JP2007029008A - 新規遺伝子およびその応用 - Google Patents

Abstract

【課題】 目的のタンパク質遺伝子を大量発現させるために、容易な方法で転写を制御する機能を有する新たな新規遺伝子を提供する。
【解決手段】 下記（Ａ）、（Ｃ）、（Ｄ）、（Ｅ）、（Ｆ）のいずれかのＤＮＡの遺伝子からなる。（Ａ）特定の塩基配列からなるＤＮＡ、（Ｂ）前記（Ａ）の塩基配列において１個もしくは数個の塩基が欠失、置換または付加された塩基配列からなるＤＮＡ、（Ｃ）前記（Ｂ）の塩基配列からなり、かつ、イソバレリル-ＣｏＡデヒドロゲナーゼ遺伝子のプロモーター活性を示すＤＮＡ、（Ｄ）前記（Ｂ）の塩基配列からなり、かつ、存在する炭素源の種類に応じて転写の誘導および抑制を行うプロモーター活性を示すＤＮＡ、（Ｅ） 前記（Ｂ）塩基配列からなり、前記（Ａ）のＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡ、（Ｆ）前記（Ｂ）の塩基配列からなり、前記（Ａ）のＤＮＡとの相同性が９０％以上であるＤＮＡ。
【選択図】 なし

Description

本発明は、新規遺伝子、特にプロモーターとして機能する新規遺伝子およびその用途に関する。

近年の遺伝子組換え技術の進歩により、大腸菌や酵母を利用した有用蛋白質の生産が可能となった。しかし、大腸菌を宿主として真核生物由来の異種タンパク質遺伝子を発現させた場合、合成されたペプチド鎖の加水分解によるプロセッシングや糖鎖の付加等、翻訳後の修飾が正常に行われないといった問題がある。一方、酵母を宿主とした場合、翻訳後の修飾の問題は解決し得るものの、発現タンパク質の分泌量が非常に少ないという問題が指摘されている。

そこで、近年、タンパク質分泌能力に優れる糸状菌が、真核生物由来の異種タンパク質を高生産させるための宿主として注目されている。糸状菌の中でもＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅは、様々な有用酵素を大量に生産、分泌できる有用微生物であり、例えば、清酒醸造や、醤油、味噌等の生産に利用されている。また、日本の伝統産業で古くから利用されてきた実績からも、その安全性は既に歴史的に証明されており、アメリカ食品薬品局（ＦＤＡ）においても安全な宿主として認定されている。このような点からＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅは、異種タンパク質の生産宿主として利用されている（例えば、特許文献１参照）。

遺伝子組換え技術を利用して有用タンパク質の生産を行う場合、効率向上のために、宿主菌の培養を、例えば、宿主菌の増殖段階とタンパク質の生産段階の２段階に分けて行うことが提案されている。つまり、培養初期においては、タンパク質の生産を抑制して宿主菌の増殖を優先させ、十分な菌体密度に達した時点で、宿主菌に目的タンパク質の生産を開始させるのである。このためには、例えば、簡便な方法で転写活性を制御できるプロモーターの使用が必要である。しかしながら、実用面において、このように容易に転写活性の制御が可能であるプロモーターは報告されていない。
特開２００４−２５４６７０

そこで、本発明は、目的のタンパク質遺伝子を大量発現させるために、容易な方法で転写を制御する機能を有する新たな新規遺伝子およびその用途の提供を目的とする。

前記目的を達成するために、本発明の新規遺伝子は、下記（Ａ）〜（Ｅ）のいずれかのＤＮＡからなる遺伝子である。
（Ａ） 配列番号１の塩基配列からなるＤＮＡ
（Ｂ） 前記（Ａ）の塩基配列において１個もしくは数個の塩基が欠失、置換または付加された塩基配列からなり、かつ、イソバレリル-ＣｏＡデヒドロゲナーゼ遺伝子のプロモーター活性を示すＤＮＡ
（Ｃ） 前記（Ａ）の塩基配列において１個もしくは数個の塩基が欠失、置換または付加された塩基配列からなり、かつ、存在する炭素源の種類に応じて転写の誘導および抑制を行うプロモーター活性を示すＤＮＡ
（Ｄ） 前記（Ａ）の塩基配列において１個もしくは数個の塩基が欠失、置換または付加された塩基配列からなり、前記（Ａ）のＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡ
（Ｅ） 前記（Ａ）の塩基配列において１個もしくは数個の塩基が欠失、置換または付加された塩基配列からなり、前記（Ａ）のＤＮＡとの相同性が９０％以上であるＤＮＡ

