JPH0659222B2 - 耐熱性リパーゼ遺伝子、該遺伝子を有するベクターおよび耐熱性リパーゼの生産方法 - Google Patents

耐熱性リパーゼ遺伝子、該遺伝子を有するベクターおよび耐熱性リパーゼの生産方法

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JPH0659222B2 JP18230189A JP18230189A JPH0659222B2 JP H0659222 B2 JPH0659222 B2 JP H0659222B2 JP 18230189 A JP18230189 A JP 18230189A JP 18230189 A JP18230189 A JP 18230189A JP H0659222 B2 JPH0659222 B2 JP H0659222B2
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Description

【発明の詳細な説明】 (産業上の利用分野) 本発明は耐熱性リパーゼをコードするDNA配列および
該リパーゼを生産する方法に関する。
更に詳しくは、耐熱性リパーゼ生産菌であるシユードモ
ナスKWI−56菌株(FERM BP−3178)に
由来する染色体DNAより調製された耐熱性リパーゼを
コードするDNA配列および該DNAを用いてリパーゼ
を生産する方法に関する。
(従来技術) リパーゼはトリグリセリドを基質とし、これを脂肪酸と
グリセリンとに加水分解する酵素である。
しかし、長鎖飽和脂肪酸を多く含む油脂は常温で固体で
あり、リパーゼを工業的に利用する場合には、油脂が溶
融する様な高温下で反応を進めなければならない。さら
に、酵素を固定化し連続反応をおこなう場合には、高温
下で長期間の滞留が必要となる。このような反応系では
用いる酵素は、強い耐熱性を持つことが要求される。
耐熱性リパーゼという点においては、特にシユードモナ
ス(Pseudomomas)属細菌がこれらのリパーゼを生産し
うることが報告されている。例えばシユードモナス・メ
フィティカ・バリュタス・リポリティカ(Pseudomomas
mephitica var.lipolytica)(特公昭50-25553),シユ
ードモナス・フラジー(Pseudomonas fragi)(特開昭
61−280274)、シユードモナス・フルオレセン
ス・バイオタイプI(Pseudomonas fluorescens biotyp
e I)(特開昭57-58885)が知られている。
一方、近年酵素を大量に生産する際、遺伝子工学的技術
の応用が導入されるようになった。すなわち、目的とす
る酵素をコードする遺伝子をクローニングし、これを適
当な高発現ベクターに連結する。さらに目的酵素遺伝子
を含んだベクターを大腸菌等の宿主細胞に形質転換し、
この形質転換体を酵素生産に最適な条件で培養すること
によって、容易かつ大量に目的とする酵素を得ることが
可能となる。遺伝子工学的技術の応用は、リパーゼにお
いても試みられており、多数の微生物よりリパーゼ遺伝
子がクローニングされている。例えばスタフィロコッカ
ス(Staphilococcus)属、シユードモナス(Pseudomona
s)属、バチルス(Bacillus)属、ゲオトリクム(Geotr
ichum)属等が知られている。
(発明が解決しようとする問題点) 耐熱性リパーゼ遺伝子のクローニングに関してはバチル
ス・ステアロサーモフィルス(Bacillus stearothermop
hilus)の報告(特開昭62-228279)があるのみである。
特にシユードモナス属由来の耐熱性リパーゼ遺伝子のク
ローニング、および該遺伝子を用いたリパーゼの生産方
法は知られていない。
(問題点を解決するための手段) 本発明者らは、耐熱性リパーゼ生産菌シユードモナスK
WI−56菌株より耐熱性リパーゼをコードする遺伝子を
クローニングし、下記のとおりその塩基配列を決定し
た。
さらに耐熱性リパーゼ遺伝子を導入したプラスミドをベ
クターとし、これを大腸菌に保持せしめることによっ
