JPH07509129A

JPH07509129A - シュードモナスシュードアルカリゲネス由来のリパーゼモジュレーター遺伝子のクローニング及び発現

Info

Publication number: JPH07509129A
Application number: JP6504176A
Authority: JP
Inventors: コックス　マリア　マチルド　ジョセフィーナ; ヘリッツェ　ヘイスベルト; クアックス　ウィルヘルムス　ヨハネス
Original assignee: ジェネンコー　インターナショナル　インコーポレイテッド
Priority date: 1992-07-23
Filing date: 1993-07-23
Publication date: 1995-10-12
Also published as: WO1994002617A3; WO1994002617A2; EP0652958A1

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】ノユードモナスンユードアル力すゲネス由来の伝子とリパーゼモジュレータ−遺伝子とを同種クラス■シュードモナス種中でクローン化及び発現することに関するものである。

発明の背景リパーゼは脂質を加水分解することができる酵素であり、油脂加工、清浄剤、診断試薬等の広範囲の適用に利用されている。

細胞外リパーゼ（トリアジルグリセロールアシルヒドロラーゼ、Ｅ、Ｃ，３，１゜１．３）は種々の微生物によって生産される。例えば、適切な微生物リパーゼは米国特許第３．９５０．２７７号に開示されており、これらのリパーゼはシュードモナス生物から得られていた。

特にツユ−トモナスリパーゼが所望の適用に有利な特徴を有することがわかった。従って、リパーゼを得るためにシュードモナス種がかなり用いられた。発酵におけるリパーゼ収量を高めるだめに、リパーゼ遺伝子が同種及び異種宿主株中にクローン化及び発現された。リパーゼ遺伝子クローニングが報告されたシュー３１８７７５号）である。

この研究で、異種宿主中でリパーゼ発現を得るのにリパーゼモジュレータ−遺伝子が必要であったことが判明した。

欧州特許第３３１３７６号には、シュードモナスセパシアから得られたリパーゼ遺伝子をＰ、セパシア中でクローン化及び発現することが記載されている。リパーゼ遺伝子の下流に位置した第２の遺伝子を欠失すると発現が得られないことが判明した。従って、この遺伝子はリパーゼ生産に不可欠であることが報告された。欧州特許第４６４９２２号には、リパーゼ遺伝子をリパーゼ特異的安定化／トランスロケーション機能を有することが報告されたタンパク質をコードする遺伝子と共にクローン化及び発現することが記載されている。これらの遺伝子はシュードモナスグルメから得られ、発現は好ましくは異種系内である。安定化タンパク質は欧州特許第３３１３７６号に記載されている遺伝子と著しく異なることが記載されているために、別の機能を有すると考えられる。国際出願第９１１００９０８号には、Ｐ、セパシアから得られたリパーゼ遺伝子及びリパーゼモジュレータ−遺伝子の異種宿主における発現が記載されている。

リパーゼモジュレータ−遺伝子はリパーゼ生産を得るために不可欠であることが報告されているが、広範囲に調査された代表的なりラスＩシュードモナス種：ンユードモナスフラギの場合そのような遺伝子は見出されていなかった。別のクラスＩシュードモナスリパーゼ遺伝子は欧州特許第３３４４６２号に記載された。

欧州特許第３３４４６２号には、シュードモナスシュードアルカリゲネス由来のＥ、コリ（ｃｏｌｉ）中でのクローニング及び発現が記載されている。異種リパーゼ生産の場合リパーゼモジュレータ−遺伝子は必須でなかったと結論することができる。

シュードモナス種の分類は、Ｐａｌ　１ｅｒｏｎｉらによって報告されたＤＮＡ −ｒＤＮＡ及びＤＮＡ−ＤＮＡハイブリッド形成研究に基づいている（Ｐａｌ　１ｅｒｏｎｉら１ｎＬＪ、５ｙｓｔ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、　２３：３３３　（＋９７３））。広範囲にわたる概要はＢｅｒｇｅｙ’ｓ　Ｍａｎｕａｌ　ｏｆＳｙｓＬｅ＋ｎａｔｉｃ　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ（Ｖｏｌ、　１．　Ｓｅｅ、　４１６０−１６１　（１９８４）、　Ｅｄｓ　Ｎ、Ｒ，jｒｉｅｇ、　Ｊ。

Ｇ、Ｈｏ１ｔ、　Ｗ口Ｉｉａｍｓ　＆　Ｗｉｌｋｉｎｓ、バルチモア／ロンドン）に見ることができる。この概要には、分類が形態学的データ及び１６ＳリポソームＲＮＡ相同性によって支持されていることも報告されている。

