JPH0659222B2 - 耐熱性リパーゼ遺伝子、該遺伝子を有するベクターおよび耐熱性リパーゼの生産方法 - Google Patents
耐熱性リパーゼ遺伝子、該遺伝子を有するベクターおよび耐熱性リパーゼの生産方法Info
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- JPH0659222B2 JPH0659222B2 JP18230189A JP18230189A JPH0659222B2 JP H0659222 B2 JPH0659222 B2 JP H0659222B2 JP 18230189 A JP18230189 A JP 18230189A JP 18230189 A JP18230189 A JP 18230189A JP H0659222 B2 JPH0659222 B2 JP H0659222B2
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Description
【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は耐熱性リパーゼをコードするＤＮＡ配列および
該リパーゼを生産する方法に関する。
該リパーゼを生産する方法に関する。
更に詳しくは、耐熱性リパーゼ生産菌であるシユードモ
ナスＫＷＩ−５６菌株（ＦＥＲＭ ＢＰ−３１７８）に
由来する染色体ＤＮＡより調製された耐熱性リパーゼを
コードするＤＮＡ配列および該ＤＮＡを用いてリパーゼ
を生産する方法に関する。
ナスＫＷＩ−５６菌株（ＦＥＲＭ ＢＰ−３１７８）に
由来する染色体ＤＮＡより調製された耐熱性リパーゼを
コードするＤＮＡ配列および該ＤＮＡを用いてリパーゼ
を生産する方法に関する。
（従来技術） リパーゼはトリグリセリドを基質とし、これを脂肪酸と
グリセリンとに加水分解する酵素である。
グリセリンとに加水分解する酵素である。
しかし、長鎖飽和脂肪酸を多く含む油脂は常温で固体で
あり、リパーゼを工業的に利用する場合には、油脂が溶
融する様な高温下で反応を進めなければならない。さら
に、酵素を固定化し連続反応をおこなう場合には、高温
下で長期間の滞留が必要となる。このような反応系では
用いる酵素は、強い耐熱性を持つことが要求される。
あり、リパーゼを工業的に利用する場合には、油脂が溶
融する様な高温下で反応を進めなければならない。さら
に、酵素を固定化し連続反応をおこなう場合には、高温
下で長期間の滞留が必要となる。このような反応系では
用いる酵素は、強い耐熱性を持つことが要求される。
耐熱性リパーゼという点においては、特にシユードモナ
ス（Pseudomomas）属細菌がこれらのリパーゼを生産し
うることが報告されている。例えばシユードモナス・メ
フィティカ・バリュタス・リポリティカ（Pseudomomas
mephitica var.lipolytica）（特公昭50-25553），シユ
ードモナス・フラジー（Pseudomonas fragi）（特開昭
６１−２８０２７４）、シユードモナス・フルオレセン
ス・バイオタイプＩ（Pseudomonas fluorescens biotyp
e Ｉ）（特開昭57-58885）が知られている。
ス（Pseudomomas）属細菌がこれらのリパーゼを生産し
うることが報告されている。例えばシユードモナス・メ
フィティカ・バリュタス・リポリティカ（Pseudomomas
mephitica var.lipolytica）（特公昭50-25553），シユ
ードモナス・フラジー（Pseudomonas fragi）（特開昭
６１−２８０２７４）、シユードモナス・フルオレセン
ス・バイオタイプＩ（Pseudomonas fluorescens biotyp
e Ｉ）（特開昭57-58885）が知られている。
一方、近年酵素を大量に生産する際、遺伝子工学的技術
の応用が導入されるようになった。すなわち、目的とす
る酵素をコードする遺伝子をクローニングし、これを適
当な高発現ベクターに連結する。さらに目的酵素遺伝子
を含んだベクターを大腸菌等の宿主細胞に形質転換し、
この形質転換体を酵素生産に最適な条件で培養すること
によって、容易かつ大量に目的とする酵素を得ることが
可能となる。遺伝子工学的技術の応用は、リパーゼにお
