JPH0720430B2 - リパーゼ遺伝子 - Google Patents
リパーゼ遺伝子Info
- Publication number
- JPH0720430B2 JPH0720430B2 JP63187684A JP18768488A JPH0720430B2 JP H0720430 B2 JPH0720430 B2 JP H0720430B2 JP 63187684 A JP63187684 A JP 63187684A JP 18768488 A JP18768488 A JP 18768488A JP H0720430 B2 JPH0720430 B2 JP H0720430B2
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- JP
- Japan
- Prior art keywords
- lipase
- dna
- escherichia coli
- strain
- pfl
- Prior art date
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- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、シュウドモナス属細菌由来のリパーゼをコー
ドするDNA配列、該DNA配列を含む組換え体DNAおよびそ
れを含む大腸菌、更にリパーゼの製造法に関する。
ドするDNA配列、該DNA配列を含む組換え体DNAおよびそ
れを含む大腸菌、更にリパーゼの製造法に関する。
リパーゼは脂質を加水分解する酵素として油脂加工、臨
床診断薬、洗剤、消化薬などに使用されているほか、近
年は化成品、特に光学活性化合物の製造法となるエステ
ルの加水分解、エステル合成、或はエステル変換を触媒
する重要な酵素である。
床診断薬、洗剤、消化薬などに使用されているほか、近
年は化成品、特に光学活性化合物の製造法となるエステ
ルの加水分解、エステル合成、或はエステル変換を触媒
する重要な酵素である。
また、シュウドモナス属細菌は、エステルの加水分解、
エステル合成、或はエステル変換の触媒に有用なリパー
ゼを生産することが知られている。（特開昭62−166,89
8号）。
エステル合成、或はエステル変換の触媒に有用なリパー
ゼを生産することが知られている。（特開昭62−166,89
8号）。
このシュウドモナス属細菌の生産するリパーゼの特性
は、工業的利用には興味あるものであるが、その目的を
達成するためにはより一層の基質特異性（含立体特異
性）が望まれている。
は、工業的利用には興味あるものであるが、その目的を
達成するためにはより一層の基質特異性（含立体特異
性）が望まれている。
しかしその一次構造及び高次構造が不明のため膨大なス
クリーニングを行うか、突然変異処理を多数行う等効率
の悪い方法に頼らなければ望ましい活性をもつリパーゼ
を得ることができなかった。
クリーニングを行うか、突然変異処理を多数行う等効率
の悪い方法に頼らなければ望ましい活性をもつリパーゼ
を得ることができなかった。
又、リパーゼは生産菌の染色体DNA中に含まれる通常１
個の構造遺伝子の発現によって生産されるために、リパ
ーゼの生産を飛躍的に向上させることは困難であった。
個の構造遺伝子の発現によって生産されるために、リパ
ーゼの生産を飛躍的に向上させることは困難であった。
近年組換えDNA技術の発達により、遺伝子が単離され高
度活性をもつものへの誘導、或はヌクレオチド配列を変
換することが可能になり、商業上関心のあるタンパク質
の創製が検討或は実施されている。
度活性をもつものへの誘導、或はヌクレオチド配列を変
換することが可能になり、商業上関心のあるタンパク質
の創製が検討或は実施されている。
本発明者等は、前記のような従来の効率の悪いリパーゼ
の改質法を改善するために、シュウドモナス属殺菌の染
色体中に存在するリパーゼの構造遺伝子をクローニング
し、リパーゼをコードするDNA配列を決定し、かかるDNA
配列を含む組換え体DNAを得、さらにこれらの組換え体D
NAを含む大腸菌を用いることにより、工業的用途に利用
可能なシュウドモナス属殺菌由来のリパーゼ又は実質的
に同じ特性を保持したその変種（variant）を製造する
ことを目的とした。
の改質法を改善するために、シュウドモナス属殺菌の染
色体中に存在するリパーゼの構造遺伝子をクローニング
し、リパーゼをコードするDNA配列を決定し、かかるDNA
配列を含む組換え体DNAを得、さらにこれらの組換え体D
NAを含む大腸菌を用いることにより、工業的用途に利用