一般に、リパーゼモジュレータ−遺伝子は、クラス２リバーゼモジュレーター遺伝子との相同性に基づいてクラス■シュードモナス種に検出することができなかった。ＡｏｙａｍらＦＥＢＳ　ｔ、ｅｔｔ、　２４２３６−４０　（１９８８）には、Ｐ、フラギにおいてそのような遺伝子が存在しないことが報告されている。最近、シュードモナス種についてＤＮＡ相同性に基づいてＲＮＡ相同グループ ■に属するリパーゼモジュレータ−遺伝子が報告された（本出願の表３及び４に示されている）。しかしながら、この遺伝子はＥ、コリ中に用いられただけであり、そこでシュードモナスリパーゼ遺伝子発現に不可欠であることが示されたにすぎない。

発明の要約本発明は、クラスＩシュードモナス種から得られたリパーゼモジュレータ−遺伝子及び対応するタベ（り質を開示するものである。

本発明は、また、リパーゼをコードするＤＮＡ配列及びリパーゼモジュレータ− 遺伝子をコードする配列で形質転換されたシュードモナス株を開示するものである。これらの菌株は、好ましくはクラスＩシュードモナス株、更に好ましくはンユードモナスンユードアル力すゲネス株である。

本発明は、更に、その形質転換株を得る方法を開示するものである。

更に、大量のリパーゼを生産するためにこれらの菌株の使用を開示するものである。

本発明は、更に、ｐＪＲＤ２１５由来のベクター及びそれがシュードモナス中で分離的に安定であることを開示するものである。そのベクターを得る方法も開使用記号・Ｋｍ’　：Ｔｎ５のネオマイシン耐性をコードする遺伝子。

ｌｉｐ：Ｍｌリパーゼをコードする遺伝子。

更に、多数の制限部位が示されている。

ＩＥ１２：　ｐＪＲＤ２１５の配列（出典ＤａｖｉｓｏｎらＧｅｎｅ　５１２７５−２８０　（１９８７））。枠は直列反復を示す。この位置で組換えが起こり、プラスミドＰＩＡδを生じた（図３に示されている）。配列分析によって欠失の位置が決定された。

阻：　プラスミドＰＩＡδの制限地図。

使用記号：Ｋｍ’　：Ｔｎ５のネオマイシン耐性をコードする遺伝子。

ｌｉｐ：Ｍｌリパーゼをコードする遺伝子。

欠失プラスミドＰＩＡδがＰＩＡより小さい約９００ｂｐであるために、いくつかの制限部位も消失している。

界工二　プラスミドＰＩＢの構築及び制限地図。

プラスミドＩ）ＴＭＰｖ１８Ａは、欧州第３３４４６２号に記載されている。

ｌｉｐ：Ｍｌリパーゼをコードする遺伝子、矢印で示された場所。

Ｔｃ’　：テトラサイクリン耐性をコードする遺伝子。

プラスミドｐＬＡＦＲ３及び誘導体には、ＲＰ４のレプリコンが隠されている。

阻・　プラスミドＰ２４Ａδの制限地図。

ｌｉｐ：Ｍｌリパーゼをコードする遺伝子。

１ｉｍ：Ｍｌリパーゼモジュレータ−タンパク質をコードする遺伝子。

ＩＮ６・　プラスミドＰ２４Ｂの制限地図。

１ｉｍ：Ｍｌリパーゼモジュレータ−タンパク質をコードする遺伝子、矢印で示された場所。

Ｔｃ’　：テトラサイクリン耐性をコードする遺伝子。

回工：　プラスミドｐＢＲｉｎｔの構築。

ａｍｐ’　：アンビシリン耐性をコードする遺伝子。

ｔｅｔ’　：テトラサイクリン耐性をコードする遺伝子。

４見：　シュードモナスシュードアルカリゲネスＭ１の染色体における組込み遺伝子座の物理的地図。

１ｉｐ：Ｍｌリパーゼをコードする遺伝子、矢印で示された場所。

！　ｉｍ＋Ｍｌリパーゼモジュレータ−タンパク質をコードする遺伝子、矢印で示された場所。

ｔｅｔ’　：テトラサイクリン耐性をコードする遺伝子。

ｌｉｐ’−：不活性化Ｍ１リパーゼ遺伝子を示す。

４旦：　プラスミドｐＵＢ　ｉ　ｎ　ｔの構築。

プラスミドｐＢＨＡ−Ｍｌは欧州特許第３３４４６２号の図１５に記載されている。

Ｋｍ’　：ｐＵＢ＋１０のネオマイシン耐性をコードする遺伝子。

ｐＨ）ａｌｌ　ニブラスミドｐｕｉｎ＋ｏのＨｐａｌｌルミｌｌプロモーターバーゼコード配列（の一部）及びリパーゼモジュレータ−遺伝子コード配列の一部を含むシュードモナスシュードアルカリゲネスＭｌ由来の挿入部分。