また、本発明のプロモーターは、本発明の遺伝子からなることを特徴とする。

本発明の発現ベクターは、プロモーターを含む発現ベクターであって、前記プロモーターが本発明のプロモーターであることを特徴とする。また、本発明の組換え体は、宿主に発現ベクターを導入した組換え体であって、前記発現ベクターが本発明の発現ベクターであることを特徴とする。

本発明の制御方法は、目的遺伝子の発現を制御する方法であって、本発明のプロモーターの下流に目的遺伝子を配置し、炭素源の種類に応じて、前記目的遺伝子の転写の誘導・抑制を制御することを特徴とする。

また、本発明の目的タンパク質の製造方法は、目的タンパク質をコードする目的遺伝子を有する組換え体の培養工程を含む製造方法であり、前記組換え体が本発明の組換え体であって、前記培養工程において、本発明の制御方法により、前記目的遺伝子の転写を制御することを特徴とする。

本発明者らは、鋭意研究の結果、本発明の新規遺伝子によれば、容易に目的遺伝子の転写を調節（誘導・抑制）できることを見出した。すなわち、本発明の新規遺伝子をプロモーターして使用した場合、転写時に存在する炭素源の種類によって、前記プロモーターの制御下にある遺伝子の転写を誘導・抑制することができる。このため、例えば、本発明の遺伝子からなるプロモーターを有する発現ベクターを宿主に導入し、その宿主（組換え体）の培養において、炭素源の種類によって、前記プロモーターの転写活性を制御すれば、前述のような宿主の増殖および目的タンパク質の生産を段階的に効率良く行うことができる。このように培養段階に応じて炭素源の種類を変えることのみによって転写の誘導・抑制を切り替える方法は、極めて簡便な制御方法である。このため、組換え体を用いた有用タンパク質の製造において、この制御方法を利用すれば、例えば、ラボスケールでのタンパク質製造であっても、極めて容易に転写活性を制御できる。したがって、本発明は、例えば、有用タンパク質の発現において、極めて優れたツールならびに方法であるといえる。

本発明の新規遺伝子は、前述のように、下記（Ａ）〜（Ｅ）のいずれかのＤＮＡからなる遺伝子であり、本発明の新規遺伝子はプロモーターとして使用できる。
（Ａ） 配列番号１の塩基配列からなるＤＮＡ
（Ｂ） 前記（Ａ）の塩基配列において１個もしくは数個の塩基が欠失、置換または付加された塩基配列からなり、かつ、イソバレリル-ＣｏＡデヒドロゲナーゼ遺伝子のプロモーター活性を示すＤＮＡ
（Ｃ） 前記（Ａ）の塩基配列において１個もしくは数個の塩基が欠失、置換または付加された塩基配列からなり、かつ、存在する炭素源の種類に応じて転写の誘導および抑制を行うプロモーター活性を示すＤＮＡ
（Ｄ） 前記（Ａ）の塩基配列において１個もしくは数個の塩基が欠失、置換または付加された塩基配列からなり、前記（Ａ）のＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡ
（Ｅ） 前記（Ａ）の塩基配列において１個もしくは数個の塩基が欠失、置換または付加された塩基配列からなり、前記（Ａ）のＤＮＡとの相同性が９０％以上であるＤＮＡ

前記（Ａ）の塩基配列は、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅのイソバレリル-ＣｏＡデヒドロゲナーゼ遺伝子（以下、「ｉｖｄＡ遺伝子」という）のプロモーター配列であり、この塩基配列がｉｖｄＡのプロモーターとして機能することは、本発明者らが初めて見出したことである。さらに、前記（Ａ）〜（Ｅ）のいずれかのＤＮＡからなる遺伝子が、存在する炭素源の種類に応じて転写の誘導および抑制を行うプロモーター活性を示すことも、本発明者らが初めて見出したことである。

前記（Ｂ）〜（Ｅ）において、欠失、置換または付加が可能な塩基数は、例えば、５０塩基に対して、１〜６個であり、好ましくは１〜５個であり、さらに好ましくは１〜４個、特に好ましくは１〜３個である。

前記（Ｃ）において、「存在する炭素源の種類に応じて転写の誘導および抑制を行うプロモーター活性」とは、例えば、以下のような意味である。例えば、本発明の遺伝子をプロモーターとして目的遺伝子の上流に挿入した発現ベクターを作成し、前記発現ベクターを導入した組換え体を培養した際に、培地に存在する炭素源の種類に応じて転写の誘導・抑制を行うことができる活性である。前記（Ｃ）のＤＮＡは、例えば、疎水性アミノ酸の存在下で転写を誘導し、親水性アミノ酸およびグルコースの少なくとも一方の存在下で転写を抑制するプロモーター活性を示すＤＮＡであることが好ましい。なお、「転写を誘導」とは、例えば、転写活性を向上させることであり、「転写を抑制」とは、例えば、転写活性を減少させることである。