可能なシュウドモナス属殺菌由来のリパーゼ又は実質的
に同じ特性を保持したその変種（variant）を製造する
ことを目的とした。
本発明者等は、前記目的を達成すべく鋭意研究の結果、
先にシュウドモナスフラジ IFO 12049株の染色体中に
存在するリパーゼ構造遺伝子のクローニング（特願昭62
−306,638号）及び大腸菌を用いたリパーゼの製造（特
願昭63−123,672号）に成功し、そしてひきつづき今回
リパーゼをコードするDNA配列の決定を行ない本発明を
完成するに至った。
先にシュウドモナスフラジ IFO 12049株の染色体中に
存在するリパーゼ構造遺伝子のクローニング（特願昭62
−306,638号）及び大腸菌を用いたリパーゼの製造（特
願昭63−123,672号）に成功し、そしてひきつづき今回
リパーゼをコードするDNA配列の決定を行ない本発明を
完成するに至った。
本発明は、下記（１）〜（４）の構成を有する。
（１）ヌクレオチドが下記の配列であるシュウドモナス
フラジ（Pseudomonasfragi）IFO 12049株由来のリパー
ゼをコードするDNA。
フラジ（Pseudomonasfragi）IFO 12049株由来のリパー
ゼをコードするDNA。
（２）前記第１項記載のDNAを大腸菌用ベクターに組み
込んでなる大腸菌内で複製可能な組換え体DNA。
込んでなる大腸菌内で複製可能な組換え体DNA。
（３）大腸菌用ベクターがpUC9である前記第２項記載の
組換え体DNA。
組換え体DNA。
（４）前記第２項若しくは第３項記載の組換え体DNAに
よって物質転換された大腸菌。
よって物質転換された大腸菌。
（５）前記第２項記載の組換え体DNAにより形質転換さ
れた大腸菌を宿主として用いることを特徴とするリパー
ゼの製造法。
れた大腸菌を宿主として用いることを特徴とするリパー
ゼの製造法。
（６）前記第４項記載の大腸菌を培養することを特徴と
するリパーゼの製造法。
するリパーゼの製造法。
以下本発明を詳細に説明する。
本発明の組換え体DNAは、リパーゼを産生しているシュ
ウドモナス属殺菌の染色体DNAを断片化し、該断片を大
腸菌内で複製するマルチコピー型のプラスミドペクター
に組込んで得られた組換え体DNAのうちリパーゼ構造遺
伝子を含むものを選択することによって得られる。
ウドモナス属殺菌の染色体DNAを断片化し、該断片を大
腸菌内で複製するマルチコピー型のプラスミドペクター
に組込んで得られた組換え体DNAのうちリパーゼ構造遺
伝子を含むものを選択することによって得られる。
シュウドモナス属殺菌の染色体DNAは、リゾチウム処理
したシュウドモナス属細菌の菌体をソディウムドデシル
サルフェート（SDS）存在化でタンパク質分解酵素によ
って溶解し、溶解物をフェノール抽出することによって
脱蛋白を行い、エタノール沈澱するこによって調整され
る。
したシュウドモナス属細菌の菌体をソディウムドデシル
サルフェート（SDS）存在化でタンパク質分解酵素によ
って溶解し、溶解物をフェノール抽出することによって
脱蛋白を行い、エタノール沈澱するこによって調整され
る。
染色体DNAの断片化は、塩基配列特異性のないエンドヌ
クレアーゼを用いることによって行われる。
クレアーゼを用いることによって行われる。
シュウドモナスフラジ染色体DNAの断片化にはSau3A1を
用い、大腸菌プラスミドベクターとしてpUC9（J.Viera
and J.Messing,Gene,19 259（1982））を用いクローニ
ング部位のBamH1部位に染色体DNA断片を導入することが
できる。
用い、大腸菌プラスミドベクターとしてpUC9（J.Viera
and J.Messing,Gene,19 259（1982））を用いクローニ
ング部位のBamH1部位に染色体DNA断片を導入することが
できる。
ここで大腸菌用DNA導入ベクターとしてpUC9を使用して
いるが、本発明では、大腸菌内で複製することができ、
適当な選択マーカーをもち、外来遺伝子の形質発現を期
待できるものであれば種類を問わない。例えばpUC8,pUC
18,pUC19等を利用することができる。
いるが、本発明では、大腸菌内で複製することができ、
適当な選択マーカーをもち、外来遺伝子の形質発現を期
待できるものであれば種類を問わない。例えばpUC8,pUC
18,pUC19等を利用することができる。
制限酵素で分解されたシュウドモナス属細菌の染色体DN
A断片は、アガロースゲル中の電気泳動によって分離、
臭化エチジウム染色によって紫外線下視覚化され、所望
のサイズのDNA断片がDEAEセルロースペーパーに吸着さ
