KR19990084507A - 피치아 시페리 유래의 세린 팔미토일 트랜스퍼라제를 코딩하는유전자 및 이를 이용한 taps 생산방법 - Google Patents

피치아 시페리 유래의 세린 팔미토일 트랜스퍼라제를 코딩하는유전자 및 이를 이용한 taps 생산방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 피치아 시페리(Pichia ciferrii) ATCC 14091 유래의 세린 팔미토일 트랜스퍼라제(serine palmitoyl transferase)를 코딩하는 유전자 LCB2, 이 유전자를 포함하는 플라스미드 prACL2(KCTC-0468BP), 이에 의해 형질전환된 피치아 시페리 및 이를 배양하여 세라미드의 원료인 테트라아세틸 피토스핑고신(TAPS : tetraacetyl phytosphingosine)을 대량 생산하는 방법을 제공한다.
본 발명에 의해 제공되는 플라스미드 prACL2(KCTC-0468BP)에 의해 형질전환된 형질전환체는 모균주 KFCC-10937에 비하여 최소 1.3배의 TAPS 생산능을 갖고 있다.

Description

피치아 시페리 유래의 세린 팔미토일 트랜스퍼라제를 코딩하는 유전자 및 이를 이용한 ＴＡＰＳ 생산방법
본 발명은 피치아 시페리(Pichia ciferrii) ATCC 14091 유래의 세린 팔미토일 트랜스퍼라제(serine palmitoyl transferase)를 코딩하는 유전자 LCB2, 이 유전자를 포함하는 플라스미드 prACL2(KCTC-0468BP), 이에 의해 형질전환된 피치아 시페리, 및 이를 배양하여 세라미드의 원료인 테트라아세틸 피토스핑고신(TAPS : tetraacetyl phytosphingosine)을 대량 생산하는 방법에 관한 것이다.
세라미드(ceramides)는 피부 표층(stratum corneum)에서 이중사슬 라멜라 구조에 의해 피부 표면에 결합되어 매끄럽고 탄력성 있는 피부를 유지시켜 주며, 피부를 보호하고 피부건조를 방지하는 효능을 갖고 있어 기능성 화장품에 사용되어 왔다. 그 구조를 보면 수산화된 2차 아민(hydroxylated secondary amine)에 고급 지방산이 아미드 결합으로 연결되어 있으며, 이러한 화합물질들을 통칭하여 세라미드라 하며, 스핑고지질(sphingolipids)에 속한다(EP B 097,059).
세라미드를 포함하는 스핑고지질은 유핵세포의 원형질막에 존재하며, 동물의 경우에는 세포-세포의 인식, 세포의 성장이나 분화를 조절하는 기능을 갖고 있다. 스핑고지질의 분해물인 스핑고신, 스핑고신-1-인산, 리소스핑고지질, 세라미드 등은 신호전이체계에서 2차 메신저 역할을 한다(Nagiec et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91, 7899, 1994).
상술한 바와 같이, 세라미드는 다양한 생리활성을 갖고 있음에도 불구하고, 천연 동식물 및 미생물에 극미량으로 존재하여, 이를 추출법에 의해 공급하는 경우 경제적 부담이 매우 크다.
반면, TAPS를 포함한 피토스핑고신(phytosphingosine)은 세라미드와 마찬가지로 피부 보호, 피부건조 방지 등의 유효 효능을 나타낼 뿐만 아니라, 다양한 미생물에 의해 생산되어 천연원료 확보가 용이하다. 또한, N-아실화반응에 의해 세라미드로 용이하게 전환되기 때문에 세라미드의 원료로서도 유용하다.
특히, 피치아 시페리는 피토스핑고신류인 TAPS를 생산하여 세포 밖으로 분비하는 특징을 갖고 있어, 그 이용성이 높다(Barenholz et al., Biochem. Biophys. Acta, 248, 458, 1971; ibid, 306, 341, 1973). 그러나, 야생종인 피치아 시페리 ATCC 14091 및 F-60-10(NRRL 1301) 균주의 TAPS 생산량은 미량이어서(Wickerham & Burton, J. Bacteriol., 80, 484, 1960), 이들 균주의 TAPS 생산량을 증가시키기 위한 변이주 개발이 활발히 진행되고 있다(미국특허 5,618,706). 본 발명자들도 TAPS 생산량이 증가되고 발효기간도 단축되어 생산성이 크게 향상된 변이주(KFCC-10937)를 개발하여 특허출원한 바 있다(한국특허출원 96-67997호).