前記（Ｄ）において、ハイブリダイズのストリンジェントな条件とは、例えば、当該技術分野における標準の条件があげられるが、例えば、温度条件は、各配列番号で示された塩基配列のTm値の±５℃、好ましくは±２℃、より好ましくは±１℃である。条件の具体例として、５×ＳＳＣ溶液、１０×Denhardt溶液、１００μｇ/ｍｌサケ精子ＤＮＡおよび１％ＳＤＳ中、６５℃でのハイブリダイゼーション、０．２×ＳＳＣおよび１％ＳＤＳ中、６５℃、３０分の洗浄（２回）、続いて、０．２×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳ中、６５℃、３０分の洗浄（２回）があげられる。

前記（Ｅ）における相同性は、９０％以上であり、好ましくは９５％以上、より好ましくは９７．５％以上である。

本発明の新規遺伝子としては、前記（Ａ）配列番号１の塩基配列からなるＤＮＡのみに限定されるものではなく、前記（Ｂ）〜（Ｅ）のいずれかに該当するＤＮＡであってもよい。また、配列番号１の塩基配列は、前述のようにＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ由来のイソバレリル-ＣｏＡデヒドロゲナーゼ遺伝子プロモーターであるが、前記Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ由来のみには限定されない。前記（Ｂ）〜（Ｅ）のいずれかに該当するＤＮＡは、例えば、配列番号１の塩基配列もしくはその部分配列からなるポリペプチドをプライマーとして使用するＰＣＲや、配列番号１の塩基配列もしくはその部分配列からなるポリペプチドをプローブとして使用するハイブリダイゼーション等によって、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ以外の生物（例えば、他の糸状菌）等から得ることもできる。また、公知の合成方法や変異方法によって得ることもできる。本発明の新規遺伝子は、誘導時に実用上十分な転写活性を示すことからも、プロモーターとして極めて有用である。

つぎに、本発明の発現ベクターは、前述のように、本発明のプロモーターを含むことを特徴とする。本発明の発現ベクターは、前述の本発明のプロモーターがベクターに挿入されていればよく、その他の構成等は何ら制限されず、例えば、従来公知のベクターのプロモーターに代えて、もしくは、併存して、本発明のプロモーターを有していればよい。また、本発明のプロモーターは、目的遺伝子に対して、順方向（forward）または逆方向（reverse）のいずれの方向に挿入されてもよい。

本発明のプロモーターを挿入するベクターとしては、特に制限されないが、例えば、プラスミドベクター、バイナリーベクター等の各種ベクターが使用できる。これらのベクターとしては、例えば、ウリジンやアルギニン要求性等の栄養要求性を相補する遺伝子（例えば、栄養要求性を非要求性（野生型）に戻す機能を有する遺伝子）、硫黄源、炭素源および窒素源等の資化性に関わる遺伝子、ピリチアミン耐性遺伝子等の選択マーカーを含むものでもよい。

本発明の発現ベクターは、例えば、発現させる目的遺伝子が前記プロモーター下流に挿入されていることが好ましい。目的遺伝子の挿入部位は、必ずしもプロモーターと隣り合う必要はなく、少なくとも本発明のプロモーターの制御下にある位置であればよい。また、前記目的遺伝子の下流には、適宜ターミネーター等を挿入してもよい。このようなプロモーター、目的遺伝子、ターミネーター等の連結方法や、これらのベクターへの挿入方法は、何ら制限されず、従来公知の方法（例えば、細胞工学別冊バイオ実験イラストレイテッド, 2, 秀潤社, 1998）に従って行うことができる。

前記目的遺伝子は、通常、発現させたい目的タンパク質をコードする遺伝子があげられるが、その種類は何ら制限されない。具体例としては、有用タンパク質のコード遺伝子であるグルコアミラーゼ遺伝子（ｇｌａＡ）、酸性プロテアーゼ遺伝子（ｐｅｐＡ）等があげられ、特に、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅのｇｌａＡ（Gene, 108, 145, 1991）やｐｅｐＡ（Biosci. Biotechnol. Biochem., 57, 1095, 1993）等が好ましい。また、ターミネーターは、特に制限されず、例えば、挿入する目的遺伝子と同じ生物由来のターミネーターを選択してもよく、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属（例えば、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）の遺伝子を目的遺伝子とする場合には、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属（例えば、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）のａｍｙＢやｇｌａＡ遺伝子等のターミネーターがあげられる。

つぎに、本発明の組換え体は、前述のように宿主に本発明の発現ベクターが導入されていることを特徴とし、本発明の発現ベクターが導入されている以外は何ら制限されない。

前記宿主としては、例えば、種々の微生物があげられ、特に制限されないが、例えば、前述のようにタンパク質分泌能に優れることから糸状菌が好ましく、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒｅ（ノイロスポラ）属、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ（ペニシリウム）属、Ｔｒｉｃｏｄｅｒｍａ（トリコデルマ）属、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ（リゾプス）属等があげられ、特にＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ等が好ましい。

