PT954571E

PT954571E - Biocatalisadores com actividade de aminoacilase

Info

Publication number: PT954571E
Application number: PT97920679T
Authority: PT
Inventors: Matthias Kittelmann; Ghisalba Dr Oreste; Kurt Laumen; Paula Walser-Volken
Original assignee: Novartis Ag; Novartis Pharma Gmbh
Priority date: 1996-04-25
Filing date: 1997-04-14
Publication date: 2007-12-07
Also published as: AU2697297A; EP1889903A1; DE69738080T2; CA2252616A1; JP3608798B2; WO1997041214A1; ATE371728T1; CA2252616C; ES2290965T3; ZA973550B; EP0954571B1; US6235516B1; EP0954571A1; DE69738080D1; JP2000509980A

Description

ΡΕ0954571 1 DESCRIÇÃO "BIOCATALISADORES COM ACTIVIDADE DE AMINOACILASE"

Existe uma procura elevada e continuada de produtos farmacêuticos e agroquímicos contendo agentes enan-tiomericamente puros, evitando os efeitos colaterais provenientes do enantiómero que é não efectivo do ponto de vista terapêutico. A invenção presente ajuda a colmatar esta procura ao proporcionar um novo enzima capaz de hidrolisar estereosselctivamente uma acilamida racémica.

Até à data apenas têm sido descritas na literatura reacções enzimáticas sobre aminas ou derivados de amina que sejam penicilinas, cefalosporinas, glucosaminas, aminoácidos, e os seus derivados. De entre os exemplos conhecidos neste domínio encontram-se a resolução do 2-aminobutanol racémico através da hidrólise de seus derivados N-acílicos por acilases de origem microbiana (Kokai Japonesa JP 58-198.296 e JP 59-39.294) e o enriquecimento enantiomérico de diversas aminas possuindo o grupo amino num átomo de carbono secundário, por um processo envolvendo a acção de transaminases de aminoácidos ómega (Stirling et al., Patente US No. 5.300.437). Na JP 06-253.875, é descrita a transferência estereoespecífica do grupo amino da L-alanina para a acetofenona na presença de, por exemplo, Acinetobacter sp. MBA-15 (FERM P13432) para a 2 ΡΕ0954571 produção de S-l-feniletilamina. A Patent3 US 5.360.724 descreve a produção de l-aril-2-aminopropano opticamente activos por transferência enantiosselectiva do grupo amino no racemato por intermédio de uma aminoácido transaminase do Bacillus megateríum. Na DE 4.332.738 descreve-se a produção de aminas primárias e secundárias opticamente activas; o processo utiliza a acilação enantiosselectiva de uma amina racémica com um éster activado como doador de acilo, na presença de uma hidrolase. Na EP-A-399589 descreve-se um processo para a preparação de N-acetil-1-metil—ómega-fenilalquilaminas predominantemente sob a forma dos seus enantiómeros R. Na JP 0 6.211.847 descreve-se a utilização de uma acilase para se obterem aminoácidos de tipo não natural. Hummel et al. (Applied Microbiol. Biotechnol. 27 (1987) 283-291 descrevem uma nova acilase que catalisa a desacetilação de ácido acetamidocinâmico (ACA) e existe em estirpes de Brevibacterium sp.

No entanto, invenção presente proporciona novos biocatalisadores para a hidrólise enantiosselectiva.

Objecto da invenção É um objecto da invenção proporcionar novos biocatalisadores para a hidrólise estereosselectiva de enantiómeros de uma acilamida racémica, ou os enzimas eles próprios.

Para além disto, é um objecto proporcionar um processo para a hidrólise estereosselectiva de acilamidas. ΡΕ0954571 3

Sumário da invenção A invenção diz respeito a um biocatalisador, isto é, um microorganismo vivo ou morto, ou um polipéptido, preferivelmente sob uma forma isolada, que exibe actividade enzimática como acilase sem possuir actividade como lipase nem como esterase. 0 biocatalisador é capaz de hidrolisar estereosselectivamente uma acilamida racémica que possua um resíduo acilico alifático e que não seja um derivado de um aminoácido natural. A invenção também diz portanto respeito a estirpes microbianas capazes de produzir um enzima da invenção. Estão incluídos tanto os microorganismos geneticamente modificados como os que ocorram na natureza.

As estirpes que ocorram na natureza e de acordo com a invenção são microorganismos que se podem obter por um processo de selecção que inclui inocular-: se um meio de selecção com uma amostra natural.

Outro aspecto da invenção é um processo para a hidrólise de uma N-acilamida racémica que possua um resíduo acilico alifático e que não seja um derivado de um aminoácido que ocorra na natureza, caracterizado por se utilizar um enzima de acordo com a invenção. 0 processo da invenção pode ser levado acabo com enzima livre ou imobilizado, que se pode utilizar sob uma 4 ΡΕ0954571 forma enriquecida ou purificada, bem como sob a forma de um extracto celular em bruto. Noutra concretização da invenção, utilize-se um microorganismo que expresse uma acilase da invenção para levar a reacção a cabo, isto é, o enzima encontra-se sob uma forma englobada numa célula.

Pode utilizar-se o processo da invenção para se separarem racematos, quando um dos estereoisómeros da acilamida racémica é especificamente hidrolisado. No entanto, se a hidrólise não for estereosselectiva (por exemplo, se a acilamida não for um racemato ou se o enzima hidro-lisar ambos os enantiómeros de uma determinada acilamida racémica), o processo da invenção também pode ser utilizado com outros objectivos, por exemplo na química dos grupos protectores.

Descrição pormenorizada da invenção A invenção diz respeito a um biocatalisador que possui actividade de aminoacilase sem exibir actividade de lipase nem de esterase, biocatalisador esse que é capaz de hidrolisar estereosselectivamente uma acilamida racémica com a fórmula (1)

...i R O

H 5 ΡΕ0954571 com ou fundido a arilo; R3 seja um resíduo de acilo alifático; e R1 e R3 sejam seleccionados em conjunto de modo a originarem um composto com a fórmula (1) que não seja um derivado de um aminoácido natural; em que cada um dos resíduos possa ser substituído ou não substituído.

Uma concretização preferida é um biocatalisador cujo substrato possa ser hidrolisado a uma amina primária. 0 biocatalisador de acordo com a invenção é preferivelmente seleccionado de entre o conjunto constituído por (a) um polipéptido com a actividade enzimática referida, e (b) um microorganismo vivo ou morto contendo um polipéptido com a actividade enzimática referida ou um extracto celular de um tal microorganismo. Um microorganismo morto, no contexto da invenção presente é, por exemplo, um microorganismo sob uma forma desintegrada do qual a parede celular e/ou a membrana celular foi mecânica ou quimicamente quebrada ou removida. A expressão sem actividade como lipase nem como esterase, no contexto da invenção presente, significa que não é detectável qualquer actividade enzimática pelo teste Api Zym (BioMérieux SA, Marcy-L'Etoile, França). Neste teste, testa-se a actividade de esterase C4 com butirato de 2-naftilo, a actividade de esterase C8 com caproato de 2-naftilo, e a actividade de lipase C14 com miristato de 2-naftilo. 6 ΡΕ0954571 A invenção diz respeito em especial a um enzima com actividade como aminoacilase e sem actividade como lipase nem como esterase, a mutantes, a variantes, e a fragmentos da acilase referida que exibam actividade como aminoacilase e na exibam actividade como lipase nem como esterase. Uma concretização preferida é um polipéptido, cujo substrato possa ser hidrolisado a uma amina primária. 0 polipéptido da invenção também é designado neste documento como "a acilase da invenção" ou ainda como "o enzima da invenção". Caso não se afirme expressamente algo em contrário, todos estes termos incluem não apenas a sequência autêntica de um polipéptido da invenção, e que é a concretização preferida da invenção, mas inclui também os mutantes, as variantes e os fragmentos desse péptido que exibam actividade enzimática como acilase, preferivelmente uma actividade estereosselectiva igual à do enzima natural. 0 polipéptido da invenção pode ser utilizado sob uma forma enriquecida ou, preferivelmente sob uma forma purificada.

Numa concretização preferida da invenção um polipéptido da invenção é em especial capaz de catalisar a seguinte reacção estereosselectiva (A): R* O i I [ «BiRoaeilase cínAr.----55—* t ij R* * ^ 0 ^ J3 0 tf 0 ♦ ê. Λ i H «mina S ácldto H enida E 0) m m {*) 7 ΡΕ0954571 em que a acilamida racémica com a fórmula (1) é estereosselectivamente hidrolisada com uma aminoacilase da invenção, que é um polipéptido com actividade enzimática como aminoacilase mas sem actividade como lipase nem como esterase, e que é capaz de hidrolisar estereosselectivamente a acilamida racémica com a fórmula (1), e em que a da hidrólise referida resulta a amina R (ou a S) com a fórmula (2), bem como o ácido com a fórmula (3) e a amida S (ou R) com a fórmula (4), em que nas fórmula (1) a (4) R1 seja hidrogénio, alquilo Ci-C8, alcenilo C2-C8, alcoxilo Ci-Cg, alquil C2-C8-carboxilo ou carboxilo; ele seja preferivelmente alquilo C1-C4, alcenilo C2-C4, alcoxilo C1-C4 ou alquil C2-C4-carboxilo, mais preferivelmente ele seja alquilo C1-C3, alcenilo C2-C3, alcoxilo C1-C3 ou alquil C2-C3-carboxilo; e de preferência ele seja seleccionado de entre o conjunto constituído por hidrogénio, metilo, etilo, n-propilo, isopropilo, prop-l-enil, prop-2-enilo, prop-2-ileno, e metoxilo R2 seja arilo ou arilo Ci-C4; substituídos ou não substituídos com alquilo C1-C4, alcoxilo C1-C4, hidroxialquilo C1-C4, aminoalquilo C1-C4, haloalquilo C1-C4, hidroxilo, amino, halogeno, nitro, sulfo ou ciano; ou em que R1 e R2 formem em conjunto um anel com 5 a 7 membros substituído com arilo, em que o anel possa ΡΕ0954571 conter um ou dois heteroátomos seleccionados de entre azoto, enxofre e oxigénio; de preferência indano, tetralina ou cromano, não substituídos ou substituídos com metoxilo, etoxilo, halogeno, metilo, etilo, nitro, ciano, amino, hidroxilo, trifluorometilo; R3 seja um resíduo acílico alifático; de preferência R3 seja alquilo C1-C4; e mais preferivelmente ele seja metilo.

Arilo seja por exemplo um homociclilo ou um heterociclilo. Um sistema anelar adequado é por exemplo um sistema anelar singelo ou duplo contendo entre 3 e 10 átomos anelares, que se encontre ligado através de um seu átomo de carbono ou através de um seu átomo de azoto e contenha até 4 heteroátomos seleccionados de entre oxigénio, azoto, enxofre e enxofre ligado a 1 ou 2 átomos de oxigénio; que pode adicionalmente também estar fundido a 1 ou 2 anéis fenílicos a ou 1 ou 2 grupos cicloalquilo, contendo preferivelmente o cicloalquilo entre 5 e 7 átomos no anel; e podendo ser insaturado ou parcial ou completamente saturado. São exemplos de arilo os grupos fenilo, naftilo, bifenililo, antrilo, fluorenilo, tienilo, furilo, pirro-lilo, imidazolilo, pirazolilo, oxazolilo, tiazolilo, tetra-zolilo, piridilo, pirazinilo, pirimidinilo, piridazinilo, indolilo, benzimidazolilo, quinolilo, isoquinolilo, 3,1-benzofuranilo, cromanilo, ciclo-hexa[b]pirrolilo, ciclo- 9 ΡΕ0954571 hexa[b]piridilo, [b]pirimidinilo, pirrolidinilo, pirroli-nilo, ciclo-hexa[b]pirazinilo, ciclo-hexa(b]pirimidinilo, imidazolidilo, piperidilo, piperazinilo, morfolinilo, tio-morfolinilo, S,S-dioxo-tiomorfolinilo, indolinilo, isoindo-linilo, 4,5,6,7-tetra-hidroindolilo, 1,2,3,4-tetra-hidro-quinolilo ou 1,2,3, 4-tetra-hidroisoquinolilo, por exemplo um dos últimos grupos mencionados, que seja não substituído ou substituído com um ou mais substituintes seleccionados de entre alquilo inferior, por exemplo metilo, fenilo, 1-naftilo ou 2 naftilo, fenil-alquilo inferior, por exemplo benzilo, hidroxi-alquilo inferior, por exemplo hidroxi-metilo ou 2-hidroxietilo, hidroxilo, alcoxilo inferior, por exemplo metoxilo ou etoxilo, amino, alquilamino inferior, por exemplo metilamino, etilamino ou terc-butilamino, di-alquil(inferior)amino, por exemplo dimetilamino ou dietil-amino, carboxilo, alcoxicarbonilo inferior, por exemplo metoxi-, etoxi-, isopropoxi-, sec-butoxi- ou terc-butoxi-carbonilo, fenil- ou naftil-alcoxil inferior-carbonilo, por exemplo benziloxicarbonilo, halogéneo, por exemplo flúor, cloro, bromo ou iodo, em especial cloro ou bromo, alcanoílo inferior, por exemplo acetilo ou pivaloílo, nitro, oxo e/ou com ciano.

Numa concretização preferida, o arilo será não substituído ou substituído com um ou mais substituintes seleccionados de entre metilo, hidroximetilo, 2-hidroxietilo, hidroxilo, metoxilo; etoxilo, amino, metil-amino, etil-amino, terc-butil-amino, dimetilamino, dietil-amino, carboxilo, metoxi-carbonilo, isopropoxi-carbonilo, sec- 10 ΡΕ0954571 butoxi-carbonilo, terc-butoxi-carbonilo, flúor, cloro, bromo, acetilo ou pivaloílo, nitro, oxo e/ou com ciano.

Numa concretização preferida da reacção A acima, hidrolisa-se uma acilamida racémica na qual R3 é alquilo C1-C3, mais preferivelmente alquilo Ci. Em especial, quando se utilizar uma acilase que se pode obter de Rhodococcus globerulus, R3 é de preferência alquilo C1-C3. O termo 'substituído' significa que a espécie em questão pode ser substituída com um a três substituintes idênticos ou diferentes, preferivelmente um ou dois substituintes idênticos ou diferentes, e de preferência com um substituinte seleccionado de entre o conjunto constituído por alquilo Ci-C8 (preferivelmente metilo), haloalquilo (preferivelmente trifluorometilo), halogéneo (preferivelmente flúor ou cloro), amino, nitro, e alcoxilo Ci-Cs (preferivelmente metoxilo).