나아가, 본 발명자들은 개발된 피치아 시페리 KFCC-10937의 TAPS 생산성을 더욱 증가시키기 위하여 유전공학적으로 접근하게 되었다. 그 결과 야생균주인 피치아 시페리 ATCC 14091로부터 TAPS를 포함한 피토스핑고신의 생합성에 관여하는 세린 팔미토일 트랜스퍼라제를 코딩하는 유전자를 클로닝하게 되었으며, 이 유전자를 본 발명자들이 개발한 변이주 KFCC-10937에 형질전환하여, 형질전환체의 증가된 TAPS 생산성을 확인함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명의 목적은 TAPS의 생합성에 관여하는 피치아 시페리 유래의 세린 팔미토일 트랜스퍼라제에 대한 유전정보를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 피치아 시페리 유래의 세린 팔미토일 트랜스퍼라제를 코딩하는 유전자를 포함하는 플라스미드 prACL2 및 이에 의해 형질전환되어 향상된 TAPS 생산능을 갖는 형질전환체를 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 또다른 목적은 상기한 형질전환된 피치아 시페리로부터 TAPS를 대량 생산하는 방법을 제공하는 것이다.
도 1은 피치아 시페리 유래의 LCB2 유전자의 제한효소지도이며, 화살표의 방향과 길이는 염기서열 결정방향 및 염기서열 결정정도를 나타낸다.
도 2는 피치아 시페리 유래의 L41 유전자가 리보좀 유전자의 여러 부위에 각각 삽입된 플라스미드의 제한효소지도이다.
도 3는 플라스미드 prACL2의 제작방법 및 제한효소 지도이다.
상기한 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 야생균주인 피치아 시페리 ATCC 14091로부터 TAPS를 포함한 피토스핑고신의 생합성에 관여하는 세린 팔미토일 트랜스퍼라제를 코딩하는 유전자 LCB2를 클로닝하여 그 염기서열을 결정하였다.
1. 세린 팔미토일 트랜스퍼라제를 코딩하는 유전자 LCB2의 분리 :
스핑고지질의 생합성 과정을 살펴보면, 첫 단계는 세린 팔미토일 트랜스퍼라제(3-ketosphinganine synthase, EC 2.3.1.50)가 세린과 팔미토일 코엔짐 (palmitoyl Co-A)을 응축하여 탄소수 18의 3-케토스핑가닌(3-ketosphinganine)을 형성하는 단계이며, 이 단계가 스핑고지질 생합성 과정의 속도결정단계(rate limiting step)이다(Barenholz et al., Biochem. Biophys. Acta, 248, 458, 1971; ibid, 306, 341, 1973). 이후에, 3-케토스핑가닌은 동물의 경우에는 긴 사슬로, 식물과 곰팡이에서는 피토스핑고신의 전구물질로 사용된다.
즉, 본 발명에서는 속도결정단계에서 작용하는 효소인 세린 팔미토일 트랜스퍼라제를 야생균주 피치아 시페리 ATCC 14091로부터 클로닝하여, 이를 본 발명자들이 개발한 발효기간이 단축되고 생산성이 크게 향상된 변이주 KFCC-10937에 형질전환시켜서 얻은 형질전환체의 TAPS 생산능을 검증하게 되었다.
본 발명자들은 피치아 시페리 ATCC 14091의 게놈 DNA로부터 세린 팔미토일 트랜스퍼라제를 코딩하는 유전자를 클로닝하기 위하여, 먼저 공지의 세린 팔미토일 트랜스퍼라제 유전자의 서브유닛들을 참조하여 프로브를 작성하였다.
사카로마이세스 세레비지아에(Saccharomyces cerevisiae) 유래의 세린 팔미토일 트랜스퍼라제를 코딩하는 유전자는 두 개의 서브유닛, 즉 LCB1과 LCB2로 구성되어 있으며(LCB는 long chain base의 약자이다; Nagiec et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91, 7899, 1994), 사람, 생쥐, 클레브시엘라 락티스(Klebsiella lactis), 쉬조사카로마이세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe) 유래의 LCB2 유전자의 DNA 염기서열도 공지되어 있다(Nagiec et al., Gene, 177, 237, 1996; Hanada et al., J. Biol. Chem., 272, 32108, 1997; Weiss & Stoffel, Eur. J. Biochem., 249, 239, 1997).