図１０ニ　シュードモナスシュードアルカリゲネス染色体内の組込み遺伝子座の物理的地図。

１　ｉｍ：Ｍ１リパーゼモジュレータ−タンパク質をコードする遺伝子、矢印で示された場所。

ｎｅｏ’　：ｐＵＢｌｌｏのネオマイシン耐性をコードする遺伝子。

Ｊｉｍ−：不活性化ＭＩＩＪパーゼモジュレーター遺伝子を示す。

発明の詳細な説明本発明の組換えＤＮＡは、シュードモナス種クラスＩ株から得られた染色体ＤＮＡの消化により得られる。代表的なりラス！シュードモナス種は、シュートモ染色体ＤＮＡは、例えばＭａｎｉａｔｉｓらＭｏ１ｅｃｕｌａｒ　ｃｌｏｎｉｎｇ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　ＨａｒｂｏｒＰｒｅｓｓ、　＋９８２及び１９８９に開示されている標準法を用いて単離される。適切な消化物を作成し、その断片をベクター内でクローン化し、引き続きこれを用いてＥ、コリを形質転換する。選択はリパーゼ遺伝子の存在に基づいて行われ、適切なプローブが利用できる場合にはハイブリッド形成を用いて行うことができる。また、発現ベクターを用いることが可能である場合には、リパーゼをスクリーンするときにハロ形成のような適切な分析を用いて所望の遺伝子の存在を選択することが可能になる。更に、適切な抗体を利用する場合、タンパク質の免疫学的検出を用いて発現をモニターすることもできる。

本発明においては、代表的なりラスＩシュードモナスとしてシュードモナスシュードアル力ルゲネスからＤＮＡライブラリーを得た。リパーゼをコードする遺伝子は、２．０ｋｂＰｖｕ　Ｉ　Ｉ断片に局在した。手順は欧州特許第３３４４６２号に記載されている。簡単に言えば、シュードモナスシュードアルカリゲネスＭ−１（ＣＢＳ４７３．８５）の上清の脂肪分解酵素を精製した。ゲル電気泳動及びイモピロン転移膜上へのプロッティング後、Ｎ−末端配列をめた。この配列に基づいて適切なプローブを調製した。このプローブを、シュードモナスシュードアルカリゲネスから単離され制限酵素で消化された染色体ＤＮＡに対するサザンハイブリッド形成実験で用いた。サイズ分画後、断片をクローン化し、再びハイブリッド形成した。２．０ｋｂＰｖｕ　Ｉ　Ｉ断片がリパーゼ遺伝子を含むことが判明した。この断片の配列を決定し、推定オーブンリーディングフレームの少なくとも一部を含むことも判明した。

この２．Ｏｋｂ断片を発現ベクターでクローン化しかっこのベクターを野生型シュードモナスシュードアルカリゲネスに形質転換すると、得られた菌株はリパーゼ生産が１０−２０倍増大した。

２．４ｋｂＰｖｕＩ　Ｉ／Ｂｅ　Ｉ　Ｉ断片の下流に局在する完全オーブンリーディングフレームを含む新規な発現ベクターが得られ、リパーゼ遺伝子とオーブンリーディングフレームはこのベクター上のそれらの１つの自然オペロン配列に見られる。

Ｐ、シュードアルカリゲネスをこのベクターで形質転換すると、リパーゼ遺伝子だけを含む発現ベクターよりリパーゼ生産が３０倍増加した。これは、オーブンリーディングフレームがリパーゼ発現をモジュレータする遺伝子をコードすることを意味する。

オーブンリーディングフレームの配列を決定し既知のクラス２リパーゼモジュレータ−遺伝子と顕著な同一性を有しないことがわかった。その同一性はアミノ酸レベルで約３０％であった。オーブンリーディングフレームは、リパーゼ遺伝子自体との同一性も２５％を示した。

染色体内のこのモジュレータ−遺伝子を不活性化すると、リパーゼは生産されなかった。発現ベクター上の遺伝子をその宿主内でクローン化するとリパーゼ生産はもとに戻った。

従って、この遺伝子はクラス■型リパーゼモジュレーター遺伝子とみなすことができる。このモジュレータ−遺伝子を野生型シュードモナスシュードアルカリゲネス中でクローン化及び発現すると、リパーゼ生産について効果がなかった。