De acordo com a invenção presente, arilo por si só ou como membro de uma espécie aralquilo é um grupo carbociclico no qual pelo menos um anel assume a forma de um anel aromático com seis membros (isto é, um anel benzénico). São preferidos os grupos fenilo, naftilo, tal como 1-naftilo ou 2-naftilo, bifenililo, tal como, em especial, 4-bifenililo, antrilo, e fluorenilo, e também sistemas anelares destes contendo um ou mais anéis saturados a eles fundidos. 11 ΡΕ0954571

Numa concretização preferida, aralquilo significa um grupo alifático substituído com uma espécie arilo, em que o grupo alifático seja um alquileno Ci-C8 ramificado ou não ramificado (preferivelmente um alquileno C1-C3, e de preferência seja metileno ou etileno) e a espécie arilo seja um grupo carboxílico tal como se definiu acima. Numa concretização mais preferida, aralquilo significa um grupo com a fórmula 10, 11 ou 12

em que R4 seja hidrogénio ou alquilo C1-C4; preferivelmente seja hidrogénio ou metilo; e de preferência seja hidrogénio; n seja um número inteiro seleccionado de entre 0, 1, 2, 3 e 4; preferivelmente n seja 0, 1, 2 e 3; mais preferivelmente n seja 0, 1 e 2; R5 e R6 sejam cada um deles independentemente do outro hidrogénio, alquilo C1-C4, haloalquilo C1-C4, halo-geno, amino, ciano, nitro ou alcoxilo Ci-C4; preferivelmente sejam hidrogénio, metilo, etilo, trifluorometilo, flúor, cloro, bromo, iodo, amino, nitro, ciano ou metoxilo; 12 ΡΕ0954571 mais preferivelmente sejam hidrogénio, metilo, flúor, cloro, ciano, nitro ou metoxilo. São outros compostos preferidos aqueles que correspondem às fórmulas 13, 14 e 15

em que n seja um número inteiro seleccionado de entre 0, 1 e 2; R5 e R6 sejam cada um deles independentemente hidrogénio ou ciano. São outros compostos preferidos aqueles que correspondem às fórmulas 16 e 17

em que X seja oxigénio, carbono ou azoto; preferivelmente será oxigénio e carbono; e 13 ΡΕ0954571 R5 e R6 sejam cada um deles independentemente hidrogénio, alquilo C1-C4, haloalquilo C1-C4, halogeno, ami-no, ciano, nitro ou alcoxilo C1-C4; sendo preferivelmente hidrogénio, metilo, etilo, iodo, bromo, trifluorometilo, cloro, fluoro, amino, ciano, nitro, metoxilo ou etoxilo.

Quando R1 e R2 formarem em conjunto um grupo ciclico heteroalifático, substituído ou não substituído, esse grupo será de preferência um composto com a fórmula (18)

São exemplos adicionais de compostos adequados:

ΡΕ0954571 14

15 ΡΕ0954571

Uma acilase da invenção pode ser obtida a partir de um microorganismo seleccionável por um processo que inclua inocular-se um meio de selecção com amostras naturais tais como solo, água, ou silagem de plantas, incluindo o meio de selecção referido uma acilamida como única fonte de carbono. Pode utilizar-se a acilamida como racemato ou, caso se pretenda fazer uma selecção prévia de uma acilase especifica para enantiómeros R, ou S, utilizar-se um enantiómero R ou S da acilamida. Nas concretizações preferidas do processo de selecção, utilizam-se para a selecção as acilamidas descritas acima no contexto da reacção de hidrólise.

Para além da finte de carbono, o meio de selecção também contém todos os ingredientes essenciais necessários para ser possível o crescimento de microorganismos, tais como sais minerais, fontes de azoto e elementos vestigiais.

Nas concretizações mais preferidas, o meio de selecção contém uma acilamida seleccionada de entre o conjunto constituído por N-acetil-l-feniletilamina sob a sua forma racémica ou a do seu enantiómero S ou R, e N-acetil-2-amino-l-fenil-4-penteno sob a sua forma racémica ou a do seu enantiómero S ou R. 16 ΡΕ0954571

Um meio de selecção adequado para levar a cabo a invenção inclui 3 g da acilamida e contém ainda 3 mL de solução de elementos vestigiais SL-6, e 1 L de solução de sais inorgânicos ML1 (pH 7,0), em que a composição da solução de sais inorgânicos MLl corresponde a 5 g de K2HP04, 0,2 g de MgS04x7H20, 20 mg de CaCl2, 20 mg de FeS04x7H20, 1,5 g de (nh4)2S04, e 1 L de água desionizada (pH 7,0); e a composição da solução de elementos vestigiais SL-6 é 20 mg de NiCl2x6H20, 200 mg de CoC12x6H20, 30 mg de MnCl2x4H20, 10 mg de CuC12x2h20, 300 mg de h3bo3, 30 mg de Na2Mo04x2H20, 100 mg de ZnS04x7H20, e 1 L de água desio-nizada. Esta receita, no entanto, pode evidentemente ser alterada desde que estejam presentes elementos vestigiais, sais minerais e fonte de azoto que sejam suficientes.

Uma acilase da invenção é preferivelmente passível de ser obtida a partir de um microorganismo selec-cionado de entre o conjunto constituído por Rhodococcus globerulus, mais preferivelmente de entre o conjunto constituído por Rhodococcus globerulus Kl/1, DSM 10337. O termo biocatalisador de acordo com a invenção presente também inclui microorganismos vivos ou mortos que exibam a actividade enzimática de uma acilase da invenção. A invenção também diz portanto respeito a um microorganismo que expresse uma acilase da invenção. Incluem-se tanto os microorganismos geneticamente modificados como aqueles que ocorrem na natureza. Enquanto os primeiros podem ser 17 ΡΕ0954571 produzidos quer por mutação quer por engenharia genética, isto é, pela transformação de um microorganismo tal como as bactérias, por exemplo a E. coli, ou uma levedura, por exemplo uma Hansenula ou uma Saccharomyces, com um gene que codifique para uma acilase da invenção, os últimos podem ser obtidos de fontes na natureza por um processo de selecção que inclui inocular-se um meio de selecção com amostras naturais, por exemplo solo, água, silagem de plantas.

Pode obter-se um gene que codifique para uma acilase da invenção, por exemplo, identificando pelo menos uma parte da sequência de uma acilase da invenção isolada, deduzindo as sequências de ADN que codificam para a sequência proteica parcial, preparando um oligonucleótido ou uma mistura de oligonucleótidos (levando em consideração a degenerescência do código genético), pesquisando numa biblioteca de NA proveniente da estirpe microbiana que expresse naturalmente a acilase pretendida, isolando o gene, e clonando-o num vector adequado para a transformação do microorganismo que se pretenda modificar geneticamente. Noutra via, pode determinar-se a sequência completa da acilase isolada e produzir-se por via sintética um ADN que codifique para a proteína. Também é muito facilmente possivel fazer um despiste numa biblioteca de ADN adequada, por exemplo de E. coli, quanto ao crescimento na presença da amida correspondente como única fonte de carbono, para se obter um clone transformado que expresse a acilase. 18 ΡΕ0954571

Pode obter-se um microorganismo que ocorra na natureza e possua actividade como acilase por um processo que se delineia adiante neste documento, e pode transformar-se por mutação de um modo conhecido por si próprio, por exemplo utilizando mutagéneos que são do conhecimento geral, tais como raios UV ou raios X, ou produtos químico mutagénicos, obtendo-se mutantes que são diferentes das espécies de origem por possuírem propriedades melhoradas, por exemplo menos necessidades quanto ao Maio nutricional, maiores velocidades de crescimento, e em especial, uma maior actividade como acilase. Mutantes desses também ocorrem espontaneamente. A identificação e o isolamento de mutantes desse tipo é levada a cabo também de uma maneira que é conhecida por si própria: avalia-se a actividade como acilase de colónias desses mutantes, por exemplo após desintegração das células, adicionando quantidades apropriadas de um substrato acilamídico adequado a porções ali-quotadas dos resíduos celulares, e determinando qualitativa ou quantitativamente os produtos reaccionais que são formados por meios cromatográficos, e em especial por HPLC. 0 isolamento de um microorganismo que expresse naturalmente uma acilase da invenção pode ser conseguido por um processo de selecção que inclua inocular-se um meio de selecção com amostras naturais tais como solo, água ou silagem d plantas, incluindo o meio de selecção referido uma acilamida como única fonte de carbono. Pode utilizar-se a acilamida sob a sua forma de racemato ou, caso se pretenda fazer uma selecção prévia de uma acilase 19 ΡΕ0954571 específica para enantiómeros R, ou S, utilizar-se um enantiómero R ou S da acilamida. Nas concretizações preferidas do processo de selecção, utilizam-se para a selecção as acilamidas descritas acima no contexto da reacção de hidrólise.

Para além da fonte de carbono, o meio de selecção também contém todos os ingredientes essenciais que são necessários para permitir o crescimento dos microorga-nismos, tais como sais inorgânicos, fontes de azoto e elementos vestigiais.

Nas concretizações mais preferidas, o meio de selecção inclui uma acilamida seleccionada de entre o conjunto constituído por N-acetil-l-feniletilamina sob a sua forma racémica ou sob a forma do seu enantiómero S, ou R, e 2-amino-l-fenil-4-penteno sob a sua forma racémica ou sob a forma do seu enantiómero S, ou R.

Um meio de selecção adequado para levar a cabo a invenção inclui 3 g da acilamida e contém ainda 3 mL de solução de elementos vestigiais SL-6, e 1 L de solução de sais inorgânicos MLl (pH 7,0), em que a composição da solução de sais inorgânicos MLl corresponde a 5 g de K2HP04, 0,2 g de MgS04x7H20, 20 mg de CcLC]_2/ 20 mg de FeS04x7H20, 1,5 g de (NH4)2S04, e 1 L de água desionizada (pH 7,0); e a composição da solução de elementos vestigiais SL-6 é 20 mg de NiCl2x6H20, 200 mg de CoC12x6H20, 30 mg de MnCl2x4H20, 10 mg de CuC12x2H20, 300 mg de H3B03, 30 mg de 20 ΡΕ0954571

Na2Mo04x2H20, 100 mg de ZnS04x7H20, e 1 L de água desionizada. Esta receita, no entanto, pode evidentemente ser alterada desde que estejam presentes elementos vesti-giais, sais minerais e fonte de azoto que sejam suficientes .

Selecciona-se um microorganismo preferido de entre o Rhodococcus globerulus, mais preferivelmente selecciona-se de entre o Rhodococcus globerulus Kl /1, DSM 10337.

Isola-se a acilase do microorganismo por métodos que são bem conhecidos na técnica, em particular pelos métodos descritos nos exemplos . É preferido um biocatalisador substancialmente purificado de acordo com a reivindicação 1, isolado a partir de um microorganismo tal como se definiu acima; contendo mais preferivelmente uma sequência de aminoácidos seleccionada de entre o conjunto constituído pelas SEQ ID Nos. 1, 2, 3 e 4.

Um aspecto importante da invenção diz respeito a um processo que inclui a hidrólise de uma N-acilamida racémica que possua um resíduo acílico alifático e que não seja um derivado de um aminoácido natural, caracterizado por se utilizar uma acilase da invenção. O processo inclui a reacção A ilustrada acima. Nas concretizações preferidas da invenção, os resíduos R1, R2, e R3 bem como a acilase, 21 ΡΕ0954571 têm os significados que lhes foram atribuídos acima. No caso de acilase do Rhodococcus globerulus Kl/1, DSM 10337, R1 também pode ser ureia.

Pode levar-se a cabo o processo da invenção (veja-se o processo A acima) com qualquer "biocatalisador" que tenha a actividade de um enzima da invenção. Um "biocatalisador" de acordo com a invenção é, por exemplo, um microorganismo que expresse uma acilase da invenção, por exemplo um microorganismo que ocorra na natureza, um mutante ou um recombinante como se definiu acima, um extracto celular de um tal microorganismo em bruto, um enzima de acordo com invenção, enriquecido ou purificado. O termo microorganismo inclui neste contexto o micro-organismo vivo ou o microorganismo morto, por exemplo sob uma forma desintegrada na qual a parede celular e/ou a membrana celular haja sido mecânica ou quimicamente quebrada ou removida.

Um "biocatalisador" para utilização no processo da invenção pode ser imobilizado. A imobilização do "biocatalisador" referido pode ser levada a cabo de forma análoga à dos processos que são conhecidos por si próprios, por exemplo acoplando-o a um suporte sólido ou inserindo-o num reactor de membranas enzimáticas.

Um microorganismo que expresse actividade enzimática como acilase pode ser quer um microorganismo de ocorrência natural opcionalmente transformado por mutação 22 ΡΕ0954571 tal como se descreveu acima, quer um microorganismo transformado por técnicas de engenharia genética que possua um gene que codifique para uma acilase da invenção para ser capaz de produzir a acilase pretendida. A hidrólise do substrato acilamida com o extracto de células microbianas é levada a cabo preferivelmente numa solução aquosa homogénea com um pH de entre 5 e 10.5, mais preferivelmente a um pH de entre 6 e 9,5. Para a estabilização do valor de pH, leva-se a cabo a reacção de uma maneira conhecida por si própria, numa solução tamponizada ou utilizando um potencióstato. A temperatura reaccional é de entre cerca de 10 e 65°C, mais preferivelmente de entre 20 e 50°C e de preferência a entre 20 e 30°C. O substrato de acilamida é utilizado preferivelmente a uma concentração de entre 1 mM e 1 M, mais preferivelmente de entre 10 mM e 100 mM. No entanto, se o substrato for menos solúvel, também é possivel utilizar-se uma suspensão de substrato.

Também são descritos os enzimas isolados a partir de Rhodococcus equi Ac6, DSM 10278, e de Arthrobacter aurescens AcR5b, DSM 10280, que diferem nos óptimos de pH e temperatura. Para o enzima de Rhodococcus equi Ac6, DSM 10278, a gama preferida de pH é de entre 5 e 10,5, mais preferivelmente entre 6 e 8, ainda mais preferivelmente entre 6,5 e 7,5, sendo preferida a gama de temperaturas de entre 10 e 65°C, mais preferivelmente de entre 20 e 37°C, e ainda mais preferivelmente de entre 25 e 30°C. Para o enzima de Arthrobacter aurescens AcR5b, DSM 10280, a gama preferida de pH é de entre 5,5 e 10,5, mais preferivelmente 23 ΡΕ0954571 entre 7 e 9,5, sendo preferida a gama de temperaturas de entre 10 e 65°C, mais preferivelmente de entre 45 e 50°C (quando se pretenda obter um máximo de actividade), ou de entre 20 e 30°C (quando se pretenda uma estabilidade máxima para o enzima). O processo de acordo com a invenção pode ser levado a cabo sob a forma de um processo descontínuo ou em continuo num reactor de membranas enzimáticas (EMR). No último caso, equipa-se de preferência o reactor de membranas enzimáticas com uma membrana de ultrafiltração com um limiar de separação inferior a cerca de 30.000, de modo a que os enzimas contidos na mistura reaccional sejam mantidos, enquanto os produtos com pequena massa molecular e os reagentes que não chegaram a reagir passem através da membrana e se possa isolar o produto do caudal de permeado. O reactor é preferivelmente esterilizado antes da sua utilização, de modo a que não seja necessária a adição de substâncias antibacterianas. Levam-se a cabo as reacções de uma maneira análoga à que se encontra descrita acima.

Pode também levar-se a cabo o processo de acordo com a invenção permitindo que a solução contendo a acilamida substrato, cujo pH foi ajustado a um valor apropriado, escorra através de um leito de um sólido dividido sobre o qual se imobilizou previamente a acilase contida no extracto microbiano em bruto (pode obter-se a preparação contendo o enzima imobilizado sobre a matriz, por exemplo, deixando o extracto microbiano em bruto 24 ΡΕ0954571 escorrer por sobre um leito de Sepharose, eupergite ou outro semelhante, activado com CNBr). 0 trabalho de separação das componentes da mistura reaccional e a purificação dos produtos e dos reagentes que não chegaram a reagir ou do enantiómero não hidrolisável de acordo com a invenção, são levados a cabo pelos processos habituais conhecidos do Estado da Técnica. Por exemplo, pode clarificar-se a mistura reaccional por filtração, ou de preferência por centrifugação, e depois pode separar-se o enzima por ultrafiltração (membrana com limite de separação < 30.000 Dalton) e o restante conjunto de produtos pode ser retirado por lavagem do retentado por diafiltração. Leva-se então a cabo a purificação propriamente dita, por exemplo, por métodos cromatográficos , por exemplo por cromatografia sobre gel (entre outros, com Sephadex G-25), por cromatografia de permuta iónica, por exemplo cromatografia de permuta aniónica, por croma-tografia em camada fina, por HPLC ou por outros métodos semelhantes. Leva-se a cabo uma extracção selectiva da amida, por exemplo preferivelmente a valores baixos de pH, e em seguida pode extrair-se a amina preferivelmente a valores de pH alcalinos.