いても試みられており、多数の微生物よりリパーゼ遺伝
子がクローニングされている。例えばスタフィロコッカ
ス（Staphilococcus）属、シユードモナス（Pseudomona
s）属、バチルス（Bacillus）属、ゲオトリクム（Geotr
ichum）属等が知られている。
の応用が導入されるようになった。すなわち、目的とす
る酵素をコードする遺伝子をクローニングし、これを適
当な高発現ベクターに連結する。さらに目的酵素遺伝子
を含んだベクターを大腸菌等の宿主細胞に形質転換し、
この形質転換体を酵素生産に最適な条件で培養すること
によって、容易かつ大量に目的とする酵素を得ることが
可能となる。遺伝子工学的技術の応用は、リパーゼにお
いても試みられており、多数の微生物よりリパーゼ遺伝
子がクローニングされている。例えばスタフィロコッカ
ス（Staphilococcus）属、シユードモナス（Pseudomona
s）属、バチルス（Bacillus）属、ゲオトリクム（Geotr
ichum）属等が知られている。
（発明が解決しようとする問題点） 耐熱性リパーゼ遺伝子のクローニングに関してはバチル
ス・ステアロサーモフィルス（Bacillus stearothermop
hilus）の報告（特開昭62-228279）があるのみである。
特にシユードモナス属由来の耐熱性リパーゼ遺伝子のク
ローニング、および該遺伝子を用いたリパーゼの生産方
法は知られていない。
ス・ステアロサーモフィルス（Bacillus stearothermop
hilus）の報告（特開昭62-228279）があるのみである。
特にシユードモナス属由来の耐熱性リパーゼ遺伝子のク
ローニング、および該遺伝子を用いたリパーゼの生産方
法は知られていない。
（問題点を解決するための手段） 本発明者らは、耐熱性リパーゼ生産菌シユードモナスＫ
ＷＩ−56菌株より耐熱性リパーゼをコードする遺伝子を
クローニングし、下記のとおりその塩基配列を決定し
た。
ＷＩ−56菌株より耐熱性リパーゼをコードする遺伝子を
クローニングし、下記のとおりその塩基配列を決定し
た。
さらに耐熱性リパーゼ遺伝子を導入したプラスミドをベ
クターとし、これを大腸菌に保持せしめることによっ
て、大腸菌に耐熱性リパーゼを生産させるに至った。
クターとし、これを大腸菌に保持せしめることによっ
て、大腸菌に耐熱性リパーゼを生産させるに至った。
以下、本発明を詳細に説明する。
リパーゼ遺伝子のクローニング シユードモナスＫＷＩ−56株より、耐熱性リパーゼ遺伝
子を含む染色体ＤＮＡは、常法に従って単離できる。例
えば、Marmurの方法（Marmur.J.,J.Mol.Biol.3,208(196
1)）や、Smithらの方法（Smith,M.,G.,“Method in Enz
ymology”,Academic press,New York,12,part A,P545(1
967)）等を用いることができる。
子を含む染色体ＤＮＡは、常法に従って単離できる。例
えば、Marmurの方法（Marmur.J.,J.Mol.Biol.3,208(196
1)）や、Smithらの方法（Smith,M.,G.,“Method in Enz
ymology”,Academic press,New York,12,part A,P545(1
967)）等を用いることができる。
染色体ＤＮＡのベクターＤＮＡへの組込みは染色体ＤＮ
ＡおよびベクターＤＮＡを制限酵素で切断したのち、両
者を混合し、ＤＮＡリガーゼで処理することにより行う
ことができる。制限酵素としてはBamHI,EcoRI,PstI,Sal
I,Sau3AI等があげられる。ベクターＤＮＡにはpUC18、pU
C19、pBR322等の公知のプラスミドベクターやＭ13mp18、
λgt10等公知のファージベクターを利用できる。
ＡおよびベクターＤＮＡを制限酵素で切断したのち、両
者を混合し、ＤＮＡリガーゼで処理することにより行う
ことができる。制限酵素としてはBamHI,EcoRI,PstI,Sal
I,Sau3AI等があげられる。ベクターＤＮＡにはpUC18、pU
C19、pBR322等の公知のプラスミドベクターやＭ13mp18、
λgt10等公知のファージベクターを利用できる。
かかる組換えベクターを用いて大腸菌、枯草菌、酵母等
