de fosfato
potásico 69 mM, pH 7, y se incuban durante 30 min a diferentes
temperaturas. Una muestra incubada en hielo sirve como la
referencia 100%. A continuación, se miden las actividades de acilasa
que permanecen en las muestras por vía de los ensayos de actividad
estándar (véase ejemplo 11).
\global\parskip1.000000\baselineskip
Entre 21 y 30ºC no se observa pérdida de
actividad de acilasa (véase tabla 12). Al mismo tiempo, a 50ºC,
todavía queda retenido un 60% de la actividad inicial después de 30
minutos de incubación, y a 56ºC la enzima se desactiva por
completo.
Cuando la acilasa diluida (véase anteriormente)
se incuba a 0-4ºC durante 16 y durante 135 días, las
actividades residuales relativas son todavía del 100 y 95% del
valor inicial. Después de una incubación a 23º y 30ºC durante 16
días, quedan retenidos el 86 y 65% de la actividad inicial.
El preparado de enzima final del ejemplo 4d) se
diluye 20 veces con los tampones indicados en el ejemplo 16 y se
incuba a temperatura ambiente (alrededor de 23ºC) durante una
semana. Se mide entonces la actividad que permanece en las muestras
como se ha descrito en el ejemplo 11. Un 100% de actividad
corresponde al valor obtenido inmediatamente obtenido
inmediatamente después de la dilución con el tampón de pH 7.
La enzima es bastante estable entre pH 7 y 9
(actividad residual 100%), pero más allá de estos límites la
estabilidad desciende de forma pronunciada.
El preparado de acilasa final obtenido en el
ejemplo 14d) se diluye 20 veces con tampón de fosfato potásico 69
mM (pH 7), con y sin agente crioprotectores (véase tabla 13). Las
soluciones de enzima se congelan a -20 y -80ºC. Después de 2,5
horas y 9 días, las muestras se descongelan y se mide la actividad
de acilasa residual en la forma descrita en el ejemplo 11.
Los datos ofrecidos en la tabla 13 demuestran
que la acilasa se desactiva por almacenamiento en estado congelado.
La estabilidad puede ser acentuada de modo notable por adición de
agentes crioprotectores.
Se efectúan ensayos de actividad bajo las
condiciones estándar ofrecidas en el ejemplo 11 con un tiempo de
incubación de 30 min y empleando concentraciones iniciales
diferentes de
(R)-N-acetil-1-feniletilamina
y de
N-acetil-(m-cianofenil)etilamina
racémica. Como fuente de enzima sirve el preparado de
AcR5b-acilasa final obtenido en el ejemplo 4d que
ha sido diluido 20 veces con tampón de fosfato potásico 69 mM, pH 7.
En la forma descrita en el ejemplo 9, se calculan las constantes de
Michaelis (Km) y las velocidades de reacción máximas.
Los valores Km para
(R)-N-acetil-1-feniletilamina
y para el (m-ciano)derivado racémico son de
5,7 y 10,4 mM y las velocidades de reacción máximas relativas son
de 100 y 23% respectivamente.
En general, se aplica el procedimiento indicado
en el ejemplo 1 con las siguientes modificaciones:
\bullet Se emplean 74 muestras de abono y agua
para inocular cultivos de enriquecimiento con pH 6, pH 7 y pH 9,
incubadas a 28ºC, y con pH 7, incubadas a 37ºC.
\bullet El medio para la primera propagación
contiene 0,5 g/l de acetato sódico como la única fuente de carbono,
el medio para la segunda y tercera propagación contiene 1 g/l de
2-acetilamino-1-fenil-4-penteno
racémico.
\bullet El cultivo de la cepa se efectúa en
los mismos valores de temperatura y pH utilizados en los
correspondientes cultivos de enriquecimiento.
\bullet Los organismos de los cultivos de
enriquecimiento se aíslan sobre Plate Count Agar (Fluka Co., Buchs,
Switzerland).
\bullet El medio para el crecimiento de las
cepas para los ensayos de actividad consiste en 1 g/l de
2-acetilamino-1-fenil-4-penteno
racémico, 1 g/l de extracto de levadura y 1 g/l de peptona en la
solución de sales minerales ML 1. El tiempo de incubación para los
cultivos en matraz sacudido es de 48-72 horas.
