JP2002513573A - ピヒア・シフェリにおける遺伝子発現のためのプラスミド及びこれを用いた形質転換方法 - Google Patents
ピヒア・シフェリにおける遺伝子発現のためのプラスミド及びこれを用いた形質転換方法Info
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- C07K14/39—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from fungi from yeasts
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Abstract
(57)【要約】
ピヒア・シフェリを形質転換するための発現カセット及びその使用を開示する。本発明は、ピヒア・シフェリ リボソームＤＮＡ断片、シクロヘキシミドに耐性のＣＹＨr遺伝子、及び所望の遺伝子を含む発現カセットに関するものである。所望の遺伝子の発現の増大を可能とするピヒア・シフェリＧＡＰＤＨプロモーター遺伝子をさらに含む発現カセットもまた、提供される。さらに、本発明は、高収率にて、発現カセットで形質転換されたピヒア・シフェリを使用するテトラアセチルフィトシフィンゴシンを製造するための方法を提供するものである。
Description
【０００１】
本発明はピヒア・シフェリ（Pichia ciferrii）形質転換のための発現カセッ
トに関する。さらにとりわけピヒア・シフェリ リボソームＤＮＡ断片である、
シクロヘキシミド及び望ましい遺伝子に、及びそれらの使用に抵抗性であるＣＹ
Ｈr遺伝子を含んでいる発現カセットに関する。
トに関する。さらにとりわけピヒア・シフェリ リボソームＤＮＡ断片である、
シクロヘキシミド及び望ましい遺伝子に、及びそれらの使用に抵抗性であるＣＹ
Ｈr遺伝子を含んでいる発現カセットに関する。
【０００２】
ピヒア・シフェリは、石炭を生物学的に脱硫するために（Stevens et al., US
P4,851,350号）、Ｄ−アルファ−アミノ酸を合成するために（Takeichi et al.,
USP5,068,187号）、（Ｓ）−１−フェニル−１，３−プロパンジオールを合成す
るために（Ajinomoto），JP6-90789A号）、または立体特異性ケトン還元による
第二アルコールを合成するために（Merck，第EP-300287号）使用されてきた。さ
らに、これはセラミドの前駆体であるテトラアセチルフィトスフィンゴシン（Ｔ
ＡＰＳ）を生産し、分泌する（Barenholz et al., Biochem.Biophys.Acta, 248,
458, 1971、同、306, 341, 1973）。
P4,851,350号）、Ｄ−アルファ−アミノ酸を合成するために（Takeichi et al.,
USP5,068,187号）、（Ｓ）−１−フェニル−１，３−プロパンジオールを合成す
るために（Ajinomoto），JP6-90789A号）、または立体特異性ケトン還元による
第二アルコールを合成するために（Merck，第EP-300287号）使用されてきた。さ
らに、これはセラミドの前駆体であるテトラアセチルフィトスフィンゴシン（Ｔ
ＡＰＳ）を生産し、分泌する（Barenholz et al., Biochem.Biophys.Acta, 248,
458, 1971、同、306, 341, 1973）。
【０００３】 セラミドと同様にＴＡＰＳを含むフィトスフィンゴシンは表面皮膚保護活性、
及び皮膚の過剰な水分不足または乾燥を防止する活性を示し、化粧でのその使用
を容易にする。これらはさまざまな微生物から入手でき、簡単にＮ−アシル化に
よってセラミドに変換されうる。
及び皮膚の過剰な水分不足または乾燥を防止する活性を示し、化粧でのその使用
を容易にする。これらはさまざまな微生物から入手でき、簡単にＮ−アシル化に
よってセラミドに変換されうる。
【０００４】 野生型ピヒア・シフェリ ATCC14091及びF-60-10(NRRL1301)によるＴＡＰＳ生
産は商業的使用には十分ではない。ピヒア・シフェリ株でのＴＡＰＳの生産を改
善するために、より高レベルでのＴＡＰＳの生産が可能である変異体を提供する
試みが行われてきた（Wickerham & Burton,J.Bacteriol., 80, 484, 1960；USP5
,618,706号）。本発明者もまた、より短い時間での多量のＴＡＰＳ生産が可能で
ある新規の有用な変異体（KFCC-10937）を開発した（KR98-49305A号）。
産は商業的使用には十分ではない。ピヒア・シフェリ株でのＴＡＰＳの生産を改
善するために、より高レベルでのＴＡＰＳの生産が可能である変異体を提供する
試みが行われてきた（Wickerham & Burton,J.Bacteriol., 80, 484, 1960；USP5
,618,706号）。本発明者もまた、より短い時間での多量のＴＡＰＳ生産が可能で
ある新規の有用な変異体（KFCC-10937）を開発した（KR98-49305A号）。
【０００５】 ピヒア・シフェリはハンセニュラ（Hansenula）種に分類されてきており、最
近は５Ｓ−ＲＮＡ解析によりピヒア（Pichia）種に再分類されている（Yamada et al. , Biosci. Biotechnol. Biochem., 58、1245, 1994）。このことから、ピヒア
酵母の遺伝的研究は十分ではなく、ピヒア・シフェリの形質転換方法は確立され
ていない。
近は５Ｓ−ＲＮＡ解析によりピヒア（Pichia）種に再分類されている（Yamada et al. , Biosci. Biotechnol. Biochem., 58、1245, 1994）。このことから、ピヒア
酵母の遺伝的研究は十分ではなく、ピヒア・シフェリの形質転換方法は確立され
ていない。
【０００６】
本発明はピヒア・シフェリ セリンパルミトイルトランスフェラーゼ遺伝子を
含むプラスミドprACL2及びＴＡＰＳの改善された生産が可能である形質導入した
ピヒア・シフェリ細胞を提供する。
含むプラスミドprACL2及びＴＡＰＳの改善された生産が可能である形質導入した
ピヒア・シフェリ細胞を提供する。
【０００７】 本発明者らは、カンジダ・ウティリス（Candida utilis）に対する公知の方法
（Kondo et al., J. Bacteriol., 177, 7171, 1995）をピヒア・シフェリのため
に変更でき、適用できることを発見した。そのヌクレオチド配列を決定するため
にピヒア・シフェリリボソームタンパク質Ｌ４１−コード遺伝子をクローニング
し、選択マーカーとして使用するために、酵母由来の抗生物質であるシクロヘキ
シミドへの抵抗性を与えるように操作した。したがって、組換え体遺伝子は望ま
しい遺伝子を発現しているピヒア・シフェリを形質転換するのに有用である発現
カセットを与えるための望ましい遺伝子を持つプラスミドと関連し得る。
（Kondo et al., J. Bacteriol., 177, 7171, 1995）をピヒア・シフェリのため
に変更でき、適用できることを発見した。そのヌクレオチド配列を決定するため
にピヒア・シフェリリボソームタンパク質Ｌ４１−コード遺伝子をクローニング
し、選択マーカーとして使用するために、酵母由来の抗生物質であるシクロヘキ
シミドへの抵抗性を与えるように操作した。したがって、組換え体遺伝子は望ま
しい遺伝子を発現しているピヒア・シフェリを形質転換するのに有用である発現
カセットを与えるための望ましい遺伝子を持つプラスミドと関連し得る。
【０００８】 さらに、本発明者らはピヒア・シフェリＧＡＰＤＨプロモーター遺伝子のクロ
ーニングに成功し、発現カセット内へのその挿入が、発現レベルの予期せぬ改善
を可能にしたことを明らかにした。事実、望ましい遺伝子としてＬＣＢ２遺伝子
を持つ発現カセットでピヒア・シフェリ株を形質転換すること、及び得られた形
質転換した細胞を培養することでＴＡＰＳの生産量を増加させた。ＬＣＢ２遺伝
子は、生体内でＴＡＰＳ合成で含まれるパルミトイルトランスフェラーゼをコー
ドしている。
ーニングに成功し、発現カセット内へのその挿入が、発現レベルの予期せぬ改善
を可能にしたことを明らかにした。事実、望ましい遺伝子としてＬＣＢ２遺伝子
を持つ発現カセットでピヒア・シフェリ株を形質転換すること、及び得られた形
質転換した細胞を培養することでＴＡＰＳの生産量を増加させた。ＬＣＢ２遺伝
子は、生体内でＴＡＰＳ合成で含まれるパルミトイルトランスフェラーゼをコー
ドしている。
【０００９】 従って本発明の目的は、ピヒア・シフェリ（Pichia ciferrii）リボソームタ
ンパク質Ｌ４１遺伝子の遺伝情報を調べて使用することである。
ンパク質Ｌ４１遺伝子の遺伝情報を調べて使用することである。
【００１０】 本発明の他の目的は、ピヒア・シフェリ リボソームＤＮＡ、選択マーカーと
してのピヒア・シフェリＬ４１遺伝子、及び所望の遺伝子を含む、ピヒア・シフ
ェリを形質転換するための発現カセットを提供することである。本発明の一つの
好ましい実施態様において、そのマーカーは抗生のシクロヘキシミドに対する耐
性を付与する遺伝子である。
してのピヒア・シフェリＬ４１遺伝子、及び所望の遺伝子を含む、ピヒア・シフ
ェリを形質転換するための発現カセットを提供することである。本発明の一つの
好ましい実施態様において、そのマーカーは抗生のシクロヘキシミドに対する耐
性を付与する遺伝子である。
【００１１】 本発明の別の目的は、前記発現カセットを含むプラスミドでピヒア・シフェリ
を形質転換する方法を提供することである。
を形質転換する方法を提供することである。
【００１２】 本発明は、ピヒア・シフェリ グリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒド
ロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）遺伝子及びＧＡＤＰＨプロモーター遺伝子の遺伝情報
を調べて使用するものである。
ロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）遺伝子及びＧＡＤＰＨプロモーター遺伝子の遺伝情報
を調べて使用するものである。
【００１３】 本発明は、ピヒア・シフェリ リボソームＤＮＡ、選択マーカーとしてのピヒ
ア・シフェリＬ４１遺伝子、ピヒア・シフェリＧＡＰＤＨプロモーター遺伝子及
び所望の遺伝子を含む、ピヒア・シフェリを形質転換するための発現カセットを
提供する。本発明の一つの好ましい実施態様において、そのマーカーは抗生のシ
クロヘキシミドに対する耐性を付与する遺伝子である。
ア・シフェリＬ４１遺伝子、ピヒア・シフェリＧＡＰＤＨプロモーター遺伝子及
び所望の遺伝子を含む、ピヒア・シフェリを形質転換するための発現カセットを
提供する。本発明の一つの好ましい実施態様において、そのマーカーは抗生のシ
クロヘキシミドに対する耐性を付与する遺伝子である。
【００１４】 本発明はさらに、ピヒア・シフェリ リボソームＤＮＡ、選択マーカーとして
のピヒア・シフェリＬ４１遺伝子、ピヒア・シフェリＧＡＰＤＨプロモーター遺
伝子、所望の遺伝子及びピヒア・シフェリ リボソームＤＮＡを含む、ピヒア・
シフェリを形質転換するための発現カセットを提供する。本発明の一つの好まし
い実施態様において、そのマーカーは抗生のシクロヘキシミドに対する耐性を付
与する遺伝子である。
のピヒア・シフェリＬ４１遺伝子、ピヒア・シフェリＧＡＰＤＨプロモーター遺
伝子、所望の遺伝子及びピヒア・シフェリ リボソームＤＮＡを含む、ピヒア・
シフェリを形質転換するための発現カセットを提供する。本発明の一つの好まし
い実施態様において、そのマーカーは抗生のシクロヘキシミドに対する耐性を付
与する遺伝子である。
【００１５】 本発明は、ＴＡＰＳ合成に関与するピヒア・シフェリ セリンパルミトイルト
ランスフェラーゼの遺伝情報を調べて使用するものである。
ランスフェラーゼの遺伝情報を調べて使用するものである。
【００１６】 本発明は、ピヒア・シフェリ セリンパルミトイルトランスフェラーゼ遺伝子
を有する発現カセットを含むプラスミドprACL2と、ＴＡＰＳの生産性が改良され
た形質転換されたピヒア・シフェリ細胞を提供するものである。
を有する発現カセットを含むプラスミドprACL2と、ＴＡＰＳの生産性が改良され
た形質転換されたピヒア・シフェリ細胞を提供するものである。
【００１７】 本発明はさらに、ピヒア・シフェリ セリンパルミトイルトランスフェラーゼ
遺伝子を有する発現カセットを含むプラスミドprACGL2、及びＴＡＰＳの生産性
が改良されたピヒア・シフェリ形質転換体を提供するものである。
遺伝子を有する発現カセットを含むプラスミドprACGL2、及びＴＡＰＳの生産性
が改良されたピヒア・シフェリ形質転換体を提供するものである。
【００１８】 本発明はさらに、ピヒア・シフェリ セリンパルミトイルトランスフェラーゼ
遺伝子を有する発現カセットを含むプラスミドprHECGL2、及びＴＡＰＳの生産性
が改良されたピヒア・シフェリ形質転換体を提供するものである。
遺伝子を有する発現カセットを含むプラスミドprHECGL2、及びＴＡＰＳの生産性
が改良されたピヒア・シフェリ形質転換体を提供するものである。
【００１９】 本発明はさらにまた、形質転換されたピヒア・シフェリ細胞を培養することに
よって、ＴＡＰＳを製造するための方法を提供する。
よって、ＴＡＰＳを製造するための方法を提供する。
【００２０】 如上の本発明の目的、他の特徴及び適用に関しては、以下の詳細な説明から当
業者にとってさらに明らかになるであろう。
業者にとってさらに明らかになるであろう。
【００２１】
Kondoらは、マーカー遺伝子として、従来の細菌のものに換えて酵母由来の抗
生耐性遺伝子を使用する、Candida utilis に対する形質転換方法を報告してい
る（Kondo et al., J.Bacteriol., 177, 7171, 1995）。本発明者らは、係る着
想をピヒア・シフェリに適用することを試みた。
生耐性遺伝子を使用する、Candida utilis に対する形質転換方法を報告してい
る（Kondo et al., J.Bacteriol., 177, 7171, 1995）。本発明者らは、係る着
想をピヒア・シフェリに適用することを試みた。
【００２２】 この目的のため、本発明者らはピヒア・シフェリ リボソームタンパク質Ｌ４
１遺伝子をクローニングし、そしてそのヌクレオチド配列を決定した。さらに本
発明者らは、シクロヘキシミドに対する感受性に寄与する第５６番目のアミノ酸
プロリンを同定しそしてそれをグルタミンに置換して、シクロヘキシミド耐性の
Ｌ４１タンパク質を得た。本発明において、Ｌ４１遺伝子が選択マーカーとして
使用される。
１遺伝子をクローニングし、そしてそのヌクレオチド配列を決定した。さらに本
発明者らは、シクロヘキシミドに対する感受性に寄与する第５６番目のアミノ酸
プロリンを同定しそしてそれをグルタミンに置換して、シクロヘキシミド耐性の
Ｌ４１タンパク質を得た。本発明において、Ｌ４１遺伝子が選択マーカーとして
使用される。
【００２３】 １．ピヒア・シフェリ リボソームタンパク質Ｌ４１遺伝子遺伝子の単離 Kondoら（Kondo et al., J.Bacteriol., 177, 7171, 1995）による方法に従い
これを修飾することによって、２つのプライマーＣＹＨ１及びＣＹＨ４を合成し
た。 ＣＹＨ１：5'-CGC GTA GTT AAY GTN CCN AAR AC-3' ＣＹＨ４：5'-GCC TGG CCY TTY TGY TTY TTN TC-3' ２つのプライマーは、それぞれ配列表にて、配列番号：７及び配列番号：８で
示される。
これを修飾することによって、２つのプライマーＣＹＨ１及びＣＹＨ４を合成し