먼저, 사카로마이세스 세레비지아에 유래의 LCB1 유전자의 DNA 염기서열(Nagiec et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91, 7899, 1994)을 참조하여, LCB1 유전자의 1kb 크기의 PstⅠ 단편을 프로브로 피치아 시페리 ATCC 14091의 게놈 DNA와 서던블럿하였을 때 밴드를 확인하지 못하였다. 그러나, LCB2 유전자의 0.9kb 크기의 SalⅠ 단편을 프로브로 서던블럿하였을 때에는, 12kb 크기의 LCB2 유전자를 함유하는 DNA 밴드를 확인하였으며, 플라스미드에 삽입하여 라이브러리를 제조하였다. 서던블럿을 반복 수행하여 3.0kb 크기의 ScaⅠ/ AflⅢ 절편으로 축소시켜 플라스미드 pL2SA을 제조하였다(도 1). LCB2 유전자의 염기서열을 결정하였으며, 그 결과는 서열 1에 나타내었다. DNA 염기서열은 GenBank에 AF053456(98.3.7)으로 등록하였다.
염기서열을 비교하면, 피치아 시페리 ATCC 14091의 LCB2 유전자는 1688bp 크기로 인트론은 없으며, 염기서열을 바탕으로 유추한 아미노산 서열도 사카로마이세스 세레비시아에의 아미노산 서열과 상당히 유사하였다. 또한, 55-79 위치에 트랜스멤브레인 헤릭스 영역(transmembrane helix region)이 존재하며, 피리독살 포스페이트(pyridoxal phosphate)와 시프 염기(Schiff base)를 형성하는 리신(lysine)을 포함하는 영역에서는 동일한 아미노산 서열을 갖고 있었다.
2. 형질전환법 :
피치아 시페리 ATCC 14091는 한세눌라(Hansenula)속(屬)으로 불리웠다가, 최근에 5S-RNA 분석에 의해 피치아속(屬)으로 개칭되었다(Yamada et al., Biosci. Biotechnol. Biochem., 58, 1245, 1994). 그 만큼 피치아속 효모에 대한 유전학적 연구가 미비하여 피치아 시페리 균주에 형질전환하는 방법도 개발되지 않았다. 이에, 본 발명자들은 본 출원 발명과 별도로 피치아 시페리에 대한 형질전환법을 개발하였으며, 본 명세서에서는 그 결과의 일부만을 기재한다.
본 발명에서의 형질전환법은 캔디다 유틸리스(Candida utilis)를 대상으로 한 형질전환법(Kondo et al., J. Bacteriol., 177, 7171, 1995)을 활용하여 개발된 것이다. 이 방법에서는, 효모에서의 발현을 고려하여, 세균 유래의 카나마이신 등의 항생제 내성 표지유전자 대신에, 효모 유래의 항생제 내성 표지유전자를 사용한다.
2-1. 형질전환체 선별을 위한 플라스미드 pCYH1.9r의 제작 :
피치아 시페리 ATCC 14091의 리보좀 단백질(ribosomal protein) L41 유전자를 클로닝하여 플라스미드 pCYH1.9를 제작한 후, DNA 염기서열을 결정하였으며 그 결과를 서열 2에 나타내었다. DNA 염기서열은 GenBank에 AF053457(98.3.7)로 등록하였다.
피치아 시페리 ATCC 14091의 L41 유전자는 419bp의 인트론을 포함하여 총 737bp로 구성되었으며, 염기서열을 바탕으로 아미노산 서열을 추정하여 보면, 다른 효모류와 90% 이상의 유사성을 보이고 있다. 항생제인 시클로헥시미드(cycloheximide)에 대해 민감성을 나타내는 56번 아미노산이 프롤린임을 확인하였다.
부위 지정 변이법(site directed mutagenesis)을 사용하여 56번 프롤린을 글루타민으로 대체하여 항생제 시클로헥시미드에 대한 저항성을 부여하였으며, 플라스미드 pCYH1.9r을 제작하였다.