Para se obter o extracto celular utilizado de acordo com o processo, cultiva-se um microorganismo que tenha actividade de acilase, em especial um dos que se mencionaram acima, num meio nutriente aquoso que contém carbono assimilável e fontes de azoto e também sais 25 ΡΕ0954571 inorgânicos, a um valor de pH de aproximadamente 6 a 9, preferivelmente de entre cerca de 6,5 e 7, e a uma temperatura de aproximadamente 28-40°C, em especial a entre cerca de 28 e 30°C, remove-se a biomassa e obtém-se o extracto celular. Selecciona-se o período de fermentação de modo a se conseguirem títulos óptimos no que toca à actividade de acilase.

Quando a densidade celular atinge um valor adequado, interrompe-se o cultivo. Separa-se o caldo de cultura por um processo já conhecido, por exemplo por centrifugação, e as células sedimentadas são lisadas por um dos processos habituais, por exemplo agitando com pequenas contas de vidro, por tratamento com ultrassons, ou utilizando uma prensa de tipo Francês. Separam-se as componentes insolúveis, bem como, quando houverem sido utilizadas, as contas de vidro, por exemplo por centrifugação, e utiliza-se o resíduo como fonte do enzima (extracto em bruto) . Este resíduo, na medida em que é um extracto em bruto contendo acilase, pode ser utilizado directamente no processo de acordo com a invenção. De forma vantajosa, no entanto, para se removerem os ácidos nucleicos (soluções viscosas!), trata-se o extracto em bruto com um agente policatiónico, por exemplo polietilenoimina, com uma poliamina tal como a espermidina, com sulfato de estreptomicina, ou com ribonuclease ou com sais de Mn2+, e removem-se por centrifugação os ácidos nucleicos precipitados. 26 ΡΕ0954571

Submete-se o extracto celular em bruto, de preferência, a uma ou mais operações de purificação para se removerem as componentes do extracto que possam interferir. 0 processo da invenção pode ser utilizado para separar racematos, quando um dos estereoisómeros da acilamida racémica for hidrolisado especificamente. No entanto, caso a hidrólise não seja estereosselectiva (por exemplo quando a acilamida não for um racemato ou quando o enzima hidrolisar ambos os enantiómeros de uma acilamida racémica bem determinada), o processo da invenção pode ser utilizado na quimica dos grupos protectores. Neste caso, o átomo de carbono ao qual R2 e R3 se ligam, nos substratos, não necessita de ser quiral. Neste caso, pode hidrolisar-se a totalidade do substrato. Num exemplo, R2 e R3 estão ligados covalentemente para formarem um anel benzénico; noutro exemplo, R2 e R3 estão ligados covalentemente para formarem um anel de ciclopentano fundido a benzeno. Em ambos os casos R1 é de preferência metilo.

Os exemplos que se seguem são ilustrativos, mas não devem, no entanto, ser interpretados de modo a limitarem a invenção presente.

Exemplos:

Exemplo 1: Isolamento de microorganismos com actividade de acilase face à (S)-1-feniletilamina

Suspendem-se 16 amostras de solo na solução de 27 ΡΕ0954571 sais inorgânicos MLl que se descreveu acima, a qual havia sido previamente esterilizada num autoclave a 120°C durante 20 minutos. Utilizam-se para inoculação de 4 mL de meio liquido (o meio de enriquecimento), 0,1 mL destas soluções e 12 amostras de água natural e de uma instalação de tratamento de efluentes. Em culturas de controlo conduzidas em paralelo com meio de enriquecimento, mas não contendo N-acetil-l-feniletilamina racémica, faz-se também uma inoculação. A composição da solução de sais inorgânicos MLl é: k2hpo4 5,0 g MgS04«7H20 0,2 g CcLC]_2 20 mg FeS04*7H20 20 mg (NH4)2S04 1,5 g Água desion. 1,0 L valor do pH 7,0 O meio de enriquecimento é constituído por:

N-acetil-l-feniletilamina racémica 3,0 g Solução de elementos vestigiais SL-6 3, 0 mL Solução de sais inorgânicos MLl 1,0 L pH A solução de elementos vestigiais SL-6 é constituída por: 28 ΡΕ0954571

NiCl2*6H20 20 mg CoC12*6H20 200 mg MnCl2*4H20 30 mg CuC12*2H20 10 mg H3BO3 300 mg Na2Mo04*2H20 30 mg ZnCl2*7H20 100 mg Água desionizada 1,0 L

Antes da inoculação encheram-se com meio tubos de ensaio de 16 mL, e esterilizaram-se durante 20 minutos a 121°C.

Incubaram-se os tubos numa posição inclinada, a 28°C, num agitador orbital, a 220 rpm. As culturas que apresentavam crescimento, manifestado por uma turvação, na presença de N-acetil-lfeniletilamina, mas não na sua ausência, são então inoculadas sobre 4 mL de meio de enriquecimento estéril e também sobre tubos de controlo, sem substrato (= segunda propagação).

Diluiram-se as culturas da quinta propagação, a 10“5 e a 10“6 com tampão de fosfato de potássio 69 mM, pH 7, e plaquearam-se sobre meio sólido constituído por meio de enriquecimento mais 20 g/L de agar, bem como sobre placas de controlo, isentas de N-acetil-l-feniletilamina. As colónias que são morfologicamente diferentes são semeadas 29 ΡΕ0954571 por esfregão - para isolamento das células e determinação da enantiosselectividade da utilização da N-acetil-1-feniletilamina - sobre placas de agar selectivas contendo meio de enriquecimento e 20 g/L de agar, nas quais a N-acetil-l-feniletilamina racémica é substituída por a) 3 g/L de (S)-N-acetil-l-feniletilamina ou b) (R)-N-acetil-1-feniletilamina. Incubam-se as placas durante entre 3 e 10 dias, a 28°"C. Cultivam-se as estirpes que apenas crescem quando o meio possui um dos enantiómeros da N-acetil-1-feniletilamina e que além disso parecem morfologicamente puras, durante - 48 h a 28°C num agitador a 220 rpm, em 25 mL de meio (frascos de 100 mL) com a seguinte composição (= meio básico com (R)~ ou com (S)-N-acetil-l-feniletilamina:

Enantiómero de N-acetil-l-feniletilamina do meio 3,0 g selectivo com agar que apresenta crescimento Extracto de levedura 2, 0 g Peptona 2, 0 g Solução de sais inorgânicos ML1 1,0 L Valor do pH 7,0

Utilizam-se 0,5 mL destas culturas de base para inocular as culturas principais, feitas com o mesmo meio e à mesma escala. Passadas 24 - 48 h de incubação a 220 rpm e 28°C, centrifugam-se os conteúdos dos frascos (15 minutos a 9000 x g) numa Superspeed Centifuge refrigerada (Dupont Co., Wilmington, Delaware, EUA), e suspendem-se as células que sedimentaram em 1 mL de tampão de fosfato de potássio 30 ΡΕ0954571 69 mM com pH 7,0. Misturam-se em tubos de Eppendorf, 0,6 mL destas suspensões com 1,2 g de contas em vidro (diâmetro de entre 0,1 e 0,25 mm, Cari Roth GmbH, Karlsruhe, Alemanha) e agita-se durante 10 minutos num moinho de bolas de vidro (Retsch Co., Haan, Alemanha) à velocidade máxima. Depois de se arrefecerem os frascos sobre um banho de gelo e de se centrifugar a 11.500 rpm num aparelho Biofuge 15 (Heraeus Sepatech, Osterode, Alemanha) para se removerem os fragmentos de células e as contas de vidro, utilizam-se os sobre-nadanntes (= extractos celulares em bruto) como fontes do enzima.

Preparam-se os testes da actividade como acilase em tubos de Eppendorf, como se segue: (S)-, ou (R)-N-acetil-l-feniletilamina 21 mM em tampão de fosfato de potássio 69 mM, pH 7 380 μΕ Extracto em bruto 20 μΐϋ

Depois de uma incubação a 30°C durante um periodo de tempo que permita a libertação de 0 a 3 mM de 1-feniletilamina adicionam-se-lhe 400 pL de acetona gelada para parar a reacção. Mistura-se vigorosamente o conteúdo do tubo, coloca-se sobre gelo durante cerca de 15 minutos e depois centrifuga-se durante 4 minutos a 11.500 rpm numa Biofuge 15 (Heraeus Sepatech, Osterode, Alemanha). Submete-se o sobrenadante a uma análise quantitativa por HPLC. Quando os testes de actividade contêm extractos celulares em bruto de células que foram cultivadas na presença de N- 31 ΡΕ0954571 acetil-l-feniletilamina, tem que se preparar um ensaio de controlo em paralelo, sem substrato, para de terminar o conteúdo em N-acetil-l-feniletilamina no extracto em bruto. Para a análise por HPLC os volumes de amostra de 20 pL são injectados sobre uma coluna RP-8 (LiChroCART 125-4, LiChrospher 100 RP-8(5mm), coluna de guarda: LiChroCART 4-4, LiChrospher 100 RP-8(5mm), Merck Co., Darmstadt,

Alemanha). Aplica-se o seguinte gradiente com um caudal de 1,25 mL/minuto, para a separação do substrato, N-acetil-1-feniletilamina, e do produto, feniletilamina:

Solvente A: tampão de fosfato de potássio, 3 mM, pH 3

Solvente B: 10 % em volume de solvente A e 90 % em volume de acetonitrilo

Tempo (minutos) Concentração de Concentração de solvente A (em solvente B (em volume) volume) 0 83 17 10 30 70 12 0 100 13 0 100 14 83 17 17 83 17

Detectam-se as substâncias no eluato medindo a absorvância no UV a 215 nm. 32 ΡΕ0954571

Calculam-se as concentrações do produto reac-cional, 1-feniletilamina, através das áreas de pico, utilizando uma curva de calibração entre 0 e 5 mM.

Define-se uma unidade (U) de actividade de aci-lase como sendo a quantidade de enzima que catalisa a libertação de 1 mol de 1-feniletilamina, por minuto. A concentração em acilase nas amostras é calculada de acordo com a formula sequinte: U/mL [μιαοί/ (mL x minuto) ] = concentração de 1-feniletilamina no frasco de HPLC [mM] / (período de incubação [minutos] x volume de amostra contendo acilase [20 μι] x volume final do teste [800 μΐι] x factor de diluição (diluição da preparação de acilase antes do teste).

Exprime-se a actividade especifica sob a forma de Unidades de actividade como acilase por mq de proteína na preparação enzimática, determinada pelo Teste BioRad para Proteína (Biorad Co., Glattbrugg, Suiça). Calcula-se a concentração da amostra em proteína utilizando uma curva de calibração com 0-1 mg/mL de albumina de soro bovino. Iso-laram-se 26 estirpes bacterianas possuindo actividade de aminoacilase face a (S)-N-acetil-l-feniletilamina. Não se obteve nenhuma estirpe contendo um enzima específico para o enantiómero (R) . A Tabela 1 ilustra as actividades específicas dos 4 melhores organismos. O Rhodococcus equi Ac6 (= DSM 10728) apresenta a maior actividade específica no 33 ΡΕ0954571 extracto em bruto e também o maior rendimento em enzima (45,2 U/L de caldo de cultura) e é portanto seleccionado como produtor de uma acilase de (S)-1-feniletilamina. Em quanto segue, refere-se a acilase da estirpe Ac6 como acilase Ac6. Nos exemplos dados adiante, o período de incubação padrão para culturas em frascos agitados contendo Ac6 é de 48 h.

Tabela 1: Produção de acilase de (S)-N-acetil-1-feniletilamina pelas 4 estirpes favoritas

Estirpe Actividade Rendimento em específica ΘΏΖΪΙΏ3. (U/Lmei0 de (U/ inCfproteína* ) cultura) Ac 6 0, 41 45,2 AC 18 0,28 36,1 Ac 12 0,36 28,3 Ac25B 0,066 13, 6 * ) U/fflCfproteína no extracto celular em bruto

Exemplo 2: Crescimento e indução da acilase de Rhodococcus equi Ac6 a) Variação do indutor e investigação da enantiosselectividade da reacção da acilase

Cultiva-se o R. equi Ac6 em meio basal contendo 3 34 ΡΕ0954571 g/L de (S)-N-acetil-l-fenietilamina ou 3 g/L de (R)-N-acetil-l-feniletilamina ou nenhuma N-acetil-l-feniletilamina, durante 91 h, pela técnica de cultura em frascos agitados descrita no Exemplo 1. Aplicando os métodos descritos no exemplo 1 preparam-se os extractos em bruto e submetem-se à medição da concentração em proteína e da actividade como acilase utilizando a (S)-N-acetil-l-feniletilamina e a (R)-N-acetil-l-feniletilamina como substratos .

Tabela 2: Indução da acilase de R. equi Ac6

Meio de D066 0 na Rendimento em Rendimento em crescimento altura da enzima com a enzima com a colheita (S)-amidaa) como (R)-amidab) como de células substrato da substrato da acilase [U/Lcaido âCilâSG [U/Lcaido de cultura] de cultura] BM 0, 46 0 0 BM + (S)- Csj LO !—1 38,2 <0, 4 amida BM + (R)- 0,19 0 0 amida BM: meio basal (vd. acima), a) (S)-N-acetil-l-feniletil- amina, b) (R)- N-acetil-l-feniletilamina

Os dados apresentados na tabela 2 mostram que a 35 ΡΕ0954571 (S)-N-acetil-l-feniletilamina tem que estar presente no meio de cultura para induzir a expressão da acilase. A (R)-N-acetil-l-feniletilamina não é eficaz como indutor da acilase da estirpe Ac6 e inibe o crescimento da bactéria. Para além disto, a acilase actua de forma fortemente (S)-enantioespecífica. b) Variação da concentração em (S)-N-acetil-1-feniletilamina

Inoculam-se células de R. equi Ac6 em três balões de Erlenmeyer de 1 L de capacidade, contendo cada um deles 100 mL de meio de base com 10 g/L de extracto de levedura e 10 g/L de extracto de carne como nutrientes adicionais. Cultivam-se as células (técnica de balão agitado, veja-se o exemplo 1) até que a D066o atinja cerca de 2.

Nessa altura reparte-se a cultura em oito porções de 25 mL cada uma, e adiciona-se (S) -N-acetil-l-f eniletilamina aos balões a agitar, em concentrações finais de O - 7 g/L, em passos de 1 g/L. Incubam-se além disso as células durante 25 h. Em seguida medem-se as concentrações proteicas e as actividades de acilase dos extractos em bruto, tal como se descreveu no exemplo 1.

Quando o meio contém mais do que 2 g/L de (S)-N-acetil-l-feniletilamina, afecta a produção de acilase de uma forma negativa. A (S)-N-acetil-l-feniletilamina inibe o 36 ΡΕ0954571 crescimento das células: o valor de DOêêo decresce com o aumento das concentrações de (S)-N-acetil-l-feniletilamina no meio.

Noutra experiência, adiciona-se (S)-N-acetil-l-feniletilamina ao meio de cultura a concentrações finais de entre 1 e 5 g/L, em passos de 1 g/1, directamente depois de da inoculação numa série de frascos para agitação (veja-se o exemplo 1), e passadas 72 h de crescimento, noutra. Utiliza-se meio de base sem suplemento de peptona mas suplementado com 20 g/L de extracto de carne e com 20 g/L de extracto de levedura. Passadas 96 h da inoculação, colhem-se as células por centrifugação e medem-se a concentração proteica bem como a actividade como acilase no extracto em bruto (veja-se o exemplo 1). A utilização de 3 g/L de (S)-N-acetil-l-fenil-etilamina permite obter o rendimento máximo em acilase (60 U/Lmeio de cultura) caso o indutor seja adicionado ao meio directamente após a inoculação, enquanto uma concentração de 2 g/L de (S) -N-acetil-l-feniletilamina leva à produção máxima de acilase (20 U/Lmei0 de cultura) caso o indutor apenas seja adicionado 72 h depois da inoculação. Iniciando a cultivação na presença de (S)-N-acetil-l-feniletilamina, o rendimento em acilase é três vezes superior ao da cultura em que o indutor só é adicionado após 72 h de crescimento. ΡΕ0954571 37 c) Variação do pH inicial

Fazem-se crescer culturas em frascos sob agitação, em meio basal contendo 3 g/L de (S)-N-acetil-1-feniletilamina e variando o pH de entre 2,5 e 9,5 em passo de 0,5 unidades de pH, durante 65 h. Em seguida mede-se a DO660 das culturas bem como as suas concentrações em proteína e as actividades de acilase nos extractos em bruto (veja-se o exemplo 1).