れる。吸着物は、1Mの塩化ナトリウム溶液で溶出され、
エタノール沈澱によって回収される。
A断片は、アガロースゲル中の電気泳動によって分離、
臭化エチジウム染色によって紫外線下視覚化され、所望
のサイズのDNA断片がDEAEセルロースペーパーに吸着さ
れる。吸着物は、1Mの塩化ナトリウム溶液で溶出され、
エタノール沈澱によって回収される。
プラスミドベクターへのシュウドモナス属細菌の染色体
DNAの導入は、制限酵素により染色体DNAおよびプラスミ
ドベクターを開裂し、両断片を結合することにより達成
される。
DNAの導入は、制限酵素により染色体DNAおよびプラスミ
ドベクターを開裂し、両断片を結合することにより達成
される。
該結合前に開裂されたベクターは、細菌性アルカリフォ
スファターゼ処理により、脱リン酸化され、自己結合を
防ぐ。染色体DNA断片とプラスミドベクターとは、リガ
ーゼを用いて結合することができる。
スファターゼ処理により、脱リン酸化され、自己結合を
防ぐ。染色体DNA断片とプラスミドベクターとは、リガ
ーゼを用いて結合することができる。
上記工程により得られた組換え体DNAで大腸菌を形質転
換し、プラスミドベクターのマーカー及びリパーゼの生
産能に基づいて、リパーゼ生産能を有する大腸菌を選択
する。ここで、大腸菌は特定のクローニングベクターの
挿入により与えられる適切なマーカー、例えばアンピシ
リン抵抗菌を選択させるものとしてJM83株（J.Messin
g、R.Crea、and P.H. Seeburg,Nucl.Acid.Res.,2,309
（1981））を用いることが出来る。更に、HB101,LE392
等の大腸菌も使用可能である。
換し、プラスミドベクターのマーカー及びリパーゼの生
産能に基づいて、リパーゼ生産能を有する大腸菌を選択
する。ここで、大腸菌は特定のクローニングベクターの
挿入により与えられる適切なマーカー、例えばアンピシ
リン抵抗菌を選択させるものとしてJM83株（J.Messin
g、R.Crea、and P.H. Seeburg,Nucl.Acid.Res.,2,309
（1981））を用いることが出来る。更に、HB101,LE392
等の大腸菌も使用可能である。
形質転換は、周知のコンピテントセル法によって行い、
プラスミドベクターのマーカーによる選択は、上記具体
例に従えば、培地に50μg/ml程度のアンピシリンを加え
ることによって行う。
プラスミドベクターのマーカーによる選択は、上記具体
例に従えば、培地に50μg/ml程度のアンピシリンを加え
ることによって行う。
また、リパーゼの生産能による選択は、１％程度のトリ
ブチリンを培地に加えることにより行うことができる。
即ち、培地上にリパーゼが生成されると、脂質が分解さ
れて脂肪酸ができ、脂質の乳化状態が変化してコロニー
周辺に円形のクリアゾーンが形成されることを利用する
（W.Kugiyama,Y.Otani,Y.Hashimoto,and Y.Takagi,Bioc
hem.Biophys.Res.Commun.,141,185（1986））。
ブチリンを培地に加えることにより行うことができる。
即ち、培地上にリパーゼが生成されると、脂質が分解さ
れて脂肪酸ができ、脂質の乳化状態が変化してコロニー
周辺に円形のクリアゾーンが形成されることを利用する
（W.Kugiyama,Y.Otani,Y.Hashimoto,and Y.Takagi,Bioc
hem.Biophys.Res.Commun.,141,185（1986））。
前記の工程で得られたリパーゼの構造遺伝子を含む組換
え体DNAは、各種制限酵素により分解され、アガロース
ゲル電気泳動法を用いた測定に基づき、その制限酵素地
図を作成され、本組換え体DNAのサブクローニングが行
われる。
え体DNAは、各種制限酵素により分解され、アガロース
ゲル電気泳動法を用いた測定に基づき、その制限酵素地
図を作成され、本組換え体DNAのサブクローニングが行
われる。
即ち、得られた組換え体DNAを制限酵素で切断し適当な
大きさ（予想されるリパーゼ構造遺伝子より大きいが、
過度に大きくない）のDNA断片を集め、これを再び大腸
菌用プラスミドベクターに組み込むか、組換え体DNAを
制限酵素で切断し、不要なDNA部分を除去しそのまま再
結合することにより、組換え体DNAの分子量を小さくす
ることが出来る。
大きさ（予想されるリパーゼ構造遺伝子より大きいが、
過度に大きくない）のDNA断片を集め、これを再び大腸
菌用プラスミドベクターに組み込むか、組換え体DNAを
制限酵素で切断し、不要なDNA部分を除去しそのまま再