이하, 본 명세서에서 L41 유전자를 CYH로, 시클로헥시미드에 대해 저항성을 나타내는 L41 유전자를 CYHr로 표기하기도 한다.
2-2. 목적 유전자의 염색체로의 삽입 효율을 증가시키기 위한 플라스미드 prDX9.0의 제작 :
목적 유전자가 염색체로 삽입되는 효율을 높이기 위하여 세포내에 수백 카피 존재하는 리보좀 DNA를 사용하였다.
피치아 시페리 리보좀 RNA의 부분 염기서열(Yamada et al., Biosci. Biotechnol. Biochem., 58, 1245, 1994)을 참조하여 합성한 프라이머로 PCR을 수행하여 6.0kb의 리보좀 DNA 단편을 확보한 후, 이 단편을 프로브로 서던블럿하여 9kb 크기의 피치아 시페리 ATCC 14091의 리보좀 DNA 단편을 분리하였으며, 플라스미드 pBluescript KS+에 삽입하여 플라스미드 prDX9.0을 제작하였다.
2-3. 형질전환 및 형질전환체 선별 :
클래스와 피터의 방법(Klass & Peter, Curr. Genet., 25, 305, 1994)에 따라, 600㎚에서의 흡광도 1.5까지 자랐을 때 원심분리하여 회수한 모균주에 플라스미드들을 첨가하고, 전압 500Ｖ, 정전용량 50㎌, 저항 800Ω의 조건에서 전기자극(electroporation)을 가한 후, 시클로헥시미드를 첨가한 YEPD 고체배지에 도말하여 형질전환체를 선발하였다.
3. LCB2 유전자를 함유한 재조합 플라스미드 prACL2의 제작 및 형질전환 :
도 3에 도시된 방법에 따라 LCB2 유전자를 함유한 재조합 플라스미드 prACL2를 제작하였으며, 이 플라스미드는 CYHr와 LCB2 유전자가 리보좀 DNA 절편에 나란히 연결된 형태를 이루고 있다. 이 플라스미드는 한국과학기술연구원 생명공학연구소내 유전자은행에 부다페스트 조약하의 규정에 따라 1998년 5월 4일자로 국제기탁하여 수탁번호 KCTC-0468BP호를 부여받았다.
이 플라스미드를 상술한 2-3.에 기재된 방법에 따라, 본 발명자들에 의해 개발된 변이주 피치아 시페리 KFCC-10937에 형질전환하였고, 유전자 카피수가 높은 형질전환체를 선별하였다.
4. 형질전환체의 발효에 의한 TAPS의 생산 :
형질전환체를 YGM 최적배지(글리세롤 100g/ℓ, 효모 추출물 2g/ℓ, KNO33g/ℓ, (NH4)2SO40.5g/ℓ, MgSO4·7H2O 0.3g/ℓ, NaCl 0.5g/ℓ, CSL 3g/ℓ, LS-300 1g/ℓ)에서 4일간 발효하여 TAPS를 생산한다.
본 발명에 의해 제공되는 형질전환체는 모균주 KFCC-10937에 비하여 적어도 1.3배의 TAPS 생산능을 갖고 있다.
이하, 실시예를 참조하여 본 발명의 구성 및 작용효과를 보다 구체적으로 설명한다.
<실시예 1> LCB2 유전자 클로닝을 위한 프로브의 제작 :
프라이머 L2f : 5'-ATG AGT ACT CCT GCA AAC TA-3',
프라이머 L2r : 5'-TAA CAA AAT ACT TGT CGT CC-3'를 합성하고 PCR을 수행하여 1680bp의 사카로마이세스 세레비지아에 LCB2 유전자를 분리하였다. 913bp의 제한효소 SalⅠ 단편을 DIG-라벨링 검출 킷트(labeling and detection kit, Boehringer Mannheim사 제품)를 사용하여 제품 매뉴얼에 따라 라벨링하여 프로브를 제작하였다.
<실시예 2> 피치아 시페리 ATCC 14091의 게놈 DNA의 추출 :
존스톤의 방법(Yeast Genetics, molecular aspects, pp. 107-123, IRL Press, 1988)에 따라 YEPD 배지(펩톤 2%, 효모 추출물 1%, 글루코스 2%)에서 배양한 피치아 시페리 ATCC 14091로부터 게놈 DNA를 추출하였다.