Obtém-se o crescimento óptimo da Rhodococcus equi Ac6 e o rendimento máximo em acilase, ambos a pH 5.5 e 7. A actividade específica de acilase, no entanto, é razoavelmente constante ao longo de uma gama alargada de pH 5,5 a pH 9,0. d) Variação dos nutrientes

Incubam-se durante 45 h e 111 h, respectivamente, frascos de cultura contendo meio basal sem peptona, com um conteúdo mínimo em extracto de levedura de 0,5 g/L, contendo 3 g/L de N-acetil-l-feniletilamina, e 2 g/L de um nutriente adicional. Depois de se determinarem os valores de D.Oeeo, separam-se as células, lisam-se, e determinam-se as concentrações de proteína e de actividade de acilase nos extractos em bruto (veja-se o exemplo 1). 38 ΡΕ0954571

Tabela 3: Crescimento e produção de acilase de Rhodococcus equi Ac6, com diversos nutrientes

Nutriente adicional Altura da colheita das células: D066 altui colh 45 h o na :a da eita 111 h Rendime acil U/L[m cultu 45 h nto em ase 0io de ra] 111 h Act 1Λ espec [um/m cult 45 h /Idade :if ica qmeio de ,ura ] 111 h Nenhum 0, 76 0,58 24,0 17, 8 0, 41 0, 44 D-Glucose 1,04 1,37 25,5 17, 0 0,34 0,24 D-Frutose 0,89 1,02 19,4 11, 6 0,28 0,20 D-Lactose 0,68 0,57 20,5 13,5 0,36 0,30 D-Sacarose 0,84 0, 73 21,4 14,2 0,35 0,28 Amilose 0,83 0, 76 24,0 19,0 0,34 0,27 Glicerol 0, 73 0,84 22, 4 14, 7 0,36 0,29 D-Manitol 0,69 0,54 20,9 15, 7 0,36 0,30 D-Sorbitol 0, 74 0,56 21,5 14,8 0,35 0,28 Acetato de sódio 1,30 1, 04 21, 4 16,8 0,16 0,15 Acetamida 1,95 1,65 24,4 19,4 0,12 0,12 L-Glutamato 1, 40 N) O co 32,1 28,2 0,31 0,27 Extracto de carne 0, 94 0,81 29,3 24,1 0,34 0,33 Peptona de caseina 0, 78 0,68 28,0 21,8 0,32 0,32 Extracto de levedura 1,13 1,14 34,2 28,6 0,33 0,31

Os rendimentos mais elevados em acilase tanto passadas 45 h como ao fim de 111 h de incubação, são obtidos com extracto de levedura (veja- -se a tabela 3) . A expressão da acilase é positivamente influenciada pela presença de L-glutamato e do complexo de nutrientes no meio, o que leva a rendimentos mais elevados em acilase (U/Lmeio), mas não a um aumento das actividades especificas. As culturas que crescem sem nutriente adicional evidenciam a actividade mais elevada de acilase, mas com um rendimento global no enzima que é baixo [U/Lcaid0 de cultura] e com uma pequena densidade celular (D.0.66o) · 39 ΡΕ0954571

Exemplo 3: Produção da acilase de Rhodococcus equi Ac6 por fermentação à escala de 20 L

Para a fermentação de Rhodococcus equi a escala de 20 L utilize-se um biorreactor de 30 L equipado com uma regulação automática do pH, da temperatura, e da concentração de oxigénio dissolvido (ρ02), bem como com um sistema anti espumas. O fermentador é carregado com 20 L de meio basal contendo 3 g/L de N-acetil-l-feniletilamina racémica e com 5 g/L de extracto de levedura. Depois de se tratar o meio num autoclave durante 30 minutos a 121°C, seguindo-se um arrefecimento até 28°C, inocula-se o biorreactor até uma d.O. 660 inicial de 0,05, com 1 L de cultura proveniente dos balões agitados, a qual cresceu anteriormente em 5 porções de 200 mL em balões de Erlenmeyer de 1 L durante 84 h a 28°C e a 220 rpm. As condições durante a fermentação são:

Temperatura 28 °C valor do pH 6,5 ajustado com HC1 2 N Arejamento 8 L/minuto = 0,375 WM p02 50 % da saturação, regulada pela velocidade do agitador Velocidade máxima do 750 rpm agitador Agente anti espumas SAG 471 40 ΡΕ0954571

Obtêm-se amostras de 25 mL de meio de cultura em diversas alturas. Medem-se os valores de D.0.66o do caldo de cultura bem como os conteúdos proteicos e as actividades de acilase dos extractos em bruto (veja-se o exemplo 1).

Atinge-se o rendimento máximo em enzima (U/Lmeio de cultura) ao fim de 30 h de incubação, e ele permanece constante pelo menos durante as 18 h seguintes. Passadas 48 h de cultivo, arrefece-se o caldo de fermentação até 15°C. Por centrifugação continua em fluxo, utilizando um rotor Sorvall TZ-28 numa Centrífuga refrigerada Sorvall RC5B Superspeed (Dupont Co., Wilmington, Delaware, EUA), recolhem-se 41 g de células (peso seco) contendo 680 U de acilase Ac6 com uma actividade específica de 0,19 U/mg de proteína no extracto em bruto. Voltam a suspender-se as células em 103 mL de tampão de fosfato de potássio 69 mM, pH 7, e armazena-se a -20°C.

Exemplo 4: Purificação da acilase de Rhodococcus equi Ac6 a) Preparação do extracto em bruto à escala preparativa

Descongelam-se 100 mL de suspensão de paredes celulares preparada tal como se descreveu no exemplo 3, e vertem-se sobre 150 mL de contas em vidro contidas num balão de vidro com 600 mL de capacidade (diâmetro de 0,1 -0,25 mm). Arrefece-se o balão num banho de gelo durante a lise das células com um misturador de mão profissional 41 ΡΕ0954571

Philips HR1385, que é operado 6 a 8 vezes durante 2 minutos de cada vez, com intervalos de 5 minutos. Depois da sedimentação das contas de vidro remove-se o sobrenadante e adiciona-se às contas de vidro 150 mL de tampão de fosfato de potássio 69 mM a pH 7,0. Após uma curta mistura e depois uma sedimentação, obtém-se um segundo sobrenadante. Misturam-se os dois sobrenadantes e centrifuga-se (20 minutos a 9.000 rpm) numa Centrífuga refrigerada Sorvall RC5B Superspeed, utilizando um rotor em alumínio Sorvall GS-3. Utiliza-se o sobrenadante da centrífuga como extracto celular em bruto para a purificação da acilase. Pode armazenar-se o extracto em bruto a -20°C durante pelo menos dois meses sem que se perca actividade, e uma descongelação e nova congelação intermediárias apenas provocam uma perda de actividade de 5 %. b) Precipitação com sulfato de amónio

Adiciona-se lentamente a 100 mL de extracto em bruto arrefecido em gelo (preparado de acordo com o exemplo 4 a)), sulfato de amónio cristalino, até uma concentração final de 25 % da saturação. Depois de se dissolver o sulfato de amónio sob uma agitação suave, mantém-se a solução em gelo durante cerca de 30 minutos e depois separa-se a proteína que precipitou por centrifugação durante 60 minutos a 9.000 rpm numa centrífuga refrigerada Du Pont RC5B Superspeed, utilizando um rotor em alumínio Sorvall GS-3. Adiciona-se mais sulfato de amónio ao sobrenadante, até uma concentração final de 85 %, e leva-se a cabo uma segunda precipitação de proteína tal como se 42 ΡΕ0954571 descreveu acima. Dissolve-se a proteína precipitada incluindo a acilase Ac6 em 150 mL de uma solução de sulfato de amónio (concentração de 30 % da saturação) em tampão de fosfato de potássio 69 mM, pH 7. c) Cromatoqrafia de interacção hidrofóbica (HIC) sobre Butil-Fractoqel

Para a HIC utiliza-se uma coluna Merck Fraktogel TSK Butyl-650(S), (26 x 310 mm), que se equilibra com uma solução a 30% da saturação, de (NH4)2S04 (em tampão fosfato 69 mM, pH 7,0). Depois de se carregar a coluna com 75 mL da solução final de proteína que se obteve depois da precipitação com sulfato de amónio que se descreveu no exemplo 4 b), lava-se a coluna com uma solução de sulfato de amónio saturada a 30% (em tampão fosfato 69 mM, pH 7,0) até que o sinal do detector de UV atinja de novo o valor da linha de base. Nessa altura aplica-se à coluna um gradiente decrescendo de 30% até 0% de sulfato de amónio, com um volume total de 825 ml e um caudal de 1,8 mL/minuto. A dimensão da fracção é de 12 mL. Mede-se a actividade de acilase Ac6 nas fracções (veja-se o exemplo 1). A acilase Ac6 elui da coluna a entre 8 e 4 % da saturação em sulfato de amónio. Juntam-se as 5 fracções mais activas e retira-se-lhes os sais por diafiltração, e concentra-se a um volume final de 23 mL num concentrador CEC em coluna equipado com uma membrana YM 30000 (Amicon Inc., Beverly, ma, EUA). Consegue-se a diafiltração adicionando repetidamente tampão de fosfato de potássio, 69 43 ΡΕ0954571 mM, pH 7, à solução concentrada de proteína, seguindo-se um passo de nova concentração. A Tabela 4 resume os resultados da purificação. A preparação de acilase Ac6 obtida por um único passo de cromatografia parece homogénea por electroforese sobre gel de poliacrilamida e SDS com um Sistema Phast, utilizando um gradiente Phast Gets do tipo 10-15 (contendo 10 a 15 % de poliacrilamida) (Pharmacia Co., Dijbendorf, Suíça) e com contrastação azul de Coomassie. Para a electroforese e para a contrastação utilizam-se os métodos padrão divulgados pela Pharmacia para meios gradientes sobre Phast Gel (ficheiro de técnica de separação Pharmacia Phast System no. 110: "SDS-PAGE", e ficheiro no. 200: "Fast Coomassie Blue Staining", Pharmacia, Uppsala, Suécia).

Tabela 4: Purificação da acilase Ac6

Passo de Purificação Acilase total (U) Recuperação (%) Actividade específica (U/mg de proteína) Factor de enriquecimento Quebra das células 502 100 0,19 1,0 Precipitação com sulfato de amónio 374 74 0,21 1,1 HIC+UF-diafiltração/ concentração 267 53 0, 76 4,0 HIC: Cromatografia de Interacção Hidrofóbica, UF: Ultrafiltração 44 ΡΕ0954571

Quando se utiliza um extracto em bruto com uma actividade especifica inferior, é necessário submeter a acilase a passos de purificação cromatográfica adicionais para se obter uma preparação enzimática homogénea, por exemplo por cromatografia de permuta de amino sobre Mono-Q ou uma filtração em gel de Superose 12HR (Pharmacia, Uppsala, Suécia) descrita no exemplo 5.

Exemplo 5: Determinação da massa molecular e da estrutura das subunidades da acilase Ac6

Utiliza-se uma coluna de filtração em gel Pharmacia Superose 12HR 10/30 (10 x 300 mm) para determinar a massa molecular da acilase Ac6 nativa. Leva-se a cabo a eluição utilizando tampão de fosfato de potássio 69 mM, pH 7,0, suplementado com NaCl 100 mM, com um caudal de 0,3 mL/minuto. Aplicam-se sobre a coluna 50 pL da acilase Ac6 purificada e concentrada que se obteve no exemplo 4c) . Determina-se a massa molecular do enzima nativo utilizando uma curva de calibração representando os valores de KAV das proteínas de calibração (veja-se a tabela 5) em relação ao logaritmo da massa molecular. Define-se o valor de KAv como se segue:

Kav (Veiuição—Vo ) / (Vcoiuna—Vq ) V0 = volume dos vazios = Veiuição do azul de

dextrana = 7,65 mL ΡΕ0954571 45

Vcoiuna = volume da coluna = 23,6 mL.

Mede-se uma massa molecular de 94.000 ± 3.000 (KAV = 0,33 ± 0,04) para a acilase Ac6 nativa.

Tabela 5: Proteínas de calibração para a determinação da massa molecular da acilase de Ac6 nativa por filtração em gel

Proteína Veluição [iílL] Kav Massa Molecular Azul de dextrana de Leuconostoc spp. *) 7, 65 0 ~2.000.000 Mioglobina de coração de cavalo 14, 8 0, 451 17.800 Inibidor de tripsina de sementes de soja 14,7 0, 440 20.100 Peroxidase de raiz forte 12,9 0,371 40.000 Albumina de soro bovino 12,2 0,330 67.000 Lactato desidrogenase de coração de bovino 12,1 0,285 140.000 Aldolase de músculo de coelho 12,1 0,281 161.000 *) utilizado para a determinação de V0

Para se determinar a estrutura das sub-unidades -46 - ΡΕ0954571 aplica-se electroforese sobre gel de SDS-poliacrilamida tal como se descreveu no exemplo 4c. Determina-se a massa molecular da acilase desnaturada utilizando uma curva de calibração que evidencie as distâncias de migração em função do logaritmo da massa molecular das proteínas utilizadas como marcadores num Estojo de Calibração Pharmacia para Pequenas Massa Moleculares. A massa molecular da acilase Ac6 desnaturada é de 50.000 ± 2.000. Este resultado, em comparação com a massa molecular determinada para o enzima nativo, indica que a acilase Ac-6 apresenta uma estrutura homodimérica.

Exemplo 6: Determinação do ponto isoeléctrico (IEP) A focagem isoeléctrica (IEF) é feita sobre geles do tipo Pharmacia Phast Gel IEF 3-9 (formando um gradiente entre pH 3 a pH 9) utilizando o Sistema Pharmacia Phast. Determina-se o valor de IEP do enzima em comparação com as proteínas do Estojo de Calibração Pharmacia para Pequenos pi (pH 2,5 - pH 6,5). Para a focagem isoeléctrica e para o procedimento de contrastação, utilizam-se os métodos padrão descritos pela Pharmacia para os meios Phast Gel IEF (ficheiro de técnica de separação Pharmacia Phast System no. 100: "IEF and titration curve analysis", e ficheiro no. 200: "Fast Coomassie Blue staining", Pharmacia, Uppsala, Suécia) . O valor de IEP da acilase Ac6 é de cerca de pH 3,5. 47 ΡΕ0954571

Exemplo 7: Dependência da velocidade reaccional da acilase Ac6 em relação ao valor de pH

Levam-se a cabo testes enzimáticos tais como os descritos no exemplo 1 em tampões com valores de pH de entre 5,71 e 9,88 (pH 5, 71, 6,09, 6,58, 7, 0, 7, 47: com tampão de fosfato de potássio, 69 mM; pH 7,48, 8,0, 8,4, 8,82, 9,10: tampão Tris-HCl, 100 mM; pH 9,38, 9,88: tampão glicina-NaOH, 100 mM) . O período de incubação é de 30 minutos e utiliza-se como fonte de enzima a preparação final de acilase que se obteve no exemplo 4c, diluída a 1/20. A acilase Ac6 evidencia um óptimo de actividade alargado a valores de pH de entre pH 6,0 e pH 8,5 com um máximo a entre pH 6,5 e pH 7,0.