結合することにより、組換え体DNAの分子量を小さくす
ることが出来る。
第２図にシュウドモナスフランジIFO 12049 株のリパ
ーゼの構造遺伝子を含むプラスミドpFL−１の制限酵素
地図を一例として示す。また、第３図にプラスミドpFL
−１のEcoRI,ScaI,NdeI,ApaI,SmaＩの各種制限酵素によ
る切断DNA断片を挿入したそれぞれのプラスミドpEL−2,
pFL−2SC,pFL−2ND,pFL−2AB,pFL−2SMを有する大腸菌
のトリブチリン寒天培地におけるクリアゾーンの形成の
有無の一例を示す。
ーゼの構造遺伝子を含むプラスミドpFL−１の制限酵素
地図を一例として示す。また、第３図にプラスミドpFL
−１のEcoRI,ScaI,NdeI,ApaI,SmaＩの各種制限酵素によ
る切断DNA断片を挿入したそれぞれのプラスミドpEL−2,
pFL−2SC,pFL−2ND,pFL−2AB,pFL−2SMを有する大腸菌
のトリブチリン寒天培地におけるクリアゾーンの形成の
有無の一例を示す。
シュウドモナス属殺菌由来のリパーゼをコードするDNA
配列が存在するDNA領域の決定は、Sangerらによるジデ
オキシ（dideoxy）法（Sanger.F.et al Proc.Natl.Aca
d.Sci.USA 74 5463 1977）等公知の方法を用いて決
定することができる。
配列が存在するDNA領域の決定は、Sangerらによるジデ
オキシ（dideoxy）法（Sanger.F.et al Proc.Natl.Aca
d.Sci.USA 74 5463 1977）等公知の方法を用いて決
定することができる。
前記第１項に係る第１図で記載されたATGの開始コドン
で始まり、TAGの終止ゴドンで終るDNA配列が、プラスミ
ドpEL−２で形質転換された大腸菌により生産されたリ
パーゼに実際対応するかどうかという点は、前記欠失実
験および本発明者等が特願昭63−123,672号で大腸菌JM8
3（pEL−２）株で発現される分子量約33,000のポリペプ
チドの確認をしたことから判断された。
で始まり、TAGの終止ゴドンで終るDNA配列が、プラスミ
ドpEL−２で形質転換された大腸菌により生産されたリ
パーゼに実際対応するかどうかという点は、前記欠失実
験および本発明者等が特願昭63−123,672号で大腸菌JM8
3（pEL−２）株で発現される分子量約33,000のポリペプ
チドの確認をしたことから判断された。
即ち、プラスミドpEL−２に含有されるシュウドモナス
フラジIFO 12049株のリパーゼ構造遺伝子のDNA配列
は、制限酵素NdeＩの認識する配列を含むがScaＩの認識
する配列は含まない配列であり、分子量が約33,000前後
となるオープンリーディングフレームであるということ
から判断されたものである。
フラジIFO 12049株のリパーゼ構造遺伝子のDNA配列
は、制限酵素NdeＩの認識する配列を含むがScaＩの認識
する配列は含まない配列であり、分子量が約33,000前後
となるオープンリーディングフレームであるということ
から判断されたものである。
第４図に、プラスミドpFL−２のシュウドモナスフラジI
FO 12049株のリパーゼをコードする領域を含む染色体D
NA配列（プラスミドpUC9のリンカーを一部含む）及びリ
パーゼ遺伝子のDNA配列に対応するアミノ酸配列の図を
示す。
FO 12049株のリパーゼをコードする領域を含む染色体D
NA配列（プラスミドpUC9のリンカーを一部含む）及びリ
パーゼ遺伝子のDNA配列に対応するアミノ酸配列の図を
示す。
前記サブクローニングの工程で分子量が少量化されたシ
ュウドモナス属殺菌由来のリパーゼ構造遺伝子を含む組
換え体DNAで、大腸菌を形質転換すれば、再びリパーゼ
生産能を有する大腸菌を得ることができる。
ュウドモナス属殺菌由来のリパーゼ構造遺伝子を含む組
換え体DNAで、大腸菌を形質転換すれば、再びリパーゼ
生産能を有する大腸菌を得ることができる。
このリパーゼ生産能を有する大腸菌の構成成分は、SDS
−ポリアクリルアミドゲル中で電気泳動されることによ
ってポリペプチドレベルにまで分離される。分離された
ポリペプチドは、クーマシーブリリアントブルー溶液中
で染色され視覚化される。
−ポリアクリルアミドゲル中で電気泳動されることによ
ってポリペプチドレベルにまで分離される。分離された
ポリペプチドは、クーマシーブリリアントブルー溶液中
で染色され視覚化される。
大腸菌用DNA導入ベクターに組み込まれたシュウドモナ
ス属細菌由来のリパーゼ構造遺伝子の大腸菌における発