<실시예 3> 플라스미드 pL2SA의 제작 :
실시예 2의 DNA를 제한효소 BamHⅠ, EcoRⅠ, EcoRⅤ, HindⅢ, PstⅠ, SalⅠ으로 각각 처리하고, 0.9%의 아가로스 겔에서 전기영동한 다음, 나이트란 멤브레인(Nytran membrane, Schleicher & Schuell사 제품)으로 옮겨, 실시예 1에서 제조한 프로브와 서던블럿하였다.
서던블럿 조건은 하이브리드액(5X SSC, 0.1%의 N-라우릴사르코신, 0.02%의 SDS, 2%의 블로킹제(blocking agent), 30%의 포름아미드)을 사용하여 42℃에서 6시간 반응시키는 것으로, Boehringer Mannheim사의 제품 매뉴얼에 따라 처리하였다.
알칼리성 인산효소(alkaline phosphatase)가 결합된 항체를 투여한 후, BCIP와 X-포스페이트(X-phosphate)를 첨가하여 보라색으로 염색된 밴드를 관찰하였다. HindⅢ로 처리한 12kb 크기의 DNA에서 양성반응을 나타냈다.
밴드가 나타난 위치의 DNA를 추출하여 플라스미드 pBluescript KS+에 연결시킨 다음, 대장균 DH5α에 형질전환하여 라이브러리를 제조한 후, 이 라이브러리를 대상으로 서던블럿을 반복하여 3.0kb 크기의 ScaⅠ/ AflⅢ 단편으로 축소하여 플라스미드 pL2SA을 제작하였다.
LCB2 유전자의 제한효소 지도와 염기서열 결정방법은 도 1에 나타내었고, 그 결과를 서열 1에 나타내었다. 피치아 시페리의 LCB2 유전자의 염기서열은 GenBank에 AF053456(98.3.7)으로 등록하였다.
피치아 시페리 ATCC 14091의 LCB2 유전자는 인트론이 없는 1688 bp 크기로, 아미노산 서열에서도 사카로마이세스 세레비시아에의 아미노산 서열과 상당히 유사하였다.
<실시예 4> 피치아 시페리 ATCC 14091의 L41 유전자의 추출 :
프라이머 CYH1 : 5'-CGC GTA GTT AAY GTN CCN AAR AC-3',
프라이머 CYH4 : 5'-GCC TGG CCY TTY TGY TTY TTN TC-3'을 합성하고, 실시예 2에서 추출한 피치아 시페리의 게놈 DNA와 PCR 반응시켜 약 300bp의 L41 유전자 단편을 분리하였고, 이 PCR 산물을 실시예 1의 방법으로 라벨링하여 프로브를 제작하였다.
피치아 시페리의 게놈 DNA와 서던블럿하였을 때, 제한효소 EcoRⅠ으로 처리한 게놈 DNA의 1.9kb 위치에서 밴드가 확인되었고, 1.9kb 크기의 EcoRⅠ DNA 단편을 추출하여 플라스미드 pBluescript KS+에 삽입하여 플라스미드 pCYH1.9를 제작하였다.
플라스미드 pCYH1.9에 함유된 1.9kb 크기의 DNA에 대한 염기서열을 결정하였으며, 그 결과를 서열 2에 나타내었다. 피치아 시페리 ATCC 14091의 L41 유전자의 DNA 염기서열은 GeneBank에 AF 053457(98.3.7)로 등록하였다.
피치아 시페리 ATCC 14091의 L41 유전자는 419bp의 인트론을 포함하여 총 737bp로 구성되었으며, 56번째 아미노산이 프롤린임을 확인하였다.
<실시예 5> L41 유전자의 56번 아미노산이 글루타민으로 치환된 상태인 플라스미드 pCYH1.9r의 제작 :
프라이머 CH-f : GGT CAA ACC AAA CCA GTT TTC와,
프라이머 CH-r : ATG GAA AAC TTG TTT GGT TTG ACC를 합성하고,
유니버셜 프라이머(universal primer)와 프라이머 CH-r의 조합과, 리벌스 프라이머(reverse primer)와 프라이머 CH-f의 조합으로 Pfu DNA 중합효소를 이용하여 pCYH1.9을 주형으로 하는 PCR을 행하여 1.2kb와 0.7kb 크기의 PCR 산물을 확보하였다.