Exemplo 8: Influências dos activadores e dos inibidores sobre a actividade da acilase Ac6

Levam-se a cabo determinações na presença de diversos activadores e inibidores potenciais, de acordo com o esquema que se apresentou no exemplo 1, aplicando as seguintes condições e concentrações finais:

Tris-HCl, pH 8 100 MM (S)-N-acetil-l-feniletilamina 20 mM Acilase purificada do exemplo 4c 0,02 U/mL Período de incubação 120 minutos 48 ΡΕ0954571

Tabela 6: Actividade da acilase Ac6 na presença de potenciais activadores e inibidores do enzima

Composto Actividade relativa ( %) Nenhum 100 1 mM 10 mM Catiões metálicos: VC13 89 (94) CoCl2 69 (83) MnCl2 87 (87) ZnCl2 68 (47) MgCl2 90 99 NiCl2 40 10 CcLC]_2 90 (83) CuCl2 88 41 PbCl2 95 (99) BaCl2 95 (99) CdCl2 85 (38) FeCl3 101 (92) Agentes quelantes: EDTA 102 104 Citrato 106 91 Agentes redutores de tiol: Ditiotreitol 103 100 Mercaptoetanol 104 108 Glutationa reduzida 106 102 Agentes bloqueadores do grupo tiol: Iodoacetamida 87 32 Inibidor de protease: Fluoreto de fenilmetilsufonilo 0 0 0,OlmM: 17 0,1 mM: 4,8 49 ΡΕ0954571 A apresentação das actividades relativas entre parêntesis indica a formação precipitados durante as avaliações enzimáticas.

Nenhum dos catiões metálicos testados, excepto o Ni2+ e até certo ponto o Zn2+ em concentração 1 mM afectam a actividade da acilase (veja-se a tabela 6). Em concentrações de 10 mM, os iões Zn2+, Ni2+, Cu2+ e Cd2+ evidenciam uma inibição considerável da acilase. Os agentes quelantes e os agentes redutores de tiol não afectam a actividade da acilase, enquanto a iodoacetamida 10 mM e o fluoreto de fenilmetilsulfonilo logo a partir de uma concentração de 0,01 mM são fortemente inibitórios. A forte inibição por parte do fluoreto de fenilsulfonilmetilo sugere um mecanismo reaccional de protease de serina, para a acilase Ac6.

Exemplo 9: Estabilidade da acilase Ac6 face à temperatura

Diluem-se a 1/45 com tampão 69 mM de fosfato de potássio a pH 7, amostras da preparação final de acilase que se obteve no exemplo 4 c, e incubam-se durante diversos períodos de tempo a várias temperaturas distintas. Em seguida levam-se a cabo as determinações normalizadas de actividade sobre cada uma destas amostras (veja-se o exemplo 1), a 30°C. 50 ΡΕ0954571

Tabela 6: Estabilidade da acilase Ac6 à temperatura

Tempo (minutos) Actividade Residual (%) 30 °C 37°C 39,5°C O o «st1 15 98 92 85 23 30 96 90 77 11 60 96 88 62 7,0 120 94 83 45 6,3 240 94 84 28 4,7 Como se pode ver na tabela 6 a acilase retém praticamente a totalidade da sua actividade inicial após 4 h de incubação a 30 °C e a 37°C, enquanto que a 39,5 O O (D 4^ a 44°C o enzima sofre desnaturação considerável. A 30°C ainda se determinam 94% da actividade inicial de acilase após 34 dias.

Exemplo 10: Dependência da velocidade reaccional da acilase relativamente à concentração em (S)-N-acetil-1-feniletilamina

Levam-se a cabo determinações de actividade nas condições padrão descritas no exemplo 1, com um período de incubação de 10 minutos a diferentes concentrações iniciais de (S)-N-acetil-l-fenitil-amina e com a preparação final de acilase Ac6 obtida no exemplo 4c, que se havia diluído a 51 ΡΕ0954571 1:5 com um tampão de fosfato de potássio 69 mM, a pH 7, como fonte de enzima. Calcula-se a constante de Michaelis, Km, a partir das concentrações em substrato, e as velocidades reaccionais correspondentes por regressão numérica não linear com o programa "SigmaPlot for Windows" (Jandel Scientific GmbH, Schimmelbusch, Alemanha) usando a fórmula: v = Vm x S/ (S +Km) . v: velocidade da reacção (U/mL = mM/minuto), Vm: velocidade reaccional máxima (U/mL), S = concentração em (S)-N-acetil-l-feniletilamina (mM). 0 valor de Km para a (S)-N-acetil-l-feniletilamina é de 0,6 mM ± 0,1 mM.

Exemplo 11: Isolamento dos microorganismos com actividade de acilase de (R)-N-acetil-l-feniletilamina

Em geral, o procedimento descrito no exemplo 1 é aplicado com as seguintes modificações : • investigam-se 43 amostras de solo e de água. • O meio liquido para as culturas de enriquecimento e para as placas selectivas de agar, sobre as quais se plaqueiam as culturas para se obterem colónia singelas, contêm 3 g/L de (R)-N-acetil-l-feniletilamina em vez de N-acetil-l-feniletilamina racémica, para além de 2 mL/L da seguinte solução de vitaminas: ΡΕ0954571 52

Biotina 5 mg Ácido Nicotínico 500 mg 4-Aminobenzoato 50 mg Pantotenato de cálcio 500 mg Tiamina1HCl 500 mg Vitamina Βχ2 0,5 mg Piridoxamina 500 mg Piridoxina1HCl 500 mg Riboflavina 250 mg Ácido fólico 15 mg Nicotinamida 250 mg Água desionizada 1 L • Suplementa-se o meio líquido para a primeira propagação com 0,5 g/L de acetato de sódio, e o da segunda propagação com 0,2 g/L, para facilitar o crescimento de microorganismos capazes de consumir ácido acético na fase inicial do enriquecimento. • Só se levam a cabo 3 propagações da cultura de enriquecimento. • O meio básico para se fazer o crescimento das células para os testes de actividade contém apenas 1 g/L de extracto de levedura, e peptona. 1 utiliza-se (R)-N-acetil-l-feniletilamina como 53 ΡΕ0954571 substrato, para os testes de actividade com a acilase Ac5RTb. • Só se conseguiram isolar três estirpes com actividade de acilase especifica (R) (veja-se a tabela 7) . a Arthrobacter aurescens AcR5b (= DSM 10280) é a que evidencia a maior actividade especifica e é seleccionada como produtora de acilase de {R) -N-l-feniletilamina, a que em seguida se faz referência como acilase AcR5b. Nos exemplos que se incluem adiante, o período de incubação padrão para culturas em frascos agitados com a estirpe AcR5b é de 23 h.

Tabela 7: Produção de actividade como acilase de (R)-N-acetil-l-feniletilamina por três estirpes com especificidade (R)

Período Rendimento Rendimento Actividade de em acilase em acilase específica incubação D. 0. com amida com amida com amida (dias) 660 (S) como (R) como (R) Estirpe substrato substrato (U/mgproteína do enzima do enzima no extracto em bruto) AcR5b 1 co o 00 0, 0 137 0.98 AcRlla 2 4,16 0, 0 152 0, 84 Ac30a 4 2,39 4,8 24 0,17 Amidas (S) e (R): (5)-, e (R)-N-acetil-l-feniletimanina 54 ΡΕ0954571

Exemplo 12: Crescimento e indução da acilase de Arthrobacter aurescens AcR5b a) Variação da concentração de (R)-N-acetil-1-feniletimanina

Cultivou-se Arthrobacter aurescens AcR5b em frascos agitados (veja-se o exemplo 11) utilizando o meio basal, no qual a concentração em (R)-N-acetil-1-feniletimanina foi variada entre 0,5 to 4 g/L em passos de 0,5 g/L. Medem-se a D.O. 660 j a actividade como acilase, e o conteúdo proteico dos extractos em bruto, tal como se descreveu no exemplo 11.

Obtém-se a quantidade máxima da acilase AcR5b-no meio que não contém (R) -N-acetil-l-feniletimanina. O enzima é portanto expresso constitutivamente. Para além disto, a actividade especifica da acilase diminui com concentrações crescentes de {R)-N-acetil-l-feniletimanina no caldo de cultura.

b) Variação do valor inicial de pH

Fazem-se crescer culturas em frascos agitados, sobre meio basal sem {R)-N-acetil-l-feniletimanina, e a valores de pH variando entre 3,5 e 11 em passos de 0,5 unidades de pH, durante 23 h. Em seguida mede-se a D066o das culturas bem como as concentrações proteicas e as actividades como acilase, dos extractos em bruto (veja-se o exemplo 11). 55 ΡΕ0954571

Obtém-se tanto o crescimento óptimo do Arthro-bacter aurescens AcR5b como o rendimento máximo em acilase (U/L de meio de cultura) a entre pH 5,5 e 9. Não ocorre nenhum crescimento a menos do que pH 4,5 e a mais do que pH 10. Selecciona-se pH 7 para continuar o cultivo da estirpe AcR5b. c) Variação da temperatura

Preparam-se culturas em frascos agitados incluindo a medição da D.O. 660 / da actividade como acilase, e do conteúdo proteico dos extractos em bruto a partir da estirpe AcR5b e de acordo com o exemplo 11, variando a temperatura entre 22 e 36°C em passos de 2°C. Utiliza-se o meio basal isento de (R)-N-acetil-l-feniletimanina. A estirpe AcR5b cresce mais rapidamente entre 28 e 32°C . Não ocorre crescimento nenhum a 36 °C. A 28°C obtém-se o rendimento máximo em enzima (U/Lcaido de cultura) · d) Variação dos nutrientes

Em frascos de cultura contendo a estirpe AcR5b suplementa-se o meio basal sem (R)-N-acetil-l-fenil-etimanina com diferentes nutrientes, a uma concentração de 5 g/L, respectivamente. Determina-se a D.O.660, a actividade como acilase, e o conteúdo proteico dos extractos em bruto, tal como se descreveu no exemplo 11. 56 ΡΕ0954571

De entre os melhores resultados no que toca ao rendimento total em enzima (U/L meio de cultura) encontram-se aqueles que se obtêm com sorbitol e com extracto de carne, que se escolhem para a cultivação ulterior da estirpe AcR5b.

Tabela 8: Crescimento e produção de acilase por Arthrobacter aurescens AcR5b, com diferentes nutrientes

Nutriente adicional D.0.660 Rendimento em acilase [U/Lmeio de cultura] Actividade específica [ U/ mpproteína ] Nenhum 1,50 134 1,12 Fontes de Carbono D-Frutose 3,97 169 1,11 D-Galactose 4, 64 173 1,19 D-Glucose 4,82 176 0,96 Monohidrato de D-Maltose 5,18 157 to 0 1 1 Extracto de malte 4,63 189 0, 87 Sacarose 6,08 156 0, 75 Amido (solúvel) 1,64 161 1,11 Glicerol 7,08 182 0, 79 D-Manitol 6,05 174 0,89 D-Sorbitol 5,9 217 1,00 Acetato de sódio 2,68 180 0, 70 Dihidrato de citrato trissódico 2, 77 153 0, 66 57 ΡΕ0954571 (continuação)

Nutriente D.0.660 Rendimento em Actividade adicional clCllclSG [U/Lmeio de especifica cultura] [ U / mgproteína] Fontes de azoto: Caldo AC (Difco) 4,23 190 1,17 Bacto-Soytone 4,31 190 0, 86 Aminoácidos Cas 3,75 160 1,32 Caseína 1, 21 hidrolisada 3,53 199 Casitone 4, 75 210 1, 05 **Corn Steep Liquor* 4, 48 197 1, 45 Proteína de peixe hidrolisada* 4,20 93 0, 52 Ácido L- glutâmico 4, 88 203 1, 04 L-Glutamina 4, 49 159 1,11 Extracto de carne 3,38 212 0, 87 Peptona de 4, 63 211 1, 05 caseina Peptona de soja 3,95 175 1,07 Peptona C (pureza técnica) Soja em pó, com 2, 75 136 1, 32 gordura 1, 02 6,5 0, 09 Extracto de levedura (Difco) 3, 94 157 0, 63 Extracto de levedura, pureza 3, 86 168 1, 01 técnica * não totalmente dissolvido, ** formação de agregados celulares 58 ΡΕ0954571 e) Variação da razão de concentrações entre as fontes de carbono e de azoto

Em frascos de cultura agitados contendo a estirpe AcR5b, suplementa-se a solução de sais inorgânicos MLl sem sulfato de amónio com sorbitol e com extracto de carne, em diversas razões diferentes, mas a concentração final de ambos os nutrientes foi mantida constante a 7 g/L. determinam-se a D.0.66o, a actividade como acilase, e o conteúdo proteico dos extractos em bruto, tal como se descreveu no exemplo 11. 0 rendimento óptimo em acilase AcR5b (375 U/L de caldo de cultura) foi obtida a uma razão de sorbitol para extracto de carne de 4:3. f) Variação da concentração total em nutrientes

Suplementa-se a solução de sais inorgânicos MLl que não contém sulfato de amónio, com sorbitol e com uma fonte complexa de azoto, à razão de concentrações de 4:3, variando a concentração total de ambos os nutrientes (7, 14, 21, 28, e 42 g/L), Utilizam-se extracto de carne, peptona de caseína, e extracto de levedura de pureza técnica como fontes complexas de azoto. A cultura em frascos para agitar (veja-se o exemplo 11) é levada a cabo em balões de Erlenmeyer de 1 L de capacidade contendo 200 mL de meio, que foram inoculadas 3 mL de uma cultura prévia. Passados 11, 20, 27, 35, 46,5, e 70 h de incubação, 59 ΡΕ0954571 retiram-se amostras de 25 mL dos frascos, e medem-se a D.0.660/ a actividade como acilase, e o conteúdo proteico dos extractos em bruto.

Obteve-se o máximo do rendimento em acilase AcR5b utilizando peptona (tabela 8), ao fim de 70 h de incubação.

Tabela 9: Crescimento de Arthrobacter aurescens AcR5b e sua produção de acilase, com diferentes fontes complexas de azoto, passadas 70 h de incubação ao valor de concentração total de nutrientes de que resulta um rendimento máximo em enzima.