\bullet Con el fin de ensayar la actividad y
enantioselectividad de la actividad de acilasa, se efectúan ensayos
con 5,47 mM de (S) y
(R)-2-acetilamino-1-fenil-4-penteno,
respectivamente, como el sustrato, y 40 \mul de extracto celular
en bruto como fuente de enzima en un volumen total de 400 \mul.
Después de un tiempo de incubación adecuado, se mezclan 200 \mul
de acetona enfriada con hielo con 200 \mul del ensayo. Se añaden
600 \mul de tampón de fosfato potásico 69 mM, pH 7, y después del
centrifugado a 11.500 rpm se analiza la concentración de
2-amino-1-fenil-4-penteno
en el sobrenadante por HPLC (longitud de onda de detección 210
nm).
Se aíslan 18 organismos que hidrolizan
preferentemente un enantiómero de
2-acetilamino-1-fenil-4-penteno,
pero solo para una cepa, Rhodococcus globerulus K1/1 (= DSM
10337), se observó la escisión exclusiva del
(S)-enantiómero en los ensayos de la enzima.
Se hizo crecer la cepa K1/1 en cultivo en matraz
agitado empleando el medio del ejemplo 21, pero con 2 g/l de cada
uno de extracto de levadura y peptona, empleando como inductor
2-acilamino-1-fenil-4-penteno
racémico o alternativamente
N-acetil-1-feniletilamina
racémica, en concentraciones de 0, 4,92, 7,38 y 9,84 mM.
La medición de la actividad de acilasa y del
valor OD660 revela que la acilasa es solo formada por la cepa K1/1
en presencia de una sustancia inductora, que puede ser
2-acetilamino-1-fenil-4-penteno
racémico o bien
N-acetil-1-feniletilamina
racémica. Las concentraciones de
2-acetilamino-1-fenil-4-penteno
por encima de 4,92 mM son inhibidoras del crecimiento y de la
formación de enzima de la cepa K1/1. Sin embargo, la
N-acetil-1-feniletilamina
en concentraciones de 7,38 y 9,84 mM, no inhibe el crecimiento,
pero tampoco conduce a una mayor densidad celular ni a un mayor
rendimiento de acilasa (U/l_{caldo \ de \ cultivo}).
La cepa K1/1 se hace crecer en matraces
sacudidos (véase ejemplo 21a) en presencia de
2-acetilamino-1-fenil-4-penteno
racémico 4,92 mM variando el valor de pH de partida entre 4 y 9 en
etapas de 0,5 unidades de pH a 28ºC y variando la temperatura de
incubación entre 20 y 40ºC en etapas de 5ºC a pH 7. Después de 72
horas de incubación, se miden el valor OD660 y la actividad de
acilasa de los extractos en bruto.
La mejor producción de la acilasa de
Rhodococcus globerulus K1/1 se consigue a pH 6,5 y 30ºC (28
U/l_{caldo \ de \ cultivo}, 0,4 U/mg_{\text{proteína}} en el
extracto en bruto).
A 10 ml de una solución 20 mM de cada una de las
amidas racémicas mostradas a continuación en tampón de fosfato 0,1
M, pH 7,0, se añaden 5 ml (1,3 unidades) de la enzima y las
soluciones se sacuden a 100 rpm y 30ºC.
Cuando la conversión alcanza un 50%
aproximadamente (comprobado por HPLC), las soluciones se acidifican
a pH 2 añadiendo HCl 1 N y se extraen 3 veces con diclorometano
para obtener las amidas no convertidas. Las capas acuosas se
neutralizan con solución de 1 N NaOH y se extraen de nuevo 3 veces
con diclorometano para recuperar las aminas formadas. Ambas fases
orgánicas se secan con MgSO_{4}, se filtra y el disolvente se
separa por destilación. Las amidas se emplean directamente para
determinaciones de la pureza óptica (HPLC), mientras que las aminas
obtenidas se convierten a las acetamidas por adición de 100 \mul
de trietilamina y 100 \mul de anhídrido acético a cada muestra y
se analiza entonces la pureza óptica por HPLC "quiral". Los
resultados se resumen en la tabla 14.