の形質転換をすることができる。形質転換は塩化カルシ
ウム法等の公知の方法を利用できる。
の形質転換をすることができる。形質転換は塩化カルシ
ウム法等の公知の方法を利用できる。
次に、上記方法で得られた形質転換体のなかから、リパ
ーゼ遺伝子を保持する株をスクリーニングすることがで
きる。例えばKUGIMIYAらの方法（Kugimiya,S.,Biochim
Biophys.Res.Commun.,141,185(1986)）を用い、トリブ
チリン寒天培地上で、トリブチリンの加水分解にともな
うクリアゾーンを形成する菌株を分離することによって
行うことができる。
ーゼ遺伝子を保持する株をスクリーニングすることがで
きる。例えばKUGIMIYAらの方法（Kugimiya,S.,Biochim
Biophys.Res.Commun.,141,185(1986)）を用い、トリブ
チリン寒天培地上で、トリブチリンの加水分解にともな
うクリアゾーンを形成する菌株を分離することによって
行うことができる。
本発明のリパーゼ遺伝子は、上記のようにして得られた
形質転換体よりアルカリ−ＳＤＳ法等の公知の方法を用
いて組換えベクターを分離・精製することにより得るこ
とができる。
形質転換体よりアルカリ−ＳＤＳ法等の公知の方法を用
いて組換えベクターを分離・精製することにより得るこ
とができる。
次にリパーゼ遺伝子が存在する領域は、上記組換えベク
ターを各種制限酵素を用いてサブクローニングし、かか
る形質転換体のトリブチリン寒天培地でのクリアゾーン
形成能を調べることにより決定できる。さらにはリパー
ゼ遺伝子の塩基配列を公知の方法、例えばジデオキシ法
（Sanger,F.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,74,5463(197
7)）等を用いて決定することができる。
ターを各種制限酵素を用いてサブクローニングし、かか
る形質転換体のトリブチリン寒天培地でのクリアゾーン
形成能を調べることにより決定できる。さらにはリパー
ゼ遺伝子の塩基配列を公知の方法、例えばジデオキシ法
（Sanger,F.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,74,5463(197
7)）等を用いて決定することができる。
クローニングされたリパーゼ遺伝子が耐熱性リパーゼ
をコードする遺伝子であることの証明 シユードモナスＫＷＩ−56菌株が生産する耐熱性リパー
ゼが、明らかに上記方法によって得られた遺伝子に由来
するものかどうかを確認するためには、リパーゼ蛋白質
の一次構造と、リパーゼ遺伝子の塩基配列より決定され
るアミノ酸配列とが一致するかどうかを調べることによ
って確認できる。
をコードする遺伝子であることの証明 シユードモナスＫＷＩ−56菌株が生産する耐熱性リパー
ゼが、明らかに上記方法によって得られた遺伝子に由来
するものかどうかを確認するためには、リパーゼ蛋白質
の一次構造と、リパーゼ遺伝子の塩基配列より決定され
るアミノ酸配列とが一致するかどうかを調べることによ
って確認できる。
シユードモナスＫＷＩ−56菌株の培養液上清より精製し
て得られた耐熱性リパーゼのアミノ酸組成は、酸加水分
解したのち、アミノ酸分析計により測定することができ
る。また、部分的アミノ酸配列は、液相エドマン分解法
等によりＮ末端アミノ酸からカルボキシペプチダーゼ法
等によりＣ末端アミノ酸から決定することができる。
て得られた耐熱性リパーゼのアミノ酸組成は、酸加水分
解したのち、アミノ酸分析計により測定することができ
る。また、部分的アミノ酸配列は、液相エドマン分解法
等によりＮ末端アミノ酸からカルボキシペプチダーゼ法
等によりＣ末端アミノ酸から決定することができる。
組換え体による耐熱性リパーゼの生産 次に、本発明で得られたリパーゼ遺伝子を利用してリパ
ーゼを生産することは可能である。リパーゼ遺伝子を挿
入したプラスミドベクターを保持する形質転換体を、酵
素生産に最適の条件下で培養し、培養上清、あるいは破
砕菌体よりリパーゼを得ることができる。
ーゼを生産することは可能である。リパーゼ遺伝子を挿
入したプラスミドベクターを保持する形質転換体を、酵
素生産に最適の条件下で培養し、培養上清、あるいは破
砕菌体よりリパーゼを得ることができる。