現は、該大腸菌と異種構造遺伝子の組込まれていない前
記大腸菌用DNA導入ベクターのみを含有する大腸菌をそ
れぞれ培養することによって調整した資料をポリペプチ
ドまで分離、視覚化し比較することによって確認され
る。
ス属細菌由来のリパーゼ構造遺伝子の大腸菌における発
現は、該大腸菌と異種構造遺伝子の組込まれていない前
記大腸菌用DNA導入ベクターのみを含有する大腸菌をそ
れぞれ培養することによって調整した資料をポリペプチ
ドまで分離、視覚化し比較することによって確認され
る。
例えば、第５図に大腸菌JM83（pUC9）株（同図ａ）及び
大腸菌JM83（pFL−２）株（同図ｂ）についてSDS−ポリ
アクリルアミドゲル中で分離、視覚化された、ポリペプ
チドの図を示す。
大腸菌JM83（pFL−２）株（同図ｂ）についてSDS−ポリ
アクリルアミドゲル中で分離、視覚化された、ポリペプ
チドの図を示す。
両試料の比較により、プラスミドpFL−２に由来するシ
ュウドモナスフラジIFO 12049株のリパーゼ構造遺伝子
の大腸菌における発現が確認される。
ュウドモナスフラジIFO 12049株のリパーゼ構造遺伝子
の大腸菌における発現が確認される。
また、大腸菌ベクターに組み込まれた異種構造遺伝子の
できるだけ高い発現レベルを確実にするためには、でき
るだけ有効なプロモーター、オペレーター系に関連させ
ることが必要である。
できるだけ高い発現レベルを確実にするためには、でき
るだけ有効なプロモーター、オペレーター系に関連させ
ることが必要である。
大腸菌においては、種々の強いプロモーター・オペレー
ター系が知られている。例えば、ラクトース（1ac）オ
ペロン、トリプトファン（trp）オペロン、外膜タンパ
ク遺伝子（1pp）プロモーター、β−ラクタマーゼプロ
モーターなどが知られている。
ター系が知られている。例えば、ラクトース（1ac）オ
ペロン、トリプトファン（trp）オペロン、外膜タンパ
ク遺伝子（1pp）プロモーター、β−ラクタマーゼプロ
モーターなどが知られている。
これら種々の方法を、本発明のリパーゼをコードする領
域の大腸菌での発現に使用することができる。更に種々
の複製起点、標識遺伝子、有効なプロモーター及びその
他の構造的要素を同様な結果を得るために組み合わせる
ことができる。
域の大腸菌での発現に使用することができる。更に種々
の複製起点、標識遺伝子、有効なプロモーター及びその
他の構造的要素を同様な結果を得るために組み合わせる
ことができる。
以上の様々な場合に得られる形質転換された大腸菌株も
また、本発明の範囲内にあるものである。更に最も効率
よくリパーゼを生産できるように、これら大腸菌株の特
有の特徴に従って増殖条件を決定することができる。
また、本発明の範囲内にあるものである。更に最も効率
よくリパーゼを生産できるように、これら大腸菌株の特
有の特徴に従って増殖条件を決定することができる。
［実施例］ 更に本発明の説明を実施例により詳細に行うが、本発明
は実施例によって制限を受けるものではない。
は実施例によって制限を受けるものではない。
実施例において、使用された制限酵素は、すべて日本ジ
ーン（株）により市販されているものを用いた。
ーン（株）により市販されているものを用いた。
実施例１ （シュウドモナス フラジ IFO 12049株染色体DNAの
調製） 200ml L−培地（１％バクトトリプトン 0.5％酵母粉末
0.5％塩化ナトリウム pH7.2に調製）30℃で一晩培養し
集菌したシュウドモナス フラジ IFO 12049株を、培
養液100mlに対し、10mM−トリス−HCI緩衝液（pH8.0）,
30mM塩化ナトリウム溶液10mlで１回洗浄し、12mlの10mM
−トリス−HC1緩衝液（pH8.0）,1mM−EDTA 2Na溶液に
懸濁した。
調製） 200ml L−培地（１％バクトトリプトン 0.5％酵母粉末
0.5％塩化ナトリウム pH7.2に調製）30℃で一晩培養し
集菌したシュウドモナス フラジ IFO 12049株を、培
養液100mlに対し、10mM−トリス−HCI緩衝液（pH8.0）,
30mM塩化ナトリウム溶液10mlで１回洗浄し、12mlの10mM
−トリス−HC1緩衝液（pH8.0）,1mM−EDTA 2Na溶液に
懸濁した。
この懸濁液に終濃度が50mMトリス−HC1緩衝液（pH8.
0）,50mM−トリス 2Na 50mM EDTA−HC1緩衝液（pH8.
0）1mg/mlリゾチウム（生化学工業社）となるように、
それぞれ加え、１時間室温（25℃）に放置した。
0）,50mM−トリス 2Na 50mM EDTA−HC1緩衝液（pH8.