Los experimentos se efectúan de la misma manera
que la descrita en el ejemplo 22. Se emplean 200 ml (1,1 unidades)
de enzima para cada sustrato indicado en la tabla 15.
A 50 ml de una solución 10 mM en tampón fosfato,
pH 7,0, de cada amida racémica indica en la tabla 6, se añaden
células enteras de Rhodococcus globerulus K1/1 (cada una de
ellas obtenida a partir de 50 ml de medio en matraz sacudido (véase
ejemplo 21), OD_{660}=2,0). La desacetilación se efectúa a 30ºC
bajo agitación continua (200 rpm). La reacción se controla por HPLC
y, una vez que la conversión es del 50% aproximadamente, las mezclas
de reacción se elaboran de la misma manera que la descrita en el
ejemplo 22. Los resultados se resumen en la tabla 16.
A 1 g (6,13 mmol) de
N-acetil-1-feniletilamina
racémica (+/-)-1a, parcialmente disuelta en 100 ml
de tampón de fosfato 0,1 M pH 7,0, se añaden 100 ml (25,3 unidades)
de acilasa de Arthrobacter aurescens Ac5R y la mezcla se
sacude (100 rpm) a 20ºC durante 27 horas. Después de la
acidificación (pH 2) por adición de HCl, la mezcla de reacción se
extrae tres veces con 100 ml de diclorometano. Las capas orgánicas
combinadas se secan (MgSO_{4}) y el disolvente se separa por
destilación después de la filtración, proporcionando 0,496 g (49,6%)
de
(S)-N-acetil-1-feniletilamina
(-)-1a ([\alpha]^{D}_{20} = -138,0ºC
(c = 1,0 EtOH), relación enantiomérica S/R = 96,8:3,2) como un
sólido blanco. La fase acuosa se neutraliza por adición de
NaHCO_{3} y se extrae de nuevo con diclorometano. La elaboración
usual conduce a 0,323 g (43,5%) de
(R)-1-feniletilamina
(+)-1a ([\alpha]^{D}_{20} = +29,4º C
(c = 2,2 EtOH), relación enantiomérica R/S = 99,7:0,3) como un
aceite incoloro.
Se vierten 100 ml de suspensión celular (40%
p/p) en un vaso de precipitados de vidrio de 600 ml y se coloca en
un cubo de hielo. El vaso de precipitados ha de permanecer en el
baño de hielo durante la sonicación. Se emplea una bocina estándar
de una pulgada bajo las siguientes condiciones:
Tiempo de ciclo: 1 seg.
Ciclo de trabajo: 50%
Control de salida: 8
Tiempo de sonicación total: 20 min (sin
interrupción)
Después de 20 min de sonicación (40 min
incluyendo la interrupción), la muestra se centrifuga durante 20 min
a 9.000 rpm en una centrífuga superspeed Sorvall RC5B refrigerada
(4ºC) empleando un rotor de aluminio Sorvall GS-3.
El sobrenadante es el extracto celular.
El ensayo estándar respecto a la actividad de
K1/1-acilasa usado para controlar la purificación y
para la caracterización enzimológica se efectúa mezclando 200 \mul
de una muestra de enzima con 380 \mul de una solución 5,55 mM de
(S)-2-acetilamino-1-fenil-4-penteno
en tampón de fosfato potásico 69 mM, pH 7, e incubando a 23ºC. La
dilución de la acilasa y el tiempo de incubación se eligen de
manera que no se forme más de 1,3 mM de producto. La reacción se
detiene por adición de 800 \mul de metanol enfriado con hielo.
Después de centrifugar durante 4 min a 11.500 rpm en una Biofuge 15
(Heraeus Sepatech, Osterode, Germany), el sobrenadante se somete a
análisis HPLC cuantitativo (véase ejemplo 1).
Se añaden 3,25 ml de una solución de PEI al 10%
(ajustada a pH 7,5 con 6 N HCl) a 105 ml de homogenado celular (de
la etapa de sonicación) hasta alcanzar una concentración de 0,3%. La
mezcla se mantiene en hielo durante 30 min y se agita suavemente.
Entonces se centrifuga la mezcla durante 20 min a 9.000 rpm a 4ºC.