た。 ＣＹＨ１：5'-CGC GTA GTT AAY GTN CCN AAR AC-3' ＣＹＨ４：5'-GCC TGG CCY TTY TGY TTY TTN TC-3' ２つのプライマーは、それぞれ配列表にて、配列番号：７及び配列番号：８で
示される。
【００２４】 ＰＣＲは、この２つのプライマーを使用して行い、約300bpのピヒア・シフェ
リ リボソームタンパク質Ｌ４１遺伝子を単離して、これをプローブとして用い
るために標識化した。
リ リボソームタンパク質Ｌ４１遺伝子を単離して、これをプローブとして用い
るために標識化した。
【００２５】 こうして得られたプローブを使用して、ピヒア・シフェリ ゲノムＤＮＡにつ
いてのサザンブロット分析を行った。EcoRIで消化したゲノムＤＮＡで、1.9 kb
の所望のバンドが得られる。EcoRIで消化された1.9 kbのＤＮＡ断片を集めて、
ヌクレオチド配列決定のために使用されるpCYH1.9を構築するために使用した。
結果を図１に示す。ピヒア・シフェリ ATCC 14091リボソームタンパク質Ｌ４１
遺伝子のＤＮＡ配列は、1998年３月７日にGenBankに、受入番号 AF 053457にて
提出された。ピヒア・シフェリ ATCC 14091リボソームタンパク質Ｌ４１遺伝子
は、４１９ bpイントロンを含む７３７塩基対を有するものである。このヌクレ
オチド配列より演繹される推定上のアミノ酸は、他の酵母のものと９０％以上の
相同性を示している。シクロヘキシミドに感受性のアミノ酸が、第５６位アミノ
酸のプロリンであることも同定された。
いてのサザンブロット分析を行った。EcoRIで消化したゲノムＤＮＡで、1.9 kb
の所望のバンドが得られる。EcoRIで消化された1.9 kbのＤＮＡ断片を集めて、
ヌクレオチド配列決定のために使用されるpCYH1.9を構築するために使用した。
結果を図１に示す。ピヒア・シフェリ ATCC 14091リボソームタンパク質Ｌ４１
遺伝子のＤＮＡ配列は、1998年３月７日にGenBankに、受入番号 AF 053457にて
提出された。ピヒア・シフェリ ATCC 14091リボソームタンパク質Ｌ４１遺伝子
は、４１９ bpイントロンを含む７３７塩基対を有するものである。このヌクレ
オチド配列より演繹される推定上のアミノ酸は、他の酵母のものと９０％以上の
相同性を示している。シクロヘキシミドに感受性のアミノ酸が、第５６位アミノ
酸のプロリンであることも同定された。
【００２６】 ２．Ｌ４１遺伝子へのシクロヘキシミド耐性の付与：形質転換細胞の選択に使
用するためのプラスミドpCYH1.9rの構築 Ｌ４１遺伝子にシクロヘキシミド耐性を付与するために、Ｌ４１遺伝子のプロ
リン（アミノ酸第５６位）をグルタミンに置換すべく部位特異的突然変異誘発を
行った。こうして得られた遺伝子操作された遺伝子を、「プラスミドＣＹＨ1.9r 」と命名する。
用するためのプラスミドpCYH1.9rの構築 Ｌ４１遺伝子にシクロヘキシミド耐性を付与するために、Ｌ４１遺伝子のプロ
リン（アミノ酸第５６位）をグルタミンに置換すべく部位特異的突然変異誘発を
行った。こうして得られた遺伝子操作された遺伝子を、「プラスミドＣＹＨ1.9r 」と命名する。
【００２７】 以下本明細書において、Ｌ４１遺伝子を「ＣＹＨ」の略号にて示し、そしてシ
クロヘキシミド耐性のＬ４１遺伝子を「ＣＹＨr」によって示すこととする。
クロヘキシミド耐性のＬ４１遺伝子を「ＣＹＨr」によって示すこととする。
【００２８】 ３．ピヒア・シフェリ リボソームＤＮＡの単離：染色体への所望の遺伝子の
組込み効率を向上させるためのプラスミドprDX9.0の構築 染色体ＤＮＡへの所望の遺伝子の組込みの効率を向上させるために、リボソー
ムＤＮＡを用いた。細胞内でリボソームＤＮＡの数百のコピーが生じる。
組込み効率を向上させるためのプラスミドprDX9.0の構築 染色体ＤＮＡへの所望の遺伝子の組込みの効率を向上させるために、リボソー
ムＤＮＡを用いた。細胞内でリボソームＤＮＡの数百のコピーが生じる。
【００２９】 ＰＣＲプライマーは、ピヒア・シフェリ リボソームＲＮＡの部分ヌクレオチ
ド配列（Yamada et al., Biosci. Biotechnol. Biochem., 58, 1245, 1994）を
使用することによって合成した。ピヒア・シフェリ ATCC 14091ゲノムＤＮＡの
ＰＣＲを、そのプライマーを使用することによって行い、6.0 kbのリボソームＤ
ＮＡ断片を単離した。その断片を、サザンブロット分析用のプローブとして使用
し、9 kbのピヒア・シフェリ ATCC 14091リボソームＤＮＡ断片を単離して、こ
れをプラスミドpBluescript KS+に挿入しプラスミドprDX9.0を作製した。
ド配列（Yamada et al., Biosci. Biotechnol. Biochem., 58, 1245, 1994）を
使用することによって合成した。ピヒア・シフェリ ATCC 14091ゲノムＤＮＡの
ＰＣＲを、そのプライマーを使用することによって行い、6.0 kbのリボソームＤ
ＮＡ断片を単離した。その断片を、サザンブロット分析用のプローブとして使用
し、9 kbのピヒア・シフェリ ATCC 14091リボソームＤＮＡ断片を単離して、こ
れをプラスミドpBluescript KS+に挿入しプラスミドprDX9.0を作製した。
【００３０】 リボソームＤＮＡ断片（9 kb）の部分配列を調べ、そして５Ｓ、２６Ｓ、５．
８Ｓ及び１８Ｓリボソームタンパク質遺伝子の位置と方向を図１に示す。
８Ｓ及び１８Ｓリボソームタンパク質遺伝子の位置と方向を図１に示す。
【００３１】 ４．組換えプラスミドの構築 リボソームＤＮＡを様々な制限酵素で消化し、ＣＹＨrに連結して図１に示す
様々なプラスミドを得、これらについて、（１）それぞれの遺伝子の転写方向；
（２）リボソームＤＮＡ及びＣＹＨr遺伝子の配列；ならびに（３）挿入部位、
リボソームＲＮＡ構造遺伝子または非転写領域の種類、に関して形質転換効率に
つき分析されよう。
様々なプラスミドを得、これらについて、（１）それぞれの遺伝子の転写方向；
（２）リボソームＤＮＡ及びＣＹＨr遺伝子の配列；ならびに（３）挿入部位、
リボソームＲＮＡ構造遺伝子または非転写領域の種類、に関して形質転換効率に
つき分析されよう。
【００３２】 図１のプラスミドの特徴を、表１に要約する。
【００３３】
【表１】
【００３４】 プラスミドの命名において、例えばprACで「p」の文字はプラスミドを示し、
「r」はプラスミドがリボソームＤＮＡを有することを示し、そして「C」は「Ｃ
ＹＨr」を意味する。prAC1.9における文字「A」はとprEC1.9における文字「E」
はリボソームＤＮＡを消化することにより遊離するために使用される制限酵素を
示す。他のプラスミドの場合、それぞれ「X」はXbaIを意味し、「E」はEcoRIを
意味し、「R」はEcoRVを意味し、そして「H」はHindIIIを意味する。従って、そ
の名前にこれらの文字を含むプラスミドは、これらそれぞれの制限酵素で消化さ
れたリボソームＤＮＡ断片を含むものである。さらにＣの後の数番号はＬ４１遺
伝子のサイズ（塩基対）を示し、一方「F」または「R」の文字はリボソームＤＮ
Ａ断片とＣＹＨrの方向を意味している。
「r」はプラスミドがリボソームＤＮＡを有することを示し、そして「C」は「Ｃ
ＹＨr」を意味する。prAC1.9における文字「A」はとprEC1.9における文字「E」
はリボソームＤＮＡを消化することにより遊離するために使用される制限酵素を
示す。他のプラスミドの場合、それぞれ「X」はXbaIを意味し、「E」はEcoRIを
意味し、「R」はEcoRVを意味し、そして「H」はHindIIIを意味する。従って、そ
の名前にこれらの文字を含むプラスミドは、これらそれぞれの制限酵素で消化さ
れたリボソームＤＮＡ断片を含むものである。さらにＣの後の数番号はＬ４１遺
伝子のサイズ（塩基対）を示し、一方「F」または「R」の文字はリボソームＤＮ
Ａ断片とＣＹＨrの方向を意味している。
【００３５】 ５．形質転換細胞の形質転換及び選択 Klass及びPeterにより報告された方法（Klass及びPeter, Curr. Genet., 25,
305, 1994）に従うものである。すなわち、ＹＥＰＤ培地にて１．５のＯＤ600nm にまで生育したピヒア・シフェリ ATCC 14091の細胞を遠心分離によって集め、
そしてプラスミドと混合した。エレクトロポレーションは、プラスミドで細胞を
形質転換すべく５００Ｖ、５０μＦ且つ８００Ωにて実施し、そしてシクロヘキ
シミド耐性Ｌ４１遺伝子（ＣＹＨr）を含む形質転換細胞を選択するようにシク
ロヘキシミドを添加したＹＥＰＤ固形培地での生育に付した。
305, 1994）に従うものである。すなわち、ＹＥＰＤ培地にて１．５のＯＤ600nm にまで生育したピヒア・シフェリ ATCC 14091の細胞を遠心分離によって集め、
そしてプラスミドと混合した。エレクトロポレーションは、プラスミドで細胞を
形質転換すべく５００Ｖ、５０μＦ且つ８００Ωにて実施し、そしてシクロヘキ
シミド耐性Ｌ４１遺伝子（ＣＹＨr）を含む形質転換細胞を選択するようにシク
ロヘキシミドを添加したＹＥＰＤ固形培地での生育に付した。
【００３６】 形質転換効率を表２（実施例１７）に示す。表２のデータから、挿入部位とし
て５Ｓと２６ＳリボソームＲＮＡ構造遺伝子の間の非転写領域が使用されている
prHEC1.9Fが、最高の形質転換効率を有することが明らかである。また、５Ｓ Ｒ
ＮＡ遺伝子の転写方向がＣＹＨrの場合と反対であるprHEC1.pRは、形質転換効率
を有意に減じた。
て５Ｓと２６ＳリボソームＲＮＡ構造遺伝子の間の非転写領域が使用されている
prHEC1.9Fが、最高の形質転換効率を有することが明らかである。また、５Ｓ Ｒ
ＮＡ遺伝子の転写方向がＣＹＨrの場合と反対であるprHEC1.pRは、形質転換効率
を有意に減じた。
【００３７】 ６．サザンブロット分析による形質転換細胞の分析 ゲノムＤＮＡを形質転換細胞から単離し、そしてＣＹＨrの挿入パターンをサ
ザンブロット分析によって分析した。その結果、形質転換細胞の染色体に、ＣＹ
Ｈrの４〜５のコピーが見出された。この結果から、本発明の発現カセットでの
ピヒア・シフェリの形質転換は、形質転換されたピヒア・シフェリ細胞の染色体
への所望の遺伝子の組込みを至適化することが示唆される。
ザンブロット分析によって分析した。その結果、形質転換細胞の染色体に、ＣＹ
Ｈrの４〜５のコピーが見出された。この結果から、本発明の発現カセットでの
ピヒア・シフェリの形質転換は、形質転換されたピヒア・シフェリ細胞の染色体
への所望の遺伝子の組込みを至適化することが示唆される。
【００３８】 ７．ＴＡＰＳ製造のためのprACL2の構築：及び形質転換細胞の培養によるＴＡ
ＰＳの製造 セリンパルミトイルトランスフェラーゼを製造するために、ＬＣＢ２遺伝子を
含む発現カセットから発現プラスミドを構築し、そしてＴＡＰＳ生産を評価する
ために変異ピヒア・シフェリ KFCC-10397へ形質転換した。所望の遺伝子たる、
セリンパルミトイルトランスフェラーゼをコードするＬＣＢ２遺伝子は、ＴＡＰ
Ｓ合成に関与するものであり、そして変異KFCC-10397は本発明者らによって開発
されたものである（KR98-49035A）。
ＰＳの製造 セリンパルミトイルトランスフェラーゼを製造するために、ＬＣＢ２遺伝子を
含む発現カセットから発現プラスミドを構築し、そしてＴＡＰＳ生産を評価する
ために変異ピヒア・シフェリ KFCC-10397へ形質転換した。所望の遺伝子たる、
セリンパルミトイルトランスフェラーゼをコードするＬＣＢ２遺伝子は、ＴＡＰ
Ｓ合成に関与するものであり、そして変異KFCC-10397は本発明者らによって開発
されたものである（KR98-49035A）。
【００３９】 セリンパルミトイルトランスフェラーゼ（３−ケトスフィンガニンシンターゼ
、EC 2.3.1.50）はスフィンゴ脂質合成の第一工程（全反応の律速工程である）
に関与し、セリンとパルミトイル−CoAとを縮合することによって１８の炭素原
子を有する３−ケトスフィンガニンを形成する（Barenholz et al., Biochem. B iophys. Acta , 248, 458, 1971; 同じく306, 341, 1973）。３−ケトスフィンガ
ニンは、動物体内で長鎖化合物の一つとして、また植物及び菌類におけるフィト
スフィンゴシンに対する前駆体として働いている。
、EC 2.3.1.50）はスフィンゴ脂質合成の第一工程（全反応の律速工程である）
に関与し、セリンとパルミトイル−CoAとを縮合することによって１８の炭素原
子を有する３−ケトスフィンガニンを形成する（Barenholz et al., Biochem. B iophys. Acta , 248, 458, 1971; 同じく306, 341, 1973）。３−ケトスフィンガ
ニンは、動物体内で長鎖化合物の一つとして、また植物及び菌類におけるフィト
スフィンゴシンに対する前駆体として働いている。
【００４０】 本発明において、ＴＡＰＳ製造を、ピヒア・シフェリの染色体にＬＣＢ２遺伝
子の複数のコピーを組込むことにより有意に向上させることができる。ＬＣＢ２
遺伝子の複数のコピーをその染色体に担持する、形質転換されたピヒア・シフェ
リ細胞は、短期間に大量のＴＡＰＳを製造する。
子の複数のコピーを組込むことにより有意に向上させることができる。ＬＣＢ２
遺伝子の複数のコピーをその染色体に担持する、形質転換されたピヒア・シフェ
リ細胞は、短期間に大量のＴＡＰＳを製造する。
【００４１】 ７−１．セリンパルミトイルトランスフェラーゼをコードするＬＣＢ２遺伝子
の単離 ピヒア・シフェリ ATCC 14091ゲノムＤＮＡからセリンパルミトイルトランス
フェラーゼをコードする遺伝子をクローニングすることを目的として、既知のセ
リンパルミトイルトランスフェラーゼ遺伝子のサブユニットを参照してプローブ
を調製した。
の単離 ピヒア・シフェリ ATCC 14091ゲノムＤＮＡからセリンパルミトイルトランス
フェラーゼをコードする遺伝子をクローニングすることを目的として、既知のセ
リンパルミトイルトランスフェラーゼ遺伝子のサブユニットを参照してプローブ
を調製した。
【００４２】 サッカロミセス・セレビシエ由来のセリンパルミトイルトランスフェラーゼを
コードする遺伝子は、２つのサブユニット、ＬＣＢ１及びＬＣＢ２からなってい
る。ＬＣＢ１遺伝子は、「長鎖ベース」に対する略語である（Nagiec et al., P roc. Natl. Acad. Sci. USA, 91, 7899, 1994）。ヒト、マウス、クレブシェラ
・ラクティス、及びサッカロミセス・ポムなどの他の生物由来のＬＣＢ２遺伝子
のＤＮＡ配列（Nagiec et al., Gene, 177, 237, 1996; Hanada et al., J. Bio l. Chem. 272, 32108, 1997; Weiss及びStoffel, Eur. J. Biochem. 249, 239,
1997）が報告されている。
コードする遺伝子は、２つのサブユニット、ＬＣＢ１及びＬＣＢ２からなってい
る。ＬＣＢ１遺伝子は、「長鎖ベース」に対する略語である（Nagiec et al., P roc. Natl. Acad. Sci. USA, 91, 7899, 1994）。ヒト、マウス、クレブシェラ
・ラクティス、及びサッカロミセス・ポムなどの他の生物由来のＬＣＢ２遺伝子
のＤＮＡ配列（Nagiec et al., Gene, 177, 237, 1996; Hanada et al., J. Bio l. Chem. 272, 32108, 1997; Weiss及びStoffel, Eur. J. Biochem. 249, 239,
1997）が報告されている。
【００４３】 最初に、サッカロミセス・セレビシエ由来のＬＣＢ１遺伝子のヌクレオチド配