以下、実施例を挙げて本発明を更に具体的に説明する
が、本発明はそれら実施例に限定されるものではない。
が、本発明はそれら実施例に限定されるものではない。
（実施例） シユードモナスＫＷＩ−56菌株の染色体ＤＮＡライブ
ラリーの作成。
ラリーの作成。
シユードモナスＫＷＩ−56株の一白金耳を200mlNB培地
（肉エキス１％、ペプトン１％、Nacl0.5％、pH7.0）に
植菌し30℃、24時間振とう培養した。菌体を集菌し、洗
浄した後、12mlの0.1Ｍトリス−塩酸緩衝液（pH8.0）、
10mMＥＤＴＡに懸濁し、１mgのリゾチームを加え37℃で
10分間放置する。次に600μの10％ＳＤＳを加え、37
℃30分間放置し溶菌をおこなった。さらに600μの３
ＭNaClを加えたのち、フェノール抽出を３回くり返し、
エーテル洗浄，エタノール沈殿をおこなった。得られた
沈殿物は乾燥後10mlのＳＳＣ溶液に溶解し、リボヌクレ
アーゼ0.5mgを加え37℃に30分間放置した。再度フェノ
ール処理を３回おこない、エーテル洗浄後、エタノール
沈殿でＤＮＡを回収し、乾燥後ＳＳＣ溶液に溶解した。
その結果、3.5mgの染色体ＤＮＡを得た。
（肉エキス１％、ペプトン１％、Nacl0.5％、pH7.0）に
植菌し30℃、24時間振とう培養した。菌体を集菌し、洗
浄した後、12mlの0.1Ｍトリス−塩酸緩衝液（pH8.0）、
10mMＥＤＴＡに懸濁し、１mgのリゾチームを加え37℃で
10分間放置する。次に600μの10％ＳＤＳを加え、37
℃30分間放置し溶菌をおこなった。さらに600μの３
ＭNaClを加えたのち、フェノール抽出を３回くり返し、
エーテル洗浄，エタノール沈殿をおこなった。得られた
沈殿物は乾燥後10mlのＳＳＣ溶液に溶解し、リボヌクレ
アーゼ0.5mgを加え37℃に30分間放置した。再度フェノ
ール処理を３回おこない、エーテル洗浄後、エタノール
沈殿でＤＮＡを回収し、乾燥後ＳＳＣ溶液に溶解した。
その結果、3.5mgの染色体ＤＮＡを得た。
染色体ＤＮＡは制限酵素Sau3AIを用い、得られるＤＮＡ
断片の鎖長が４〜10Kbの範囲となるような条件下で部分
分解した。
断片の鎖長が４〜10Kbの範囲となるような条件下で部分
分解した。
ベクターＤＮＡはプラスミドpUC19を用いた。pUC19は制
限酵素BamHI切断し、アルカリホスファターゼで処理し
た。
限酵素BamHI切断し、アルカリホスファターゼで処理し
た。
部分分解したシユードモナスＫＷＩ−56株染色体ＤＮＡ
とBamHI消化したプラスミドpUC19を２：１の割合で混合
したのち、宝酒造製ＤＮＡライゲーションキットを用い
て16℃、30分間の反応によって連結させた。
とBamHI消化したプラスミドpUC19を２：１の割合で混合
したのち、宝酒造製ＤＮＡライゲーションキットを用い
て16℃、30分間の反応によって連結させた。
大腸菌HB101株はHanahanの方法（Hanahan,D.,Gene,10,6
3(1980)）に基づき、カルシウム処理をほどこすことに
よって形質転換細胞として調製し、上記組み換えプラス
ミドを形質転換した。
3(1980)）に基づき、カルシウム処理をほどこすことに
よって形質転換細胞として調製し、上記組み換えプラス
ミドを形質転換した。
リパーゼ遺伝子を挿入したプラスミドの単離 上記、形質転換体を、50μｇ／mlアンピシリン、１％ト
リブチリンを含むＬＢ培地にプレーティングした。37℃
で48時間培養したのち、約16,400個の形質転換体より14
個のコロニー周辺にクリアゾーンを形成する株を得た。
リブチリンを含むＬＢ培地にプレーティングした。37℃
で48時間培養したのち、約16,400個の形質転換体より14
個のコロニー周辺にクリアゾーンを形成する株を得た。
14個のクリアゾーン形成株は50μｇ／mlのアンピシリン
を含む５mlＬＢ液体培地で37℃、24時間振とう培養し
た。培養液は菌体を破砕する目的で超音波処理し、その
リパーゼ活性を測定した。測定には回転撹拌法を用い
た。すなわち、反応容器５ml１／20Ｍリン酸緩衝液（pH
0.7）、１mlオリーブ油、１ml酵素液を加え、37℃、60
分間、スターラー回転500rpmで反応をおこなった。エタ
ノール20mlを加えて反応を停止したのち、生成した遊離