El sobrenadante se utiliza entonces para la precipitación con
sulfato amónico.
Se añaden lentamente 18,81 g de
(NH_{4})_{2}SO_{4} cristalino a 90 ml de extracto en
bruto después de la precipitación de ácidos nucleicos para alcanzar
una concentración de 35% de saturación. La mezcla se mantiene en
hielo durante 30 minutos y se agita suavemente. La mezcla se
centrifuga luego durante 20 min a 9.000 rpm a 4ºC. El sobrenadante
se somete a cromatografía en un sistema FPLC (Pharmacia, Uppsala,
Sweden) para la purificación adicional.
Para purificar la acilasa se emplean dos tipos
de columna diferentes (interacción hidrófoba y filtración en gel)
acopladas al equipo FPLC.
Para la HIC se prepara una columna Merck
Fractogel TSK Butyl-650(S) (26 x 310 mm,
volumen: 165 ml) y se equilibra con solución saturada al 35% de
(NH_{4})_{2}SO_{4} (en tampón de fosfato pH 7,0).
Después de cargar la columna con 90 ml de sobrenadante procedente
de la precipitación con (NH_{4})_{2}SO_{4}, la columna
se lava con solución saturada al 35% de
(NH_{4})_{2}SO_{4} hasta que ya no se separa de la
columna por lavado más proteína. Se aplica entonces a la columna un
gradiente de (NH_{4})_{2}SO_{4} que va desde 35% a 0%
de saturación con un volumen total de 1.150 ml. El flujo se ajusta a
1,8 ml/min. Se recogen fracciones de 12 ml y se ensayan respecto a
la actividad de acilasa.
La acilasa eluye entre 11,5% y 7,5%
(NH_{4})_{2}SO_{4}. Las fracciones activas se reúnen
(140 ml).
La concentración y desalificación del conjunto
de fracciones HIC (140 ml) conteniendo la acilasa de Rhodococcus
globerulus K1/1 se efectúan en una cámara de ultrafiltración
CEC1 Amicon. Se utiliza una membrana YM30 (corte PM 30.000 Da). La
desalificación se consigue por diafiltración y adiciones repetidas
de tampón de fosfato potásico libre de
(NH_{4})_{2}SO_{4} (69 mM, pH 7,0) a la muestra
concentrada, seguido por una etapa de reconcentración. El conjunto
de fracciones HIC se concentra a 4,5 ml.
Se utiliza una columna de filtración en gel
Pharmacia Superose 12HR 10/30 (10 x 300 mm) como etapa de
purificación final. La elución se efectúa empleando tampón de
fosfato potásico (69 mM, pH 7,0) suplementado con 100 mM NaCl con
una velocidad de flujo de 0,3 ml/min. A la columna se aplican 200
\mul de la fracción de acilasa concentrada y desalificada
obtenida en la etapa de ultrafiltración. Se recogen fracciones de
0,5 ml y se analizan respecto a la presencia de acilasa.
\vskip1.000000\baselineskip
La acilasa de K1/1 es inhibida fuertemente solo
por 10 mM de Zn^{2+} y fluoruro de fenilmetilsulfonilo. La severa
inhibición por el último compuesto incluso a concentraciones muy
bajas indica un mecanismo de reacción de la enzima similar a la
serina proteasa.
27.2.1. El peso molecular de la acilasa es de
54,6 kDa según SDS-PAGE (véase ejemplo 4.c. y 5) y
92,3 kDa cuando se somete a filtración en gel (véase ejemplo 5)
sugiriendo ello una estructura homodímera de la acilasa
natural.
27.2.2. El punto isoeléctrico de la acilasa se
mide en la forma descrita en el ejemplo 6, siendo de
aproximadamente pH 4,0.
27.2.3. Para la determinación de la actividad y
estabilidad de la acilasa bajo condiciones variables de pH, se
emplean las siguientes condiciones tampón:
tampón de fosfato pH 5,5-pH
7,5
tampón de Tris pH 7,5-pH 9,0
tampón de glicina pH 9,0-pH
10,5
Para la determinación de la estabilidad al pH,
se incuban muestras de acilasa durante 2 hora a 23ºC en tampones de
diversos valores pH. Las muestras de enzimas se someten entonces a
ensayos de actividad estándar (véase ejemplo 26). La acilasa
muestra una estabilidad amplia óptima entre pH 5,5 y pH 7,5.