Fonte de azoto Concentração total em nutriente (g/L) D.0.660 Rendimento em acilase [U/Lmeio de cultura ] Actividade especifica [ U/mgproteina ] Peptona de caseina 28 o co \—1 1470 4,5 Extracto de carne 21 9,7 1070 4,2 Extracto de levedura 21 CM CO 950 3,5

Exemplo 13: Produção da acilase de Arthrobacter aurescens AcR5b por fermentação a uma escala de 20 L

Leva-se a cabo a produção fermentativa da acilase AcR5b a uma escala de 20 L tal como se descreveu no exemplo 3, mas com as seguintes modificações: 60 ΡΕ0954571 • A composição do meio de cultura é peptona de caseina a 12 g/L, sorbitol a 16 g/L, agente anti espuma SAG 471 a 1 mL/L, dissolvidos na solução de sais minerais MLl (exemplo 1), sem sulfato de amónio, pH 7. • A velocidade do agitador é ajustada a entre 500 e 800 rpm, ponto no qual a concentração do oxigénio dissolvido é de 40 % da saturação, e o caudal de ar '+e ajustado a 15 L/minuto (= 0,75 WM) . • Inocula-se o biorreactor com 0,5 L de uma cultura prévia que se cultivou em porções de 2 vezes 250 mL e balões de Erlenmeyer de 1 L, a 28°C e a 220 rpm durante 19 h. • Colhem-se as células por centrifugação em continuo após 33 h de cultivo. A actividade especifica e também o rendimento total em acilase ainda aumentam significativamente na fase de crescimento estacionário, até 5,26 U/mgproteína e 6420 U/Lmeio de cultura, respectivâmente, a um valor de D.O.660 de 25. Volta-se a suspender a massa de células em húmido, em tampão de fosfato de potássio 69 mM, com pH 7, até uma concentração final de 40 % em peso por volume. 61 ΡΕ0954571

Exemplo 14: Purificação da acilase de Arthro-bacter aurescens AcR5b a) Preparação do extracto celular em bruto à escala preparativa

Arrefecem-se num banho de gelo 100 mL da suspensão de células obtida no exemplo 13 e que se descongelou, e sonicou-se com um equipamento Sonicator W-385 (Heat System Ultrasonics, Farmingdale, EUA) utilizando o dispositivo de transmissão padrão de 1/2", nas seguintes condições: Periodo de cada ciclo 1 segundo, ciclo em carga 50 %, controlo da saida regulado a 8, e periodo total de sonicação de 25 min. Depois de se retirarem os pedaços de células por centrifugação numa centrífuga refrigerada a 13.400 g e durante 20 minutos, utiliza-se o sobrenadante como um extracto celular em bruto para uma purificação adicional. b) Precipitação de ácidos nucleicos com polietilenoimina

Mistura-se o extracto em bruto obtido no exemplo 14 a) com uma solução a 10 % (peso / volume) de polietilenoimina com uma massa molecular de 30000 - 40000, pH 7, de modo a obter uma concentração final do polímero de 0,3 %. Agita-se a solução durante 30 minutos a 0°C e separa-se o precipitado por centrifugação a 27.000 g e a 4°C ,durante 30 minutos. 62 ΡΕ0954571 c) Precipitação com sulfato de amónio

Adiciona-se ao sobrenadante do exemplo 14 b) sulfato de amónio sólido, até se obter uma concentração final de 30 % da saturação. Agita-se a mistura cuidadosamente a 0°C e depois centrifuga-se a 4°C e a 27.000 g durante 30 minutos. Adiciona-se mais sulfato de amónio ao sobrenadante, de modo a obter uma concentração final de 70 % da saturação. Sedimenta-se a proteína precipitada contendo a acilase por centrifugação (veja-se acima) e dissolve-se em 40 mL de tampão de fosfato de potássio 69 mM, pH 7. d) HIC sobre Butil-Fractogel

Dissolvem-se 5,76 g de sulfato de amónio na solução proteica final do exemplo 14 c, para se obter uma concentração final de 25 % da saturação. Leva-se a cabo a HIC de acordo com o exemplo 4 c) , com as únicas excepções de que a coluna é previamente equilibrada com uma solução de sulfato de amónio a 25 %, e de que o gradiente vai desde 25 % a 0 % da saturação em sulfato de amónio.

Depois de se retirar a proteína não ligada da coluna lavando-a com uma solução de sulfato de amónio a 25 %, a acilase AcR5b elui a entre 13 e 10 % de sulfato de amónio. O enzima representa o único pico de proteína do cromatograma todo. Juntam-se as fracções activas, dessalga-se e concentra-se tal como se descreveu no exemplo 4 c). 63 ΡΕ0954571

e) Cromatografia de permuta iónica sobre Macro Prep Hiqh-Q

Equilibra-se uma coluna de 16 x 125 mm com enchimento de suporte Macro Prep High-Q (Biorad, Glattbrugg, Suiça), com 250 mL de tampão de fosfato de potássio 69 mM a pH 7. Depois de se carregar sobre o gel metade da solução concentrada de proteína obtida no exemplo 14 d) utilizou-se um gradiente de entre 0 e 1 M de NaCl em tampão de fosfato de potássio 70 mM, pH 7, O caudal é de 1 mL/minuto, a fracção é de dimensão de 1,5 mL. Monitoriza-se a concentração proteica no eluato através do sinal no detector de UV e mede-se a actividade da acilase e o contudo em proteína nas fracções activas tal como se descreveu para o exemplo 11. A actividade como acilase elui a entre 0,4 e 0,6 M em NaCl. O pico de actividade é idêntico ao único pico do cromatograma que é detectado no detector de UV. Juntam-se as fracções activas e concentra-se por ultrafiltração (veja-se o exemplo 4 c) até uma concentração final de 2 mg/mL.

A Tabela 10 resume os dados acerca da purificação da acilase AcR5b. As fracções de acilase AcR5b obtidas por cromatografia de permuta aniónica evidenciam todas elas duas bandas na electroforese sobre gel de SDS -64- ΡΕ0954571 poliacrilamida (SDS-PAGE, veja-se o exemplo 4 c), e aparentam ser homogéneas por page nativo, que também se leva a cabo com um Sistema Phast utilizando Geles Phast do tipo 8-25 (contendo 8 a 25 % de poliacrilamida) (Pharmacia Co., Dijbendorf, Suíça). Contrastam-se os geles com azul de Coomassie (veja-se o exemplo 4 c). Para o PAGE nativo, utilize-se o método padrão divulgado pela Pharmacia para meios gradientes para Geles Phast (ficheiro da técnica do Sistema Pharmacia Phast no. 120: "Native PAGE".

Tabela 10: Purificação da acilase AcR5b

Passo de purificação Acilase total (U) Recuperação Actividade (%) específica (U/mg) Factor de enriquecimento Lise das células 5593 100 1,9 1,0 Precipitação com polietilenoimina 5282 94 3, 0 1,6 Precipitação com sulfato de amónio 4408 79 2, 8 1,5 HIC + UF-diafiltração/ concentração 4186 75 8,2 4,3 Cromatografia de permuta aniónica 3725 67 10,0 5,2 65 ΡΕ0954571

Exemplo 15: Determinação da massa molecular e da estrutura das sub unidades

Mede-se a massa molecular da acilase AcR5b nativa como sendo 220.000110.000, por cromatografia sobre gel, de acordo com o exemplo 5. No SDS-PAGE (veja-se o exemplo 5) a acilase desnaturada do Arthrobacter aurescens AcR5b evidencia duas bandas correspondo a massas moleculares de 89.000±3.000 e 16.000±1.000. Estes resultados indicam que a acilase AcR5b é um tetrâmero constituído por 2 sub unidades idênticas e grandes e duas sub unidades idênticas e pequenas (estrutura em sub unidades do tipoci2P2) .

Exemplo 16: Dependência do valor de pH para a velocidade reaccional da acilase AcR5b

Levam-se a cabo testes enzimáticos descritos no exemplo 1 com {R)-N-acetil-l-feniletilamina em tampões com um valor de pH na gama de entre 5,5 e 11,0 (pH 5,5, 6,0,

6.5, 7,0, 7,5, 8,0: tampão de fosfato de potássio 69 mM; pH 7.5, 8,0, 8,5, 9,0: tampão de Tris-HCl 100 mM; pH 8,5, 9,0, 9.5, 10,0, 10,5, 11,0: tampão de glicina-NaOH, 100 mM) . O período de incubação é de 3 minutos, utilizando a preparação final de acilase obtida no exemplo 4 d como fonte de enzima. A actividade de acilase evidencia um óptimo de pH largo entre pH 7,5 e 9, com um máximo a pH 8. 66 ΡΕ0954571

Exemplo 17: Influência dos activadores e dos inibidores sobre a actividade da acilase AcR5b

Mistura-se 40 μΕ da solução concentrada de enzima do exemplo 4 d) com 360 μΕ de soluções 1 e 10 mM dos activadores/inibidores potenciais em Tris-HCl 100 mM, pH 8, e incuba-se à temperatura ambiente durante 30 minutos. Utilizam-se estas soluções de acilase previamente incubadas como fontes do enzima para as determinações de actividade na presença do activador / inibidor (veja-se o exemplo 8), na concentração utilizada na incubação prévia . O periodo de incubação foi de 12 minutos. Para reactivar o EDTA incuba-se previamente a acilase com o catião metálico a uma concentração de 1 mM (veja-se acima). Depois de se adicionar o EDTA a uma concentração final de 10 mM sob a forma de uma solução 110 mM em Tris-HCl 100 mM, pH 8, incubando-se previamente a acilase por uma segunda vez durante 30 minutos, antes de se levar a cabo a determinação padrão da actividade.

Dos catiões metálicos divalentes, 6 inibem o enzima de uma forma notável, ma sem todos os casos pode restaurar-se pelo menos parcialmente a actividade com EDTA. O EDTA apor si só e o FeCl3 aumentam a actividade da acilase. O ditiotreitol, a iodoacetamida, e o fluoreto de fenilmetilsulfonilo inibem o enzima a um grau pequeno a moderado. 67 ΡΕ0954571

Tabela 11: Actividade da acilase AcR5b na presença de activadores e de inibidores potenciais

Composto Actividade relativa (%) Nenhum 100 Reactivação 1 mM 10 mM com EDTA Catiões metálicos divalentes CoCl2 26 (15) 91 MnCl2 99 (60) n.d. ZnCl2 <1,5 (0) 75 MgCl2 103 93 n.d. NiCl2 14 0 85 CaCl2 92 88 n.d. CUCI2 50 0 86 PbCl2 79 9 102 BaCl2 92 89 n.d. CdCl2 5 0 79 FeCl3 121 132 n.d. VC13 96 (106) n.d. Agentes quelantes EDTA 119 121 n.d. Citrato 122 100 n.d. Agentes redutores de tiol Ditiotreitol 35 5,4 n.d. Mercaptoetanol 115 69 n.d. Glutationa reduzida 113 112 n.d. Agentes bloqueadores de grupo tiol Iodoacetamida 96 29 n.d. Inibidor de protease: Fluoreto de fenilmetilsulfonilo 44 n .d. n.d. As actividades relativas entre parêntesis indicam formação de precipitados no decurso dos testes enzimáticos. n.d.: não determinado 68 ΡΕ0954571

Exemplo 18: Estabilidade da acilase AcR5b a) Estabilidade à temperatura

Diluem-se a 1/10 amostras da preparação final de acilase obtida no exemplo 14 d, com tampão de fosfato de potássio 69 mM, pH 7, e incubam-se durante 30 minutos a diversas temperaturas. Utiliza-se como padrão de 100% uma amostra incubada sobre gelo. Em seguida medem-se as actividades de acilase remanescentes pelas determinações padrão de actividade (veja-se o exemplo 11). Não se observa qualquer perda da actividade de acilase entre 21 e 30°C (veja-se a tabela 12) . Embora após 30 minutos de incubação a 50°C ainda se mantenha 605 da actividade de acilase inicial, a 56 °C o enzima é completamente desactivado.

Tabela 12: Actividade residual da acilase AcR5b após incubação durante 30 minutos a diversas temperaturas

Temperatura 0 21 25 30 35 40 45 50 56 60 (°C) Actividade 100 95 102 100 89 82 68 60 0 0 residual (%)

Quando se incuba a acilase diluída (veja-se acima) a 0 - 4°C durante 16 e durante 135 dias, as actividades relativas residuais ainda são de 100 e de 95 % 69 ΡΕ0954571 do valor inicial. Após uma incubação a 23 e a 30°C durante 16 dias, retém-se 86 e 65 % da actividade inicial.

b) Estabilidade ao pH

Dilui-se a 1/20 a preparação enzimática final do exemplo 4 d), com os tampões descritos no exemplo 16, e incuba-se à temperatura ambiente (cerca de 23°C) durante uma semana. Em seguida mede-se a actividade remanescente nas amostras, de acordo com quanto se descreveu no exemplo 11. Uma actividade de 100 % corresponde ao valor obtido imediatamente após a diluição no tampão de pH 7. O enzima é razoavelmente estável a entre pH 7 e 9 (100 % de actividade residual), mas fora deste intervalo a sua actividade decresce marcadamente. c) Estabilidade à congelação

Dilui-se a 1/20 a preparação enzimática final do exemplo 4 d), com tampão de fosfato de potássio 69 mM (pH 7), na presença e na ausência de agentes crioprotectores (veja-se a tabela 13) . Congelam-se as soluções enzimáticas a -20 e a -80°C. passados 2,5 e 9 dias, descongelam-se as amostras e mede-se a sua actividade residual tal como se descreveu no exemplo 11.

Os dados listados na tabela 13 demonstram que a acilase é desactivada por armazenagem no estado congelado. 70 ΡΕ0954571 A estabilidade pode ser aumentada de forma notável adicionando agentes crioprotectores.

Tabela 13: Influência da congelação sobre a actividade da acilase AcR5b

Agente crioprotector Actividade relativa (%) 2,5 h, 9 dias 2,5 h, 9 dias -20°C -20 °C -80 °C -80°C nenhum 67 0 100 34 5% de glicerol 100 89 100 97 50% de glicerol 77 98 100 90 10% de (NH4)2S04 100 81 92 83 10% de sacarose 100 100 100 92

Exemplo 19: Dependência da velocidade reaccional da acilase AcR5b da concentração do substrato

Levam-se a cabo determinações da actividade nas condições padrão descritas no exemplo 11, com um período de incubação de 30 minutos, utilizando diferentes concentrações iniciais de (R)-N-acetil-l-feniletilamina e de N-acetil-(m-cianofenil)etilamina racémica. Utiliza-se como fonte de enzima a preparação final de acilase AcR5b obtida no exemplo 4 d, que se diluiu a 1/20 com tampão de fosfato de potássio 69 mM, pH 7. Calculam-se as constantes de Michaelis (Km) e as velocidades reaccionais máximas tal como se descreveu no exemplo 9. 71 ΡΕ0954571

Os valores de Km relativos a (R)-N-acetil-1-feniletilamina e a N-acetil-(m-cianofenil)etilamina racémi-ca são respectivamente de 5,7 e de 10,4 mM, e as velocidades reaccionais máximas são de 100 e 23 %.

Exemplo 20: Isolamento de microorganismos com actividade de acilase de (S)-2-amino-l-fenil-4-penteno

Aplica-se em geral o processo descrito no exemplo 1, com as modificações seguintes: • Utilizam-se 74 amostras de solo e de água para inocular culturas de enriquecimento com pH 6, pH 7, e pH 9, incuba-se a 28°C, e com pH 7, incuba-se a 37°C. • O meio para a primeira propagação contém 0,5 g/L de acetato de sódio como única fonte de carbono, e os meios para a segunda e terceira propagações contêm 1 g/L de 2-acetilamino-l-fenil-4-penteno racémico. • Leva-se a cabo o cultivo de estirpes aos mesmos valores de temperatura e de pH que se utilizaram para as culturas de enriquecimento correspondentes. ΡΕ0954571 72 • Isolam-se os organismos a partir das culturas de enriquecimento com Agar de Contagem de Placas (Fluka Co., Buchs, Suiça). • 0 meio para o crescimento das estirpes é constituído por 1 g/L de 2-acetilamino-l-feiyl-4-penteno racémico, 1 g/L de extracto de levedura, e 1 g/L de peptona na solução de sais inorgânicos MLl. 0 período de incubação para as culturas em frascos sob agitação é de 48 - 72 h. • Para se testar a actividade e a enantios-selectividade, os testes de actividade de acilase são levados a cabo, respectivamente, com 5,47 mM de (S) e de (R)-2-acetilamino-l-fenil-4-penteno, a título de substratos, e com 40 pL de extracto de células em bruto como fonte de enzimas, num volume total de 400 pL. Após um período de incubação apropriado misturam-se 200 pL de acetona arrefecida em gelo com 200 pL de meio do teste, e com 600 pL de tampão de fosfato de potássio 69 mM, pH 7, e após centrifugação a 11.500 rpm analisa-se por HPLC a concentração do sobrenadante em 2-amino-l-fenil-4-penteno (comprimento de onda de detecção de 210 nm). 73 ΡΕ0954571

Isolam-se 18 organismos que hidrolisam de preferência um enantiómero do 2-acetilamino-l-fenil-4-penteno, mas apenas para uma estirpe, o Rhodococcus globerulus Kl/1 (= DSM 10337), se observou nos testes enzimáticos a clivagem exclusiva do enantiómero (S).