脂肪酸を1/20ＮのＫＯＨで滴定した。酵素活性は１分間
に１マイクロモルの脂肪酸を遊離せしめる酵素量を１ユ
ニット（１Ｕ）とした。
を含む５mlＬＢ液体培地で37℃、24時間振とう培養し
た。培養液は菌体を破砕する目的で超音波処理し、その
リパーゼ活性を測定した。測定には回転撹拌法を用い
た。すなわち、反応容器５ml１／20Ｍリン酸緩衝液（pH
0.7）、１mlオリーブ油、１ml酵素液を加え、37℃、60
分間、スターラー回転500rpmで反応をおこなった。エタ
ノール20mlを加えて反応を停止したのち、生成した遊離
脂肪酸を1/20ＮのＫＯＨで滴定した。酵素活性は１分間
に１マイクロモルの脂肪酸を遊離せしめる酵素量を１ユ
ニット（１Ｕ）とした。
その結果、14個のクリアゾーン形成株の中から、0.025
Ｕ／mlのリパーゼ活性を示す一株を単離した。本形質転
換体はＳＡ−３株と命名した。
Ｕ／mlのリパーゼ活性を示す一株を単離した。本形質転
換体はＳＡ−３株と命名した。
次にＳＡ−３株を50μｇ／mlのアンピシリンを含む５ml
ＬＢ液体培地で37℃、24時間振とう培養し、アルカリ−
ＳＤＳ法によりプラスミドを抽出した。本プラスミドは
11.5Kbの外来ＤＮＡ断片を保持していた。本プラスミド
はpLP6と命名した。
ＬＢ液体培地で37℃、24時間振とう培養し、アルカリ−
ＳＤＳ法によりプラスミドを抽出した。本プラスミドは
11.5Kbの外来ＤＮＡ断片を保持していた。本プラスミド
はpLP6と命名した。
ｐＬＰ６の解析 プラスミドpLP6を各種制限酵素を用いて断片化し、サブ
クローニングした。組み換えプラスミドを保持する大腸
菌HB101株のトリブチリン−ＬＢ平板上でのクリアゾー
ン形成を指標として、リパーゼ遺伝子がコードされる最
小ＤＮＡ断片を明らかにした。
クローニングした。組み換えプラスミドを保持する大腸
菌HB101株のトリブチリン−ＬＢ平板上でのクリアゾー
ン形成を指標として、リパーゼ遺伝子がコードされる最
小ＤＮＡ断片を明らかにした。
その結果2.1KbのBglII-BamHI断片をリパーゼ遺伝子がコ
ードされる最小ＤＮＡ断片とし、本断片をBamHIで消化
したプラスミドpUC19に結合した。得られたプラスミド
をpLP65と命名した。pLP65の制限酵素切断地図を第１図
に示す。
ードされる最小ＤＮＡ断片とし、本断片をBamHIで消化
したプラスミドpUC19に結合した。得られたプラスミド
をpLP65と命名した。pLP65の制限酵素切断地図を第１図
に示す。
リパーゼ遺伝子塩基配列の決定 塩基配列の決定に先立ちMessingらの方法（J.Messing,G
ene19,269(1982)）に従って、2.1KbのBalII-BamHI断片
をファージＭ13mp18、もしくはmp19にサブクローニング
し、宝酒造（株）製キロベース・デレーション・キット
を用い種々デレーション・ファージを作製した。これら
を鋳型としジデオキシ法により、2.1KbのBglII-BamHI断
片の全塩基配列を決定した。その結果、第２図に示すオ
ーブンリーディングフレームの存在を認めた。また、第
３図には第２図の塩基配列より決定されるアミノ酸配列
を示す。
ene19,269(1982)）に従って、2.1KbのBalII-BamHI断片
をファージＭ13mp18、もしくはmp19にサブクローニング
し、宝酒造（株）製キロベース・デレーション・キット
を用い種々デレーション・ファージを作製した。これら
を鋳型としジデオキシ法により、2.1KbのBglII-BamHI断
片の全塩基配列を決定した。その結果、第２図に示すオ
ーブンリーディングフレームの存在を認めた。また、第
３図には第２図の塩基配列より決定されるアミノ酸配列
を示す。
耐熱性リパーゼのアミノ酸組成、およびＮ末端、Ｃ末
端アミノ酸の決定 シユードモナスＫＷＩ−56菌株の培養液上清より精製し
て得られた耐熱性リパーゼ１mgを用い、液相エドマンド
分解法によりＮ末端アミノ酸よりアミノ酸配列を順次決
定した。その結果、リパーゼのＮ末端からのアミノ酸配
列は、アラニンーアスパラギン酸−グリシンであること
がわかった。この配列は第３図の45番目から47番目に存
在した。
端アミノ酸の決定 シユードモナスＫＷＩ−56菌株の培養液上清より精製し
て得られた耐熱性リパーゼ１mgを用い、液相エドマンド