La actividad de la acilasa de K1/1 se mide en
ensayos de actividad estándar (véase ejemplo 26) bajo diversas
condiciones de pH. La acilasa presenta una actividad óptima entre
pH 6,0 y pH 7,5 con un descenso más pronunciado de actividad en el
lado ácido del valor óptimo.
Se incuban muestras de acilasa a diversas
temperaturas que oscilan entre 0ºC y 65ºC durante 30 min. Después
de enfriar en un baño de hielo, las muestras de acilasa se someten a
ensayos de actividad estándar (véase ejemplo 26).
La acilasa no muestra pérdida de actividad
cuando se incubó durante 30 min a una temperatura de hasta 50ºC. La
acilasa incubada a 55ºC pierde 40% de su actividad, mientras que la
acilasa incubada a mayores temperaturas (60ºC, 65ºC) resulta
totalmente inactivada en el plazo de 30 min de incubación.
Para la determinación de la secuencia de
aminoácidos N-terminales de la acilasa de K1/1 se
utiliza un Sistema de Secuenciación de proteínas
N-terminales G1005A llevando a cabo una química de
degradación Edman sobre muestras de proteína retenidas en columnas
bifásicas de adsorción en miniatura consistentes en una columna de
muestras en fase inversa apareada con una columna de fuerte
intercambio aniónico. Se efectúa un análisis de aminoácidos PHT
mediante un sistema HP1090 HPLC en línea (Hewlet Packard, Palo Alto,
CA, USA).
La secuencia de aminoácidos
N-terminales (50 residuos) se muestra en SEQ ID NO
1: SQSEIVWASASELAARV
RERSLTPVEIGDAMIEHIDAVNPsINAVVQFDR.
RERSLTPVEIGDAMIEHIDAVNPsINAVVQFDR.
La determinación de la secuencia
N-terminal se efectúa de la forma descrita en el
ejemplo 27.2.5.
La secuencia de aminoácidos
N-terminales (30 residuos) de la
Ac6-acilasa se muestra en SEQ ID NO 2:
MNTSDPG
WMSATEMAAQVASKSLSPNEIAE
WMSATEMAAQVASKSLSPNEIAE
La determinación de la secuencia
N-terminal se efectúa de forma descrita en el
ejemplo 27.2.5.
La secuencia de aminoácidos
N-terminales de la subunidad pequeña (16 kDa) se
muestra en SEQ ID NO 3: PITN
PA??RDHAE, la secuencia de aminoácidos N-terminales de la subunidad grande (89 kDa) se muestra en SEQ ID NO 4:TAIrlrGY?DTPSVAPGE (?: aminoácido desconocido, cápsulas pequeñas: aminoácido no determinado).
PA??RDHAE, la secuencia de aminoácidos N-terminales de la subunidad grande (89 kDa) se muestra en SEQ ID NO 4:TAIrlrGY?DTPSVAPGE (?: aminoácido desconocido, cápsulas pequeñas: aminoácido no determinado).
A 50 ml de una solución 10 mM de
2-acetilamino-1-fenil-4-penteno
racémico en tampón fosfato (pH 7,0), se añaden 7 ml de la acilasa
de K1/1 (0,456 U), que ha sido purificada por HIC y concentrada por
ultrafiltración (ejemplo 26.5 y 26.6). La desacilación se efectúa a
30ºC bajo agitación continua a 200 rpm. La reacción se controla por
HPLC (véase ejemplo 1) y, una vez que la conversión es del 50%
aproximadamente, la solución se acidifica a pH 2 con 1 N HCl y se
extrae tres veces con un volumen de diclorometano, para obtener las
amidas no convertidas. La fase acuosa se neutraliza con 1 N NaOH y
se neutraliza de nuevo tres veces con diclorometano para recuperar
las aminas formadas. Ambas fases orgánicas se secan con MgSO_{4},
se filtran y el disolvente se separa por destilación. Las amidas se
emplean directamente para determinaciones de la pureza óptica por
HPLC bajo las siguientes condiciones:
Columna Chiralcel OJ, hexano/isopropanol 9:1
como eluyente, velocidad de flujo 1 ml/min, detección a 208 nm. Las
aminas obtenidas se convierten a las acetamidas por adición de 100
ml de trietilamina y 100 ml de anhídrido acético a cada una de las
muestras antes de ser analizadas respecto a la pureza óptica por
HPLC.