두 PCR 산물을 주형으로 유니버셜 프라이머와 리벌스 프라이머만을 사용하여 다시 PCR을 행하였다.
이상에서 L41 유전자에서 56번 아미노산인 프롤린이 글루타민으로 치환된 상태인 플라스미드 pCYH1.9r를 제작하였다.
<실시예 6> 리보좀 DNA 단편을 함유한 플라스미드 prDX9.0의 제작 :
프라이머 18R : 5'-CAA TAA TTG CAA TGC TCT ATC CCC AGC ACG-3',
프라이머 26F : 5'-GGA TAT GGA TTC TTC ACG GTA ACG TAA CTG-3'를 합성하고, 실시예 2에서 추출한 피치아 시페리의 게놈 DNA와 PCR 반응시켜 6.0kb의 PCR 산물을 분리하였고, 이 PCR 산물을 실시예 1의 방법으로 라벨링하여 프로브를 제작하였다.
피치아 시페리의 게놈 DNA와 서던블럿하였을 때, 제한효소 XhoⅠ으로 처리한 9kb 위치에서 밴드가 확인되었다. 밴드 위치에서 DNA를 추출한 다음 플라스미드 pBluescript KS+에 삽입하여 라이브러리를 만들었다. 서던블럿을 재차 수행하여 9kb 크기의 리보좀 DNA 단편을 함유하는 플라스미드 prDX9.0를 선별하였다.
<실시예 7> L41 유전자가 리보좀 DNA의 여러 부위에 각각 삽입된 플라스미드의 제작 :
실시예 5의 플라스미드 pCYH1.9r을 제한효소 EcoRⅠ으로 처리하여 얻은 절편을, prDX9.0를 도 2에 나타낸 각종 제한효소로 처리하여 얻은 플라스미드에 삽입하여, L41 유전자가 리보좀 유전자의 여러 부위에 각각 삽입된 플라스미드를 제작하였다.
일례로서 플라스미드 prHEC1.9F를 들어 특성을 소개하면, 실시예 6에서 얻은 플라스미드 prDX9.0을 제한효소 HindⅢ/EcoRⅠ으로 처리하여 얻은 1.4kb의 리보좀 DNA의 EcoRⅤ 위치에, 실시예 5의 플라스미드 pCYH1.9r을 제한효소 EcoRⅠ으로 처리하여 얻은 1.9kb의 CYHr유전자를 연결하여 플라스미드 prHEC1.9F를 제작하였다.
<실시예 8> 플라스미드 prHEC1.9F의 선발 :
클래스와 피터의 방법(Klass & Peter, Curr. Genet., 25, 305, 1994)에 따라, YEPD 배지 100㎖에서 600㎚에서의 흡광도 1.5까지 배양한 피치아 시페리 KFCC-10937을 원심분리하여 회수한 후, 25mM의 DTT를 첨가한 50mM의 인산완충액(pH7.5) 40㎖에 37℃에서 15분간 분산시켰다. 빙냉의 안정액(270mM의 수크로스, 10mM의 트리스-Cl(pH7.5), 1mM의 MgCl2) 100㎖로 2회 세척한 후, 안정액 1㎖에 현탁하였다.
현탁액 50㎕에 실시예 7에서 제조한 각종 플라스미드 용액(0.1㎍/㎕ TE) 5㎕를 첨가하고, 얼음 위에서 10분간 방치한 후, 0.2㎜의 전기자극(electroporation)용 쿠베트(cuvette, Bio-Rad사 제품)로 옮겼다. Gean-pulser Ⅱ(Bio-Rad사 제품)를 사용하여, 전압 500Ｖ, 정전용량 50㎌, 저항 800Ω의 조건으로 전기자극을 가한 다음, 다시 안정액 0.5㎖에 현탁시켰다. 여기에 YEPD 배지 2㎖를 첨가하여 25℃에서 5시간 배양한 후, 시클로헥시미드 10㎍/㎖을 첨가한 YEPD 고체배지에 도말하여 25℃에서 배양하여 4~5일 후 형성된 형질전환체의 수를 계측하였다.
형질전환율은 표 1에 나타내었다.