宿主への発現ベクターの導入方法（形質転換法）は、何ら制限されないが、コンピテントセルを用いるヒートショック法、エレクトロポレーション法等の従来公知の方法（例えば、Agric. Biol. Chem., 51, 323, 1987）により行うことができる。

つぎに、本発明の制御方法は、目的遺伝子の発現を制御する方法であって、本発明のプロモーターを使用することによって、容易な方法で転写の誘導・抑制を制御できる。すなわち、本発明の制御方法は、前述のように、本発明のプロモーターの下流に目的遺伝子を配置し、炭素源の種類に応じて、前記目的遺伝子の転写の誘導・抑制を制御することを特徴とする。なお、以下、転写を誘導する炭素源を「誘導炭素源」といい、転写を抑制する炭素源を「抑制炭素源」という。

本発明の制御方法において、前記誘導炭素源としては、例えば、疎水性アミノ酸があげられ、前記抑制炭素源としては、例えば、親水性アミノ酸およびグルコースの少なくとも一方があげられる。

本発明の制御方法は、例えば、前記プロモーターの下流に目的遺伝子が挿入された本発明の発現ベクターを準備する工程、前記発現ベクターを導入した組換え体を準備する工程、および、前記組換え体を培養する工程を有し、前記培養工程において、親水性アミノ酸およびグルコースの少なくとも一方を炭素源とすることにより前記目的遺伝子の転写を抑制し、疎水性アミノ酸を炭素源とすることによって前記目的遺伝子の転写を誘導することが好ましい。このように、組換え体の培養時に、炭素源を変化させることのみによって、目的遺伝子の転写の誘導・抑制の切り替えを行うことができる。

培養法によって目的タンパク質を製造する場合、前述のように、培養前半で宿主（組換え体）の増殖を図り、培養後半で宿主（組換え体）によるタンパク質生産を開始させることが好ましい。したがって、本発明の制御方法では、前記培養工程において、培養前半に炭素源（抑制炭素源）として親水性アミノ酸およびグルコースの少なくとも一方を使用し、培養後半に炭素源（誘導炭素源）として、前記疎水性アミノ酸を使用することが好ましい。このように抑制炭素源を使用している間は、宿主が増殖し、誘導炭素源を使用している間は、増殖した宿主によりタンパク質が生産される。なお、本発明において培養前半・後半とは、それぞれ全培養時間の１／２を意味するものでなく、単に、宿主増殖とタンパク質生産との工程順序を表すものである。

前記親水性アミノ酸としては、例えば、グルタミン酸、アスパラギン酸、アルギニンがあげられ、中でも好ましくはグルタミン酸、アスパラギン酸、より好ましくはグルタミン酸があげられる。また、抑制炭素源（親水性アミノ酸、グルコース）の中でも、特にグルタミン酸が好ましい。なお、これらの親水性アミノ酸ならびにグルコースは、いずれか１種類でもよいし２種類以上を併用してもよい。

一方、前記疎水性アミノ酸としては、例えば、ロイシン、イソロイシン、バリン、フェニルアラニン、アラニン、メチオニン、トリプトファン、プロリンがあげられ、中でも好ましくはロイシン、イソロイシン、バリン、より好ましくはロイシンがあげられる。なお、これらの疎水性アミノ酸は、いずれか１種類でもよいし、２種類以上を併用してもよい。

抑制炭素源と誘導炭素源の組合せとしては、特に制限されないが、例えば、前半がグルタミン酸の場合、後半がロイシン、イソロイシン、バリンまたはこれらの混合物である組合せ、好ましくは後半がロイシンである組合せ、前半がグルコースの場合、後半がロイシン、イソロイシン、バリンまたはこれらの混合物である組合せ、好ましくはイソロシンである組合せ等があげられる。

前記炭素源の組合せとしては、例えば、各炭素源を使用した場合における転写活性が、次のような関係となるものも好ましい。例えば、抑制炭素源を使用した際の転写活性に対する誘導炭素源を使用した際の転写活性が、１０〜３００倍であることが好ましく、より好ましくは５０〜３００倍であり、特に好ましくは１００〜３００倍である。なお、ここでいう転写活性とは、転写活性そのものでもよいし、プロモーターの制御下で発現したタンパク質の活性や発現量であってもよい。

つぎに、本発明の目的タンパク質の製造方法は、目的タンパク質をコードする目的遺伝子を有する組換え体の培養工程を含む方法であって、前記組換え体が本発明の組換え体であって、前記培養工程において、本発明の制御方法により、前記目的遺伝子の転写を制御することを特徴とする。