A una conversión de 50,3% se obtiene
(S)-2-amino-1-fenil-4-penteno
con 87,4% ee,
(R)-N-2-acetilamino-1-fenil-4-penteno
con 98,8% ee correspondiente a un valor E de 74,9%.
La cepa K1/1 se hace crecer de acuerdo con el
ejemplo 3 en un fragmentador de 30 litros relleno con 20 litros de
medio básico conteniendo 1 g/l de
N-acetil-1-feniletilamina
racémica. Las células se recogen por centrifugado continuo y se
resuspenden en la mezcla de reacción, la cual se separa por adición
de una solución de 80 g de
2-acetilamino-1-(4-clorofenil)-4-penteno
racémico en 500 ml de metanol a 20 litros de tampón de fosfato
potásico, 69 mM, pH 7. Después de agitar durante 21 horas a 28ºC y
500 rpm, la amina formada y la amida sin reaccionar se separan y
analizan respecto a su pureza óptica de forma análoga al
procedimiento indicado en el ejemplo 30.
Se aíslan 31,1 g (rendimiento 94,5%) de
(S)-2-amino-1(4-clorofenil)-4-penteno
con >99,9% ee y 38,6 g (rendimiento al 97%) de
(R)-2-acetilamino-1(4-clorofenil)-4-penteno
con 98,5% ee.
Los siguientes microorganismos han sido
depositados de acuerdo con el Tratado de Budapest con el
DSM-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und
Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg 1b, D-38124
Braunschweig:
Rhodococcus globerulus K1/1, DSM 10337
(depositado el 23 septiembre, 1995)
Rhodococcus equi Ac6, DSM 10278
(depositado el 23 septiembre, 1995)
Arthrobacter aurescens AcR5b, DSM 10280
(depositado el 23 septiembre, 1995)
\global\parskip0.000000\baselineskip
(1) INFORMACIÓN GENERAL
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- SOLICITANTE
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: Novartis AG
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CALLE: Schartzwaldalle
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: Basilea
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: Suiza
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- CÓDIGO POSTAL (ZIP): 4002
\vskip0.500000\baselineskip
- (G)
- TELÉFONO: + 41 61 676 11 11
\vskip0.500000\baselineskip
- (H)
- TELEFAZ: + 41 61 676 79 76
\vskip0.500000\baselineskip
- (I)
- TELEX: 962 991
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Nuevo biocatalizador
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- NÚMERO DE SECUENCIAS: 4
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- FORMA LEIBLE POR ORDENADOR:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TIPO DE MEDIO: disco Floppy
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- ORDENADOR: IBM PC compatible
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- SOFTWARE: Patentln Release #1.0 versión #1.30 (EPO)
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:1:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 50 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CARACTERÍSTICA DE LAS HEBRAS: desconocida
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: péptido
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- POSICIÓN: 41
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: /producto = "el aminoácido es incierto"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:1:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 2:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 30 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CARACTERÍSTICA DE LAS HEBRAS: desconocida
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:2:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Met Asn Thr Ser Asp Pro Gly Trp Met Ser Ala
Thr Glu Met Ala Ala}
\sac{Gln Val Ala Ser Lys Ser Leu Ser Pro Asn
Glu Ile Ala Glu}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 3:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 13 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CARACTERÍSTICA DE LAS HEBRAS: desconocida
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:3:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Pro Ile Thr Asn Pro Ala Xaa Xaa Arg Asp His
Ala Glu}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 4:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 18 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CARACTERÍSTICA DE LAS HEBRAS: desconocida
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA; DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: sitio modificado
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- POSICIÓN: 4
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: /producto = "el aminoácido es incierto"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: sitio modificado
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- POSICIÓN: 6
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: /producto = "el aminoácido es incierto"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 4:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Thr Ala Ile Arg Ile Arg Gly Tyr Xaa Asp Thr
Pro Ser Val Ala Pro}
\sac{Gly Glu}
Claims (8)
1. Un biocatalizador obtenible a partir de una
Rhodococcus globerulus K1/1, con número de depósito DSM
10337, en donde el biocatalizador exhibe actividad enzimática de
amina acilasa sin actividad de lipasa o esterasa, cuyo
biocatalizador es capaz de hidrolizar de forma estereoselectiva una
acilamida racémica de fórmula (1)
en
donde
R^{2} es arilo o arilo
C_{1}-C_{4}; o R^{1} y R^{2} juntos forman
un anillo de 5 a 7 miembros sustituido por o condensado a
arilo;
R^{3} es un residuo acilo alifático; y
R^{1} y R^{3} juntos se eligen con el fin de
formar un compuesto de fórmula (1) que no es un derivado de un
aminoácido natural; en donde cada uno de los residuos puede estar
sustituido o insustituido, teniendo dicha amina acilasa un
aminoácido N-terminal SEQ ID NO.1.