Exemplo 21: Crescimento e indução da acilase de Rhodococcus globerulus Kl/1 a) Variação do indutor

Faz-se crescer a estirpe Kl/1 em cultura em frascos agitados utilizando o meio do exemplo 21, mas com 2 g/L de extracto de levedura e de peptona, com 2-acetilamino-l-fenil-4-penteno racémico, ou em alternativa com N-acetil-l-feniletilamina a titulo de indutor, nas concentrações de 0, 4,92, 7,38, e 9,84 mM. A medição da actividade como acilase e da D.O.660 revela que a acilase apenas é formada por parte da estirpe Kl/1 na presença de uma substância indutora, que pode ser quer 2-acetilamino-l-fenil-4-penteno racémico e ou N-acetil-l-feniletilamina racémica.

As concentrações de 2-acetilamino-l-fenil-4-penteno superiores a 4,92 mM são inibitórios do crescimento e da formação de enzima da Kl/1. A N-acetil-1- 74 ΡΕ0954571 feniletilamina a concentrações de 7,38 e de 9,84 mM, no entanto, não inibe o crescimento, mas em nenhum destes casos se obtém um aumento de densidade da cultura nem do rendimento em acilase (U/Icaido de cultura) · b) Variação do pH inicial e da temperatura

Faz-se crescer a estirpe Kl/1 em frascos de cultura (veja-se o exemplo 21 a) na presença de 2-acetilamino-l-fenil-4-penteno racémico 4,92 mM, variando o valor do pH inicial entre 4 e 9 em passos de 0,5 unidades de pH, a 28°C e variando a temperatura de incubação entre 20 e 40°C em passos de 5°C a pH 7. Após 72 h de incubação mede-se a D.O.660 e a actividade como acilase, dos extractos em bruto. A melhor produção da acilase do Rhodococcus globerulus Kl/1 é conseguida a pH 6,5 e a 30°C (28 U/Lcaido de cultura, 0,4U/mgptoteí na no extracto em bruto).

Exemplo 22: Hidrólise enzimática com acilase de Arthrobacter aurescens Ac5R de elevado grau de pureza

Adiciona-se a 10 mL de uma solução 20 mM de cada uma das amidas racémicas 1 listadas adiante em tampão fosfato 0,1 M e a pH 7,0, 5 ml (1,3 unidades) do enzima, e agitam-se as soluções a 100 rpm e a 30°C. ΡΕ0954571 75 0 r! o {| aeilíse 1 λΑΛ* β-'-ΝΛ3 .......—» , ,CÍ 4 * NHj H H (+/-)-la-l2a (+)- or {-)* or (*)-1M2a

Quando a transformação atinge cerca de 50 % (o que se verifica por HPLC), acidificam-se as soluções até pH 2 adicionando-lhes HC1 1 N e extrai-se por três vezes com diclorometano para se obterem as amidas não transformadas. Neutralizam-se as fases aquosas com solução 1 N de NaOH e extrai-se por três vezes com diclorometano para se recuperarem as aminas formadas. Ambas as fases orgânicas são secas sobre MgS04, filtradas, e separa-se o solvente por destilação. Utilizam-se directamente as amidas para as determinações das purezas ópticas (HPLC), enquanto as aminas que se obtêm são transformadas nas suas acetamidas pela adição de 100 μ]1. de trietilamina e de 100 μυ de anidrido acético a cada amostra, e depois são analisadas quanto à sua pureza óptica por HPLC "quiral". Resumem-se os resultados na tabela 14.

1ar R*»H 4a 5a 6a 2a:. RJ = M, R**C«

7a 8a 9a 10scR**-CHaCH=CHz 11 a: Rs i -CHjCHjCHi 12a· Rs « -CHjCH3 76 ΡΕ0954571

Tabela 14: Transformação e enantiosselectividade da hidrólise enzimática com acilase Ac5R de Arthrobacter aurescens com elevado grau de pureza

Substrato Periodo de incubação (h) Transformação (%) e.e. de (5)-amida e.e. de (R)-amina Selecti-vidade E la 22 50,3 >99,9 98,2 >500 2a 75 47, 4 82,4 91,5 60 3a 75 51,3 >99,9 95,0 320 4a 139 46,0 87, 4 >99,9 >500 5a 4 6 50,1 96,1 95, 7 180 6a 194 35,2 46,6 90,5 32 8a 22 47, 4 82,4 91,5 60

Exemplo 23: Hidrólise enzimática com acilase Ac6 de Rhodococcus equi parcialmente purificada

Levam-se a cabo as experiências do mesmo modo que se descreveu para o exemplo 22. Utilizam-se 200 mL (1,1 unidades) de enzima para cada um dos substratos listados na tabela 15. 77 ΡΕ0954571

Tabela 15: Transformação e enantiosselectividade da hidrólise enzimática com acilase Ac6 de Rhodococcus equi parcialmente purificada

Substrato Período de incubação (h) Transformação (%) e .e. de (R)~ amida e.e. de (S) -amina Selectividade E la 18 50, 6 99,3 96,8 350 2a 19 46,1 85,5 >99, 9 >500 3a 19 49, 4 97, 4 >99, 9 >500 4a 19 50, 4 >99, 9 98,5 >500 5a 20 52,3 96,7 88,2 65 7a 19 14, 4 16,4 97, 4 88 8a 20 47, 9 90,1 97,8 280 9a 20 51, 7 >99, 9 92,1 230

Exemplo 24: Hidrólise de amidas com células inteiras de Rhodococcus globerulus Kl/1

Adicionam-se, a 50 mL de uma solução 10 mM em tampão fosfato a pH 7,0, de cada uma das amidas racémicas que se listam na tabela 16, células inteiras de Rhodococcus globerulus Kl/1 (todas obtidas de frascos de cultura agitados de 50 mL) (veja-se o exemplo 21), D.0.66o = 2,0). A desacetilação é levada a cabo a 30°C sob agitação continuada (200 rpm). Monitoriza-se o decurso da reacção por HPLC e depois de a transformação atingir cerca de 50 % purificam-se as misturas reaccionais tal como se descreveu para o exemplo 22.Resumem-se os resultados na tabela 16. 78 ΡΕ0954571

Tabela 16: Transformação e enantiosselectividade da hidrólise enzimática com células inteiras de Rhodococcus globerulus Kl/1 Substrato Período de incubação (h) Transformação (%) e. e. de (S)- amida e. e. de (R)~ amina Selectividade E la 3, 0 50, 6 >99, 9 97,5 >500 4a 3, 5 52, 6 >99,9 90,0 140 6a 3, 5 51, 7 >99, 9 93,5 290 10a 3, 5 51, 7 95, 7 90,0 70 11a 4,0 55, 7 97,8 77, 8 35 12a 2, 0 49, 4 90, 7 93,0 87 12a 3,5 53, 1 >99, 9 87,9 Exemplo 25 Hidrólise Preparativa de la racémica com acilase Ac5R de Arthrobacter aurescens.

Adiciona-se a 1 g (613 mmol) de N-acetil-1-feniletilamina racémica (+)-la, parcialmente dissolvida em 100 mL de tampão fosfato 0,1 M a pH 7,0, 100 mL (25,3 unidades) de acilase de Arthrobacter aurescens Ac5R, e agita-se a mistura (100 rpm) a 20°C durante 27 horas. Depois de se acidificar (pH 2) por adição de HC1, extrai-se a mistura reaccional três vezes com 100 mL de diclorometano. Seca-se o conjunto das fases orgânicas (MgSCh) e separa-se o solvente por destilação depois de se 79 ΡΕ0954571 filtrar, obtendo-se 0,496 g (49,6 %) de (S)-N-acetil-1- feniletilamina (-)-la ( [a]D20 = -138, 0° (c = 1,0 em EtOH), com razão enantiomérica S/R = 96,8:3,2), sob a forma de um sólido branco. Neutraliza-se a fase aquosa por adição de NaHC03 e extrai-se de novo com diclorometano. A purificação habitual permite obter 0,323 g (43,5 %) de (R)-l- feniletilamina (+) -lb ( [a] d20 = +29,4° (c = 2,2 em EtOH), com razão enantiomérica R/S = 99,7:0,3) sob a forma de um óleo incolor.

Exemplo 26: Purificação da acilase do Rhodococcus globerulus Kl/1 26.1. Preparação do extracto em bruto à escala preparativa

Verte-se 100 mL de suspensão de células (a 40% em peso) para um balão de vidro com 600 mL, e coloca-se sobre um balde de gelo. Durante a sonicação, o balão tem que permanecer no banho de gelo. Utiliza-se um dispositivo padrão de uma polegada para transferir os ultrassons, nas seguintes condições: período do ciclo: 1 segundo período de carga: 50 % controlo de saída: 8 período total de sonicação: 20 minutos (ininterruptos) 80 ΡΕ0954571

Ao fim de 20 minutos de sonicação (40 minutos incluindo as interrupções) centrifuga-se a amostra durante 20 minutos a 9.000 rpm numa centrífuga refrigerada (4°C) de alta velocidade Sorvall RC5B, utilizando um rotor Sorvall GS-3 em alumínio. O sobrenadante é o extracto em bruto. A determinação padrão da actividade da acilase Kl/1 que se utilize para monitorizar a purificação e para a caracterização enzimológica é levado a cabo misturando 20 pL de uma amostra de enzima com 380 pL de uma solução 5,55 mM de (S)-2-acetilamino-l-fenil-4-penteno em tampão de fosfato de potássio 69 mM, pH 7, e incuba-se a 23°C. Selecciona-se a diluição da acilase e o período de incubação de modo a não se formar mais do que 1,3 mM do produto. A reacção é terminada pela adição de 800 μΐ de metanol gelado. Depois de se centrifugar durante 4 minutos a 11.500 rpm numa Biofuge 15 (Heraeus Sepatech, Osterode, Alemanha) submete-se o sobrenadante a uma análise quantitativa por HPLC (veja-se o exemplo 1). 26.2. Precipitação dos ácidos nucleicos.

Adiciona-se 3,25 ml de uma solução de PEI a 10% (cujo pH foi ajustado a 7,5 com HC1 6N) a 105 ml de homogenato de células (proveniente do passo de sonicação), para se obter uma concentração de 0,3%. Mantém-se a mistura em gelo durante 30 minutos com agitação suave. Em seguida centrifuga-se a mistura durante 20 minutos a 9.000 rpm e a 4°C. Utiliza-se então o sobrenadante para precipitação com sulfato de amónio. 81 ΡΕ0954571 26.3. Precipitação com sulfato de amónio.

Adicionam-se lentamente 18,81 g de (NH4)2S04 cristalino a 90 mL de extracto em bruto depois de se haverem precipitado os ácidos nucleicos, para se obter uma concentração de 35% da saturação. Mantém-se a mistura em gelo durante 30 minutos com agitação suave. Depois disto centrifuga-se a mistura durante 20 minutos a 9.000 rpm e a 4°C. Submete-se o sobrenadante a uma cromatografia num sistema de FPLC (Pharmacia, Uppsala, Suécia) para se obter uma purificação adicional. 26.4. FPLC.

Para purificar a acilase utilizam-se dois tipos de coluna diferentes (de interacção hidrofóbica e de filtração através de gel) acopladas ao equipamento de FPLC. 26.4.1. Cromatografia de interacção hidrofóbica (HIC).

Para a HIC prepara-se uma coluna Merck Fractogel TSK Butil-650(S) (26 x 310 mm, volume:165 mL) e equilibra-se com uma solução de (NH4)2S04 a 35% de saturação (em tampão fosfato, pH 7,0). Depois de se carregar a coluna com 90 mL de sobrenadante proveniente da precipitação com (NH4) 2S04, lava-se a coluna com uma solução de (NH4)2S04 a 35% de saturação até não sair da coluna mais nenhuma 82 ΡΕ0954571 proteína. Nessa altura aplica-se à coluna um gradiente de uma solução de (NH4)2S04 de 35% a 0% de saturação, com um volume total de 1150 mL. Ajusta-se o caudal a 1,8 mL/minuto, recolhem-se fracções de 12 ml e testam-se quanto à sua actividade de acilase. A acilase elui a entre 11,5% e 7,5% de (NH4)2S04. Juntam-se as fracções activas (140 mL). 26.4.2. Ultrafiltração

Leva-se a cabo a concentração e a dessalinização do conjunto de fracções de HIC (140 mL) que contêm a acilase de Rhodococcus globerulus Kl/1 numa câmara de ultrafiltração CEC1 Amicon. Utiliza-se uma membrana YM30 (com massa molecular de corte 30.000 Da). Consegue-se a dessalinização por diafiltração e por adições repetidas à amostra concentrada, de tampão de fosfato de potássio isento de (NH4)2S04 (69 mM, pH 7,0), seguindo-se passos de nova concentração. Concentra-se o conjunto de fracções de HIC a um volume de 4,5 mL. 26.4.3. Filtração através de gel.

Utiliza-se uma coluna de filtração em gel Pharmacia Superose 12HR 10/30 (10 x 300 mm) no último passo de purificação. Leva-se a cabo a eluição utilizando tampão de fosfato de potássio (69 mM, pH 7,0) suplementado com NaCl 100 mM, com um caudal de 0,3 mL/minuto. Aplica-se 83 ΡΕ0954571 sobre a coluna 200 pL da fracção de acilase concentrada e dessalinizada obtida da ultrafiltração. Recolhem-se fracções de 0,5 mL que se analisam quanto à presença de acilase. 26.4.4. Esquema de purificação para a acilase de Rhodococcus globerulus Kl/1. volume proteína acilase act. rendimento factor de (mL) (mg/mL) (U) espec. (%) purificação (U/mg) extracto 105 12,15 387,5 0,304 100 1,00 em bruto Precip. 90 9,92 309, 6 0,347 79, 9 1,14 PEI Precip. 90 8,63 310, 5 0,400 80,1 1,32 NH4SO4 HIC 140 1,14 293,3 1, 841 75, 8 6,06 filtração 33, 8 2,36 251, 7 3,174 65, 0 10,44 em gel * Apenas se aplicam 200 μΕ dos 4,5 mL de fracção concentrada e dessalinizada proveniente da HIC à coluna Pharmacia Superose 12HR (veja-se o Exemplo 26.4.2). Os dados apresentados na tabela são calculados para o volume total da fracção concentrada proveniente da HIC (4,5 mL). _

Exemplo 27: Dados de caracterização da acilase de Rhodococcus globerulus Kl/1 27.1.