本発明の目的タンパク質の製造方法は、本発明の組換え体を使用し、本発明の制御方法により目的遺伝子の転写を制御する以外は、何ら制限されず、その他の条件等は、従来公知の培養方法等が採用できる。

培地の種類や培養条件等は、特に制限されず、例えば、宿主の種類や生産するタンパク質の種類等に応じて適宜決定できる。培地の具体例としては、例えば、Ｃｚａｐｅｋ-Ｄｏｘ（例えば、炭素源１〜３重量％）等があげられる。培養温度は、通常、宿主の種類に応じて決定できるが、例えば、２５〜３５℃の範囲が一般的である。また、培養時間も、通常、宿主の種類に応じて決定できるが、一般的に、２〜４日の範囲である。この培養時間のうち、前述のように宿主の増殖を目的として抑制炭素源の存在下で培養する時間は、例えば、１／４〜１／２の範囲であり、残りがタンパク質の生産期である。宿主の増殖は、例えば、濁度測定等による菌体密度測定によって確認でき、十分な菌体密度に達した時点で誘導炭素源への切り替えを行うこともできる。

培地における抑制炭素源の添加割合は、特に制限されないが、例えば、１〜１０重量％の範囲、好ましくは１〜５重量％であり、より好ましくは１〜３重量％である。一方、培地における誘導炭素源の添加割合は、特に制限されないが、例えば、１〜１０重量％の範囲、好ましくは１〜５重量％であり、より好ましくは１〜３重量％である。抑制炭素源または誘導炭素源は、一定の添加割合を保つように、フィーディングを行うことが好ましい。なお、抑制炭素源から誘導炭素源に切り替える場合には、培地における抑制炭素源が減少した状態で、誘導炭素源を添加することが好ましい。

このような培養方法によって生産されたタンパク質は、例えば、従来公知の方法で培養液から回収することができる。また、得られたタンパク質は、所望に応じて、例えば、塩析、カラムクロマトグラフィー等の従来公知の方法によって精製してもよい。

本発明の新規遺伝子を有する発現プラスミドを構築し、各炭素源を使用した場合における転写活性を測定した。なお、本発明は、以下の実施例に限定されるものではない。

（転写活性解析用プラスミドｐＮＧ１の構築）
形質転換用の選択マーカーとしてＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅの硝酸還元酵素遺伝子（ｎｉａＤ遺伝子）（Mol. Gen. Genet., 218, 99, 1989）、レポーター遺伝子として大腸菌のβ-グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）遺伝子（ｕｉｄＡ遺伝子）（Proc. Natl. Actad. Sci., 83, 8447, 1986）、その下流にＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅのタカアミラーゼ遺伝子（ａｍｙＢ遺伝子）のターミネーターを含む転写活性解析用プラスミドｐＮＧ１を、以下の方法により構築した。

プロモーターの転写活性を測定するため、以下の方法により、図1に示す転写活性解析用プラスミドｐＮＧ１を構築した。まず、硝酸還元酵素遺伝子（ｎｉａＤ遺伝子）を含むプラスミドｐＵＮ１（Biosci. Biotech. Biochem., 61, 1367, 1997）のＳａｌＩ-ＳｐｈＩサイトに、プラスミドｐＧＡＰＧ１（Curr. Genet., 22, 85, 1992）を鋳型としてＰＣＲ法により増幅させたｕｉｄＡ遺伝子とその下流にａｍｙＢ遺伝子のターミネーターとを含むＤＮＡ断片を挿入した。このＤＮＡ断片の増幅には、プライマーとして、ＳａｌＩサイトを付加した上流プライマー（forward primer配列番号２）と、ＳｐｈＩサイトを付加した下流プライマー（reverse primer配列番号３）とを使用した。
Forward primer(Salus) : 5'-ggtcgacatgttacgtcctgtagaaacccc-3'
Reverse primer(Sphua) : 5'-ccgcatgcctttcctataatagactagcg-3'

（プロモーター遺伝子断片の取得とｐＮＧ１への挿入）
ｐＮＧ１におけるｕｉｄＡ遺伝子上流のＳｍａＩ-ＳａｌＩサイトに、ｉｖｄＡ遺伝子のプロモーター（配列番号１）を挿入したプラスミドを作製した。ｉｖｄＡ遺伝子のプロモーターは、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ ＲＩＢ１２８（独立行政法人酒類総合研究所）のゲノムＤＮＡを鋳型としてＰＣＲ法により増幅させた。ｉｖｄＡ遺伝子のプロモーターの増幅には、適当な制限酵素サイトを付加したプライマーを使用した。具体的には、ＳｍａＩサイトを付加した上流プライマー（forward primer配列番号４）と、ＳａｌＩサイトを付加した下流プライマー（reverse primer配列番号５）とを使用した。
Forward primer（SmaivdA） :
5'-tgccccgggtgcggggataatctagggagagc-3'
Reverse primer（SalivdA） :
5'-ggcgtcgactgtgcgaaaggtatctctgcagg-3'