て、大腸菌に耐熱性リパーゼを生産させるに至った。
以下、本発明を詳細に説明する。
リパーゼ遺伝子のクローニング シユードモナスKWI−56株より、耐熱性リパーゼ遺伝
子を含む染色体DNAは、常法に従って単離できる。例
えば、Marmurの方法(Marmur.J.,J.Mol.Biol.3,208(196
1))や、Smithらの方法(Smith,M.,G.,“Method in Enz
ymology”,Academic press,New York,12,part A,P545(1
967))等を用いることができる。
染色体DNAのベクターDNAへの組込みは染色体DN
AおよびベクターDNAを制限酵素で切断したのち、両
者を混合し、DNAリガーゼで処理することにより行う
ことができる。制限酵素としてはBamHI,EcoRI,PstI,Sal
I,Sau3AI等があげられる。ベクターDNAにはpUC18、pU
C19、pBR322等の公知のプラスミドベクターやM13mp18、
λgt10等公知のファージベクターを利用できる。
かかる組換えベクターを用いて大腸菌、枯草菌、酵母等
の形質転換をすることができる。形質転換は塩化カルシ
ウム法等の公知の方法を利用できる。
次に、上記方法で得られた形質転換体のなかから、リパ
ーゼ遺伝子を保持する株をスクリーニングすることがで
きる。例えばKUGIMIYAらの方法(Kugimiya,S.,Biochim
Biophys.Res.Commun.,141,185(1986))を用い、トリブ
チリン寒天培地上で、トリブチリンの加水分解にともな
うクリアゾーンを形成する菌株を分離することによって
行うことができる。
本発明のリパーゼ遺伝子は、上記のようにして得られた
形質転換体よりアルカリ−SDS法等の公知の方法を用
いて組換えベクターを分離・精製することにより得るこ
とができる。
次にリパーゼ遺伝子が存在する領域は、上記組換えベク
ターを各種制限酵素を用いてサブクローニングし、かか
る形質転換体のトリブチリン寒天培地でのクリアゾーン
形成能を調べることにより決定できる。さらにはリパー
ゼ遺伝子の塩基配列を公知の方法、例えばジデオキシ法
(Sanger,F.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,74,5463(197
7))等を用いて決定することができる。
クローニングされたリパーゼ遺伝子が耐熱性リパーゼ
をコードする遺伝子であることの証明 シユードモナスKWI−56菌株が生産する耐熱性リパー
ゼが、明らかに上記方法によって得られた遺伝子に由来
するものかどうかを確認するためには、リパーゼ蛋白質
の一次構造と、リパーゼ遺伝子の塩基配列より決定され
るアミノ酸配列とが一致するかどうかを調べることによ
って確認できる。
シユードモナスKWI−56菌株の培養液上清より精製し
て得られた耐熱性リパーゼのアミノ酸組成は、酸加水分
解したのち、アミノ酸分析計により測定することができ
る。また、部分的アミノ酸配列は、液相エドマン分解法
等によりN末端アミノ酸からカルボキシペプチダーゼ法
等によりC末端アミノ酸から決定することができる。
組換え体による耐熱性リパーゼの生産 次に、本発明で得られたリパーゼ遺伝子を利用してリパ
ーゼを生産することは可能である。リパーゼ遺伝子を挿
入したプラスミドベクターを保持する形質転換体を、酵
素生産に最適の条件下で培養し、培養上清、あるいは破
砕菌体よりリパーゼを得ることができる。
以下、実施例を挙げて本発明を更に具体的に説明する
が、本発明はそれら実施例に限定されるものではない。
(実施例) シユードモナスKWI−56菌株の染色体DNAライブ
ラリーの作成。
シユードモナスKWI−56株の一白金耳を200mlNB培地
(肉エキス1%、ペプトン1%、Nacl0.5%、pH7.0)に
植菌し30℃、24時間振とう培養した。菌体を集菌し、洗
浄した後、12mlの0.1Mトリス−塩酸緩衝液(pH8.0)、
10mMEDTAに懸濁し、1mgのリゾチームを加え37℃で
10分間放置する。次に600μの10%SDSを加え、37