列（Nagiec et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91, 7899, 1994）を参照す
ることにより、ＬＣＢ１遺伝子のPstI断片（1 kb）を、ピヒア・シフェリ ATCC
14091のゲノムＤＮＡのサザンブロット分析用のプローブとして使用した。この
分析において、所望のバンドは検出されなかった。他方、プローブとしてＬＣＢ
２遺伝子のSalI断片（0.9 kb）を用いるサザンブロット分析で、12 kbのＬＣＢ
２遺伝子のＤＮＡバンドが得られた。このバンドを集め、そしてプラスミドpBlu
escript KS+に挿入してライブラリーを得た。サザンブロット分析を繰り返すこ
とにより、ScaI/AfiIII断片（3.0 kb）を得、そしてプラスミドpL2SAを構築した
（図２）。ＬＣＢ２遺伝子のヌクレオチド配列を調べ、配列表において配列番号
：３として、推定上のアミノ酸配列（配列番号：４）と共に表す。この配列は、
1998年３月７日にGenBankに、受入番号 AF 053456にて提出された。
列（Nagiec et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91, 7899, 1994）を参照す
ることにより、ＬＣＢ１遺伝子のPstI断片（1 kb）を、ピヒア・シフェリ ATCC
14091のゲノムＤＮＡのサザンブロット分析用のプローブとして使用した。この
分析において、所望のバンドは検出されなかった。他方、プローブとしてＬＣＢ
２遺伝子のSalI断片（0.9 kb）を用いるサザンブロット分析で、12 kbのＬＣＢ
２遺伝子のＤＮＡバンドが得られた。このバンドを集め、そしてプラスミドpBlu
escript KS+に挿入してライブラリーを得た。サザンブロット分析を繰り返すこ
とにより、ScaI/AfiIII断片（3.0 kb）を得、そしてプラスミドpL2SAを構築した
（図２）。ＬＣＢ２遺伝子のヌクレオチド配列を調べ、配列表において配列番号
：３として、推定上のアミノ酸配列（配列番号：４）と共に表す。この配列は、
1998年３月７日にGenBankに、受入番号 AF 053456にて提出された。
【００４４】 ピヒア・シフェリ ATCC 14091 ＬＣＢ２遺伝子は、1688塩基対を含み、イント
ロンは有していない。推定上のアミノ酸配列は、サッカロミセス・セレビシエ由
来のものと高い相同性を示している。膜貫通ヘリックス領域は、第５５位から第
７９位のアミノ酸にわたって存在している。ピリドキサールホスフェートと共に
シッフ塩基を形成するリシンを含む領域は、サッカロミセス・セレビシエのもの
と同じアミノ酸配列を有している。
ロンは有していない。推定上のアミノ酸配列は、サッカロミセス・セレビシエ由
来のものと高い相同性を示している。膜貫通ヘリックス領域は、第５５位から第
７９位のアミノ酸にわたって存在している。ピリドキサールホスフェートと共に
シッフ塩基を形成するリシンを含む領域は、サッカロミセス・セレビシエのもの
と同じアミノ酸配列を有している。
【００４５】 ７−２．プラスミドprACL2の構築 プラスミドpL2SAを、HindIII、Klenow及びBamHIでこの順に消化し、ＬＣＢ２
遺伝子の3.0 kbの断片を得た。この断片をプラスミドprHEC1.9Fに挿入し、これ
をEco47III及びBamHIで処理し、プラスミドprACL2を得た。
遺伝子の3.0 kbの断片を得た。この断片をプラスミドprHEC1.9Fに挿入し、これ
をEco47III及びBamHIで処理し、プラスミドprACL2を得た。
【００４６】 プラスミドprACL2は、ピヒア・シフェリ リボソームＤＮＡ断片、ＣＹＨr（Ｌ
４１）及びＬＣＢ２遺伝子を有し、この順に相互に連結されている。プラスミド
prACL2は、特許手続きを目的とした微生物の寄託の国際認知にかかるブダペスト
条約に従い、1998年３月４日にテジョンに在するKorean Collection of Type Cu
ltures に寄託され、KCTC-0468BPの受託番号を与えられた。
４１）及びＬＣＢ２遺伝子を有し、この順に相互に連結されている。プラスミド
prACL2は、特許手続きを目的とした微生物の寄託の国際認知にかかるブダペスト
条約に従い、1998年３月４日にテジョンに在するKorean Collection of Type Cu
ltures に寄託され、KCTC-0468BPの受託番号を与えられた。
【００４７】 ７−３．形質転換 プラスミドprACL2は、変異ピヒア・シフェリ KFCC-10937へと、前記の工程５
に示す手順に従うことにより形質転換し、そして高い遺伝子コピー数を有してい
る形質転換細胞を選択した。
に示す手順に従うことにより形質転換し、そして高い遺伝子コピー数を有してい
る形質転換細胞を選択した。
【００４８】 ７−４．形質転換細胞の培養によるＴＡＰＳの製造 上記工程７−３にて得られた、形質転換された細胞をＹＧＭ最適培地（グリセ
ロール １００ｇ／リットル、酵母抽出物 ２ｇ／リットル、ＫＮＯ3 ３ｇ／リッ
トル、（ＮＨ4）2ＳＯ4 ０．５ｇ／リットル、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ０．３ｇ／
リットル、ＮａＣｌ ０．５ｇ／リットル、ＣＳＬ ３ｇ／リットル及びＬＳ−３
００ １ｇ／リットル）にて４日間培養し、ＴＡＰＳを製造した。
ロール １００ｇ／リットル、酵母抽出物 ２ｇ／リットル、ＫＮＯ3 ３ｇ／リッ
トル、（ＮＨ4）2ＳＯ4 ０．５ｇ／リットル、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ０．３ｇ／
リットル、ＮａＣｌ ０．５ｇ／リットル、ＣＳＬ ３ｇ／リットル及びＬＳ−３
００ １ｇ／リットル）にて４日間培養し、ＴＡＰＳを製造した。
【００４９】 本発明に従い形質転換された細胞は、親株KFCC-10937よりも少なくとも１．３
倍高いＴＡＰＳ製造を呈した。
倍高いＴＡＰＳ製造を呈した。
【００５０】 ８．ピヒア・シフェリからのグリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロ
ゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）プロモーター遺伝子の単離 グリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）は、
解糖に関わる必須酵素であり、グリセルアルデヒド−３−ホスフェートを１，３
−ビス−ホスフォグリセレートへと変換する。これは構成性に発現されている酵
素である。ＧＡＰＤＨプロモーター遺伝子は炭素供給源によってほとんど影響を
受けないので、これが遺伝子操作分野の研究者の注目を引くのである（Kniskern
et al., Gene, 46, 135, 1986; Travis et al., J. Biol. Chem., 260, 4384,
1985; Hallewell et al., Biotechnol., 5, 363, 1987; Rosenberg et al., Met hod Enzymol. , 185, 341, 1990; Waterham et al., Gene, 16, 37, 1997）。
ゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）プロモーター遺伝子の単離 グリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）は、
解糖に関わる必須酵素であり、グリセルアルデヒド−３−ホスフェートを１，３
−ビス−ホスフォグリセレートへと変換する。これは構成性に発現されている酵
素である。ＧＡＰＤＨプロモーター遺伝子は炭素供給源によってほとんど影響を
受けないので、これが遺伝子操作分野の研究者の注目を引くのである（Kniskern
et al., Gene, 46, 135, 1986; Travis et al., J. Biol. Chem., 260, 4384,
1985; Hallewell et al., Biotechnol., 5, 363, 1987; Rosenberg et al., Met hod Enzymol. , 185, 341, 1990; Waterham et al., Gene, 16, 37, 1997）。
【００５１】 これらの研究に基づき、本発明者らはピヒア・シフェリＧＡＰＤＨプロモータ
ー遺伝子をクローニングし、そしてＧＡＰＤＨプロモーターの挿入で所望の遺伝
子の発現が増大するか否かについて評価した。
ー遺伝子をクローニングし、そしてＧＡＰＤＨプロモーターの挿入で所望の遺伝
子の発現が増大するか否かについて評価した。
【００５２】 ８−１．ＧＡＰＤＨ遺伝子の単離 ピヒア・シフェリ ATCC 14091のゲノムＤＮＡからＧＡＰＤＨ遺伝子をクロー
ニングするために、サッカロミセス・セレビシエ2805由来のＧＡＰＤＨ遺伝子を
使用した。かくしてクローニングされたＧＡＰＤＨ遺伝子を使用することによっ
て、プラスミドpGH2.2を構築した（図４）。ピヒア・シフェリ ATCC 14091のＧ
ＡＰＤＨ遺伝子のヌクレオチド配列を調べ、配列表において配列番号：５として
、推定上のアミノ酸配列（配列番号：６）と共に表す。この配列は、1998年３月
７日にGenBankに、受入番号 AF 053300にて提出された。
ニングするために、サッカロミセス・セレビシエ2805由来のＧＡＰＤＨ遺伝子を
使用した。かくしてクローニングされたＧＡＰＤＨ遺伝子を使用することによっ
て、プラスミドpGH2.2を構築した（図４）。ピヒア・シフェリ ATCC 14091のＧ
ＡＰＤＨ遺伝子のヌクレオチド配列を調べ、配列表において配列番号：５として
、推定上のアミノ酸配列（配列番号：６）と共に表す。この配列は、1998年３月
７日にGenBankに、受入番号 AF 053300にて提出された。
【００５３】 ピヒア・シフェリ ATCC 14091 ＧＡＰＤＨ遺伝子は、1004塩基対を含み、イン
トロンは有していない。ヌクレオチド配列及び推定上のアミノ酸配列は、サッカ
ロミセス・セレビシエ由来のものとそれぞれ６９．３％及び７６．２％の相同性
を示している。このことは、ピヒア・シフェリ ATCC 14091 ＧＡＰＤＨ遺伝子が
新規であることを示している。
トロンは有していない。ヌクレオチド配列及び推定上のアミノ酸配列は、サッカ
ロミセス・セレビシエ由来のものとそれぞれ６９．３％及び７６．２％の相同性
を示している。このことは、ピヒア・シフェリ ATCC 14091 ＧＡＰＤＨ遺伝子が
新規であることを示している。
【００５４】 ８−２．ＧＡＰＤＨプロモーター遺伝子の単離 プラスミドpGH2.2及びプライマー（プライマーＮｏ．３及び４；それぞれ配列
表において、配列番号：９及び配列番号：１０）を使用してＰＣＲを実施し、ピ
ヒア・シフェリＧＡＰＤＨプロモーター遺伝子（６００ bp）を単離した。この
遺伝子を、pT7-Blue T-ベクターのEcoRV部位に挿入し、プラスミドpT7GHを得た
。
表において、配列番号：９及び配列番号：１０）を使用してＰＣＲを実施し、ピ
ヒア・シフェリＧＡＰＤＨプロモーター遺伝子（６００ bp）を単離した。この
遺伝子を、pT7-Blue T-ベクターのEcoRV部位に挿入し、プラスミドpT7GHを得た
。
【００５５】 ８−３．それ自体のプロモーターを含まないＬＣＢ２遺伝子の単離 図５に示す方法に従い、プラスミドpL2SAから、それ自体のプロモーターを含
まないＬＣＢ２遺伝子を単離した。その遺伝子は２．３ kbのサイズを有してい
る。これをpT7GHのBamHI部位に挿入し、プラスミドpGAL2を得た。
まないＬＣＢ２遺伝子を単離した。その遺伝子は２．３ kbのサイズを有してい
る。これをpT7GHのBamHI部位に挿入し、プラスミドpGAL2を得た。
【００５６】 ８−４．プラスミドprACGL2の構築 図５に示す方法に従い、プラスミドpGAL2から、２．９ kbのＬＣＢ２遺伝子を
単離し、そしてprHEC1.9FのEco47III/XbaI部位へと挿入してプラスミドprACGL2
を得た。
単離し、そしてprHEC1.9FのEco47III/XbaI部位へと挿入してプラスミドprACGL2
を得た。
【００５７】 プラスミドprACGL2は、ピヒア・シフェリ リボソームＤＮＡ断片、ＣＹＨr（
Ｌ４１）、ＧＡＰＤＨプロモーター遺伝子及びＬＣＢ２遺伝子を有し、この順に
相互に連結されている。プラスミドprACGL2は、特許手続きを目的とした微生物
の寄託の国際認知にかかるブダペスト条約に従い、1998年６月２５日にテジョン
に在するKorean Collection of Type Cultures に寄託され、KCTC-0498BPの受託
番号を与えられた。
Ｌ４１）、ＧＡＰＤＨプロモーター遺伝子及びＬＣＢ２遺伝子を有し、この順に
相互に連結されている。プラスミドprACGL2は、特許手続きを目的とした微生物
の寄託の国際認知にかかるブダペスト条約に従い、1998年６月２５日にテジョン
に在するKorean Collection of Type Cultures に寄託され、KCTC-0498BPの受託
番号を与えられた。
【００５８】 ８−５．prHECGL2の構築 宿主細胞（例えば、ピヒア・シフェリの株）を、プラスミドprACGL2で形質転
換すると、プラスミドが宿主細胞への形質転換に先駆けて直線化のために唯一の
制限酵素のみで処理されるので、得られる形質転換細胞はピヒア・シフェリ由来
の遺伝子だけでなく出発の細菌プラスミドの望ましくない他の領域も担持してい
るはずである。これを回避するために、本発明者らは、プラスミドprACGL2のＬ
ＣＢ２遺伝子の下流にピヒア・シフェリ リボソームＤＮＡ断片（８００ bp）を
加えている。かくして得られたプラスミドは、prHECGL2と命名された（図６）。
換すると、プラスミドが宿主細胞への形質転換に先駆けて直線化のために唯一の
制限酵素のみで処理されるので、得られる形質転換細胞はピヒア・シフェリ由来
の遺伝子だけでなく出発の細菌プラスミドの望ましくない他の領域も担持してい
るはずである。これを回避するために、本発明者らは、プラスミドprACGL2のＬ
ＣＢ２遺伝子の下流にピヒア・シフェリ リボソームＤＮＡ断片（８００ bp）を
加えている。かくして得られたプラスミドは、prHECGL2と命名された（図６）。
【００５９】 プラスミドprHECGL2は、ピヒア・シフェリ リボソームＤＮＡ断片、ＣＹＨr（
Ｌ４１）、ＧＡＰＤＨプロモーター遺伝子、ＬＣＢ２及びピヒア・シフェリ リ
ボソームＤＮＡ断片を有し、この順に相互に作動可能に連結されている。この制
限地図は、図６に示されている。プラスミドprHECGL2は、特許手続きを目的とし
た微生物の寄託の国際認知にかかるブダペスト条約に従い、1998年８月１０日に
テジョンに在するKorean Collection of Type Cultures に寄託され、KCTC-0511
BPの受託番号を与えられた。
Ｌ４１）、ＧＡＰＤＨプロモーター遺伝子、ＬＣＢ２及びピヒア・シフェリ リ
ボソームＤＮＡ断片を有し、この順に相互に作動可能に連結されている。この制
限地図は、図６に示されている。プラスミドprHECGL2は、特許手続きを目的とし
た微生物の寄託の国際認知にかかるブダペスト条約に従い、1998年８月１０日に
テジョンに在するKorean Collection of Type Cultures に寄託され、KCTC-0511
BPの受託番号を与えられた。
【００６０】 宿主細胞をプラスミドprHECGL2で形質転換すると、双方のピヒア・シフェリ
リボソームＤＮＡを切断すべくこのプラスミドを適切な制限酵素により処理する
ことによって、得られる形質転換細胞はピヒア・シフェリ由来の遺伝子を一つだ