しかしながら、リパーゼ遺伝子の過剰コピーを細胞に導入すると、リパーゼ生産はモジュレータ−遺伝子の添加により顕著に増加した。これらの実験から、モジュレータ−遺伝子はリパーゼ遺伝子に比べてｌ：１比では必要としないことが明らかである。

本発明は、クラスｌリパーゼモジュレータ−遺伝子が同種宿主細胞においてリパーゼ生産性を増大することを初めて開示するものである。更に、この遺伝子がリパーゼ遺伝子に比べてｌ：１比では必要としないことも結論される。

本発明は、リパーゼを得る方法であって、クラスｌシュードモナス種から得られたリパーゼ遺伝子及びリパーゼモジュレータ−遺伝子を同種ンユードモナス種の菌株中でクローン化し、リパーゼを発現する条件下で組換え株を培養し、培養物からリパーゼを単離する、ことを特徴とする方法を開示するものである。

本発明の宿主細胞及びリパーゼモジュレータ−遺伝子源はクラスＩンユードモナス種、シュードモナスアルカリゲネス、シュードモナスシュードアルカリゲネス、ノユードモナススタツツエリ、シュードモナスアエルギノーザ及びシュードモナスメンドシナより選ばれることが好ましい。これらの菌株の変異株を用いることもできる。

最も好ましい実施態様においては、シュードモナスシュードアルカリゲネスが宿主株である。

リパーゼ遺伝子及びリパーゼモジュレータ−遺伝子は複製可能発現ベクター上でクローン化することができるが、宿主株の染色体内に挿入することもできる。

場合によっては、クローン化遺伝子を導入する前に染色体リパーゼ遺伝子及びリパーゼモジュレータ−遺伝子を不活性化することもできる。これは、突然変異りバーゼの生産が行われる場合特に重要である。野生型遺伝子が存在すると、生産物の著しい汚染を生じる。遺伝子のコピー数はベクターの選択によって調節することができる。

リパーゼ及びリパーゼモジュレータ−遺伝子は、シス及びトランスの両方で作用することが見出される。また、１つのオペロン内にあることも見出される。従って、遺伝子を１つのオペロン内でクローン化することが好ましい。また、遺伝子を２つの別個のベクター上でクローン化することも可能であり、そのことにより独立した調節が可能である。

本発明は、更に、シュードモナス中で分離的に安定であるプラスミドを得る方法を開示するものである。この方法は、抗生物質を存在させずに形質転換シュードモナス株を培地に繰返し希釈し、次いで抗生物質を存在させてインキュベートする、ことを含むものである。

本発明は、本明細書でｐｌＡδと呼ばれるｐＪＲＤ２１５の分離的に安定な誘導体を開示するものである。配列分析により、２つの直接反復の間に９００塩基対断片が欠失していたことが示される。

下記実施例は、本発明を具体的に説明するものであって限定するものではない。

鴎基質としてトリブチリン（メルク）又はヒマシ油を用いて寒天平板上でコロニーを生育した（ｌａｇｒｅｎｃｅらＮａｔｕｒｅ　１９１　（１９６７）　１２６４−１２６５に記載）。平板を３０℃で４８−７２時間インキュベートした。

透明ゾーンが現れ、脂肪分解活性を示す。酵素濃度の対数を強化ゾーンの直径に対してプロットすると、直線関係を認めることができる。

また、特定量の寒天培地を含む寒天スライス上でコロニーを生育した。生育後、全生育コロニーをトリブチリンを含む平板上に置いた。２４時間のインキュベーション期間後、強化ゾーンを認めることができる。このゾーンの直径は、コロニーによって生産された酵素レベルの対数と直線関係を示す。欧州特許第３３４４６２号、実施例ＩＯに記載されているように実験発酵槽中で生育された菌株の上清の活性をめると、後者が認められた。

本特許出願に記載される菌株及びプラスミドを表Ａに示す。

表Ａ（つづき）実施例シュードモナスシュードアルカリゲネスＭｌ由来リパーゼ遺伝子及びリパーゼモジュレータ−遺伝子のシュードモナスシュードアルカリゲネスＭｌ中でのクローニングシュードモナスシュードアルカリゲネスＭｌ由来リパーゼ遺伝子を欧州特許第３３４４６２号に記載されているようにＥ、コリ中でクローン化した。同種遺伝子発現を達成するために、ｐＴＭＰｖ１８Ａ断片を含む５ｓｔＩ／ＨｉｎｄＩＩＩリパーゼ遺伝子（欧州特許第３３４４６２号：図１１）をｐ　、Ｊ　ＲＤ　２１５　（ＤａｖｉｓｏｎらＧｅｎｅ　５１（１９８７）　２７５−２８０）　Ｓ　ｓ　ｔ　Ｉ及びＨｉｎｄｌＩＩ制限部位にクローン化した。ｐｉＡと呼ばれるこのプラスミドの制限部位を図１に示す。