ＰＣＲは、（94℃, 1分）→（55℃, 1分）→（72℃, 1分）の反応条件で３０サイクル行った。ＰＣＲ増幅後の反応液をQIAquick PCR Purification Kit （商品名、株式会社キアゲン、以下同様）を用いて精製した後、ＰＣＲ産物を、各プライマーに付加した制限サイトを切断する制限酵素で処理し、再度、QIAquick PCR Purification Kitにより精製した。これらの遺伝子断片を、ＳｍａＩおよびＳａｌＩで処理したｐＮＧ１へ、Ligation kit ver. 2（商品名、タカラバイオ株式会社）を用いて挿入し、各プロモーターのプラスミドサンプルを構築した。なお、対照として、ａｍｙＢ遺伝子のプロモーターを挿入したプラスミドサンプルも、同様にして構築した。

（アスペルギルス・オリゼーへの形質転換）
つぎに、前述のｉｖｄＡ遺伝子のプロモーターまたはａｍｙＢ遺伝子のプロモーターが挿入された前記プラスミドサンプルを用いて、以下の方法により、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅを形質転換した。まず、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅのｎｉａＤ遺伝子変異株であるｎｉａＤ３００株（ 独立行政法人酒類総合研究所 ）を、デキストリン-ペプトン培地（２重量％デキストリン、１重量％ポリペプトン、０．５重量％ＫＨ₂ＰＯ₄、０．１重量％ＮａＮＯ₃、０．０５重量％ＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ、ｐＨ６．５）で回転振とう培養（３０℃、１４５ｒｐｍ、20時間）した後、回収した菌体を滅菌水で洗浄した。この菌体をプロトプラスト化緩衝液（１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ６、０．８Ｍ ＮａＣｌ、０．５ｍｇ／ｍｌ Yatalase（タカラバイオ株式会社））に懸濁し、３０℃で２時間、緩やかに振とうすることによりプロトプラスト化を行った。得られたプロトプラストを乾熱滅菌した３Ｇ-３のグラスフィルターでろ過し、残存する菌体を除去した後、０．８Ｍ ＮａＣｌ溶液で２回洗浄した。次に、このプロトプラストをＴＦ液（１）（０．８Ｍ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＣａＣｌ₂、１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液、ｐＨ８、以下同様）に、２×１０⁸個／ｍｌとなるように懸濁した後、０．２容量のＴＦ液（２）（４０％（Ｗ／Ｖ）ＰＥＧ４０００、５０ｍＭ ＣａＣｌ₂、５０ｍＭ トリス−塩酸緩衝液、ｐＨ８、以下同様）を加えてコンピテントセルを調製した。

前記コンピテントセル０．２ｍｌに、導入する前述のプラスミドサンプルを５０μｇ加え、氷上で３０分間静置した後、前記ＴＦ液（２）１ｍｌを加えて、さらに１５分間室温で静置した。これに、前記ＴＦ液（１）８．５ｍｌを添加した後、遠心分離（１８００ｒｐｍ、５分間）によりプロトプラストを回収し、再度、ＴＦ液（１）０．２ｍｌに懸濁した。このプロトプラスト懸濁液を、再生用下層最少平板培地（０．６重量％ＮａＮＯ₃、０．１５２重量％ＫＨ₂ＰＯ₄、０．０５２重量％ＫＣｌ、０．０５２重量％ＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ、０．８Ｍ ＮａＣｌ、２重量％ａｇａｒ、ｐＨ６．５）上にのせ、さらに、予め４５℃に保温した再生用上層最少培地（前記下層最小平板培地のagar濃度を０．５重量％にしたもの）５ｍｌを重層して、前記プロトプラストを包埋した。これを３０℃で１０日間培養した後、生育してきた形質転換体を釣菌した。

（ｎｉａＤ相同組換えによるプラスミド１コピー導入株の選抜）
サザン解析によって、形質転換体の中からｎｉａＤ座位にプラスミドが1コピー導入された菌株を選抜した。まず、各形質転換体より抽出したゲノムＤＮＡをＳａｌＩで完全消化し、０．８重量％アガロース電気泳動により分離してナイロンメンブレン・ハイボンドN+ （商品名、アマシャムバイオサイエンス株式会社）にブロットした。プローブとして、ＰＣＲ法により増幅したｎｉａＤ遺伝子の塩基配列の一部を用いた。プローブを増幅するため鋳型としてはｐＵＮ１を用い、プライマーは配列番号６の上流側プライマー（forward primer）と配列番号７の下流側プライマー（reverse primer）を使用した。
Forward primer(Prnis) : 5'-ggcaaccatcaccgaggtgcgg-3'
Reverse primer(Prnia) : 5'-ggtaagacgcggttgtcattg-3'