け担持している。すなわち、プラスミドprHECGL2をピヒア・シフェリへと形質転
換すると、得られる形質転換されたピヒア・シフェリ細胞は、唯一の内在性遺伝
子を担持しているはずである。
リボソームＤＮＡを切断すべくこのプラスミドを適切な制限酵素により処理する
ことによって、得られる形質転換細胞はピヒア・シフェリ由来の遺伝子を一つだ
け担持している。すなわち、プラスミドprHECGL2をピヒア・シフェリへと形質転
換すると、得られる形質転換されたピヒア・シフェリ細胞は、唯一の内在性遺伝
子を担持しているはずである。
【００６１】 ８−６．形質転換 ピヒア・シフェリ KFCC-10937の細胞とプラスミドprACL2、prACGL2及びprHECG
L2を混合し、それぞれプラスミドで細胞を形質転換すべく電圧５００Ｖ、容量５
０μＦ且つ抵抗８００Ωにてエレクトロポレーションを実施した。
L2を混合し、それぞれプラスミドで細胞を形質転換すべく電圧５００Ｖ、容量５
０μＦ且つ抵抗８００Ωにてエレクトロポレーションを実施した。
【００６２】 ８−７．形質転換細胞培養によるＴＡＰＳの製造 上記工程８−６にて得られた、形質転換された細胞をＹＧＭ最適培地（グリセ
ロール １００ｇ／リットル、酵母抽出物 ２ｇ／リットル、ＫＮＯ3 ３ｇ／リッ
トル、（ＮＨ4）2ＳＯ4 ０．５ｇ／リットル、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ０．３ｇ／
リットル、ＮａＣｌ ０．５ｇ／リットル、ＣＳＬ ３ｇ／リットル及びＬＳ−３
００ １ｇ／リットル）にて培養し、ＴＡＰＳを製造した。
ロール １００ｇ／リットル、酵母抽出物 ２ｇ／リットル、ＫＮＯ3 ３ｇ／リッ
トル、（ＮＨ4）2ＳＯ4 ０．５ｇ／リットル、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ０．３ｇ／
リットル、ＮａＣｌ ０．５ｇ／リットル、ＣＳＬ ３ｇ／リットル及びＬＳ−３
００ １ｇ／リットル）にて培養し、ＴＡＰＳを製造した。
【００６３】 本発明に従い、プラスミドprACGL2（KCTC-0498BP）またはプラスミドprHECGL2
（KCTC-0511BP）で形質転換された細胞は、親株KFCC-10937よりも、そしてプラ
スミドprACL2で形質転換された細胞（KCTC-0468BP）よりも、それぞれ少なくと
も２．１倍及び少なくとも１．５倍高いＴＡＰＳ製造を呈した。
（KCTC-0511BP）で形質転換された細胞は、親株KFCC-10937よりも、そしてプラ
スミドprACL2で形質転換された細胞（KCTC-0468BP）よりも、それぞれ少なくと
も２．１倍及び少なくとも１．５倍高いＴＡＰＳ製造を呈した。
【００６４】 配列表のフリーテキスト 配列番号：７は、ＰＣＲプライマーＣＹＨ１に対する人工配列である。
【００６５】 配列番号：８は、ＰＣＲプライマーＣＹＨ４に対する人工配列である。
【００６６】 配列番号：９は、ＧＡＰＤＨプロモーター遺伝子の単離のために使用されるＰ
ＣＲプライマーＮｏ．３に対する人工配列である。
ＣＲプライマーＮｏ．３に対する人工配列である。
【００６７】 配列番号：１０は、ＧＡＰＤＨプロモーター遺伝子の単離のために使用される
ＰＣＲプライマーＮｏ．４に対する人工配列である。
ＰＣＲプライマーＮｏ．４に対する人工配列である。
【００６８】 配列番号：１１は、ＰＣＲプライマーＣＨ−ｆに対する人工配列である。
【００６９】 配列番号：１２は、ＰＣＲプライマーＣＨ−ｒに対する人工配列である。
【００７０】 配列番号：１３は、ＰＣＲプライマー１８Ｒに対する人工配列である。
【００７１】 配列番号：１４は、ＰＣＲプライマー２６Ｆに対する人工配列である。
【００７２】 配列番号：１５は、ＰＣＲプライマーＬ２ｆに対する人工配列である。
【００７３】 配列番号：１６は、ＰＣＲプライマーＬ２ｒに対する人工配列である。
【００７４】 配列番号：１７は、ＧＡＰＤＨ遺伝子の単離のために使用されるＰＣＲプライ
マーＮｏ．１に対する人工配列である。
マーＮｏ．１に対する人工配列である。
【００７５】 配列番号：１８は、ＧＡＰＤＨ遺伝子の単離のために使用されるＰＣＲプライ
マーＮｏ．２に対する人工配列である。
マーＮｏ．２に対する人工配列である。
【００７６】
本発明を、様々な実施例によってさらに詳細に説明するが、これら実施例は本
発明の範囲を限定するものとして理解されるべきでない。
発明の範囲を限定するものとして理解されるべきでない。
【００７７】 実施例１：ピヒア・シフェリATCC14091からのゲノムＤＮＡの単離 ピヒア・シフェリATCC14091の細胞をJohnston（Johnston et al., Yeast Gene
tics, molecular aspects, pp.107-123, IRL, Press, 1988）によって記載の方
法に従ってＹＥＰＤ培地（ペプトン ２％、酵母エキス １％、及びグルコース
２％）内で増殖させ、回収し、ＳＳＥＭ溶液（１Ｍ ソルビトール、１００ｍＭ
クエン酸ナトリウム、６０ｍＭ ＥＤＴＡ、１００ｍＭ ２−メルカプトエタ
ノール）に懸濁させた。ノボザイムを０．１ｍｇ／ｍｌの濃度でこの懸濁液に加
え、プロトプラストを得るために３７℃にて３０分間反応させた。等量のＳＤＳ
−ＴＥ溶液（１Ｍ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ、ｐＨ ８．０中、２％ ＳＤＳ、５０ｍＭ
ＥＤＴＡ）を加え、６０℃にて１０分間反応させ、細胞を分解させた。８，０
００ｒｐｍでの１５分間の遠心によって得られた上清に、２倍量のエタノールを
加えた。得られたペレットを、ＲＮaseを含んだＴＥ溶液に溶解させ、ピヒア・
シフェリゲノムＤＮＡを抽出した。
tics, molecular aspects, pp.107-123, IRL, Press, 1988）によって記載の方
法に従ってＹＥＰＤ培地（ペプトン ２％、酵母エキス １％、及びグルコース
２％）内で増殖させ、回収し、ＳＳＥＭ溶液（１Ｍ ソルビトール、１００ｍＭ
クエン酸ナトリウム、６０ｍＭ ＥＤＴＡ、１００ｍＭ ２−メルカプトエタ
ノール）に懸濁させた。ノボザイムを０．１ｍｇ／ｍｌの濃度でこの懸濁液に加
え、プロトプラストを得るために３７℃にて３０分間反応させた。等量のＳＤＳ
−ＴＥ溶液（１Ｍ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ、ｐＨ ８．０中、２％ ＳＤＳ、５０ｍＭ
ＥＤＴＡ）を加え、６０℃にて１０分間反応させ、細胞を分解させた。８，０
００ｒｐｍでの１５分間の遠心によって得られた上清に、２倍量のエタノールを
加えた。得られたペレットを、ＲＮaseを含んだＴＥ溶液に溶解させ、ピヒア・
シフェリゲノムＤＮＡを抽出した。
【００７８】 実施例２：ピヒア・シフェリATCC14091からのＬ４１遺伝子の単離 以下の２つのプライマーＣＹＨ１及びＣＹＨ４を合成した。 ＣＹＨ１：5'-CGC GTA GTT AAY GTN CCN AAR AC-3' ＣＹＨ４：5'-GCC TGG CCY TTY TGY TTY TTN TC-3' これらの２つのプライマーはまた配列表でそれぞれ配列番号：７及び配列番号
：８として表した。
：８として表した。
【００７９】 ＰＣＲをこの２つのプライマーと実施例１で得たピヒア・シフェリゲノムＤＮ
Ａを用いて行ない、約３００ｂｐのＬ４１遺伝子断片を得た。
Ａを用いて行ない、約３００ｂｐのＬ４１遺伝子断片を得た。
【００８０】 この断片を取扱説明書にしたがってＤＩＧ−標識化及び検出キット（Boehring
er Mannheim）で標識化し、プローブを得た。
er Mannheim）で標識化し、プローブを得た。
【００８１】 実施例３：Ｌ４１遺伝子の配列決定 実施例１で得たピヒア・シフェリのゲノムＤＮＡをさまざまな制限酵素で消化
し、消化産生物を０．９％アガロースゲル電気泳動にかけ、Nytran（登録商標）
膜（Schleicher & Schuell）に写し、続いて実施例２で得たプローブを用いて、
ハイブリッド形成溶液（５×ＳＳＣ、０．１％ Ｎ−ラウリルサルコシン、０．
０２％ ＳＤＳ、２％ ブロッキング剤及び３０％ ホルムアルデヒド）でハイ
ブリッド形成させた。ハイブリッド形成はBoehringer Mannheimによって準備さ
れた取扱説明書にしたがって４２℃、６時間で行った。
し、消化産生物を０．９％アガロースゲル電気泳動にかけ、Nytran（登録商標）
膜（Schleicher & Schuell）に写し、続いて実施例２で得たプローブを用いて、
ハイブリッド形成溶液（５×ＳＳＣ、０．１％ Ｎ−ラウリルサルコシン、０．
０２％ ＳＤＳ、２％ ブロッキング剤及び３０％ ホルムアルデヒド）でハイ
ブリッド形成させた。ハイブリッド形成はBoehringer Mannheimによって準備さ
れた取扱説明書にしたがって４２℃、６時間で行った。
【００８２】 アルカリホスファターゼ共役抗体を導入し、ＢＣＩＰ及びＸ−リン酸を加えた
。紫色染色バンドが観察された。
。紫色染色バンドが観察された。
【００８３】 バンドはEcoRIで処理したゲノムＤＮＡの１．９ｋｂの大きさで検出された。
このＤＮＡ断片（１．９ｋｂ）を回収し、プラスミドpBluescript KS+（Stratag
ene）のEcoRI部位へ連結させ、大腸菌（E.Coli）ＤＨ５αに形質転換しライブラ
リーを確立した。
このＤＮＡ断片（１．９ｋｂ）を回収し、プラスミドpBluescript KS+（Stratag
ene）のEcoRI部位へ連結させ、大腸菌（E.Coli）ＤＨ５αに形質転換しライブラ
リーを確立した。
【００８４】 このライブラリーを繰り返しサザンブロット解析にかけ、Ｌ４１遺伝子を含む
１．９ｋｂ遺伝子断片を単離した（プラスミドpCYH1.9）。ヌクレオチド配列決
定を自動化シークエンサーモデル３７３Ａ（Applied Biosystem）を用いてこの
プラスミドについて行った。この結果は配列表に、その推定されるアミノ酸配列
（配列番号：２）と共に配列番号：１として表した。本配列は１９９８年３月７
日、受入番号AF053457にてGenBankに提出した。
１．９ｋｂ遺伝子断片を単離した（プラスミドpCYH1.9）。ヌクレオチド配列決
定を自動化シークエンサーモデル３７３Ａ（Applied Biosystem）を用いてこの
プラスミドについて行った。この結果は配列表に、その推定されるアミノ酸配列
（配列番号：２）と共に配列番号：１として表した。本配列は１９９８年３月７
日、受入番号AF053457にてGenBankに提出した。
【００８５】 ピヒア・シフェリATCC14091のＬ４１遺伝子は４１９ｂｐのイントロンを含む
７３７塩基対からなる。アミノ酸残基５６はプロリンである。
７３７塩基対からなる。アミノ酸残基５６はプロリンである。
【００８６】 実施例４：プロリン（アミノ酸第５６位）をグルタミンに置換したプラスミド
pCYH1.9rの構築 ２つのプライマーＣＨ−ｆ及びＣＨ−ｒを調製した。 プライマーＣＨ−ｆ：GGT CAA ACC AAA CCA GTT TTC プライマーＣＨ−ｒ：ATG GAA AAC TTG TTT GGT TTG ACC これらの２つのプライマーもまた配列表においてそれぞれ配列番号：１１及び
配列番号：１２として表す。
pCYH1.9rの構築 ２つのプライマーＣＨ−ｆ及びＣＨ−ｒを調製した。 プライマーＣＨ−ｆ：GGT CAA ACC AAA CCA GTT TTC プライマーＣＨ−ｒ：ATG GAA AAC TTG TTT GGT TTG ACC これらの２つのプライマーもまた配列表においてそれぞれ配列番号：１１及び
配列番号：１２として表す。
【００８７】 ユニバーサルプライマーとプライマーＣＨ−ｒの組合せ、及び逆方向プライマ
ーとプライマーＣＨ−ｆの組合せを、ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ及び鋳型とし
てpCYH1.9を用いたＰＣＲで使用し、１．２ｋｂ及び０．７ｋｂの２つのＰＣＲ
産生物を得た。ＰＣＲをこの２つのＰＣＲ産生物（１．２ｋｂ及び０．７ｋｂ）
及びユニバーサル及び逆方向プライマーを用いて再び行い、プロリン（アミノ酸
第５６位）をグルタミンに置換したプラスミドpCYH1.9rを得た。
ーとプライマーＣＨ−ｆの組合せを、ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ及び鋳型とし
てpCYH1.9を用いたＰＣＲで使用し、１．２ｋｂ及び０．７ｋｂの２つのＰＣＲ
産生物を得た。ＰＣＲをこの２つのＰＣＲ産生物（１．２ｋｂ及び０．７ｋｂ）
及びユニバーサル及び逆方向プライマーを用いて再び行い、プロリン（アミノ酸
第５６位）をグルタミンに置換したプラスミドpCYH1.9rを得た。
【００８８】 実施例５：リボソームＤＮＡ断片を含むプラスミドprDX9.0の構築 以下の２つのプライマー１８Ｒ及び２６Ｆを合成した。 プライマー１８Ｒ：5'-CAA TAA TTG CAA TGC TCT ATC CCC AGC ACG-3' プライマー２６Ｆ：5'-GGA TAT GGA TTC TTC ACG GTA ACG TAA CTG-3' これらの２つのプライマーもまた配列表にてそれぞれ配列番号：１３及び配列
番号：１４として表す。
番号：１４として表す。
【００８９】 ＰＣＲを、この２つのプライマーと実施例１で得たピヒア・シフェリゲノムＤ
ＮＡを用いて行い、６．０ｋｂのＰＣＲ産生物を得た。このＰＣＲ産生物を実施
例２と同様の手法で標識化し、プローブを得た。
ＮＡを用いて行い、６．０ｋｂのＰＣＲ産生物を得た。このＰＣＲ産生物を実施
例２と同様の手法で標識化し、プローブを得た。
【００９０】 プローブをピヒア・シフェリゲノムＤＮＡでのサザンブロット解析に用いたと
き、バンドがXhoIで処理したゲノムＤＮＡの９ｋｂのサイズにて検出された。こ
のＤＮＡ断片（９ｋｂ）を回収し、pBluescript KS+（Stratagene）内に挿入し
、そのライブラリーを確立した。このライブラリーを繰り返しサザンブロット解
析にかけ、リボソームＤＮＡを含む９ｋｂ遺伝子断片を単離した（プラスミドpr
DX9.0）。
き、バンドがXhoIで処理したゲノムＤＮＡの９ｋｂのサイズにて検出された。こ
のＤＮＡ断片（９ｋｂ）を回収し、pBluescript KS+（Stratagene）内に挿入し
、そのライブラリーを確立した。このライブラリーを繰り返しサザンブロット解
析にかけ、リボソームＤＮＡを含む９ｋｂ遺伝子断片を単離した（プラスミドpr
DX9.0）。
【００９１】 ヌクレオチド配列決定をこのプラスミドに対して、自動化シークエンサーモデ
ル３７３Ａ（Applied Biosystem）を用いて行った。２６Ｓ、１８Ｓ、５．８Ｓ
及び５Ｓリボソーム遺伝子の局在と開始点を含む結果を図１に示す。
ル３７３Ａ（Applied Biosystem）を用いて行った。２６Ｓ、１８Ｓ、５．８Ｓ
及び５Ｓリボソーム遺伝子の局在と開始点を含む結果を図１に示す。
【００９２】 実施例６：プラスミドprXHNCの構築 実施例５で得たプラスミドprDX9.0をXbaIで処理し、３．５ｋｂのリボソーム
ＤＮＡを得、次いでプラスミドpBluescript KS+に挿入した。得られた組換え体
プラスミドをHpaI/NcoI/クレノーで処理し、１．６ｋｂリボソームＤＮＡを取り
出し、実施例４でのプラスミドpCYH1.9rをEcoRI/クレノーで消化することで得た
１．９ｋｂ ＣＹＨr遺伝子と連結し、プラスミドprXHNCを得た。
ＤＮＡを得、次いでプラスミドpBluescript KS+に挿入した。得られた組換え体
プラスミドをHpaI/NcoI/クレノーで処理し、１．６ｋｂリボソームＤＮＡを取り
出し、実施例４でのプラスミドpCYH1.9rをEcoRI/クレノーで消化することで得た
１．９ｋｂ ＣＹＨr遺伝子と連結し、プラスミドprXHNCを得た。