플라스미드 ㎍당 형질전환체의 수 플라스미드 ㎍당 형질전환체의 수
prXHNC 276 prEHC 250
prCEX 194 prCRX 226
prXCH 314 prXCE 134
prAC1.9 1574 prXHC1.9 1287
prEC1.9 983 prHEC1.9F 1760
prHEC1.9R 54
표 1의 결과로부터 CYHr유전자가 삽입된 리보좀 DNA의 위치와 CYHr유전자의 전사방향이 형질전환효율과 밀접한 관계가 있음을 확인하였고, 5S와 26S 리보좀 RNA 구조유전자 사이의 비전사부위(non-transcribed sequence)를 도입부위로 사용하는 플라스미드인 prHEC1.9F의 경우 형질전환 효율이 가장 높았다.
이러한 과정을 거쳐 고효율로 형질전환을 유도하는 1.4kb 크기의 리보좀 DNA와 CYHr유전자를 포함하는 플라스미드 prHEC1.9F를 제작하였다.
<실시예 9> 플라스미드 prACL2의 제작 :
실시예 3의 플라스미드 pL2SA를 제한효소 HindⅢ/Klenow/BamHⅠ의 순서로 처리하여 얻은 3.0kb 크기의 LCB2 절편을, 제한효소 Eco47Ⅲ/BamHⅠ으로 처리한 플라스미드 prHEC1.9F에 삽입하여 플라스미드 prACL2를 제작하였다.
이상에서 제조한 플라스미드 prACL2는 리보좀 DNA의 HindⅢ/EcoRⅤ의 0.6kb의 비전사부위, CYHr(L41), LCB2 유전자의 순서로 연결되어 있는 형태이다.
위에서 얻은 플라스미드 prACL2는 한국과학기술연구원 생명공학연구소내 유전자은행에 부다페스트 조약하의 규정에 따라 1998년 5월 4일자로 국제기탁하여 수탁번호 KCTC-0468BP호를 부여받았다.
<실시예 10> 형질전환 :
실시예 8의 방법으로 플라스미드 prACL2를 제한효소 ApaⅠ으로 처리하여 개환한 다음, 실시예 8의 방법으로 모균주 KFCC-10937에 형질전환하였으며, 플라스미드 ㎍당 102~ 103개의 집락이 형성되었고, 그중 직경이 큰 집락을 12개 선발하였다.
선발한 형질전환체 각각을 시클로헥시미드 5㎍/㎖ 첨가한 YEPD 배지에 접종하여 25℃에서 18~20시간 진탕배양한 다음, 원심분리하여 세포를 회수하여 1.5㎖ 튜브에 옮겼다. 세포를 STES 용액(0.5M NaCl, 0.01M EDTA, 1% SDS in 0.2M 트리스-Cl, pH7.6) 30㎕에 현탁한 후, 지름 0.4㎜의 유리알을 0.8 부피만큼 첨가한 다음, 5분간 교반하고, TE 완충액(1mM EDTA in 10mM 트리스-Cl, pH8.0) 200㎕과 페놀/클로로포름/이소아밀알콜(25:24:1) 200㎕을 첨가하여 2분간 교반한 후, 12,000rpm에서 원심분리하였다. 상등액에 2.5배 부피의 에탄올을 첨가하여 게놈 DNA를 침전시키고, 건조하였다.
게놈 DNA 2~3㎍을 증류수 50㎕에 녹이고, 제한효소 EcoRⅠ으로 처리한 다음, 0.8% 아가로스 겔로 전기영동하였다. 실시예 4의 L41 유전자를 프로브로 서던블럿하여 밴드를 확인하였다. 형질전환체의 게놈 DNA에 L41 유전자가 5~10 카피 존재함을 확인하였다. 이중 하나를 골라 형질전환체 1이라 명하였다.
<비교예> 모균주 KFCC-10937의 TAPS 생산 :
모균주 KFCC-10937를 YGM 최적배지(글리세롤 100g/ℓ, 효모 추출물 2g/ℓ, KNO33g/ℓ, (NH4)2SO40.5g/ℓ, MgSO4·7H2O 0.3g/ℓ, NaCl 0.5g/ℓ, CSL 3g/ℓ, LS-300 1g/ℓ) 100㎖에 접종하여 25℃에서 4일간 250rpm으로 배양한 후, 4℃에서 2일간 정치시킨 다음, 클로로포름/메탄올을 1:1로 혼합한 용매 4부피를 첨가하여 층을 분리시킨 다음, TAPS를 추출하였다.