℃30分間放置し溶菌をおこなった。さらに600μの3
MNaClを加えたのち、フェノール抽出を3回くり返し、
エーテル洗浄,エタノール沈殿をおこなった。得られた
沈殿物は乾燥後10mlのSSC溶液に溶解し、リボヌクレ
アーゼ0.5mgを加え37℃に30分間放置した。再度フェノ
ール処理を3回おこない、エーテル洗浄後、エタノール
沈殿でDNAを回収し、乾燥後SSC溶液に溶解した。
その結果、3.5mgの染色体DNAを得た。
染色体DNAは制限酵素Sau3AIを用い、得られるDNA
断片の鎖長が4〜10Kbの範囲となるような条件下で部分
分解した。
ベクターDNAはプラスミドpUC19を用いた。pUC19は制
限酵素BamHI切断し、アルカリホスファターゼで処理し
た。
部分分解したシユードモナスKWI−56株染色体DNA
BamHI消化したプラスミドpUC19を2:1の割合で混合
したのち、宝酒造製DNAライゲーションキットを用い
て16℃、30分間の反応によって連結させた。
大腸菌HB101株はHanahanの方法(Hanahan,D.,Gene,10,6
3(1980))に基づき、カルシウム処理をほどこすことに
よって形質転換細胞として調製し、上記組み換えプラス
ミドを形質転換した。
リパーゼ遺伝子を挿入したプラスミドの単離 上記、形質転換体を、50μg/mlアンピシリン、1%ト
リブチリンを含むLB培地にプレーティングした。37℃
で48時間培養したのち、約16,400個の形質転換体より14
個のコロニー周辺にクリアゾーンを形成する株を得た。
14個のクリアゾーン形成株は50μg/mlのアンピシリン
を含む5mlLB液体培地で37℃、24時間振とう培養し
た。培養液は菌体を破砕する目的で超音波処理し、その
リパーゼ活性を測定した。測定には回転撹拌法を用い
た。すなわち、反応容器5ml1/20Mリン酸緩衝液(pH
0.7)、1mlオリーブ油、1ml酵素液を加え、37℃、60
分間、スターラー回転500rpmで反応をおこなった。エタ
ノール20mlを加えて反応を停止したのち、生成した遊離
脂肪酸を1/20NのKOHで滴定した。酵素活性は1分間
に1マイクロモルの脂肪酸を遊離せしめる酵素量を1ユ
ニット(1U)とした。
その結果、14個のクリアゾーン形成株の中から、0.025
U/mlのリパーゼ活性を示す一株を単離した。本形質転
換体はSA−3株と命名した。
次にSA−3株を50μg/mlのアンピシリンを含む5ml
LB液体培地で37℃、24時間振とう培養し、アルカリ−
SDS法によりプラスミドを抽出した。本プラスミドは
11.5Kbの外来DNA断片を保持していた。本プラスミド
はpLP6と命名した。
pLP6の解析 プラスミドpLP6を各種制限酵素を用いて断片化し、サブ
クローニングした。組み換えプラスミドを保持する大腸
菌HB101株のトリブチリン−LB平板上でのクリアゾー
ン形成を指標として、リパーゼ遺伝子がコードされる最
小DNA断片を明らかにした。
その結果2.1KbのBglII-BamHI断片をリパーゼ遺伝子がコ
ードされる最小DNA断片とし、本断片をBamHIで消化
したプラスミドpUC19に結合した。得られたプラスミド
をpLP65と命名した。pLP65の制限酵素切断地図を第1図
に示す。
リパーゼ遺伝子塩基配列の決定 塩基配列の決定に先立ちMessingらの方法(J.Messing,G
ene19,269(1982))に従って、2.1KbのBalII-BamHI断片
をファージM13mp18、もしくはmp19にサブクローニング
し、宝酒造(株)製キロベース・デレーション・キット
を用い種々デレーション・ファージを作製した。これら
を鋳型としジデオキシ法により、2.1KbのBglII-BamHI断
片の全塩基配列を決定した。その結果、第2図に示すオ
ーブンリーディングフレームの存在を認めた。また、第
3図には第2図の塩基配列より決定されるアミノ酸配列
を示す。
耐熱性リパーゼのアミノ酸組成、およびN末端、C末
端アミノ酸の決定 シユードモナスKWI−56菌株の培養液上清より精製し