【００９３】 実施例７：プラスミドprEHCの構築 実施例５で得たプラスミドprDX9.0をEcoRIで処理し、３．８ｋｂのリボソーム
ＤＮＡを得、次いでプラスミドpBluescript KS+に挿入した。得られた組換え体
プラスミドをHpaIで処理し、２ｋｂリボソームＤＮＡを取り出し、実施例４での
プラスミドpCYH1.9rをEcoRI/クレノーで消化することで得た１．９ｋｂ ＣＹＨ r 遺伝子と連結し、プラスミドprEHCを得た。
ＤＮＡを得、次いでプラスミドpBluescript KS+に挿入した。得られた組換え体
プラスミドをHpaIで処理し、２ｋｂリボソームＤＮＡを取り出し、実施例４での
プラスミドpCYH1.9rをEcoRI/クレノーで消化することで得た１．９ｋｂ ＣＹＨ r 遺伝子と連結し、プラスミドprEHCを得た。
【００９４】 実施例８：プラスミドprCEXの構築 実施例５で得たprDX9.0をEcoRI/XbaIで処理し、１．１ｋｂのリボソームＤＮ
Ａを得た。実施例４でのプラスミドpCYH1.9rをEcoRI/クレノーで消化することで
得た１．９ｋｂ ＣＹＨr遺伝子を、この１．１ｋｂのリボソームＤＮＡのEcoRI
部位と連結し、プラスミドprCEXを得た。
Ａを得た。実施例４でのプラスミドpCYH1.9rをEcoRI/クレノーで消化することで
得た１．９ｋｂ ＣＹＨr遺伝子を、この１．１ｋｂのリボソームＤＮＡのEcoRI
部位と連結し、プラスミドprCEXを得た。
【００９５】 実施例９：プラスミドprCRXの構築 実施例５で得たprDX9.0をEcoRV／XbaIで処理し、１．３ｋｂのリボソームＤＮ
Ａを得た。実施例４でのプラスミドpCYH1.9rをEcoRI/クレノーで消化することで
得た１．９ｋｂ ＣＹＨr遺伝子を、この１．３ｋｂのリボソームＤＮＡのEcoRV
部位と連結し、プラスミドprCRXを得た。
Ａを得た。実施例４でのプラスミドpCYH1.9rをEcoRI/クレノーで消化することで
得た１．９ｋｂ ＣＹＨr遺伝子を、この１．３ｋｂのリボソームＤＮＡのEcoRV
部位と連結し、プラスミドprCRXを得た。
【００９６】 実施例１０：プラスミドprXCHの構築 実施例５で得たprDX9.0をXbaIで処理し、３．５ｋｂのリボソームＤＮＡを得
た。実施例４でのプラスミドpCYH1.9rをEcoRI/クレノーで消化することで得た１
．９ｋｂ ＣＹＨr遺伝子を、この３．５ｋｂのリボソームＤＮＡのHpaI部位と連
結し、プラスミドprXCHを得た。
た。実施例４でのプラスミドpCYH1.9rをEcoRI/クレノーで消化することで得た１
．９ｋｂ ＣＹＨr遺伝子を、この３．５ｋｂのリボソームＤＮＡのHpaI部位と連
結し、プラスミドprXCHを得た。
【００９７】 実施例１１：プラスミドprXCEの構築 実施例５で得たprDX9.0をXbaIで処理し、３．５ｋｂのリボソームＤＮＡを得
た。実施例４でのプラスミドpCYH1.9rをEcoRIで消化することで得た１．９ｋｂ
ＣＹＨr遺伝子を、この３．５ｋｂのリボソームＤＮＡのEcoRI部位と連結し、プ
ラスミドprXCEを得た。
た。実施例４でのプラスミドpCYH1.9rをEcoRIで消化することで得た１．９ｋｂ
ＣＹＨr遺伝子を、この３．５ｋｂのリボソームＤＮＡのEcoRI部位と連結し、プ
ラスミドprXCEを得た。
【００９８】 実施例１２：プラスミドprXHC1.9の構築 実施例５で得たprDX9.0をXhoI/HindIIIで処理し、１．６ｋｂのリボソームＤ
ＮＡを得た。この１．６ｋｂリボソームＤＮＡを含むプラスミドをHindIII/クレ
ノーで消化し、実施例４でのプラスミドpCYH1.9rをEcoRIで消化することで得た
１．９ｋｂ ＣＹＨr遺伝子を、このHindIII/クレノー消化産生物のEcoRI部位と
連結し、プラスミドprXHC1.9を得た。
ＮＡを得た。この１．６ｋｂリボソームＤＮＡを含むプラスミドをHindIII/クレ
ノーで消化し、実施例４でのプラスミドpCYH1.9rをEcoRIで消化することで得た
１．９ｋｂ ＣＹＨr遺伝子を、このHindIII/クレノー消化産生物のEcoRI部位と
連結し、プラスミドprXHC1.9を得た。
【００９９】 実施例１３：プラスミドprAC1.9の構築 実施例５で得たprDX9.0をHindIII/EcoRVで処理し、０．６ｋｂのリボソームＤ
ＮＡを得た。実施例４でのプラスミドpCYH1.9rをEcoRI/クレノーで消化すること
で得た１．９ｋｂ ＣＹＨr遺伝子を、この０．６ｋｂのリボソームＤＮＡのEco
RV部位と連結し、プラスミドprAC1.9を得た。
ＮＡを得た。実施例４でのプラスミドpCYH1.9rをEcoRI/クレノーで消化すること
で得た１．９ｋｂ ＣＹＨr遺伝子を、この０．６ｋｂのリボソームＤＮＡのEco
RV部位と連結し、プラスミドprAC1.9を得た。
【０１００】 実施例１４：プラスミドprEC1.9の構築 実施例５で得たprDX9.0をHindIII/EcoRIで処理し、１．４ｋｂのリボソームＤ
ＮＡを得た。実施例４でのプラスミドpCYH1.9rをEcoRIで消化することで得た１
．９ｋｂ ＣＹＨr遺伝子を、この１．４ｋｂのリボソームＤＮＡのEcoRI部位と
連結し、プラスミドprXCHを得た。
ＮＡを得た。実施例４でのプラスミドpCYH1.9rをEcoRIで消化することで得た１
．９ｋｂ ＣＹＨr遺伝子を、この１．４ｋｂのリボソームＤＮＡのEcoRI部位と
連結し、プラスミドprXCHを得た。
【０１０１】 実施例１５：プラスミドprHEC1.9Fの構築 実施例５で得たprDX9.0をHindIII/EcoRIで処理し、１．４ｋｂのリボソームＤ
ＮＡを得た。実施例４でのプラスミドpCYH1.9rをEcoRI/クレノーで消化すること
で得た１．９ｋｂ ＣＹＨr遺伝子を、この１．４ｋｂのリボソームＤＮＡのEcoR
V部位と連結し、プラスミドprHEC1.9Fを得た。
ＮＡを得た。実施例４でのプラスミドpCYH1.9rをEcoRI/クレノーで消化すること
で得た１．９ｋｂ ＣＹＨr遺伝子を、この１．４ｋｂのリボソームＤＮＡのEcoR
V部位と連結し、プラスミドprHEC1.9Fを得た。
【０１０２】 実施例１６：prHEC1.9Rの構築 実施例１５での手順を、ＣＹＨrの挿入開始点を実施例５のものと逆向きにし
たことを除いて繰り返し、プラスミドprHEC1.9Rを得た。
たことを除いて繰り返し、プラスミドprHEC1.9Rを得た。
【０１０３】 実施例１７：プラスミドの形質転換効率 Klass及びPeter（Klass & Peter,Curr.Genet.,25.305,1994）によって記述さ
れた方法にしたがった。すなわち、ピヒア・シフェリKFCC-10937をＹＥＰＤ培地
（１００ｍｌ）内でＯＤ500nm １．５まで増殖させ、遠心にて回収し、５０ｍ
Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．５；４０ｍｌ）内で、２５ｍＭ ＤＴＴを加えて３７
℃にて１５分間分散させた。混合液を氷冷安定化溶液（１００ｍｌ：２７０ｍＭ
スクロース、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ（ｐＨ ７．５）、１ｍＭ ＭｇＣｌ2
）にて２回洗浄し、１ｍｌの安定化溶液内に懸濁させた。
れた方法にしたがった。すなわち、ピヒア・シフェリKFCC-10937をＹＥＰＤ培地
（１００ｍｌ）内でＯＤ500nm １．５まで増殖させ、遠心にて回収し、５０ｍ
Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．５；４０ｍｌ）内で、２５ｍＭ ＤＴＴを加えて３７
℃にて１５分間分散させた。混合液を氷冷安定化溶液（１００ｍｌ：２７０ｍＭ
スクロース、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ（ｐＨ ７．５）、１ｍＭ ＭｇＣｌ2
）にて２回洗浄し、１ｍｌの安定化溶液内に懸濁させた。
【０１０４】 得られた懸濁液（５０マイクロリットル）に、５マイクロリットルの実施例６
〜１６で得られたそれぞれのプラスミドの溶液を加え、氷上に１０分間おいた。
次いで溶液を０．２ｍｍエレクトロポレーションキュベット（Bio-Rad）に移し
た。エレクトロポレーションをGene-pulserII（Bio-Red）を用いて５００Ｖ、５
０μＦ及び８００Ωで行ない、エレクトロポレーション産生物を０．５ｍＬの安
定化溶液内に懸濁させた。２ｍＬのＹＥＰＤ培地を加えた後、培養を２５℃で５
時間行った。次いで培養液を、１０μｇ／ｍＬのシクロヘキシミドを加えたＹＥ
ＰＤ固体培地上に２５℃で４〜５日間まいた。形質転換した細胞の数を計数し、
形質転換効率を表２に示した。
〜１６で得られたそれぞれのプラスミドの溶液を加え、氷上に１０分間おいた。
次いで溶液を０．２ｍｍエレクトロポレーションキュベット（Bio-Rad）に移し
た。エレクトロポレーションをGene-pulserII（Bio-Red）を用いて５００Ｖ、５
０μＦ及び８００Ωで行ない、エレクトロポレーション産生物を０．５ｍＬの安
定化溶液内に懸濁させた。２ｍＬのＹＥＰＤ培地を加えた後、培養を２５℃で５
時間行った。次いで培養液を、１０μｇ／ｍＬのシクロヘキシミドを加えたＹＥ
ＰＤ固体培地上に２５℃で４〜５日間まいた。形質転換した細胞の数を計数し、
形質転換効率を表２に示した。
【０１０５】
【表２】
【０１０６】 表２での結果は、ＣＹＨr遺伝子が挿入されたリボソームＤＮＡ部位、及びＣ
ＹＨr遺伝子の転写方向が形質転換効率にとても関連することを明らかにする。
５Ｓと２６ＳリボソームＲＮＡ構造遺伝子間の非転写領域が挿入部位として使用
されたプラスミドprAC1.9及びprHEC1.9Fは最も高い形質転換効率を持っている。
そして、５Ｓ ＲＮＡ遺伝子の転写方向がＣＹＨrのそれと反対であるprHEC1.9R
は有意に減少した形質転換効率を示している。
ＹＨr遺伝子の転写方向が形質転換効率にとても関連することを明らかにする。
５Ｓと２６ＳリボソームＲＮＡ構造遺伝子間の非転写領域が挿入部位として使用
されたプラスミドprAC1.9及びprHEC1.9Fは最も高い形質転換効率を持っている。
そして、５Ｓ ＲＮＡ遺伝子の転写方向がＣＹＨrのそれと反対であるprHEC1.9R
は有意に減少した形質転換効率を示している。
【０１０７】 これらの結果を基に、プラスミドprHEC1.9Fを選択した。
【０１０８】 実施例１８：形質転換条件の選択 形質転換の最適な条件を確立する目的で、ApaI/ScaIの処理の後得た直鎖prHEC
1.9を、電気容量を５０μＦに保つ一方で、電圧を５００、６００または７００
Ｖに変更し、抵抗値を１００、２００、３００、４００、５００、６００、７０
０または８００Ωに変更することを除いて実施例１７の手順に従って形質転換し
た。結果を表３に示している。
1.9を、電気容量を５０μＦに保つ一方で、電圧を５００、６００または７００
Ｖに変更し、抵抗値を１００、２００、３００、４００、５００、６００、７０
０または８００Ωに変更することを除いて実施例１７の手順に従って形質転換し
た。結果を表３に示している。
【０１０９】
【表３】
【０１１０】 表３の結果から、最適な形質転換条件は、電気容量５０μＦ、電圧５００Ｖ、
及び抵抗値８００Ωであることが確かめられた。
及び抵抗値８００Ωであることが確かめられた。
【０１１１】 実施例１９：サザンブロット解析による形質転換細胞の解析 実施例１７で選択したそれぞれの形質転換細胞を５μｇ／ｍＬのシクロヘキシ
ミドを加えたＹＥＰＤ培地に植え付け、２５℃で１８〜２０時間攪拌しながら培
養し、続いて遠心によって細胞ペレットを回収した。そして、得られた細胞を１
．５ｍＬチューブ内においた。細胞を３０μＬのＳＴＥＳ溶液（０．２Ｍ Ｔｒ
ｉｓ−Ｃｌ，ｐＨ ７．６中０．５Ｍ ＮａＣｌ、０．０１Ｍ ＥＤＴＡ、１％
ＳＤＳ）中で懸濁させ、０．８容量のガラスビーズ（直径０．４ｍｍ）をここ
に加えた。混合液を５分間攪拌し、２００μＬのＴＥ緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉ
ｓ−Ｃｌ，ｐＨ ８．０中１ｍＭ ＥＤＴＡ）と２００μＬのフェノール／クロ
ロホルム／イソアミルアルコール（２５：２４：１）を加えた。得られた混合液
を２分間攪拌し、１２，０００ｒｐｍにて遠心した。２．５容量のエタノールを
上清に加え、ゲノムＤＮＡを沈降させ、乾燥させた。
ミドを加えたＹＥＰＤ培地に植え付け、２５℃で１８〜２０時間攪拌しながら培
養し、続いて遠心によって細胞ペレットを回収した。そして、得られた細胞を１
．５ｍＬチューブ内においた。細胞を３０μＬのＳＴＥＳ溶液（０．２Ｍ Ｔｒ
ｉｓ−Ｃｌ，ｐＨ ７．６中０．５Ｍ ＮａＣｌ、０．０１Ｍ ＥＤＴＡ、１％
ＳＤＳ）中で懸濁させ、０．８容量のガラスビーズ（直径０．４ｍｍ）をここ
に加えた。混合液を５分間攪拌し、２００μＬのＴＥ緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉ
ｓ−Ｃｌ，ｐＨ ８．０中１ｍＭ ＥＤＴＡ）と２００μＬのフェノール／クロ
ロホルム／イソアミルアルコール（２５：２４：１）を加えた。得られた混合液
を２分間攪拌し、１２，０００ｒｐｍにて遠心した。２．５容量のエタノールを
上清に加え、ゲノムＤＮＡを沈降させ、乾燥させた。
【０１１２】 ゲノムＤＮＡ（２〜３μｇ）を５０μＬの蒸留した水中に溶解し、EcoRIで処
理し、０．８％アガロースゲル上の電気泳動にかけた。サザンブロット解析を、
プローブとして実施例２でのＬ４１を使用することで行い、バンドを検出した。
Ｌ４１の遺伝子の４〜５コピーがすべての形質転換細胞のゲノムＤＮＡ上にある
ことが観察された。
理し、０．８％アガロースゲル上の電気泳動にかけた。サザンブロット解析を、
プローブとして実施例２でのＬ４１を使用することで行い、バンドを検出した。
Ｌ４１の遺伝子の４〜５コピーがすべての形質転換細胞のゲノムＤＮＡ上にある
ことが観察された。
【０１１３】 実施例２０：プラスミドprACL2の構築 （１）ピヒア・シフェリATCC14091からのＬＣＢ２遺伝子の単離 サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）の細胞をJohnston
（Johnston et al.,Yeast Genetics,molecular aspects,pp.107-123,IRL,Press,
1988）によって記載の方法に従ってＹＥＰＤ培地（ペプトン ２％、酵母エキス
１％、及びグルコース ２％）内で増殖させ、回収し、そこよりゲノムＤＮＡ
を単離した。
（Johnston et al.,Yeast Genetics,molecular aspects,pp.107-123,IRL,Press,
1988）によって記載の方法に従ってＹＥＰＤ培地（ペプトン ２％、酵母エキス
１％、及びグルコース ２％）内で増殖させ、回収し、そこよりゲノムＤＮＡ
を単離した。
【０１１４】 以下の２つのプライマーＬ２ｆ及びＬ２ｒを合成した。 プライマーＬ２ｆ：5'-ATG AGT ACT CCT GCA AAC TA-3' プライマーＬ２ｒ：5'-TAA CAA AAT ACT TGT CGT CC-3' これらの２つのプライマーもまた配列表においてそれぞれ配列番号：１５及び
配列番号：１６として表した。
配列番号：１６として表した。
【０１１５】 ＰＣＲをこの２つのプライマーと上記で得たサッカロミセス・セレビシエ ゲ
ノムＤＮＡを用いて行い、約１６８０ｂｐのＬＣＢ２遺伝子断片を得た。９１３
ｂｐのSalI断片を、取扱説明書にしたがってＤＩＧ−標識化及び検出キット（Bo
ehringer Mannheim）で標識化し、プローブを得た。
ノムＤＮＡを用いて行い、約１６８０ｂｐのＬＣＢ２遺伝子断片を得た。９１３