分解法によりＮ末端アミノ酸よりアミノ酸配列を順次決
定した。その結果、リパーゼのＮ末端からのアミノ酸配
列は、アラニンーアスパラギン酸−グリシンであること
がわかった。この配列は第３図の45番目から47番目に存
在した。
次に、耐熱性リパーゼ２mgを約36μｇのカルボキシペプ
チターゼＡで処理し、経時的に遊離したアミノ酸を測定
した結果、著しいバリンの遊離がみられた。この結果よ
り、耐熱性リパーゼＣ末端のアミノ酸はバリンと決定さ
れた。また第３図に示すように、塩基配列から決定され
たアミノ酸配列Ｃ末端もバリンであった。
チターゼＡで処理し、経時的に遊離したアミノ酸を測定
した結果、著しいバリンの遊離がみられた。この結果よ
り、耐熱性リパーゼＣ末端のアミノ酸はバリンと決定さ
れた。また第３図に示すように、塩基配列から決定され
たアミノ酸配列Ｃ末端もバリンであった。
さらに、耐熱性リパーゼ蛋白のアミノ酸組成と塩基配列
から決定されたアミノ酸組成との比較をおこなった。耐
熱性リパーゼ50μｇを６Ｎ塩酸中、110℃、24時間処理
し、加水分解されたアミノ酸を測定した。システィン残
基は耐熱性リパーゼを過ギ酸酸化したのち、上記の要領
で測定した。トリプトファン残基は0.1％耐熱性リパー
ゼ水溶液の294.4nmと280.0nmの吸光度からチロシン残基
との比較をおこない算出した。また、塩基配列より決定
されたリパーゼのアミノ酸組成は、第３図45番目から36
4番目までのアミノ酸組成として算出した。その結果、
第１表に示されるように、耐熱性リパーゼのアミノ酸組
成と塩基配列より決定されたアミノ酸組成は大略一致し
た。
から決定されたアミノ酸組成との比較をおこなった。耐
熱性リパーゼ50μｇを６Ｎ塩酸中、110℃、24時間処理
し、加水分解されたアミノ酸を測定した。システィン残
基は耐熱性リパーゼを過ギ酸酸化したのち、上記の要領
で測定した。トリプトファン残基は0.1％耐熱性リパー
ゼ水溶液の294.4nmと280.0nmの吸光度からチロシン残基
との比較をおこない算出した。また、塩基配列より決定
されたリパーゼのアミノ酸組成は、第３図45番目から36
4番目までのアミノ酸組成として算出した。その結果、
第１表に示されるように、耐熱性リパーゼのアミノ酸組
成と塩基配列より決定されたアミノ酸組成は大略一致し
た。
以上の結果より、クローニングされたリパーゼ遺伝子
は、シュードモナスＫＷＩ−56菌株由来の耐熱性リパー
ゼをコードする遺伝子であることがわかった。
は、シュードモナスＫＷＩ−56菌株由来の耐熱性リパー
ゼをコードする遺伝子であることがわかった。
また、耐熱性リパーゼのＮ末端アミノ酸は第３図45番目
のアラニンであることから、リパーゼは翻訳後第３図44
番目のプロリンと45番目のアラニンの間で切断をうけ完
成される。
のアラニンであることから、リパーゼは翻訳後第３図44
番目のプロリンと45番目のアラニンの間で切断をうけ完
成される。
大腸菌による耐熱性リパーゼの生産 500ml坂口フラスコに50μｇ／mlアンピシリンを添加し
たＬＢ培地50mlを分注し、プラスミドpLP65を保持した
大腸菌HB101株前培養を１％の植菌量で接種し、37℃、2
4時間の振とう培養をおこなった。菌株を集菌し洗浄し
たのち、50mlの20mMトリス塩酸緩衝液（pH7.5）に懸濁
した。懸濁液は超音波処理によって菌体を破砕し、残存
菌体を取り除くため遠心分離をおこなった。遠心上清の
リパーゼ活性を前記の回転撹拌法によって測定したとこ
ろ、2.0Ｕ／mlのリパーゼ活性を得た。また、この遠心
上清を６０℃、１時間熱処理し残存リパーゼ活性測定し
たが、失活はみとめられなかった。
たＬＢ培地50mlを分注し、プラスミドpLP65を保持した
大腸菌HB101株前培養を１％の植菌量で接種し、37℃、2
4時間の振とう培養をおこなった。菌株を集菌し洗浄し
たのち、50mlの20mMトリス塩酸緩衝液（pH7.5）に懸濁
した。懸濁液は超音波処理によって菌体を破砕し、残存
菌体を取り除くため遠心分離をおこなった。遠心上清の
リパーゼ活性を前記の回転撹拌法によって測定したとこ
ろ、2.0Ｕ／mlのリパーゼ活性を得た。また、この遠心
上清を６０℃、１時間熱処理し残存リパーゼ活性測定し
たが、失活はみとめられなかった。