プローブのラベリングおよびシグナルの検出はECL Direct Nucleic Acid Labelling and Detection System（商品名、アマシャムバイオサイエンス株式会社）を用いた。宿主であるＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅｎｉａＤ３００株においては、８．２ｋｂのシグナルが現れるが、前記解析用プラスミドがｎｉａＤ座位に1コピー導入された形質転換体は、このシグナルが消失し、代わりに８．５ｋｂおよび１１．１ｋｂの２本のシグナルが現れる。したがって、この２本のシグナルの有無に基づいて目的の形質転換体を選抜した。

（各形質転換体のＧＵＳ活性測定）
選抜された前記形質転換体菌体内のＧＵＳ蛋白活性を公知の方法（Proc. Natl. Sci. USA, 83, 8447, 1986）に準じて測定した。すなわち、最少培地（０．６重量％ＮａＮＯ₃、０．１５２重量％ＫＨ₂ＰＯ₄、０．０５２重量％ＫＣｌ、０．０５２重量％ＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ、ｐＨ６．５）１００ｍｌに、１重量％アミノ酸（Ｌ−ロイシン、Ｌ-イソロイシン、Ｌ-バリン、Ｌ-アラニン、Ｌ-アルギニンまたはＬ-グルタミン酸）または１重量％グルコースを添加した液体培地を準備し、この液体培地へ形質転換体の分生子を５×１０⁷個／１００ｍｌとなるよう接種し、回転振とう培養（３０℃、４８時間、１８０ｒｐｍ）した。なお、ａｍｙＢ遺伝子のプロモーターが挿入された前記プラスミドサンプルを用いた形質転換体については、１重量％デキストリンもしくは１重量％グルコースを添加して同様に培養を行った。

そして、３Ｇ−１のグラスフィルターで回収した培養菌体を滅菌水で３回洗浄し、濾紙にはさんで十分に脱水した後、液体窒素で凍結して乳鉢で破砕し、この破砕菌体０．５ｇを抽出緩衝液（５０ｍＭ ＮａＨ₂ＰＯ₄・２Ｈ₂Ｏ、１０ｍＭ ２−メルカプトエタノール、０．１重量％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、１０ｍＭ ＥＤＴＡ・Ｎａ₂、０．１重量％Ｎ−ラウリルサルコシン、ｐＨ７．０）５ｍｌに懸濁した。これを室温で１分間ボルテックスミキサーにより攪拌した後、遠心分離（１５０００ｒｐｍ、１０分間）し、回収した上清を粗酵素液とした。

前記粗酵素液０．０５ｍｌをＧＵＳ反応液（５０ｍＭ ＮａＨ₂ＰＯ₄・２Ｈ₂Ｏ、１０ｍＭ ２−メルカプトエタノール、０．１重量％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、１ｍＭ ｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−グルクロニド、ｐＨ７）０．４５ｍｌに添加し、３７℃で３０分間反応させ、反応停止液（２．５Ｍ ２−アミノ−２−メチル−１，３−プロパンジオール）０．２ｍｌを混和した。そして、反応停止後の反応液について、波長４１５ｎｍにおける吸光度を測定し、遊離したｐ−ニトロフェノール量を求めた。前記粗酵素液のタンパク質濃度は、ウシ血清アルブミンを標準とし、プロテインアッセイ（日本バイオ・ラッド ラボラトリーズ株式会社）を用いて定量した。ＧＵＳ活性は基質であるp-ニトロフェニル -β-グルクロニドから１分間に１ｎｍｏｌのp-ニトロフェノールを遊離する活性を１Ｕとして表した。得られた結果を下記表１に示す。

前記表１に示すように、ｉｖｄＡ遺伝子のプロモーターは、１重量％ロイシンを炭素源とした場合、強力な転写活性を示すａｍｙＢ遺伝子プロモーターの誘導時（１％デキストリン使用）に対して、約８０％にあたる高い転写活性を示した。また、イソロイシン、バリンのような疎水性分岐鎖アミノ酸においても、比較的高い転写活性を示した。一方、炭素源を１重量％グルタミン酸にした場合、その転写活性は、１重量％ロイシンを使用した場合の約１／２８０に急減した。ａｍｙＢ遺伝子の場合、グルコースを使用した場合、デキストリンを使用した場合に比べて約１／６程度の減少しか見られず、約１／２８０の減少は、その約４５倍であり、極めて顕著な抑制であるといえる。したがって、ｉｖｄＡ遺伝子のプロモーターによれば、実用上十分に高い転写活性を示し、且つ、炭素源の変化によって、顕著な転写活性の調節（誘導・抑制）を容易に実現できることがわかる。