ｂｐのSalI断片を、取扱説明書にしたがってＤＩＧ−標識化及び検出キット（Bo
ehringer Mannheim）で標識化し、プローブを得た。
【０１１６】 実施例１で得たピヒア・シフェリのゲノムＤＮＡを様々な制限酵素、BamHI、E
coRI、EcoRV、HindIII、PstIまたはSalIで消化し、消化産生物をＴＡＥ緩衝液中
電気泳動にかけ、Nytran（登録商標）膜（Schleicher & Schuell）に写し、続い
てサザンブロット解析を行った。
coRI、EcoRV、HindIII、PstIまたはSalIで消化し、消化産生物をＴＡＥ緩衝液中
電気泳動にかけ、Nytran（登録商標）膜（Schleicher & Schuell）に写し、続い
てサザンブロット解析を行った。
【０１１７】 サザンブロット解析は、ハイブリッド形成溶液（５×ＳＳＣ、０．１％ Ｎ−
ラウリルサルコシン、０．０２％ ＳＤＳ、２％ ブロッキング剤及び３０％
ホルムミド）を用い、Boehringer Mannheimによって準備された取扱説明書にし
たがって４２℃で６時間行った。
ラウリルサルコシン、０．０２％ ＳＤＳ、２％ ブロッキング剤及び３０％
ホルムミド）を用い、Boehringer Mannheimによって準備された取扱説明書にし
たがって４２℃で６時間行った。
【０１１８】 アルカリホスファターゼ共役抗体を導入し、ＢＣＩＰ及びＸ−リン酸を加えた
。紫色染色バンドが観察された。
。紫色染色バンドが観察された。
【０１１９】 バンドはHindIIIで処理したゲノムＤＮＡの１２ｋｂの大きさで検出された。
【０１２０】 このＤＮＡ断片（１２ｋｂ）を回収し、プラスミドpBluescript KS+（Stratag
ene）内に挿入し、大腸菌（E.Coli） ＤＨ５αに形質転換してライブラリーを確
立した。
ene）内に挿入し、大腸菌（E.Coli） ＤＨ５αに形質転換してライブラリーを確
立した。
【０１２１】 このライブラリーを繰り返しサザンブロット解析にかけ、ＬＣＢ２遺伝子を含
む３．０ｋｂのＳａｃI/ＡｆｌIII断片を単離した（プラスミドｐＬ２ＳＡ）。
む３．０ｋｂのＳａｃI/ＡｆｌIII断片を単離した（プラスミドｐＬ２ＳＡ）。
【０１２２】 ピヒア・シフェリＬＣＢ２遺伝子の制限配置及び配列を図２に示した。このヌ
クレオチド配列は配列表に、その推定されるアミノ酸配列（配列番号：４）と共
に配列番号：３として表した。このヌクレオチド配列は１９９８年３月７日、受
入番号AF053456にてGenBankに提出した。
クレオチド配列は配列表に、その推定されるアミノ酸配列（配列番号：４）と共
に配列番号：３として表した。このヌクレオチド配列は１９９８年３月７日、受
入番号AF053456にてGenBankに提出した。
【０１２３】 ピヒア・シフェリATCC14091のＬＣＢ２遺伝子はイントロンを含まない１６８
８塩基対からなり、その予想されるアミノ酸配列はサッカロミセス・セレビシエ
のものと高い相同性を示す。 （２）プラスミドｐｒＡＣＬ２の構築 実施例１５で得たプラスミドprHEC1.9FをEco47III/BamHIで消化し、直鎖状プ
ラスミドを得た。一方、上記（１）で得たプラスミドｐＬ２ＳＡをHindIII、ク
レノー及びBamHIで、この順で処理し、３．０ｋｂのＬＣＢ２遺伝子の断片を得
た。この３．０ｋｂ断片を上記の直鎖プラスミドに挿入し、プラスミドprACL2を
得た（図３）。
８塩基対からなり、その予想されるアミノ酸配列はサッカロミセス・セレビシエ
のものと高い相同性を示す。 （２）プラスミドｐｒＡＣＬ２の構築 実施例１５で得たプラスミドprHEC1.9FをEco47III/BamHIで消化し、直鎖状プ
ラスミドを得た。一方、上記（１）で得たプラスミドｐＬ２ＳＡをHindIII、ク
レノー及びBamHIで、この順で処理し、３．０ｋｂのＬＣＢ２遺伝子の断片を得
た。この３．０ｋｂ断片を上記の直鎖プラスミドに挿入し、プラスミドprACL2を
得た（図３）。
【０１２４】 プラスミドprACL2はピヒア・シフェリリボソームＤＮＡ断片、ＣＹＨr（Ｌ４
１）及びＬＣＢ２遺伝子を持ち、これらはこの順で互いに連結している。プラス
ミドprACL2は、特許手続きを目的とした微生物の寄託の国際認知にかかるブダペ
スト条約に従い、1998年３月４日にテジョンに在するKorean Collection of Typ
e Cultures に寄託され、KCTC-0468BPの受託番号を与えられた。
１）及びＬＣＢ２遺伝子を持ち、これらはこの順で互いに連結している。プラス
ミドprACL2は、特許手続きを目的とした微生物の寄託の国際認知にかかるブダペ
スト条約に従い、1998年３月４日にテジョンに在するKorean Collection of Typ
e Cultures に寄託され、KCTC-0468BPの受託番号を与えられた。
【０１２５】 実施例２１：形質転換 プラスミドprACL2をApaIで直線化し、実施例１７の手順に従って、変異株ピヒ
ア・シフェリKFCC-10937内に形質転換した。プラスミドμｇあたり１０2〜１０3 コロニーが形成された。１２個の最も大きなコロニーを選択した。
ア・シフェリKFCC-10937内に形質転換した。プラスミドμｇあたり１０2〜１０3 コロニーが形成された。１２個の最も大きなコロニーを選択した。
【０１２６】 それぞれの形質転換細胞を５μｇ／ｍＬのシクロヘキシミドを加えたＹＥＰＤ
培地に植え込み、攪拌しながら２５℃にて１８〜２０時間培養し、続けて遠心に
より細胞ペレットを得た。そして得られた細胞を１．５ｍＬチューブにおいた。
細胞を３０μＬのＳＴＥＳ溶液（０．２Ｍ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ，ｐＨ ７．６中０
．５Ｍ ＮａＣｌ、０．０１Ｍ ＥＤＴＡ、１％ ＳＤＳ）中で懸濁させ、０．
８容量のガラスビーズ（直径０．４ｍｍ）をここに加えた。混合液を５分間攪拌
し、２００μＬのＴＥ緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ，ｐＨ ８．０中１ｍ
Ｍ ＥＤＴＡ）と２００μＬのフェノール／クロロホルム／イソアミルアルコー
ル（２５：２４：１）を加えた。得られた混合液を２分間攪拌し、１２，０００
ｒｐｍにて遠心した。２．５容量のエタノールを上清に加え、ゲノムＤＮＡを沈
降させ、乾燥させた。
培地に植え込み、攪拌しながら２５℃にて１８〜２０時間培養し、続けて遠心に
より細胞ペレットを得た。そして得られた細胞を１．５ｍＬチューブにおいた。
細胞を３０μＬのＳＴＥＳ溶液（０．２Ｍ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ，ｐＨ ７．６中０
．５Ｍ ＮａＣｌ、０．０１Ｍ ＥＤＴＡ、１％ ＳＤＳ）中で懸濁させ、０．
８容量のガラスビーズ（直径０．４ｍｍ）をここに加えた。混合液を５分間攪拌
し、２００μＬのＴＥ緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ，ｐＨ ８．０中１ｍ
Ｍ ＥＤＴＡ）と２００μＬのフェノール／クロロホルム／イソアミルアルコー
ル（２５：２４：１）を加えた。得られた混合液を２分間攪拌し、１２，０００
ｒｐｍにて遠心した。２．５容量のエタノールを上清に加え、ゲノムＤＮＡを沈
降させ、乾燥させた。
【０１２７】 ゲノムＤＮＡ（２〜３μｇ）を５０μＬの蒸留した水中に溶解し、EcoRIで処
理し、０．８％アガロースゲル上の電気泳動にかけた。サザンブロット解析を、
プローブとして実施例２でのＬ４１を使用することで行い、バンドを検出した。
Ｌ４１遺伝子の５〜１０コピーがすべての形質転換細胞のゲノムＤＮＡ上にある
ことが観察された。これらの内１つをつり上げ、「形質転換細胞１」と命名した
。
理し、０．８％アガロースゲル上の電気泳動にかけた。サザンブロット解析を、
プローブとして実施例２でのＬ４１を使用することで行い、バンドを検出した。
Ｌ４１遺伝子の５〜１０コピーがすべての形質転換細胞のゲノムＤＮＡ上にある
ことが観察された。これらの内１つをつり上げ、「形質転換細胞１」と命名した
。
【０１２８】 比較例１：KFCC-10937株培養によるＴＡＰＳ生産 KFCC-10937親株を１００ｍＬのＹＧＭ最適培地（グリセロール １００ｇ／ｌ
、酵母エキス ２ｇ／ｌ、ＫＮＯ3 ３ｇ／ｌ、（ＮＨ4）2ＳＯ4 ０．５ｇ／ｌ
、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ３ｇ／ｌ、ＮａＣｌ ０．５ｇ／ｌ、ＣＳＬ ３ｇ／ｌ
及びＬＳ−３００ １ｇ／ｌ）中で２５℃、２５０ｒｐｍにて４日間培養した。
２５℃にて２日間おいた後、４容量のクロロホルム／メタノール（１：１）混合
溶媒を加え、相分離させてＴＡＰＳを抽出した。
、酵母エキス ２ｇ／ｌ、ＫＮＯ3 ３ｇ／ｌ、（ＮＨ4）2ＳＯ4 ０．５ｇ／ｌ
、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ３ｇ／ｌ、ＮａＣｌ ０．５ｇ／ｌ、ＣＳＬ ３ｇ／ｌ
及びＬＳ−３００ １ｇ／ｌ）中で２５℃、２５０ｒｐｍにて４日間培養した。
２５℃にて２日間おいた後、４容量のクロロホルム／メタノール（１：１）混合
溶媒を加え、相分離させてＴＡＰＳを抽出した。
【０１２９】 ＴＡＰＳをＥＬＳＤ（Electron Light Scanning Detecter（電子走査光検出器
））を用いてＨＰＬＣで解析した。溶媒として、その比を９：１、７：３及び次
いで９：１と変化させたイソ−オクタンとＴＨＦ／ギ酸（１００：１．５）の混
合液を用いた。
））を用いてＨＰＬＣで解析した。溶媒として、その比を９：１、７：３及び次
いで９：１と変化させたイソ−オクタンとＴＨＦ／ギ酸（１００：１．５）の混
合液を用いた。
【０１３０】 実施例２２：形質転換細胞１によるＴＡＰＳ生産 実施例２０で得た形質転換細胞１を比較例１でのものと同様の条件及び様式で
培養し、ＴＡＰＳを生産した。
培養し、ＴＡＰＳを生産した。
【０１３１】 比較例１及び実施例２２でのＴＡＰＳ生産を表４に示した。
【０１３２】
【表４】
【０１３３】 表４での結果は、本発明での発現カセットを持つピヒア・シフェリの形質転換
が、宿主細胞の染色体上での望ましい遺伝子の統合を最大化できることを肯定し
ている。
が、宿主細胞の染色体上での望ましい遺伝子の統合を最大化できることを肯定し
ている。
【０１３４】 実施例２３：ＧＡＰＤＨ遺伝子クローニングのためのプローブの調製 以下の２つのプライマー（プライマーＮｏ．１及びＮｏ．２）を合成した。
【０１３５】 プライマー１：5'-ATG GTT AGA GTT GCT ATT AAC G-3' プライマー２：5'-AAG CCT TGG CAA TGT GTT CAA-3' これらの２つのプライマーもまた配列表においてそれぞれ配列番号：１７及び
配列番号：１８として表した。
配列番号：１８として表した。
【０１３６】 ＰＣＲをこの２つのプライマーを用いて行い、（国際衛生研究所（ＮＩＨ）の
R.B.Wicknerのご厚意により提供された）サッカロミセス・セレビシエ（Sacchar omyces cerevisiae ）２８０５より１ｋｂ ＧＡＰＤＨ遺伝子を単離した。この遺
伝子をプラスミドｐＴ７−Ｂｌｕｅ Ｔ−ベクター（Novagen）のEcoRV部位に挿
入し、プラスミドｐＴ７−ＳＧＨを得た。
R.B.Wicknerのご厚意により提供された）サッカロミセス・セレビシエ（Sacchar omyces cerevisiae ）２８０５より１ｋｂ ＧＡＰＤＨ遺伝子を単離した。この遺
伝子をプラスミドｐＴ７−Ｂｌｕｅ Ｔ−ベクター（Novagen）のEcoRV部位に挿
入し、プラスミドｐＴ７−ＳＧＨを得た。
【０１３７】 プラスミドｐＴ７−ＳＧＨをXbaI及びSalIで消化し、０．９ｋｂ遺伝子断片を
得、これを取扱説明書にしたがって、ＤＩＧ−標識化及び検出キット（Boehring
er Mannheim）で標識化してプローブを得た。
得、これを取扱説明書にしたがって、ＤＩＧ−標識化及び検出キット（Boehring
er Mannheim）で標識化してプローブを得た。
【０１３８】 実施例２４：ピヒア・シフェリからのＧＡＰＤＨ遺伝子の単離 実施例１で得たピヒア・シフェリのゲノムＤＮＡを様々な制限酵素、BamHI、E
coRI、EcoRV、HindIII、PstIまたはSalIで消化し、消化産生物を０．９％アガロ
ースゲル電気泳動にかけ、Nytran（登録商標）膜（Schleicher & Schuell）に写
し、続いて実施例２３で得たプローブを用いてサザンブロット解析を行った。
coRI、EcoRV、HindIII、PstIまたはSalIで消化し、消化産生物を０．９％アガロ
ースゲル電気泳動にかけ、Nytran（登録商標）膜（Schleicher & Schuell）に写
し、続いて実施例２３で得たプローブを用いてサザンブロット解析を行った。
【０１３９】 サザンブロット解析は、ハイブリッド形成溶液（５×ＳＳＣ、０．１％ Ｎ−
ラウリルサルコシン、０．０２％ ＳＤＳ、２％ ブロッキング剤及び３０％
ホルムアミド）を用い、Boehringer Mannheimによって準備された取扱説明書に
したがって４２℃で６時間行った。
ラウリルサルコシン、０．０２％ ＳＤＳ、２％ ブロッキング剤及び３０％
ホルムアミド）を用い、Boehringer Mannheimによって準備された取扱説明書に
したがって４２℃で６時間行った。
【０１４０】 アルカリホスファターゼ共役抗体を導入し、ＢＣＩＰ及びＸ−リン酸を加えた
。紫色染色バンドが、HindIII/EcoRIで処理したゲノムＤＮＡの断片の大きさで
ある約６ｋｂの位置に観察された。
。紫色染色バンドが、HindIII/EcoRIで処理したゲノムＤＮＡの断片の大きさで
ある約６ｋｂの位置に観察された。
【０１４１】 このＤＮＡ断片（約６ｋｂ）を回収し、プラスミドpBluescript KS+（Stratag
ene）に挿入し、大腸菌（E.Coli） ＤＨ５αに形質転換してライブラリーを確立
した。このライブラリーを繰り返しサザンブロット解析にかけ、ＧＡＰＤＨ遺伝
子を含む６．０ｋｂのＡｆｌIII/HindIII断片を単離した（プラスミドpGH2.2）
。
ene）に挿入し、大腸菌（E.Coli） ＤＨ５αに形質転換してライブラリーを確立
した。このライブラリーを繰り返しサザンブロット解析にかけ、ＧＡＰＤＨ遺伝
子を含む６．０ｋｂのＡｆｌIII/HindIII断片を単離した（プラスミドpGH2.2）
。
【０１４２】 ピヒア・シフェリATCC14091のＧＡＰＤＨ遺伝子の制限配置及び配列を図４に
示した。このヌクレオチド配列は配列表に、その推定されるアミノ酸配列（配列
番号：６）と共に配列番号：５として表した。本配列は１９９８年３月７日、受
入番号AF053300にてGenBankに提出した。
示した。このヌクレオチド配列は配列表に、その推定されるアミノ酸配列（配列
番号：６）と共に配列番号：５として表した。本配列は１９９８年３月７日、受
入番号AF053300にてGenBankに提出した。
【０１４３】 ピヒア・シフェリATCC14091のＧＡＰＤＨ遺伝子はイントロンを含まない１０
０４塩基対からなる。ヌクレオチド配列と予想されるアミノ酸配列はサッカロミ
セス・セレビシエからのものとそれぞれ６９．３％及び７６．２％の相同性を示
す。
０４塩基対からなる。ヌクレオチド配列と予想されるアミノ酸配列はサッカロミ
セス・セレビシエからのものとそれぞれ６９．３％及び７６．２％の相同性を示
す。
【０１４４】 実施例２５：ピヒア・シフェリＧＡＰＤＨプロモーター遺伝子の単離 以下の２つのプライマー（プライマーＮｏ．３及びＮｏ．４）を合成した。
【０１４５】 プライマー３：5'-GAT ATC TAC ATA CAA TTG ACC CAT AG-3' プライマー４：5'-GGA TCC TTA ATT ATT TGT TTG TTT-3' これらの２つのプライマーもまた配列表においてそれぞれ配列番号：９及び配