抗生物質を存在させずに培地に繰返し希釈し、次いでインキュベートした後、このプラスミドＰＩＡの安定な誘導体を単離した。得られた誘導体の確認により、図２に示されるように約９００塩基対の欠失が生じたことがわかった。驚くべきことに、ＰＩＡδと名付けられたこのプラスミドは、プラスミドＰＩＡよりがなり安定であった。プラスミドＰＩＡδの制限地図は図３に示されている。改善された分離安定性を表１に示す。

抗生物質を存在させずに０．Ｄ、・ｌで２ＸＴＹ培養中で細胞を生育し、約１０ ”細胞を２ＸＴＹ培地に接種し、２４時間（＝１日）生育し、次いで培養物を１０００倍に希釈し、インキュベーションを２４時間に２日）等長くした。コロニーをまず抗生物質を存在させずに平板上３０℃で２４時間生育した。引き続きコロニーをｌｏｎｇハネオマイシンを含む平板にレプリカ平板を行った。

１）ＴＭＰｖ１８Ａ断片を含むＥｃｏＲＩ／Ｈｉｎｄｌ　Ｉ　Ｉリパーゼ遺伝子をｐＬＡＦＲ３（Ｓｔａｓｋａｗｉｃｚら、　Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、　１６９　（１９８７）　５７８９−５７９４）　Ｅ　ｃ　ｏ　ＲＩy びＨｉｎｄｌＩＩ制限部位にクローン化した。ＰＩＢと呼ばれるこのプラスミドの制限地図は図４に示されている。

欧州特許第３３４４６２号に記載されているように、シュードモナスシュードアルカリゲネスＭｌのＢｅ１ｌ断片をＥ、コリ中でクローン化した。これらのクローンの１つ、１．７ｋｂＢ　ｃ　Ｉ　Ｉ断片は３′領域のリパーゼ遺伝子と１．２ｋｂの下流配列を含むことがわかってきた。クラス夏シュードモナス種がリパーゼモジュレータ−遺伝子も含むかを調べるために、両断片（ｐＴＭＰｖｌ　８Ａの１．７ｋｂＢ　ｃ　Ｉ　１及び５ｓｔｌ／Ｈｉｎｄｌｌｌ　（２，０ｋｂ）リパーゼ遺伝子含有断片）を１つの発現カセット中で混合するとクローンｐＴＺ１ＢＢ２４を生じた（図は示されていない）。Ｐｖｕｌ／ＥｃｏＲＩ内部断片をシュードモナス発現カセットＰＩＡδと交換すると発現カセットＰ２４Ａ２δを生じた。このプラスミドの制限地図は、図５に示されている。全挿入部分のＤＮＡ配列は配列表に示されており、２つのオーブンリーディングフレームを含み、一方がリパーゼ遺伝子をコードし、もう一方は以後リパーゼモジュレータ−遺伝子と記載される推定リパーゼモジュレータ−遺伝子をコードする。

また、ｐＴＺ　１８　Ｂ２．４のＥｃｏＲＩ／Ｈｉｎｄｌ　ＩＩリパーゼ及びモジュレータ−遺伝子含有をｐＬＡＦＲ３ＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄｌ　Ｉ　Ｉ制限部位にクローン化すると、プラスミドＰ２４Ｂ２を生じた。このプラスミドの制限地図は図６に示されている。

エレクトロポレーションを用いて、発現カセットをすべてシュードモナスシュードアルカリゲネスＭｌ内に導入した（ｍｉｒｔｈらＭｏ１．　Ｇｅｎ、　Ｇｅｎ、　２１６　（１９８９）　１７５シユードモナスシユードアルカリゲネスのリパーゼ及びモジュレータ−両遺伝子の染色体不活性化シュードモナスシュードアルカリゲネス中で複製することができないが他の微生物中で複製することができる自己不活性化組込みプラスミドを用いて、シュードモナスシュードアルカリゲネスＭｌの染色体内のリパーゼ遺伝子及びリパーゼモジュレータ−遺伝子を不活性化した。

リパーゼ遺伝子の不活性化Ｅ、コリ中で複製することができる自己不活性化プラスミドｐＢＲ３２２（Ｂｏｌ　１ｖａｒらＧｅｎｅ　２　（１９７７）　９５−１１３）であって、リパーゼコード配列の３８Ｎ−末端及び４９Ｃ−末端アミノ酸が消失している（以後ｐＢＲｉｎｔと記載）プラスミド上でリパーゼ遺伝子のＰｖｕｌ−Ｐｓｔｌ内部断片をクローン化した。