0）1mg/mlリゾチウム（生化学工業社）となるように、
それぞれ加え、１時間室温（25℃）に放置した。
この溶液に 0.5％ SDS存在下 100ug/mlの濃度となる
ようプロテニエースＫ（メルク社）を加え、３時間50℃
でゆるやかに振とうさせ菌体を溶解させた。
ようプロテニエースＫ（メルク社）を加え、３時間50℃
でゆるやかに振とうさせ菌体を溶解させた。
この試料を等量のトリス飽和フェノールで２回、等量の
ジエチルエーテルで１回抽出した後、エタノール沈殿さ
せ、沈殿物を10mMトリス HC1緩衝液（pH8.0）−1mM−E
DTA溶液（以下TE）に溶かし、同溶液中で４℃、２日間
透析し、染色体DNAを調製した。
ジエチルエーテルで１回抽出した後、エタノール沈殿さ
せ、沈殿物を10mMトリス HC1緩衝液（pH8.0）−1mM−E
DTA溶液（以下TE）に溶かし、同溶液中で４℃、２日間
透析し、染色体DNAを調製した。
実施例２ （リパーゼ遺伝子のクローニング） 実施例１で調製したシュウドモナス フラジIFO 12049
株の染色体DNA約７μｇを37℃でそれぞれIUのSau3A1で
５分、15分、25分、35分、50分と経時的反応で部分消化
し、終濃度20mMとなるようEDTA 2Na溶液で反応を止めた
後、各反応液を混合した。
株の染色体DNA約７μｇを37℃でそれぞれIUのSau3A1で
５分、15分、25分、35分、50分と経時的反応で部分消化
し、終濃度20mMとなるようEDTA 2Na溶液で反応を止めた
後、各反応液を混合した。
この混合した試料を、pH7−９で40mMトリス2mM酢酸ナト
リウム、1mM EDTA 2Na中の0.7％アガロースゲル中で 4
0mA 16時間電気泳動した。
リウム、1mM EDTA 2Na中の0.7％アガロースゲル中で 4
0mA 16時間電気泳動した。
アガロースゲル中より２〜6KbのDNA断片をワットマンDE
81 DEAEセルロースペーパー（ワットマン社）に吸着さ
せ、被吸着物を300μｌの1M−NaCl−TE溶液で溶出さ
せ、被溶出物を等量のトリス飽和フェノールで２回、等
量のジエチルエーテルで１回抽出し、2.5倍量のエタノ
ールを加え沈殿させ回収した。
81 DEAEセルロースペーパー（ワットマン社）に吸着さ
せ、被吸着物を300μｌの1M−NaCl−TE溶液で溶出さ
せ、被溶出物を等量のトリス飽和フェノールで２回、等
量のジエチルエーテルで１回抽出し、2.5倍量のエタノ
ールを加え沈殿させ回収した。
この時回収物は約0.7μｇであった。
この試料と、BamH1消化後、0.6Uのアルカリホスファタ
ーゼ（宝酒造（株））で50℃、３時間の反応により脱リ
ン酸したpUC91.5μｇとを66mMトリス−HC1緩衝液（pH8.
0）6.6mM−MgCl20.066mM−ATP及び10mMジチオスレイト
ール存在下で、４℃16時間1ul（147U/ul）のT4DNAリガ
ーゼによって連結した。
ーゼ（宝酒造（株））で50℃、３時間の反応により脱リ
ン酸したpUC91.5μｇとを66mMトリス−HC1緩衝液（pH8.
0）6.6mM−MgCl20.066mM−ATP及び10mMジチオスレイト
ール存在下で、４℃16時間1ul（147U/ul）のT4DNAリガ
ーゼによって連結した。
この連結したDNA試料を用い、コンピテントセル法によ
り〜２×109菌体数のJM83株を形質転換し、50μg/mlの
ビクシリン（明治製菓社）、１％トリブチリン、及び0.
0002％ Ｘ−galを含むL.寒天培地上で16時間培養させ
た。
り〜２×109菌体数のJM83株を形質転換し、50μg/mlの
ビクシリン（明治製菓社）、１％トリブチリン、及び0.