列番号：１０として表した。
列番号：１０として表した。
【０１４６】 ＰＣＲを実施例２４で得たプラスミドpGH2.2及び２つのプライマー（プライマ
ーＮｏ．３及びＮｏ．４）を用いて行い、ピヒア・シフェリＧＡＰＤＨプロモー
ター遺伝子（６００ｂｐ）を単離した。この遺伝子をpT7-Blue T-ベクターのEco
RV部位に挿入し、プラスミドpT7GHを得た。
ーＮｏ．３及びＮｏ．４）を用いて行い、ピヒア・シフェリＧＡＰＤＨプロモー
ター遺伝子（６００ｂｐ）を単離した。この遺伝子をpT7-Blue T-ベクターのEco
RV部位に挿入し、プラスミドpT7GHを得た。
【０１４７】 実施例２６：それ自体のプロモーターから独立したＬＣＢ２遺伝子の単離 実施例２０で得たプラスミドpL2SAをAflIIIで処理し、プロモーターフリーＬ
ＣＢ２遺伝子（２．３ｋｂ）を得た。この２．３ｋｂ遺伝子をクレノーで処理し
、BamHI/クレノーで処理したプラスミドpBluescript KS+内に挿入し、プラスミ
ドpL2B2.3を得た（図５）。
ＣＢ２遺伝子（２．３ｋｂ）を得た。この２．３ｋｂ遺伝子をクレノーで処理し
、BamHI/クレノーで処理したプラスミドpBluescript KS+内に挿入し、プラスミ
ドpL2B2.3を得た（図５）。
【０１４８】 プラスミドpL2B2.3をBamHIで消化し、２．３ｋｂ ＬＣＢ２遺伝子を得、これ
を実施例４で得たプラスミドｐＴ７ＧＨのBamHI部位に挿入し、pGAL2を得た。
を実施例４で得たプラスミドｐＴ７ＧＨのBamHI部位に挿入し、pGAL2を得た。
【０１４９】 実施例２７：発現カセットの構築 実施例１５で得たプラスミドprHEC1.9FをEco47III及びXbaIで処理することで
直線化した。プラスミドpGAL2（実施例２６）をEcoRV及びXbaIで処理することで
得たＧＡＰＤＨプロモーター／ＬＣＢ２遺伝子（２．９ｋｂ）をこの直鎖プラス
ミドprHEC1.9Fに挿入し、prACGL2を得た（図５）。
直線化した。プラスミドpGAL2（実施例２６）をEcoRV及びXbaIで処理することで
得たＧＡＰＤＨプロモーター／ＬＣＢ２遺伝子（２．９ｋｂ）をこの直鎖プラス
ミドprHEC1.9Fに挿入し、prACGL2を得た（図５）。
【０１５０】 プラスミドprACGL2はピヒア・シフェリリボソームＤＮＡ断片ＣＹＨr（Ｌ４１
）、ＧＡＰＤＨプロモーター遺伝子及びＬＣＢ２遺伝子を持ち、この順で互いに
連結している。プラスミドprACGL2は、特許手続きを目的とした微生物の寄託の
国際認知にかかるブダペスト条約に従い、1998年６月２５日にテジョンに在する
Korean Collection of Type Cultures に寄託され、KCTC-0498BPの受託番号を与
えられた。
）、ＧＡＰＤＨプロモーター遺伝子及びＬＣＢ２遺伝子を持ち、この順で互いに
連結している。プラスミドprACGL2は、特許手続きを目的とした微生物の寄託の
国際認知にかかるブダペスト条約に従い、1998年６月２５日にテジョンに在する
Korean Collection of Type Cultures に寄託され、KCTC-0498BPの受託番号を与
えられた。
【０１５１】 実施例４で得たプラスミドpCYH1.9rをEcoR４７III及びXbaIで処理することで
直線化した。プラスミドpGAL2（実施例２６）をEcoRV及びXbaIで処理することで
得られたＧＡＰＤＨプロモーター／ＬＣＢ２遺伝子（２．９ｋｂ）を直鎖プラス
ミドpCYH1.9rに挿入しpCHGL2を得た（図６）。このプラスミドをEcoRV／XbaI/ク
レノーで処理し、４．６ｋｂ ＣＹＨr／ＧＡＰＤＨプロモーター／ＬＣＢ２遺伝
子を得、ついでこれをプラスミドprDX9.0（実施例５）をHindIII/EcoRIで処理す
ることで得た１．４ｋｂリボソームＤＮＡのEcoRV部位に挿入した、プラスミドp
rHECGL2を得た（図６）。
直線化した。プラスミドpGAL2（実施例２６）をEcoRV及びXbaIで処理することで
得られたＧＡＰＤＨプロモーター／ＬＣＢ２遺伝子（２．９ｋｂ）を直鎖プラス
ミドpCYH1.9rに挿入しpCHGL2を得た（図６）。このプラスミドをEcoRV／XbaI/ク
レノーで処理し、４．６ｋｂ ＣＹＨr／ＧＡＰＤＨプロモーター／ＬＣＢ２遺伝
子を得、ついでこれをプラスミドprDX9.0（実施例５）をHindIII/EcoRIで処理す
ることで得た１．４ｋｂリボソームＤＮＡのEcoRV部位に挿入した、プラスミドp
rHECGL2を得た（図６）。
【０１５２】 プラスミドprHECGL2は、プラスミドprACGL2のＬＣＢ２遺伝子の下流に連結し
た付加的なピヒア・シフェリリボソームＤＮＡ断片（８００ｂｐ）を含む構造を
持っている。すなわち、プラスミドprHECHL2はこの順で効果的に互いに連結した
ピヒア・シフェリリボソームＤＮＡ断片、ＣＨＹr（Ｌ４１）、ＧＡＰＤＨプロ
モーター遺伝子、ＬＣＢ２及びピヒア・シフェリリボソームＤＮＡ断片を含む。
た付加的なピヒア・シフェリリボソームＤＮＡ断片（８００ｂｐ）を含む構造を
持っている。すなわち、プラスミドprHECHL2はこの順で効果的に互いに連結した
ピヒア・シフェリリボソームＤＮＡ断片、ＣＨＹr（Ｌ４１）、ＧＡＰＤＨプロ
モーター遺伝子、ＬＣＢ２及びピヒア・シフェリリボソームＤＮＡ断片を含む。
【０１５３】 プラスミドprHECGL2は、特許手続きを目的とした微生物の寄託の国際認知にか
かるブダペスト条約に従い、1998年８月１０日にテジョンに在するKorean Colle
ction of Type Cultures に寄託され、KCTC-0511BPの受託番号を与えられた。
かるブダペスト条約に従い、1998年８月１０日にテジョンに在するKorean Colle
ction of Type Cultures に寄託され、KCTC-0511BPの受託番号を与えられた。
【０１５４】 プラスミドprHECGL2は、プラスミドprACGL2と以下の点すなわち、ピヒア・シ
フェリを形質転換するのに使用されると、前者がピヒア・シフェリ内在性遺伝子
のみをピヒア・シフェリ形質転換細胞の染色体上に導入するのに対し、後者はピ
ヒア・シフェリ内在性遺伝子を（プラスミドpBluescripte KS+に由来する）細菌
遺伝子とともに導入するという点において識別され、且つ有利である。
フェリを形質転換するのに使用されると、前者がピヒア・シフェリ内在性遺伝子
のみをピヒア・シフェリ形質転換細胞の染色体上に導入するのに対し、後者はピ
ヒア・シフェリ内在性遺伝子を（プラスミドpBluescripte KS+に由来する）細菌
遺伝子とともに導入するという点において識別され、且つ有利である。
【０１５５】 実施例２８：形質転換 プラスミドprACGL2（実施例２７）及びprHECGL2（実施例２７）をそれぞれApa
I及びApaI/ScaIで直線化した。次いでこれらの直鎖プラスミドを実施例１７の手
順に従ってピヒア・シフェリ KFCC-10937内に形質導入した。プラスミドμｇあ
たり１０3コロニーが形成された。４つのもっとも大きなコロニーをおのおのの
プラスミド形質転換細胞として選択した。
I及びApaI/ScaIで直線化した。次いでこれらの直鎖プラスミドを実施例１７の手
順に従ってピヒア・シフェリ KFCC-10937内に形質導入した。プラスミドμｇあ
たり１０3コロニーが形成された。４つのもっとも大きなコロニーをおのおのの
プラスミド形質転換細胞として選択した。
【０１５６】 それぞれの形質転換細胞を、５μｇ／ｍＬのシクロヘキシミドを加えたＹＥＰ
Ｄ培地に植え付け、２５℃で１８〜２０時間攪拌しながら培養し、続いて遠心に
よって細胞ペレットを回収した。そして、得られた細胞を１．５ｍＬチューブ内
においた。細胞を３０μＬのＳＴＥＳ溶液（０．２Ｍ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ，ｐＨ
７．６中０．５Ｍ ＮａＣｌ、０．０１Ｍ ＥＤＴＡ、１％ ＳＤＳ）中で懸濁
させ、０．８容量のガラスビーズ（直径０．４ｍｍ）をここに加えた。混合液を
５分間攪拌し、２００μＬのＴＥ緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ，ｐＨ ８
．０中１ｍＭ ＥＤＴＡ）と２００μＬのフェノール／クロロホルム／イソアミ
ルアルコール（２５：２４：１）を加えた。得られた混合液を２分間攪拌し、１
２，０００ｒｐｍにて遠心した。２．５容量のエタノールを上清に加え、ゲノム
ＤＮＡを沈降させ、乾燥させた。
Ｄ培地に植え付け、２５℃で１８〜２０時間攪拌しながら培養し、続いて遠心に
よって細胞ペレットを回収した。そして、得られた細胞を１．５ｍＬチューブ内
においた。細胞を３０μＬのＳＴＥＳ溶液（０．２Ｍ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ，ｐＨ
７．６中０．５Ｍ ＮａＣｌ、０．０１Ｍ ＥＤＴＡ、１％ ＳＤＳ）中で懸濁
させ、０．８容量のガラスビーズ（直径０．４ｍｍ）をここに加えた。混合液を
５分間攪拌し、２００μＬのＴＥ緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ，ｐＨ ８
．０中１ｍＭ ＥＤＴＡ）と２００μＬのフェノール／クロロホルム／イソアミ
ルアルコール（２５：２４：１）を加えた。得られた混合液を２分間攪拌し、１
２，０００ｒｐｍにて遠心した。２．５容量のエタノールを上清に加え、ゲノム
ＤＮＡを沈降させ、乾燥させた。
【０１５７】 ゲノムＤＮＡ（２〜３μｇ）を５０μＬの蒸留した水内に溶解し、HindIII、E
coRIまたはXbaIで処理し、０．８％アガロースゲル上の電気泳動にかけた。サザ
ンブロット解析を、プローブとしてＤＩＧ−標識化Ｌ４１遺伝子、ＤＩＧ−標識
化ＬＣＢ２遺伝子またはＤＩＧ−標識化ＧＡＰＤＨプロモーター遺伝子を使用す
ることで行い、バンドを検出した（図７）。遺伝子の約４−５コピーがすべての
形質転換細胞のゲノムＤＮＡ上にあることが観察された。ｐｒｅＡＣＧＬ２形質
転換細胞及びｐｒＨＥＣＧＬ２形質転換細胞のそれぞれ１つをすくい上げ、それ
ぞれ「形質転換細胞２」及び「形質転換細胞３」と命名した。
coRIまたはXbaIで処理し、０．８％アガロースゲル上の電気泳動にかけた。サザ
ンブロット解析を、プローブとしてＤＩＧ−標識化Ｌ４１遺伝子、ＤＩＧ−標識
化ＬＣＢ２遺伝子またはＤＩＧ−標識化ＧＡＰＤＨプロモーター遺伝子を使用す
ることで行い、バンドを検出した（図７）。遺伝子の約４−５コピーがすべての
形質転換細胞のゲノムＤＮＡ上にあることが観察された。ｐｒｅＡＣＧＬ２形質
転換細胞及びｐｒＨＥＣＧＬ２形質転換細胞のそれぞれ１つをすくい上げ、それ
ぞれ「形質転換細胞２」及び「形質転換細胞３」と命名した。
【０１５８】 実施例２９：形質転換細胞２によるＴＡＰＳの生産 実施例２８にて得られた形質転換細胞２を比較例１でのものと同一の状態及び
様式で培養し、ＴＡＰＳを生産させた。ＴＡＰＳ生産を表５に示す。
様式で培養し、ＴＡＰＳを生産させた。ＴＡＰＳ生産を表５に示す。
【０１５９】
【表５】
【０１６０】 実施例３０及び比較例２：形質転換細胞３によるＴＡＰＳ生産 実施例２で得られた形質転換細胞２またはピヒア・シフェリの親株を、比較例
１でのものと同様の条件下でＹＭＧＬ培地（酵母エキス ３ｇ／Ｌ、麦芽エキス
３ｇ／Ｌ、グリセロール ３０ｇ／Ｌ）中で培養し、ＴＡＰＳを生産させた。
ＴＡＰＳ生産を表６に示した。
１でのものと同様の条件下でＹＭＧＬ培地（酵母エキス ３ｇ／Ｌ、麦芽エキス
３ｇ／Ｌ、グリセロール ３０ｇ／Ｌ）中で培養し、ＴＡＰＳを生産させた。
ＴＡＰＳ生産を表６に示した。
【０１６１】
【表６】
【０１６２】 表６の結果は、ＹＭＧＬ内でのＴＡＰＳの純粋な生産は、ＹＧＭ最適培地での
ものと比較した場合に減少しており、形質転換細胞３によるＴＡＰＳ生産は親株
のそれに比べて２．１倍多かったことを明らかにしている。
ものと比較した場合に減少しており、形質転換細胞３によるＴＡＰＳ生産は親株
のそれに比べて２．１倍多かったことを明らかにしている。
【０１６３】
まとめると、本発明は以下の利点がある。
【０１６４】 （１）本発明の発現カセットは宿主ピヒア・シフェリ細胞の染色体内への望ま
しい遺伝子の組み込みを最大化させる。
しい遺伝子の組み込みを最大化させる。
【０１６５】 （２）本発明によるプラスミドprACL2は、この順で作動可能に互いに連結した
０．６ｋｂピヒア・シフェリリボソームＤＮＡ断片、ＣＹＨr（Ｌ４１）及びセ
リンパルミトイルトランスフェラーゼをコードするＬＣＢ２遺伝子を持っている
。これは宿主細胞への良好な形質転換効率を示し、得られた形質転換細胞は親株
に比べて少なくとも１．３倍のＴＡＰＳ生産を示す。
０．６ｋｂピヒア・シフェリリボソームＤＮＡ断片、ＣＹＨr（Ｌ４１）及びセ
リンパルミトイルトランスフェラーゼをコードするＬＣＢ２遺伝子を持っている
。これは宿主細胞への良好な形質転換効率を示し、得られた形質転換細胞は親株
に比べて少なくとも１．３倍のＴＡＰＳ生産を示す。
【０１６６】 （３）本発明による発現カセット内へのＧＡＰＤＨプロモーター遺伝子の導入
は、形質転換細胞内での望ましい遺伝子の発現をさらに増加させる。
は、形質転換細胞内での望ましい遺伝子の発現をさらに増加させる。
【０１６７】 （４）本発明によるプラスミドprACGL2は、０．６ｋｂピヒア・シフェリリボ
ソームＤＮＡ断片、ＣＹＨr（Ｌ４１）、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒ
ドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）プロモーター遺伝子及びＬＣＢ２遺伝子を持ち、プ
ラスミドprHECGL2はさらにプラスミドprACGL2内のＬＣＢ２遺伝子の下流に８０
０ｂｐのピヒア・シフェリリボソームＤＮＡ断片を持つ。これらのプラスミドは
ＧＡＰＤＨプロモーターの活性によるＬＣＢ２遺伝子の発現の増加のために優れ
た形質転換効率を示し、同時に親株KFCC-10937に比べて少なくとも２．１倍のＴ
ＡＰＳ生産を示す。
ソームＤＮＡ断片、ＣＹＨr（Ｌ４１）、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒ
ドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）プロモーター遺伝子及びＬＣＢ２遺伝子を持ち、プ
ラスミドprHECGL2はさらにプラスミドprACGL2内のＬＣＢ２遺伝子の下流に８０
０ｂｐのピヒア・シフェリリボソームＤＮＡ断片を持つ。これらのプラスミドは
ＧＡＰＤＨプロモーターの活性によるＬＣＢ２遺伝子の発現の増加のために優れ
た形質転換効率を示し、同時に親株KFCC-10937に比べて少なくとも２．１倍のＴ
ＡＰＳ生産を示す。
【０１６８】 本発明の好ましい実施様態が本明細書の以上で詳細に記述されたが、当業者に
明らかであろう本明細書で示した基礎的な発明概念の多くの変更及び／または修
飾が、添付の請求項で定義されたような本発明の精神及び意図の範囲内になお収
まるであろう。
明らかであろう本明細書で示した基礎的な発明概念の多くの変更及び／または修
飾が、添付の請求項で定義されたような本発明の精神及び意図の範囲内になお収
まるであろう。
【０１６９】
【配列表】
【図１】 図１は、各プラスミドについて異なる位置にピヒア・シフェリのＬ４１遺伝子
を組み込んだピヒア・シフェリ リボソームＤＮＡを有する様々なプラスミドの
制限地図であり、図中、 斜線囲み部はリボソームＤＮＡ断片を示し、 強調文字で示した制限酵素はそれぞれのプラスミドを直線化するために使用さ
れた酵素を示し、 矢印は遺伝子の転写方向を示し、そして プラスミドprACL2はピヒア・シフェリ由来のセリンパルミトイルトランスフェ