（発明の効果） 本発明の耐熱性リパーゼ遺伝子の発明によって大腸菌、
枯草菌、酵母等の微生物を用いての耐熱性リパーゼ生産
が可能となる。さらに、遺伝子に位置特異的変異導入法
等を採用し、耐アルカリ性、界面活性剤耐性等の新たな
能力を持ったリパーゼを生産させるための材料にもな
る。
枯草菌、酵母等の微生物を用いての耐熱性リパーゼ生産
が可能となる。さらに、遺伝子に位置特異的変異導入法
等を採用し、耐アルカリ性、界面活性剤耐性等の新たな
能力を持ったリパーゼを生産させるための材料にもな
る。
第１図はプラスミドpLP65の制限酵素切断地図を示す。
図中細線はプラスミドpUC19由来の遺伝子を、太線はシ
ユードモナスＫＷＩ−56菌株染色体ＤＮＡ由来の遺伝子
を示す。第２図は耐熱性リパーゼをコードする遺伝子の
オープンリーディングフレーム塩基配列を示す。第３図
は第２図のオープンリーディングフレームより決定され
るアミノ酸配列を示す。
図中細線はプラスミドpUC19由来の遺伝子を、太線はシ
ユードモナスＫＷＩ−56菌株染色体ＤＮＡ由来の遺伝子
を示す。第２図は耐熱性リパーゼをコードする遺伝子の
オープンリーディングフレーム塩基配列を示す。第３図
は第２図のオープンリーディングフレームより決定され
るアミノ酸配列を示す。
フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 (Ｃ１２Ｎ 9/20 Ｃ１２Ｒ 1:19）
Claims (3)
- 【請求項１】下記の塩基配列を有することを特徴とする
耐熱性リパーゼをコードする遺伝子。 - 【請求項２】請求項(1)記載の遺伝子を有するベクタ
ー。 - 【請求項３】請求項(2)記載のベクターを保持した宿主
を培養し、その培養液から耐熱性リパーゼを分離するこ
とを特徴とする耐熱性リパーゼの生産方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP18230189A JPH0659222B2 (ja) | 1989-07-14 | 1989-07-14 | 耐熱性リパーゼ遺伝子、該遺伝子を有するベクターおよび耐熱性リパーゼの生産方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP18230189A JPH0659222B2 (ja) | 1989-07-14 | 1989-07-14 | 耐熱性リパーゼ遺伝子、該遺伝子を有するベクターおよび耐熱性リパーゼの生産方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0347079A JPH0347079A (ja) | 1991-02-28 |
| JPH0659222B2 true JPH0659222B2 (ja) | 1994-08-10 |
Family
ID=16115896
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP18230189A Expired - Fee Related JPH0659222B2 (ja) | 1989-07-14 | 1989-07-14 | 耐熱性リパーゼ遺伝子、該遺伝子を有するベクターおよび耐熱性リパーゼの生産方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0659222B2 (ja) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH07135980A (ja) * | 1993-11-19 | 1995-05-30 | Chisso Corp | シュードモナス菌リパーゼ遺伝子 |
| JP3855329B2 (ja) * | 1996-11-28 | 2006-12-06 | 住友化学株式会社 | エステラーゼ遺伝子及びその利用 |
-
1989
- 1989-07-14 JP JP18230189A patent/JPH0659222B2/ja not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0347079A (ja) | 1991-02-28 |
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