て得られた耐熱性リパーゼ1mgを用い、液相エドマンド
分解法によりN末端アミノ酸よりアミノ酸配列を順次決
定した。その結果、リパーゼのN末端からのアミノ酸配
列は、アラニンーアスパラギン酸−グリシンであること
がわかった。この配列は第3図の45番目から47番目に存
在した。
次に、耐熱性リパーゼ2mgを約36μgのカルボキシペプ
チターゼAで処理し、経時的に遊離したアミノ酸を測定
した結果、著しいバリンの遊離がみられた。この結果よ
り、耐熱性リパーゼC末端のアミノ酸はバリンと決定さ
れた。また第3図に示すように、塩基配列から決定され
たアミノ酸配列C末端もバリンであった。
さらに、耐熱性リパーゼ蛋白のアミノ酸組成と塩基配列
から決定されたアミノ酸組成との比較をおこなった。耐
熱性リパーゼ50μgを6N塩酸中、110℃、24時間処理
し、加水分解されたアミノ酸を測定した。システィン残
基は耐熱性リパーゼを過ギ酸酸化したのち、上記の要領
で測定した。トリプトファン残基は0.1%耐熱性リパー
ゼ水溶液の294.4nmと280.0nmの吸光度からチロシン残基
との比較をおこない算出した。また、塩基配列より決定
されたリパーゼのアミノ酸組成は、第3図45番目から36
4番目までのアミノ酸組成として算出した。その結果、
第1表に示されるように、耐熱性リパーゼのアミノ酸組
成と塩基配列より決定されたアミノ酸組成は大略一致し
た。
以上の結果より、クローニングされたリパーゼ遺伝子
は、シュードモナスKWI−56菌株由来の耐熱性リパー
ゼをコードする遺伝子であることがわかった。
また、耐熱性リパーゼのN末端アミノ酸は第3図45番目
のアラニンであることから、リパーゼは翻訳後第3図44
番目のプロリンと45番目のアラニンの間で切断をうけ完
成される。
大腸菌による耐熱性リパーゼの生産 500ml坂口フラスコに50μg/mlアンピシリンを添加し
たLB培地50mlを分注し、プラスミドpLP65を保持した
大腸菌HB101株前培養を1%の植菌量で接種し、37℃、2
4時間の振とう培養をおこなった。菌株を集菌し洗浄し
たのち、50mlの20mMトリス塩酸緩衝液(pH7.5)に懸濁
した。懸濁液は超音波処理によって菌体を破砕し、残存
菌体を取り除くため遠心分離をおこなった。遠心上清の
リパーゼ活性を前記の回転撹拌法によって測定したとこ
ろ、2.0U/mlのリパーゼ活性を得た。また、この遠心
上清を60℃、1時間熱処理し残存リパーゼ活性測定し
たが、失活はみとめられなかった。
(発明の効果) 本発明の耐熱性リパーゼ遺伝子の発明によって大腸菌、
枯草菌、酵母等の微生物を用いての耐熱性リパーゼ生産
が可能となる。さらに、遺伝子に位置特異的変異導入法
等を採用し、耐アルカリ性、界面活性剤耐性等の新たな
能力を持ったリパーゼを生産させるための材料にもな
る。
【図面の簡単な説明】
第1図はプラスミドpLP65の制限酵素切断地図を示す。
図中細線はプラスミドpUC19由来の遺伝子を、太線はシ
ユードモナスKWI−56菌株染色体DNA由来の遺伝子
を示す。第2図は耐熱性リパーゼをコードする遺伝子の
オープンリーディングフレーム塩基配列を示す。第3図
は第2図のオープンリーディングフレームより決定され
るアミノ酸配列を示す。
フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 FI 技術表示箇所 (C12N 9/20 C12R 1:19)

Claims (3)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項1】下記の塩基配列を有することを特徴とする
    耐熱性リパーゼをコードする遺伝子。
  2. 【請求項2】請求項(1)記載の遺伝子を有するベクタ
    ー。
  3. 【請求項3】請求項(2)記載のベクターを保持した宿主
    を培養し、その培養液から耐熱性リパーゼを分離するこ
    とを特徴とする耐熱性リパーゼの生産方法。
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