0002％ Ｘ−galを含むL.寒天培地上で16時間培養させ
た。
およそ1500のpUC9プラスミドベクターのマーカーにより
選択された形質転換株のうち、１株培地中にクリアーゾ
ーンを形成する株があったのでこれを分離した。この菌
株を大腸菌JM83（pEL−１）と名付けた。
選択された形質転換株のうち、１株培地中にクリアーゾ
ーンを形成する株があったのでこれを分離した。この菌
株を大腸菌JM83（pEL−１）と名付けた。
実施例３ （組換え体DNAの解析） プラスミドpFL−１を各種制限酵素により、消化しアガ
ロースゲル電気泳動法を用いた測定に基づいて制限酵素
地図を作成した。pFL−１の制限酵素地図を第２図に示
す。
ロースゲル電気泳動法を用いた測定に基づいて制限酵素
地図を作成した。pFL−１の制限酵素地図を第２図に示
す。
プラスミドpEL−１の制限酵素地図に基づいて、各種制
限酵素により切断して得た各DNA断片をpUC9にサブクロ
ーニングし、大腸菌JM83株を形質転換させ、実施例２と
同様に１％トリブチリンを含む培地におけるクリアゾー
ン形成の有無を調べた。
限酵素により切断して得た各DNA断片をpUC9にサブクロ
ーニングし、大腸菌JM83株を形質転換させ、実施例２と
同様に１％トリブチリンを含む培地におけるクリアゾー
ン形成の有無を調べた。
第３図にプラスミドpFL−１をEcoRI,ScaＩ、NdeI,ApaI,
SmaＩの各種制限酵素による切断DNA断片を挿入したプラ
スミド、それぞれpFL−2,pFL−2SC,pFL−2ND,pFL−2AB,
pFL−2SM,を有する大腸菌のクリアゾーン形成の有無を
示す。
SmaＩの各種制限酵素による切断DNA断片を挿入したプラ
スミド、それぞれpFL−2,pFL−2SC,pFL−2ND,pFL−2AB,
pFL−2SM,を有する大腸菌のクリアゾーン形成の有無を
示す。
実施例４ （DNA配列の決定） プラスミドpFL−２のシュウドモナスフラジIFO12049株
の染色体DNAに由来する部分についてM13 Seaquencing
Kit（宝酒造（株））及びDeaza Seaquencing Kit（日本
ジーン（株））を用いてDNA配列を決定した。その結果
第４図に示したオープンリーディングフレームが確認さ
れた。
の染色体DNAに由来する部分についてM13 Seaquencing
Kit（宝酒造（株））及びDeaza Seaquencing Kit（日本
ジーン（株））を用いてDNA配列を決定した。その結果
第４図に示したオープンリーディングフレームが確認さ
れた。
実施例５ （組換え体DNAの大腸菌における発現） 大腸菌JM83（pUC9）株及びJM83（pFL−２）株を振とう
培養機で37℃で16時間、50μg/mlのビクシリン（明治製
菓（株））を含むＬ液体培地で培養した。菌体を集菌し
0.1Mリン酸緩衝液（pH0.7）に再懸濁し、培養液30μｌ
に相当する菌体を等量の２×サンプル緩衝液（10％グリ
セロール、５％２−メルカプトエタノール、2,3％SDS,
0.0625Mトリス−HC1（pH6.8）と混合し、５分間煮沸
し、15％SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動によ
り、ポリペプチドについて分析した。
培養機で37℃で16時間、50μg/mlのビクシリン（明治製
菓（株））を含むＬ液体培地で培養した。菌体を集菌し
0.1Mリン酸緩衝液（pH0.7）に再懸濁し、培養液30μｌ
に相当する菌体を等量の２×サンプル緩衝液（10％グリ
セロール、５％２−メルカプトエタノール、2,3％SDS,
0.0625Mトリス−HC1（pH6.8）と混合し、５分間煮沸
し、15％SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動によ
り、ポリペプチドについて分析した。
SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動は、Laemmliらの
方法（Laemmli,U.K.Nature 227680（1970））に準じて
行い、電気泳動は、20mAでブロムフェノールブルーがゲ
ルの下端に達するまで行った。
方法（Laemmli,U.K.Nature 227680（1970））に準じて
行い、電気泳動は、20mAでブロムフェノールブルーがゲ
ルの下端に達するまで行った。
第５図に15％SDS−ポリアクリルアミドゲル中で、クー
マシーブリリアントブルー溶液により染色された大腸菌
JM83（pUC9）株（レーンａ）及びJM83（pEL−２）株
（レーンｂ）についてのポリペプチドを示す。プラスミ
ドpFL−２に含まれるシュウドモナスフラジIFO 12049
株由来のリパーゼ構造遺伝子の大腸菌JM83株における発
現（←に示されたポリペプチド）が確認された。
マシーブリリアントブルー溶液により染色された大腸菌
JM83（pUC9）株（レーンａ）及びJM83（pEL−２）株
（レーンｂ）についてのポリペプチドを示す。プラスミ
ドpFL−２に含まれるシュウドモナスフラジIFO 12049
株由来のリパーゼ構造遺伝子の大腸菌JM83株における発
現（←に示されたポリペプチド）が確認された。
第１〜５図は、本発明を説明するための説明図である。 第１図はシュウドモナスフラジIFO 12049株由来のリパ
ーゼ構造遺伝子のDNA配列を示す。 第２図は、プラスミドpFL−１の制限酵素地図を示す。
黒塗りの部分が、シュウドモナスフラジIFO 12049株染
色体DNA由来のDNA断片である。 第３図は、プラスミドpFL−2,pFL−2SC,pFL−2ND,pFL−
2AB,pFL−2SMのプラスミドpUC9への各挿入断片とトリブ
チリン寒天培地におけるクリアゾーン形成の有無を示
す。 クリアゾーン＋はクリアゾーン形成を示す。 第４図、プラスミドpFL−２のシュウドモナスフラジIFO
12049株のリパーゼ構造遺伝子を含む染色体DNA配列
（プラスミドpUC9のリンカーを一部含む）及びリバーゼ