ｐＢＲ３２２及びＩ）ＴＭＰｖｌ　８Ａ　（欧州特許第３３４４６２号）由来のｐＢＲｉｎｔの構築についての詳細な情報は、図７に示されている。シュードモナスシュードアルカリゲネスＭＩＲ−Ｍ”（制限マイナス、修飾プラス）をｐＢＲｉ　ｎ　ｔで形質転換した。テトラサイクリン耐性（５ｍｇ／ｌ）コロニーを選択した。これらはすべてリパーゼが負であり、ヒマシ油（０，５％）寒天平板上に清澄化ゾーンがなくトリブチリン（２％）寒天平板上に清澄化ゾーンの減少を示した。シュードモナスンユードアル力すゲネスＭＩＲ−Ｍ＋自体は、両方の種類の寒天平板上で透明なハロを生じる。２つの独立したリパーゼ負の電気さく孔のサザン分析により、単一の交差を介して組込みが作られることがわかった。

この事象の結果として、ツユ−トモナスシュードアルカリゲネスの染色体の位置は図８に示されている変化を受ける。

リパーゼモジュレータ−遺伝子の不活性化はとんどすべてのバシラス（Ｂａｃｉ　ｆｌｕｓ）種において複製することができる自己不活性化プラスミドｐ　ＵＢ　Ｉ　１０　（ＧｒｙｃｚａｎらＢａｃｔｅｒｉｏｌ、　１３４　（１９７８）　３１８−３２９）であって、リパーゼモジュレータ−コード配列の９４Ｎ末端及び１０７Ｃ末端アミノ酸か消失しているプラスミド（以後ｐＵＢ　ｉ　ｎ　ｔと記載される）上でリパーゼモジュレータ−遺伝子のＥｃｏＲＶ−Ｐｖｕ　Ｉ　Ｉ内部断片をクローン化した。

ｐＢＨＡ−Ｍ＋　（欧州特許第３３４４６２号に記載）由来のｐＵＢ　ｉ　ｎ　ｔの構築についての詳細な情報は図９に示されている。

ンユードモナスシュードアル力すゲネスＭＩＲ−Ｍ“をｐＵＢ　ｉ　ｎ　ｔで形質転換した。ネオマイシン（１０ｍｇ／Ｉ）コロニーを選択した。これらはリパーゼが負であり、ヒマシ油（０，５％）寒天平板上に清澄化ゾーンがなくトリブチリン（２％）寒天平板上に清澄化ゾーンの減少を示した。３つの独立したリパーゼ負の電気さく孔のサザン分析により、単一の交差を介して組込みが作られることがわかった。この事象の結果として、シュードモナスシュードアルカリゲネスの染色体の位置は図１Ｏに示されている変化を受ける。

相補性低コピー数プラスミド、完全なリパーゼ遺伝子だけを含むＰＩＢ及び完全なリパーゼ遺伝子及びモジュレータ−遺伝子の両方を含むＰ２４Ｂ２並びに高コピー数プラスミド、完全なリパーゼ遺伝子だけを含むＰＩＡδ及び完全なリパーゼ及びモジュレータ−遺伝子の両方を含むＰ２４Ａ２δを用いて、相補性実験を行った。相補性実験の結果は、表２に示されている。これらの実験から、リパーゼ及びリパーゼモジュレータ−遺伝子の両方がリパーゼ遺伝子及びリパーゼモジュレータ−遺伝子両不活性化株のリパーゼ活性の全相補性に無傷であることを必要とすることが結論される。

実施例３形質転換シュードモナスシュードアルカリゲネスＭｌのリパーゼ発現リパーゼ遺伝子を異種宿主微生物（欧州特許第３３４４６２号に記載されている）において発現した。しかしながら、リパーゼ発現レベルは、シュードモナスシュードアルカリゲネスＭｌで得られたレベルに比べて非常に低かった。そのために、同種遺伝子発現が更に開発された。

トリブチリン及び／又はヒマシ油を含む寒天平板上及び０ｄｅｒａらＪ、　Ｆｅｒｍｅ吐Ｔｅｃｈｎｏ１．６４　（１９８６）　３６３−３７１に記載されているオリーブ油基礎培地中で発酵後の両方で、形質転換細胞のリパーゼ生産を試験した。結果を表２に示す。

リパーゼ遺伝子発現カセットの多コピーの導入によって達成された改善は、親株シュードモナスシュードアルカリゲネスＭｌによって生産されたリパーゼレベルと比べて２０倍である。