Actividade da acilase de Rhodococcus 84 ΡΕ0954571 globerulus Kl/1 na presença de activantes e inibidores potenciais do enzima grupo composto actividade relativa (%) nenhum 100 1 mM 10 mM catiões metálicos CoCl2 97 86 MnCl2 94 83 ZnCl2 66 0 MgCl2 101 87 NiCl2 87 80 CaCl2 89 85 CuCl2 66 50 F eCl3 101 37 agentes quelantes EDTA 99 89 citrato de Na 113 133 agentes redutores de tiol ditiotreitol 112 77 mercaptoetanol 106 101 glutationa, reduzida 104 93 agentes bloqueadores do grupo tiol iodoacetamida 104 67 p-hidroxibenzoato de mercúrio 89 96 inibidores de enzima PLP D-ciclosserina 104 96 inibidor de protease fluoreto de fenilmetilsulfonilo 0,1 mM: 0% 0, 01 mM: 0% 85 ΡΕ0954571 A acilase Kl/1 é fortemente inibida apenas por Zn2+ 10 mM e por fluoreto de f enilmetilsulf onilo. Esta inibição severa pelo último destes compostos, mesmo a concentrações muito pequenas, indica que o enzima reage por um mecanismo do tipo do de uma protease de serina. 27.2. Dados de caracterização geral da acilase de Rhodococcus globerulus Kl/1 27.2.1. A massa molecular da acilase é de 54,6 kDa, por SDS-PAGE (veja-se o exemplo 4.c e o 5), e de 92,3 kDa quando é submetida a uma filtração em gel (veja-se o exemplo 5), o que sugere que a acilase nativa apresenta uma estrutura homodimérica. 27.2.2. O ponto isoeléctrico da acilase é medido tal como se descreveu no exemplo 6, sendo de cerca de pH 4,0. 27.2.3. Para a determinação da actividade e da estabilidade da acilase sob diversas condições de pH, utilizam-se as seguintes soluções tampão: para pH 5,5 - pH 7,5 tampão fosfato para pH 7,5 - pH 9,0 tampão Tris para pH 9,0 - pH 10,5 tampão glicina

Para a determinação da estabilidade ao pH, 86 ΡΕ0954571 incubam-se amostras de acilase durante 2 h a 23°C em tampões a diversos valores de pH. Em seguida submetem-se as amostras de enzima às determinações padrão de actividade (veja-se o exemplo 26). A acilase evidencia um óptimo de estabilidade amplo a entre pH 5,5 e pH 7,5. A actividade da acilase de Kl/1 é medida em ensaios padrão de determinação de actividade (veja-se o exemplo 26) sob diversas condições de pH. A acilase apresenta uma actividade óptima a entre pH 7,0 e pH 7,5 com um decréscimo mais pronunciado da actividade a valores de pH mais ácidos, a partir do óptimo. 27.2.4. Estabilidade térmica da acilase do Rhodococcus globerulus Kl/1.

Incubam-se amostras da acilase a diversas temperaturas na gama de entre 0°C e 65°C, durante 30 minutos. Depois de serem arrefecidas num banho de gelo, submetem-se as amostras de acilase às determinações padrão de actividade (veja-se o exemplo 26). A acilase não evidencia diminuição da sua actividade quando é incubada durante 30 minutos a temperaturas que vão até 50°C. A acilase incubada a 55°C perde 40% da sua actividade, enquanto que a acilase 87 ΡΕ0954571 incubada a temperaturas superiores (60°C, 65 °C) é completamente desactivada durante os 30 minutos da incubação. 27.2.5. Sequência de aminoácidos do terminal N da acilase de Rhodococcus globerulus Kl/1.

Para a determinação da sequência de aminoácidos do terminal N da acilase do Kl/1 utilizou-se um Sistema de Sequenciação de Terminal N de Porteina HPG1005A, o qual leva a cabo quimica de degradação de Edman automatizada sobre amostras de proteína retidas em colunas de adsorção em miniatura, retentoras e bifásicas, constituídas por uma coluna de fase reversa ligada a uma coluna de permuta aniónica forte. A análise dos derivados PTH de aminoácidos é levada a cabo em linha por um sistema HP1090 HPLC (Hewlett Packard, Paio Alto, CA, EUA) A sequência de aminoácidos do terminal N (50 resíduos) é ilustrada na SEQ ID NO 1: SQSEIVWASASELAARVRERSLTPVEIGDAMIEHIDAVNPsINAWQFDR.

Exemplo 28: Sequência do terminal N de aminoácidos da acilase de (S) -N-acetil-l-feniletilamina de Rhodococcus equi Ac6

Leva-se a cabo a determinação da sequência de aminoácidos do terminal N tal como se descreveu no exemplo 27.2.5. 88 ΡΕ0954571 A sequência de aminoácidos do terminal N (30 resíduos) da acilase Ac6 está ilustrada na SEQ ID NO 2: MNTSDPGWMSATEMAAQVASKSLSPNEIAE.

Exemplo 29: Sequência terminal N de aminoácidos da acilase específica para (R) de Arthrobacter aurescens AcR5b

Leva-se a cabo a determinação da sequência de aminoácidos do terminal N tal como se descreveu no exemplo 27.2.5. A sequência de aminoácidos do terminal N da pequena sub unidade (16 kDa) está ilustrada na SEQ ID NO 3: PITNPA77RDHAE, e sequência de aminoácidos do terminal N da sub unidade grande (89 kDa) está ilustrada na SEQ ID NO 4: TAlrlrGY?DTPSVAPGE (7: aminoácido desconhecido, minúscula: aminoácido incerto).

Exemplo 30: Preparação de (S)-2-amino-l-fenil-4-penteno utilizando a acilase de Kl/1 purificada

Adicionam-se a 50 mL de uma solução 10 mM de 2-acetilamino-l-fenil-4-penteno racémico em tampão fosfato (pH 7,0), 7 mL de acilase de Kl/1 (0,456 U), que se havia purificado por HIC e concentrado por ultrafiltração (exemplos 26.5 e 26.6). Leva-se a cabo a desacetilação a 30°C sob agitação contínua a 200 rpm. Monitoriza-se a 89 ΡΕ0954571 reacção por HPLC (veja-se o exemplo 1), e depois de a transformação ter ocorrido a cerca de 50 % acidifica-se a solução com HC1 1 N até pH 2 e extrai-se por três vezes com igual volume de diclorometano para se obter as amidas não transformadas. Neutraliza-se a fase aquosa com NaOH 1 N e extrai-se de novo por três vezes com diclorometano para se recuperarem as aminas que se formaram. Ambas as fases orgânicas são secas sobre MgS04, filtradas, e separa-se o solvente por destilação. As amidas são directamente utilizadas para a determinação da pureza óptica por um HPLC nas seguintes condições: coluna Chiralcel OJ, eluente de hexano / isopropanol a 9:1, caudal de 1 mL/minuto, detecção a 208 nm. As aminas obtidas são transformadas nas ace-tamidas correspondentes por adição de 100 mL de tri-etilamina e de 100 mL de anidrido acético a cada amostra, antes de também serem utilizadas para a determinação da sua pureza óptica por HPLC.

Aos 50,3 % de transformação obtém-se o (S)-2-ami-no-l-fenil-4-penteno com 87,4 % de ee, o (R)-N-acetilamino-1-fenil-4-penteno com 98,8 % de ee, correspondendo a um valor de E de 74,9 %.

Exemplo 31: Preparação de (S)-2-amino-l-(4-cloro-fenil)-4-penteno utilizando a acilase de Kl/1- sob a forma de células inteiras de Rhodococcus globerulus Kl/1

Cultiva-se a estirpe Kl/1 de acordo com o exemplo 3, num fermentador de 30 L contendo 20 L de meio basal que contém 1 g/L de N-acetil-l-feniletilamina racémica. Colhem- 90 ΡΕ0954571 se as células por centrifugação continua e voltam a suspender-se na mistura reaccional, que se prepara adicionando uma solução de 80 g de 2-acetilamino-l-(4-clorofenil)-4-penteno racémico em 500 mL de metanol a 20 L de tampão de fosfato de potássio, 69 mM, pH 7. Depois de se agitar durante 21 h a 28°C e a 500 rpm, separa-se a amina formada e a amida por reagir e analisam-se quanto ás suas purezas ópticas de um modo análogo ao descrito no exemplo 30.

Isolam-se 31,1 g (94,5 % de rendimento) de (S)-2-amino-1-(4-clorofenil)-4-penteno com > 99,9 % de ee, e 38,6 g (rendimento de 97 %) de (R)-2-acetilamino-l-(4-cloro fenil) -4-penteno com 98,5 % de ee.

Depósito dos Microorganismos

Depositaram-se os seguintes microorganismos de acordo com o Tratado de Budapeste, junto da DSM - Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg lb, D-38124 Braunschweig:

Rhodococcus globerulus Kl/1, DSM 10337 (depositado a 23 de Setembro de 1995)

Rhodococcus equi Ac6, DSM 10278 (depositado a 23 de Setembro de 1995)

Arthrobacter aurescens AcR5b, DSM 10280 (depositado a 23 de Setembro de 1995) 91 ΡΕ0954571

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS (1) INFORMAÇÃO GERAL: (i) REQUERENTE: (A) NOME: Novartis AG (B) RUA: Schartzwaldallee (C) CIDADE: Basileia (E) PAÍS: Suíça (F) CÓDIGO POSTAL (ZIP): 4002 (G) TELEFONE: +41 61 696 11 11 (H) TELEFAX: + 41 61 696 79 76 (I) TELEX: 962 991 (ii) TÍTULO DA INVENÇÃO: Novo Biocatalisador (iii) NÚMERO DE SEQUÊNCIAS: 4 (iv) FORMA LEGÍVEL POR COMPUTADOR: (A) TIPO DE MEIO: Disquete

(B) COMPUTADOR: compatível com pc da IBM

(C) SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS (D) PROGRAMA: Patent In Release #1.0, Versão #1.30 (EPO) (2) INFORMATION SOBRE A SEQ ID NO: 1: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 50 aminoácidos (B) TIPO: aminoácidos (C) CADEIA DE CODIFICANTE: desconhecida (D) TOPOLOGIA: desconhecida (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómica) (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: Péptido (B) LOCALIZAÇÃO: 41 (D) OUTRAS INFORMAÇÕES:/produto = "aminoácido é incerto" (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 1: 92 ΡΕ0954571

Ser Gin Ser Gin Ile Vai Trp Ala Ser Ala Ser Glu Leu Ala Ala Arç 1 5 10 15

Vai &rg Glu Arg Ser Leu Thr Pro Vai Glu Ile Gly Asp Alá Mefc II# 20 25 30

Glu Sis XI# Mp Ala Vai Mn Pro Ser lie Mo Ala Vai Vai Gin Phe 35 40 45

Asp Ãrg 50 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 2: (1) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 30 aminoácidos (B) TIPO: aminoácidos (C) CADEIA DE CODIFICANTE: desconhecida (D) TOPOLOGIA: desconhecida (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómica) (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 2:

Ket As» Thr Ser Asp Pro Gly Trp «tet Ser Ala Thr Glu Met Ala Ala 1 5 10 15

Gin Vai Ala Ser Lys Leu Ser Pro Asn Glu Ile Ala Glu 20 25 30 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 3: (1) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 13 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) CADEIA DE CODIFICANTE: desconhecida (D) TOPOLOGIA: desconhecida (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómica) (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 3:

Pro Ile Thr Mn Pro Ala Xaa Xaa Arg Asp Mis Ala Glu 1 5 10 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 4: 93 ΡΕ0954571 (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 18 aminoácidos (B) TIPO: aminoácidos (C) CADEIA DE CODIFICANTE: desconhecida (D) TOPOLOGIA: desconhecida (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómica) (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: Local modificado (B) LOCALIZAÇÃO: 4 (C) OUTRA INFORMAÇÃO:/produto = "aminoácido é incerto" (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: Local modificado (B) LOCALIZAÇÃO: 6 (C) OUTRA INFORMAÇÃO:/produto = "aminoácido é incerto" (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 4

Thr Ala Ile Arg lie Arg Giy Tyr Xaa Aap Thr Pia Ser Vai Ala Pro 1 5 10 15

Gly Glu

Lisboa, 27 de Novembro de 2007

Claims

ΡΕ0954571 1 REIVINDICAÇÕES 1. Um biocatalisador que se possa obter a partir de um Rhodococcus globerulus Kl/1, com número de depósito DSM 10337, em que o biocatalisador exiba acti-vidade enzimática como aminoacilase sem actividade como lipase nem como esterase, biocatalisador esse capaz de hidrolisar selectivamente uma acilamida racémica com a fórmula (1)

em que R2 seja arilo ou aril-Ci-C4; ou R1 e R2 formem em conjunto um anel com 5 a 7 membros substituído com ou fundido a arilo; R3 seja um resíduo de acilo alifático; e R1 e R3 sejam seleccionados em conjunto de modo a originarem um composto com a fórmula (1) que não seja um derivado de um aminoácido natural; em que cada um dos resíduos possa ser substituído ou não substituído, possuindo a aminoacilase referida a sequência no terminal N SEQ NO.1. 2 ΡΕ0954571 2. 0 biocatalisador de acordo com a reivin dicação 1, capaz de catalisar a reacção A R* 0 r* k' Nr h2o 1 0 * A * 1,· (f·^ O Re 0 C* Ji, ! n assina S ácido H R <i) m (3) ¢4) em que nas fórmula (D a (4) R1 seja hidrogénio, alquilo Ci-Cg, alcenilo C alcoxilo Ci-Cg, alquil C2-C8-carboxilo ou carboxilo; R2 seja arilo ou arilo C1-C4; alquilo C alcoxilo C1-C4, hidroxialquilo C1-C4, aminoalquilo C1-C4, haloalquilo C1-C4 substituídos ou não substituídos, hidroxilo, amino, halogeno, nitro, sulfo ou ciano; ou em que R1 e R2 formem em conjunto um anel com 5 a 7 membros substituído com ou fundido a arilo, em que o anel possa conter um ou dois heteroátomos seleccionados de entre azoto, enxofre e oxigénio; e R3 seja um resíduo acílico alifático. 3. 0 catalisador de acordo com a reivindicação 2 que catalise a reacção A em que R1 seja hidrogénio, alquilo C1-C4, alcenilo C2-C4, alcoxilo C1-C4 ou alquil C2-C4-carboxilo. 3 ΡΕ0954571 4. 0 catalisador de acordo com a reivindicação 2 que catalise a reacção A em que R3 seja alquilo C1-C4.
5. Um processo que inclua a hidrólise de uma acilamida que seja uma N-acilamida, e possua um residuo acilico alifático, e que não seja um derivado de um aminoácido natural, caracterizado por se utilizar um biocatalisador de acordo com a reivindicação 1. 6. 0 processo de acordo com a reivindicação 5, a que corresponda o esquema reaccional seguinte R* 0 h"Õ " t H tf t + Q * + 0 ,A tf' O tf 0 * c* -tf' !, {A) H ' * aratna $ ácido amida R m m m !4) em que nas fórmula (1) a (4) R1 seja hidrogénio, alquilo Ci-C8, alcenilo C2-C8, alcoxilo Ci-C8, alquil C2-C8-carboxilo ou carboxilo; R2 seja arilo ou arilo C1-C4; alquilo C1-C4, alcoxilo C1-C4, hidroxialquilo C1-C4, aminoalquilo C1-C4, haloalquilo Ci-C4 substituídos ou não substituídos, hidroxilo, amino, halogeno, nitro, sulfo ou ciano; ou em que R1 e R2 formem em conjunto um anel com 4 ΡΕ0954571 5 a 7 membros substituído com arilo, em que o anel possa conter um ou dois heteroátomos seleccionados de entre azoto, enxofre e oxigénio; e seja substituído com ou esteja fundido a arilo; R3 seja um resíduo acílico alifático. 7. 0 processo da reivindicação 6 em que R3 seja alquilo Ci-C3 caso o biocatalisador seja proveniente do Rhodococcus globerulus Kl/1, DSM 10337. 8. 0 processo de qualquer uma das reivindicações 5 a 7, em que o catalisador esteja sob uma forma imobilizada. Lisboa, 27 de Novembro de 2007 1 ΡΕ0954571 REFERÊNCIAS CITADAS NA DESCRIÇÃO Esta lista de referências citadas pelo requerente é apenas para conveniência do leitor. A mesma não faz parte do documento da patente Europeia. Ainda que tenha sido tomado o devido cuidado ao compilar as referências, podem não estar excluídos erros ou omissões e o IEP declina quaisquer responsabilidades a esse respeito. Documentos de patentes citadas na Descrição • JF5S1§82§eA * US 5380724 A

* DE 433273S * EP 39S58S A * JPBS211S47B Literatura que não é de patentes citada na Descrição ♦ HUMMEL et aÈ. AfipSed Mcrolmí. BMechnol 1907, 27. 2S3-29)