のDNA配列に対応するアミノ酸配列を示す。 第５図は、15％SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動
によりポリペプチドについて分析された大腸菌JM83（pU
C9）株（レーンａ）及JM83（pFL−２）株（レーンｂ）
を示す。 左側の数字は、同時に電気泳動されたタンパク質マーカ
ーの分子量（×1,000）を示す。
ーゼ構造遺伝子のDNA配列を示す。 第２図は、プラスミドpFL−１の制限酵素地図を示す。
黒塗りの部分が、シュウドモナスフラジIFO 12049株染
色体DNA由来のDNA断片である。 第３図は、プラスミドpFL−2,pFL−2SC,pFL−2ND,pFL−
2AB,pFL−2SMのプラスミドpUC9への各挿入断片とトリブ
チリン寒天培地におけるクリアゾーン形成の有無を示
す。 クリアゾーン＋はクリアゾーン形成を示す。 第４図、プラスミドpFL−２のシュウドモナスフラジIFO
12049株のリパーゼ構造遺伝子を含む染色体DNA配列
（プラスミドpUC9のリンカーを一部含む）及びリバーゼ
のDNA配列に対応するアミノ酸配列を示す。 第５図は、15％SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動
によりポリペプチドについて分析された大腸菌JM83（pU
C9）株（レーンａ）及JM83（pFL−２）株（レーンｂ）
を示す。 左側の数字は、同時に電気泳動されたタンパク質マーカ
ーの分子量（×1,000）を示す。
フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 //(Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:38） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 9/20 Ｃ１２Ｒ 1:19） Ｃ１２Ｒ 1:38）
Claims (6)
- 【請求項１】ヌクレオチドが下記の配列であるシュウド
モナスフラジ（Pseudomonasfragi）IFO 12049株由来の
リパーゼをコードするDNA。 - 【請求項２】特許請求の範囲第１項記載のDNAを大腸菌
用ベクターに組み込んでなる大腸菌内で複製可能な組換
え体DNA。 - 【請求項３】大腸菌用ベクターがpUC9である特許請求の
範囲第２項記載の組換え体DNA。 - 【請求項４】特許請求の範囲第２項若しくは第３項記載
の組換え体DNAによって形質転換された大腸菌。 - 【請求項５】特許請求の範囲第２項記載の組換え体DNA
により形質転換された大腸菌を宿主として用いることを
特徴とするリパーゼの製造法。 - 【請求項６】特許請求の範囲第４項記載の大腸菌を培養
することを特徴とするリパーゼの製造法。
Priority Applications (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP63187684A JPH0720430B2 (ja) | 1988-07-27 | 1988-07-27 | リパーゼ遺伝子 |
| DE19883887656 DE3887656T2 (de) | 1987-12-03 | 1988-11-18 | Lipasegen. |
| EP19880119211 EP0318775B1 (en) | 1987-12-03 | 1988-11-18 | A lipase gene |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP63187684A JPH0720430B2 (ja) | 1988-07-27 | 1988-07-27 | リパーゼ遺伝子 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0239890A JPH0239890A (ja) | 1990-02-08 |
| JPH0720430B2 true JPH0720430B2 (ja) | 1995-03-08 |
Family
ID=16210333
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP63187684A Expired - Lifetime JPH0720430B2 (ja) | 1987-12-03 | 1988-07-27 | リパーゼ遺伝子 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0720430B2 (ja) |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS62228279A (ja) * | 1986-03-28 | 1987-10-07 | Fuji Oil Co Ltd | Ｄｎａ配列、プラスミド及びリパ−ゼを生産する方法 |
| JPH01148188A (ja) * | 1987-12-03 | 1989-06-09 | Chisso Corp | リパーゼ構造遺伝子を含む組換え体ｄｎａ，それを含む大腸菌、及びリパーゼの製造法 |
-
1988
- 1988-07-27 JP JP63187684A patent/JPH0720430B2/ja not_active Expired - Lifetime
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| ＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌａｎｄＢｉｏｐｈｙｓｉｃａｌＲｅｓｅａｒｃｈＣｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ，１４１［１（１９８６）Ｐ．１８５−１９０ |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0239890A (ja) | 1990-02-08 |
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