しかしながら、リパーゼモジュレータ−遺伝子を発現カセットにおいて同様にクローン化することにより発現レベルを更に改善することができる。

これらのデータから、リパーゼモジュレータ−遺伝子が１：Ｉ比では必要でないがリパーゼ発現が２０倍以上に増大すると限定因子となると結論される。

リパーゼモジュレータ−遺伝子はリパーゼ生産に必要であるが、遺伝子の染色体コピーは２０００％増加を与えるのに十分である。この点でのみ追加モジュレーション遺伝子コピーを導入すると、リパーゼ高生産がもたらされる。

データがシャベロン様機能を示している以外、この遺伝子の正確な機能が何であるかはまだ不明であるが、極めて低いレベルの遺伝子産物だけで多量のリパーゼの分泌に十分であると考えられる。

表２本　これらの菌株の成長速度はおそらく多面的突然変異のために低下する。

実施例４リパーゼ遺伝子及びリパーゼモジュレータ−遺伝子と他のリパーゼ及びリパーゼモジュレータ−遺伝子との相同性の比較リパーゼ及びリパーゼモジュレータ−遺伝子配列をコンピュータ分析を用いて比較した。未確認リパーゼ遺伝子を用いて相同性をめるために、欧州特許第３３４４６２号に記載されている分子酵素スクリーニング分析を用いた。

これらの実験から、Ｐ、シュードアルカリゲネスと同じＲＮＡ相同グループに属するシュードモナス種はかなり強い相同を示すが、別のＲＮＡ相同グループ（Ｐａｌｌｅｒｏｎｉ、　１９７３）及び他の細菌種に属するシュードモナス種はハイブリッド形成を全く示さないことが結論された。両方の方法の間の相関は十分に確立されており、未確認リパーゼ遺伝子を用いて相同性をめることを可能にする。

リパーゼ遺伝子の配列の比較シュードモナスリパーゼ遺伝子の配列が発表されている。シュードモナスンユードアルカリゲネスＭｌと比較したこれらの配列のコンピュータ分析により、Ｐ。

アエルギノーザ（欧州特許第３３４４６２号）の場合同一性８１％、またシュードモナス種（ｌｈａｒａらＪ、　Ｒｉｏｔ、　Ｃｈｅｍ、　２６６　（１９９１）　１８１３５−１８１４０）の場合８１％、Ｐ、フラギ（Ａｏｌｙａｍａら、ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔ、２４２　（１９８８）　３６−４０．　Ｋｕｇｉｍｉｙａら、Ｂｉｏｃｈｅｕ　Ｂｉｏｐｈｙ刀B Ｒｅｓ、　Ｃｏｍｍｕｎ、　１４１　（１９８６）　１８５−１９０）、３種はすべておそら＜ＲＮＡ相同グループＩに属する、Ｐ、セパシア（Ｊｏｒｇｅｎｓｅｎら、　Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、　１７３　（＋９９１）　５５９−５６７）の場合５２％及びＰ、　クルｊ　（ＰＣＴ９１１０００１０）　（Ｄ場合５９％、共ｉ：　ＲＮ　Ａ相同グループＩＩに属しく表１１１）　Ｓ、ハイカス（Ｓ、　ｈｙｉｃｕｓＸＧｏｅｔｚら、　ＮＡＲ１３（１９８５）　５８９５−５９０６）とは全く相同でない、が示される。

これらのデータはハイブリッド形成がＰ、フラギ、Ｐ、セパシア（示されていない）、Ｐ、グルメ（又はＰ、グラジオリ（Ｐ、ｇｌａｄｉｏｌｉ））　、Ｐ、ハイカスＤＮＡに見られない欧州特許第３３４４６２号に記載されているハイブリッド形成データと一致しているが、適切なハイブリッド形成シグナルはＰ、アエルギノーザＤＮＡから得られる。結果を表３に示す。

リパーゼモジュレータ−遺伝子の配列比較リパーゼモジュレータ−遺伝子は、ＲＮＡ相同グループＩＩに属するシュードモナス種に記載されているだけであった。Ｐ、セパシアのリパーゼモジュレータ−遺伝子（欧州特許第３３１３７６号及びＪｏｒｇｅｎｓｅｎら、　Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、　１７３　（１９９１）　５５９−５６７の両方）及びＰ、グルメのリパーゼモジュレータ−遺伝子（ＰＣＴ　９１１００９１０）が記載された。最近、配列相同性に基づいてシュードモナスＲＮＡ相同グループＩに属するシュードモナス種のリパーゼモジュレータ−遺伝子配列が記載された（ｌｈａｒａら、　Ｊ、　Ｆｅｒｎ、　Ｂｉｏｅｎｇ、　７３　（１９９２）　３３７−３４２）。結果を表４に示す。