ラーゼをコードするＬＣＢ２遺伝子を担持している。
を組み込んだピヒア・シフェリ リボソームＤＮＡを有する様々なプラスミドの
制限地図であり、図中、 斜線囲み部はリボソームＤＮＡ断片を示し、 強調文字で示した制限酵素はそれぞれのプラスミドを直線化するために使用さ
れた酵素を示し、 矢印は遺伝子の転写方向を示し、そして プラスミドprACL2はピヒア・シフェリ由来のセリンパルミトイルトランスフェ
ラーゼをコードするＬＣＢ２遺伝子を担持している。
【図２】 図２は、ピヒア・シフェリＬＣＢ２遺伝子の制限地図であり、矢印の方向及び
長さはそれぞれ、ヌクレオチド配列決定の方向及び程度を示す。
長さはそれぞれ、ヌクレオチド配列決定の方向及び程度を示す。
【図３】 図３は、プラスミドprACL2の構築及び制限地図を表す。
【図４】 図４は、ピヒア・シフェリＧＡＰＤＨ遺伝子の制限地図であり、矢印の方向及
び長さはそれぞれ、ヌクレオチド配列決定の方向及び程度を示す。
び長さはそれぞれ、ヌクレオチド配列決定の方向及び程度を示す。
【図５】 図５は、プラスミドprACGL2の構築及び制限地図を表す。
【図６】 図６は、プラスミドprHECGL2の構築及び制限地図を表す。
【図７】 図７は、宿主細胞に形質転換されたＬＣＢ２遺伝子のコピー数を測定するため
に行われたサザンブロット分析の結果である。
に行われたサザンブロット分析の結果である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｒ 1:84） Ｃ１２Ｒ 1:84） (Ｃ１２Ｎ 1/19 (Ｃ１２Ｐ 13/00 (Ｃ１２Ｐ 13/00 (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (31)優先権主張番号 １９９８／３３９６９ (32)優先日 平成10年８月21日(1998．8．21) (33)優先権主張国 韓国（ＫＲ） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＣＡ，ＪＰ，Ｕ Ｓ (72)発明者 バエ， ジュン フーン 大韓民国 305−345 タエジョン ユソン −ク シンソン−ドン ナンバー 120− ２／302 (72)発明者 チョイ， ウイ スン 大韓民国 305−335 タエジョン ユソン −ク クン−ドン 395−３ ダソル ア パートメント ナンバー 102−507 (72)発明者 ソン， ジュン フーン 大韓民国 302−280 タエジョン セオ− ク ウォルピョン−ドン ヌリ アパート メント ナンバー 103−506 (72)発明者 カン， ヒュン アー 大韓民国 302−171 タエジョン セオ− ク カルマ−ドン キュンソン クンマウ ル アパートメント ナンバー 125− 1501 (72)発明者 パーク， チャン セオ 大韓民国 427−040 キュンキ−ド クワ チュン−シティ ビュルヤン−ドン ジュ ウコン アパートメント ナンバー 710 −401 Ｆターム(参考） 4B024 AA05 AA20 BA80 CA04 DA11 EA04 GA14 4B064 AE01 CA19 CC24 DA01 DA10 4B065 AA72X AA72Y AB01 AC14 BA02 CA16 CA41 CA44
Claims (42)
- 【請求項１】 配列番号：１で示され、ピヒア・シフェリ リボソームタン
パク質をコードするＬ４１遺伝子。 - 【請求項２】 ピヒア・シフェリにおける所望の遺伝子に対する発現カセッ
トであって、 （ｃ）所望の構造遺伝子、 （ｂ）シクロヘキシミドへの耐性をもたらし、（ｃ）に作動可能に連結される
ＣＹＨr遺伝子、 （ａ）（ｂ）に作動可能に連結されるピヒア・シフェリ リボソームＤＮＡ を含む発現カセット。 - 【請求項３】 前記ピヒア・シフェリ リボソームＤＮＡが、そのHindIII/E
coRI消化産物の約1.4 ｋｂの断片を含む非転写領域である請求の範囲第２項記載
の発現カセット。 - 【請求項４】 前記所望の遺伝子が、ピヒア・シフェリ セリンパルミトイ
ルトランスフェラーゼをコードし、且つ配列番号：３で示されるＬＣＢ２遺伝子
である請求の範囲第２項記載の発現カセット。 - 【請求項５】 前記所望の遺伝子が、ピヒア・シフェリ セリンパルミトイ
ルトランスフェラーゼをコードし、且つ配列番号：３で示されるＬＣＢ２遺伝子
である請求の範囲第３項記載の発現カセット。 - 【請求項６】 請求の範囲第５項記載の発現カセットを含むプラスミドであ
って、図３に示す制限地図を有するプラスミドprACL2（KCTC-0468BP）であるプ
ラスミド。 - 【請求項７】 所望の遺伝子によってコードされるタンパク質を製造するた
めの方法であって、請求の範囲第２項記載の発現カセットを有するプラスミドで
、ピヒア・シフェリ細胞を形質転換する工程を含む方法。 - 【請求項８】 約５００Ｖの電圧、約５０μＦの容量及び約８００Ωの抵抗
、の条件下でのエレクトロポレーションによって、ピヒア・シフェリが形質転換
される、請求の範囲第７項記載の方法。 - 【請求項９】 請求の範囲第２項記載の発現カセットを含むベクターで形質
転換されたピヒア・シフェリ細胞。 - 【請求項１０】 請求の範囲第３項記載の発現カセットを含むベクターで形
質転換されたピヒア・シフェリ細胞。 - 【請求項１１】 請求の範囲第４項記載の発現カセットを含むベクターで形
質転換されたピヒア・シフェリ細胞。 - 【請求項１２】 請求の範囲第５項記載の発現カセットを含むベクターで形
質転換されたピヒア・シフェリ細胞。 - 【請求項１３】 請求の範囲第６項記載の発現カセットを含むベクターで形
質転換されたピヒア・シフェリ細胞。。 - 【請求項１４】 テトラアセチルフィトスピンゴシンを製造するための方法
であって、以下の工程すなわち、 （ａ）好適な培養培地にて、請求の範囲第１１項記載の形質転換されたピヒア
・シフェリ細胞を培養し、及び （ｂ）テトラアセチルフィトスピンゴシンをそれから回収する工程を含む方法
。 - 【請求項１５】 テトラアセチルフィトスピンゴシンを製造するための方法
であって、以下の工程すなわち、 （ａ）好適な培養培地にて、請求の範囲第１２項記載の形質転換されたピヒア
・シフェリ細胞を培養し、及び （ｂ）テトラアセチルフィトスピンゴシンをそれから回収する工程を含む方法
。 - 【請求項１６】 テトラアセチルフィトスピンゴシンを製造するための方法
であって、以下の工程すなわち、 （ａ）好適な培養培地にて、請求の範囲第１３項記載の形質転換されたピヒア
・シフェリ細胞を培養し、及び （ｂ）テトラアセチルフィトスピンゴシンをそれから回収する工程を含む方法
。 - 【請求項１７】 配列番号：３で示され、且つピヒア・シフェリ セリンパ
ルミトイルトランスフェラーゼをコードするＬＣＢ２遺伝子。 - 【請求項１８】 配列番号：５で示され、且つピヒア・シフェリ グリセル
アルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼをコードするＧＡＰＤＨ遺伝子
。 - 【請求項１９】 請求の範囲第１８項記載のＧＡＰＤＨ遺伝子に対するプロ
モーター遺伝子であって、ヌクレオチド第１位からヌクレオチド第９０６位の配
列にわたるプロモーター遺伝子。 - 【請求項２０】 ピヒア・シフェリにおける所望の遺伝子に対する発現カセ
ットであって、 （ｄ）所望の構造遺伝子、 （ｃ）（ｄ）に作動可能に連結される請求の範囲第１９項記載のＧＡＰＤＨプ
ロモーター遺伝子、 （ｂ）シクロヘキシミドへの耐性をもたらし、（ｃ）に作動可能に連結される
ＣＹＨr遺伝子、 （ａ）（ｂ）に作動可能に連結されるピヒア・シフェリ リボソームＤＮＡ を含む発現カセット。 - 【請求項２１】 前記ピヒア・シフェリ リボソームＤＮＡが、そのHindIII
/EcoRI消化産物の約1.4 ｋｂの断片を含む非転写領域である請求の範囲第２０項
記載の発現カセット。 - 【請求項２２】 前記所望の遺伝子が、ピヒア・シフェリ セリンパルミト
イルトランスフェラーゼをコードし、且つ配列番号：３で示されるＬＣＢ２遺伝
子である請求の範囲第２０項記載の発現カセット。 - 【請求項２３】 前記所望の遺伝子が、ピヒア・シフェリ セリンパルミト
イルトランスフェラーゼをコードし、且つ配列番号：３で示されるＬＣＢ２遺伝
子である請求の範囲第２１項記載の発現カセット。 - 【請求項２４】 請求の範囲第２３項記載の発現カセットを含むプラスミド
であって、図５に示す制限地図を有するプラスミドprACL2（KCTC-0498BP）であ
るプラスミド。 - 【請求項２５】 ピヒア・シフェリにおける所望の遺伝子に対する発現カセ
ットであって、 （ｅ）約８００ ｂｐのピヒア・シフェリ リボソームＤＮＡ断片、 （ｄ）（ｅ）に作動可能に連結される所望の構造遺伝子、 （ｃ）（ｄ）に作動可能に連結される請求の範囲第１９項記載のＧＡＰＤＨプ
ロモーター遺伝子、 （ｂ）シクロヘキシミドへの耐性をもたらし、（ｃ）に作動可能に連結される
ＣＹＨr遺伝子、 （ａ）（ｂ）に作動可能に連結されるピヒア・シフェリ リボソームＤＮＡ を含む発現カセット。 - 【請求項２６】 前記ピヒア・シフェリ リボソームＤＮＡが、そのHindIII
/EcoRI消化産物の約1.4 ｋｂの断片を含む非転写領域である請求の範囲第２５項
記載の発現カセット。 - 【請求項２７】 前記所望の遺伝子が、ピヒア・シフェリ セリンパルミト
イルトランスフェラーゼをコードし、且つ配列番号：３で示されるＬＣＢ２遺伝
子である請求の範囲第２５項記載の発現カセット。 - 【請求項２８】 前記所望の遺伝子が、ピヒア・シフェリ セリンパルミト
イルトランスフェラーゼをコードし、且つ配列番号：３で示されるＬＣＢ２遺伝
子である請求の範囲第２６項記載の発現カセット。 - 【請求項２９】 請求の範囲第２８項記載の発現カセットを含むプラスミド
であって、図６に示す制限地図を有するプラスミドprACL2（KCTC-0511BP）であ
るプラスミド。 - 【請求項３０】 所望の遺伝子によってコードされるタンパク質を製造する
ための方法であって、ApaI及びScaIで請求の範囲第２５項記載の発現カセットを
有するプラスミドを直線化し、かように処理されたプラスミドで、ピヒア・シフ
ェリ以外の生物起源に由来する外来遺伝子がピヒア・シフェリ染色体へ組み込ま
れないようにピヒア・シフェリ細胞を形質転換する工程を含む方法。 - 【請求項３１】 請求の範囲第２０項記載の発現カセットを含むベクターで
形質転換されたピヒア・シフェリ細胞。 - 【請求項３２】 請求の範囲第２１項記載の発現カセットを含むベクターで
形質転換されたピヒア・シフェリ細胞。 - 【請求項３３】 請求の範囲第２２項記載の発現カセットを含むベクターで
形質転換されたピヒア・シフェリ細胞。 - 【請求項３４】 請求の範囲第２３項記載の発現カセットを含むベクターで
形質転換されたピヒア・シフェリ細胞。 - 【請求項３５】 請求の範囲第２４項記載のプラスミドで形質転換されたピ
ヒア・シフェリ細胞。 - 【請求項３６】 請求の範囲第２５項記載の発現カセットを含むベクターで
形質転換されたピヒア・シフェリ細胞。 - 【請求項３７】 請求の範囲第２６項記載の発現カセットを含むベクターで
形質転換されたピヒア・シフェリ細胞。 - 【請求項３８】 請求の範囲第２７項記載の発現カセットを含むベクターで
形質転換されたピヒア・シフェリ細胞。 - 【請求項３９】 請求の範囲第２８項記載の発現カセットを含むベクターで
形質転換されたピヒア・シフェリ細胞。 - 【請求項４０】 請求の範囲第２９項記載のプラスミドで形質転換されたピ
ヒア・シフェリ細胞。 - 【請求項４１】 テトラアセチルフィトスピンゴシンを製造するための方法
であって、以下の工程すなわち、 （ａ）好適な培養培地にて、請求の範囲第３５項記載の形質転換されたピヒア
・シフェリ細胞を培養し、及び （ｂ）テトラアセチルフィトスピンゴシンをそれから回収する工程を含む方法
。 - 【請求項４２】 テトラアセチルフィトスピンゴシンを製造するための方法
であって、以下の工程すなわち、 （ａ）好適な培養培地にて、請求の範囲第４０項記載の形質転換されたピヒア
・シフェリ細胞を培養し、及び （ｂ）テトラアセチルフィトスピンゴシンをそれから回収する工程を含む方法
。
Applications Claiming Priority (7)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1019980016309A KR100267668B1 (ko) | 1998-05-07 | 1998-05-07 | 피치아 시페리 유래의 세린 팔미토일 트랜스퍼라제를 코딩하는유전자 및 이를 이용한 taps 생산방법 |
| KR1998/16310 | 1998-05-07 | ||
| KR1019980016310A KR100267666B1 (ko) | 1998-05-07 | 1998-05-07 | 피치아 시페리용 발현 플라스미드 |
| KR1998/16309 | 1998-05-07 | ||
| KR1998/33969 | 1998-08-21 | ||
| KR1019980033969A KR100287483B1 (ko) | 1998-08-21 | 1998-08-21 | 피치아 시페리 유래의 글리세르알데히드-3-인산 탈수소효소 프로모터 유전자 및 이를 이용한 taps 생산방법 |
| PCT/KR1998/000346 WO1999057279A1 (en) | 1998-05-07 | 1998-10-31 | Plasmid for gene expression in pichia ciferrii and transformation method using the same |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2002513573A true JP2002513573A (ja) | 2002-05-14 |
Family
ID=27349725
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2000547234A Pending JP2002513573A (ja) | 1998-05-07 | 1998-10-31 | ピヒア・シフェリにおける遺伝子発現のためのプラスミド及びこれを用いた形質転換方法 |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US6638735B1 (ja) |
| EP (1) | EP1076707A1 (ja) |
| JP (1) | JP2002513573A (ja) |
| WO (1) | WO1999057279A1 (ja) |
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| JP2015097493A (ja) * | 2013-11-19 | 2015-05-28 | 花王株式会社 | セラミド生産性向上方法およびセラミド製造方法 |
| JP2016054735A (ja) * | 2014-09-05 | 2016-04-21 | 花王株式会社 | 改変スターメレラ属微生物 |
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| US8440456B2 (en) * | 2009-05-22 | 2013-05-14 | Vib, Vzw | Nucleic acids of Pichia pastoris and use thereof for recombinant production of proteins |
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