本発明の新規遺伝子、すなわちプロモーターによれば、炭素源の種類によって、容易に転写活性の調節（誘導・抑制）を行うことができる。このため、形質転換体を用いた培養によって効率良くタンパク質を生産するために、宿主の増殖とタンパク質の生産とを段階的に行う場合、炭素源の種類によって容易に目的タンパク質のコード遺伝子について転写を制御できる。したがって、本発明は、特に有用タンパク質の大量生産等において極めて優れたプロモーターといえる。

図１は、本発明における転写活性解析用プラスミドｐＮＧ１を示す図である。

Claims (15)

1. 下記（Ａ）〜（Ｅ）のいずれかのＤＮＡからなる新規遺伝子。
   （Ａ） 配列番号１の塩基配列からなるＤＮＡ
   （Ｂ） 前記（Ａ）の塩基配列において１個もしくは数個の塩基が欠失、置換または付加された塩基配列からなり、かつ、イソバレリル-ＣｏＡデヒドロゲナーゼ遺伝子のプロモーター活性を示すＤＮＡ
   （Ｃ） 前記（Ａ）の塩基配列において１個もしくは数個の塩基が欠失、置換または付加された塩基配列からなり、かつ、存在する炭素源の種類に応じて転写の誘導および抑制を行うプロモーター活性を示すＤＮＡ
   （Ｄ） 前記（Ａ）の塩基配列において１個もしくは数個の塩基が欠失、置換または付加された塩基配列からなり、前記（Ａ）のＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡ
   （Ｅ） 前記（Ａ）の塩基配列において１個もしくは数個の塩基が欠失、置換または付加された塩基配列からなり、前記（Ａ）のＤＮＡとの相同性が９０％以上であるＤＮＡ
2. 前記（Ｃ）のＤＮＡが、疎水性アミノ酸の存在下で転写を誘導し、親水性アミノ酸およびグルコースの少なくとも一方の存在下で転写を抑制するプロモーター活性を示すＤＮＡである、請求項１記載の新規遺伝子。
3. 前記遺伝子が、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ由来のイソバレリル-ＣｏＡデヒドロゲナーゼ遺伝子プロモーターである、請求項１または２記載の新規遺伝子。
4. 請求項１〜３のいずれか一項に記載の新規遺伝子からなるプロモーター。
5. プロモーターを含む発現ベクターであって、前記プロモーターが請求項４記載のプロモーターである発現ベクター。
6. 目的遺伝子が前記プロモーター下流に挿入されている、請求項５記載の発現ベクター。
7. 前記目的遺伝子が、目的タンパク質をコードする遺伝子である、請求項６記載の発現ベクター。
8. 発現ベクターがプラスミドである、請求項５〜７のいずれか一項に記載の発現ベクター。
9. 宿主に発現ベクターを導入した組換え体であって、前記発現ベクターが請求項５〜８のいずれか一項に記載の発現ベクターである組換え体。
10. 前記宿主が糸状菌である、請求項９記載の組換え体。
11. 目的遺伝子の発現を制御する方法であって、請求項４記載のプロモーターの下流に目的遺伝子を配置し、炭素源の種類に応じて、前記目的遺伝子の転写の誘導・抑制を制御することを特徴とする制御方法。
12. 疎水性アミノ酸を炭素源とすることによって前記目的遺伝子の転写を誘導し、親水性アミノ酸およびグルコースの少なくとも一方を炭素源とすることにより前記目的遺伝子の転写を抑制する、請求項１１記載の制御方法。
13. 前記プロモーターの下流に目的遺伝子が挿入された発現ベクターを準備する工程、前記発現ベクターを導入した組換え体を準備する工程、および、前記組換え体を培養する工程を有し、
    前記培養工程において、親水性アミノ酸およびグルコースの少なくとも一方を炭素源とすることにより前記目的遺伝子の転写を抑制し、疎水性アミノ酸を炭素源とすることによって前記目的遺伝子の転写を誘導する、請求項１２記載の制御方法。
14. 前記培養工程において、培養前半に炭素源として親水性アミノ酸およびグルコースの少なくとも一方を使用し、培養後半に炭素源として、疎水性アミノ酸を使用する、請求項１３記載の制御方法。
15. 目的タンパク質をコードする目的遺伝子を有する組換え体の培養工程を含む目的タンパク質の製造方法であって、
    前記組換え体が請求項９または１０記載の組換え体であって、
    前記培養工程において、請求項１１〜１４のいずれか一項に記載の制御方法により、前記目的遺伝子の転写を制御することを特徴とする目的タンパク質の製造方法。

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