表３種々のシュードモナスリパーゼの同一性％。表の下の部分は核酸配列の比較を示す。上の部分はアミノ酸配列比較を示す。

表３種々のシュードモナスリパーゼモジュレータ−遺伝子の同一性％。表の下の部分は核酸配列の比較を示す。上の部分はアミノ酸配列比較を示す。ｎｄ＝＞これらの種の場合リパーゼモジュレータ−遺伝子なしを記載した。

これらのデータから、リパーゼモジュレータ−遺伝子がリパーゼ遺伝子自体より保存されないと考えられることが結論される。

見出される相同性の程度は一致することができることさえも確立した。Ｐ、シュードアルカリゲネスＭｌのリパーゼ配列をＰ、シュードアルカリゲネスＭｌのリパーゼモジュレータ−配列に比べるとアミノ酸相同性２５％が見出され、種々のＲＮＡ相同グループに属するリパーゼモジュレータ−遺伝子間の実測配列相同性はかなり低いことを示した。

更に、　１ｈａｒａらは最初に異種微生物におけるＲＮＡ相同グループ■由来のシュードモナス種の場合モジュレータ−遺伝子の必要を記載しているようである。Ｐ。

フラギ及びＰ、シュードアルカリゲネスＭｌの両方の場合、Ｅ、コリにおけるリパーゼ発現はそのようなモジュレータ−遺伝子の存在に依存するように考えられていなかった。

非常に低いレベルの相同性に基づいて、匹敵する機能を有する遺伝子を扱うことはむしろ驚くべきことである。

Ｐ、シュードアルカリゲネスＭｌ由来のモジュレータ−遺伝子はＥ、コリにおける遺伝子発現に必要であると考えられないが、２０倍以上でのＰ、シュードアルカリゲネスＭｌにおけるリパーゼ遺伝子発現のレベルには必要である。このことは、以前には認められていなかった。

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ＥｃｏＲＴＦＩＧＵＲＥ　６Ｆ工ＧＵＲＥ　８ｐＢＨＭｌＦＩＧＬＩＲＥ　９　Ｂ１（ＧＵＲＥ　１０フロントページの続き（７２）発明者　ファックス　ウィルへルムス　ヨハネスオランダ国　エフエル −２２５３ヴエーベーフオールシヨツテン　ヤン　ファン　ガーレンラーン　８

Claims

【特許請求の範囲】

１．リパーゼを得る方法であって、クラスＩシュードモナス種から得られたリパーゼ遺伝子とリパーゼモジュレーター遺伝子を同種シュードモナス種中でクローン化し、リパーゼ遺伝子を発現する条件下で組換え株を培養し、培養物からリパーゼを単離する、ことを特徴とする方法。
２．クラスＩシュードモナス種がシュードモナスアルカリゲネス、シュードモナスシュードアルカリゲネス、シュードモナススタッツェリ、シュードモナスアエルギノーザ及びシュードモナスメンドシナ又はその変異株からなる群より選ばれる請求項１記載の方法。
３．クラスＩシュードモナス種がシュードモナスシュードアルカリゲネス又はその変異株である請求項１記載の方法。
４．クラスＩシュードモナス種宿主株がリパーゼ欠失及び／又はリパーゼモジュレーター欠失である請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
５．クラスＩシュードモナス株のリパーゼ生産を高める方法であって、クラスＩリパーゼ及びリパーゼモジュレーター両遺伝子を宿主細胞中でクローン化及び発現することを特徴とする方法。
６．相同株から得られたリパーゼ及びリパーゼモジュレーター遺伝子で形質転換したクラスＩシュードモナス株。
７．リパーゼ遺伝子を含むベクターで形質転換したシュードモナス株であって、生産されたリパーゼ量が非形質転換株より少なくとも１５倍大きいことを特徴とするシュードモナス株。
８．リパーゼモジュレーター遺伝子で更に形質転換される請求項７記載のシュードモナス株。
９．クラスＩシュードモナスより選ばれ、同種リパーゼ及び／又はリパーゼモジュレーター遺伝子で形質転換される請求項７又は８記載のシュードモナス株。
１０．シュードモナス中で分離的に安定なｐＪＲＤ２１５の誘導体。
１１．ＬｐＪＲＤ２１５の分離的に安定な誘導体を得る方法であって、抗生物質を存在させずに形質転換シュードモナス株を培地に繰返し希釈し、次いで抗生物質を存在させてインキュベートする、ことを特徴とする方法。