TAPS는 ELSD(electron light scanning detector)를 이용하여 HPLC로 분석하였다. 용매로 이소옥탄과 THF/포름산(100:1.5)의 희석비율을 9:1, 7:3, 9:1로 변화시켰다.
<실시예 11> 형질전환체 1의 TAPS 생산 :
실시예 10에서 선발한 형질전환체 1를 비교예의 조건으로 배양하여, TAPS를 추출하였다.
비교예 및 실시예 11의 결과는 표 2에 나타내었다.
KFCC-10937와 형질전환체 1의 TAPS 생산성 비교
KFCC-10937 형질전환체 1
2배 증식시간 (시간) 1.5 1.5
생물체량(biomass) 농도 (g/ℓ) 41.6 43.6
TAPS (㎎/ℓ) 5206 7444
TAPS 특이수율 (㎎/gdw) 125.1 170.7
용적생산성 (㎎ TAPS/ℓ/hr) 54.2 77.5
본 발명에 의해 제공되는 플라스미드 prACL2는, 고효율로 형질전환을 유도하는 0.6kb 크기의 리보좀 DNA와, CYHr(L41) 유전자 및 TAPS 생합성에 관여하는 세린 팔미토일 트랜스퍼라제를 코딩하는 LCB2 유전자가 순서대로 연결되어 있는 형태이며, 모균주에의 형질전환 효율이 높으며, 이 플라스미드에 의해 형질전환된 형질전환체는 모균주 KFCC-10937에 비하여 최소 1.3배의 TAPS 생산능을 갖고 있다.
<서열목록>
서열 번호 : 1
서열의 길이 : 3296bp
서열의 타입 : 핵산 및 아미노산
쇄의 수 : 2본쇄
토폴로지 : 선형
분자의 타입 : 게놈 DNA
기원
생물명 : 피치아 시페리(Pichia ciferrii)
주명 : ATCC 14091
서열의 특징
특징을 나타내는 기호 : CDS
존재 위치 : 765 .. 2453
특징을 결정하는 방법 : E
서열 번호 : 2
서열의 길이 : 1906bp
서열의 타입 : 핵산 및 아미노산
쇄의 수 : 2본쇄
토폴로지 : 선형
분자의 타입 : 게놈 DNA
기원
생물명 : 피치아 시페리(Pichia ciferrii)
주명 : ATCC 14091
서열의 특징
특징을 나타내는 기호 : CDS
존재 위치 : 603 .. 605
특징을 결정하는 방법 : E
특징을 나타내는 기호 : CDS
존재 위치 : 1025 .. 1348
특징을 결정하는 방법 : E
특징을 나타내는 기호 : 인트론
존재 위치 : 606 .. 1024
특징을 결정하는 방법 : E
.

Claims (5)

  1. 피치아 시페리(Pichia ciferrii) 유래의 세린 팔미토일 트랜스퍼라제(serine palmitoyl transferase)를 코딩하는, 서열 1에 기재된 LCB2 유전자.
  2. 피치아 시페리 유래의 리보좀 DNA, 항생제 시클로헥시미드(cycloheximide)에 대해 저항성을 갖는 CYHr유전자, 및 제 1항에 기재된 LCB2 유전자로 구성되며; 제 3도에 기재된 제한효소지도를 갖는 플라스미드 prACL2(KCTC-0468BP).
  3. 제 2항에 있어서, 피치아 시페리 유래의 리보좀 DNA는 HindⅢ/EcoRⅤ으로 절단하여 얻어지는 0.6kb 크기를 포함하는 비전사부위를 포함함을 특징으로 하는 플라스미드 prACL2.
  4. 제 2항에 기재된 플라스미드 prACL2로 형질전환된 피치아 시페리.
  5. 제 4항에 기재된 형질전환체 피치아 시페리를 배양하여, 배양액으로부터 테트라아세틸 피토스핑고신(tetraacetyl phytosphingosine)을 추출함을 특징으로 하는 테트라아세틸 피토스핑고신의 생산방법.
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