2. Un biocatalizador según la reivindicación 1,
capaz de catalizar la reacción A
en donde en las fórmulas (1) a
(4)
R^{1} es hidrógeno, alquilo
C_{1}-C_{8}, alquenilo
C_{2}-C_{8}, alcoxi
C_{1}-C_{8},
alquil(C_{2}-C_{8})carboxi o
carboxi;
R^{2} es arilo o arilo
C_{1}-C_{4}; insustituido o sustituido por
alquilo C_{1}-C_{4}, alcoxi
C_{1}-C_{4}, hidroxialquilo
C_{1}-C_{4}, aminoalquilo
C_{1}-C_{4}, haloalcoxi
C_{1}-C_{4}, hidroxi, amino, halógeno, nitro,
sulfo o ciano;
o en donde R^{1} y R^{2} juntos forman un
anillo de 5 a 7 miembros sustituido por o condensado a arilo, en
donde los anillos pueden contener 1 o 2 heteroátomos seleccionados
entre nitrógeno, azufre y oxígeno; y
R^{3} es un residuo acilo alifático.
3. Un biocatalizador según la reivindicación 2
capaz de catalizar la reacción A, en donde R^{1} es hidrógeno,
alquilo C_{1}-C_{4}, alquenilo
C_{2}-C_{4}, alcoxi
C_{1}-C_{4} o
alquil(C_{2}-C_{4})carboxi.
4. Un biocatalizador según la reivindicación 2
capaz de catalizar la reacción A, en donde R^{3} es alquilo
C_{1}-C_{4}.
5. Un procedimiento que comprende la hidrólisis
de una N-acilamida acilamida racémica que tiene un
residuo ácido alifático y que no es un derivado de un aminoácido
natural, caracterizado porque se emplea un biocatalizador
según la reivindicación 1.
6. Un procedimiento según la reivindicación 5,
que incluye el siguiente esquema de reacción,
en donde en las fórmulas (1) a
(4)
R^{1} es hidrógeno, alquilo
C_{1}-C_{8}, alquenilo
C_{2}-C_{8}, alcoxi
C_{1}-C_{8},
alquil(C_{2}-C_{8})carboxi o
carboxi;
R^{2} es arilo o arilo
C_{1}-C_{4}; insustituido o sustituido por
alquilo C_{1}-C_{4}, alcoxi
C_{1}-C_{4}, hidroxialquilo
C_{1}-C_{4}, aminoalquilo
C_{1}-C_{4}, haloalcoxi
C_{1}-C_{4}, hidroxi, amino, halógeno, nitro,
sulfo o ciano;
o en donde R^{1} y R^{2} juntos forman un
anillo de 5 a 7 miembros sustituido por o condensado a arilo, en
donde los anillos pueden contener 1 o 2 heteroátomos seleccionados
entre nitrógeno, azufre y oxígeno; y
R^{3} es un residuo acilo alifático.
7. Un procedimiento según la reivindicación 6,
en donde R^{3} es alquilo C_{1}-C_{3} en el
caso de que el biocatalizador se derive de Rhodococcus
globerulus K1/1, DSM 10337.
8. Un procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 5 a 7, en donde el biocatalizador se emplea en
forma inmovilizada.
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