CN1685037A - 新的荧光假单胞菌突变菌株及其变体,它们的生产方法以及在藻酸盐生产中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明描述了荧光假单胞菌(Pseudomonasfluroscens)突变菌株的生物纯的细菌培养物，其产生大量藻酸盐。所述藻酸盐可包含确定含量的甘露糖醛酸盐和古洛糖醛酸盐残基，在藻酸盐中可能存在确定水平的乙酰基，以及所需分子量的藻酸盐。同时，也描述了调节藻酸盐生产的高产量突变体。本发明还提供了生产新的荧光假单胞菌突变菌株及其变体的方法，并将所得菌株应用于藻酸盐的生产。

Description

新的荧光假单胞菌突变菌株及其变体，它们的生产方法 以及在藻酸盐生产中的应用
发明领域
本发明涉及新的荧光假单胞菌突变菌株及其变体，其能生产大量藻酸盐。所述藻酸盐不仅可大量生产，而且还可以具有确定含量的甘露糖醛酸盐(mannuronate)和古洛糖醛酸盐(guluronate)残基，在藻酸盐中可能存在确定水平的乙酰基，以及所需分子量的藻酸盐。同时，也描述了调节藻酸盐生产的高产量突变体。本发明还提供了生产新的荧光假单胞菌突变菌株及其变体的方法，以及所得菌株在藻酸盐生产中的应用。
现有技术的描述
已知有数种微生物能够生产藻酸盐，研究最多的细菌是绿脓杆菌(Pseudomonasaeruginosa)。然而，当将其生产的藻酸盐应用于营养物或药物时，其应用受到了限制，因为它与哺乳动物或人的初级和次级感染有关。其它的菌种可能是安全的来源，但一般不能生产大量藻酸盐或具有足够高分子量的藻酸盐，由于该原因不能被应用。已知非致病的假单胞菌种类如恶臭假单胞菌(P.putida)、门多萨假单胞菌(P.mendocina)以及荧光假单胞菌(P.fluorescens)产生相似于乙酰化藻酸盐的细胞外聚多糖，Govan J.R.W.等，J.of General Microbiology(1981)，125，p.217-220。并且，Conti，E.等，Microbiology(1994)，140，p.1125-1132描述了从荧光假单胞菌和恶臭假单胞菌生产藻酸盐。然而，还不知道这些菌株中的任何稳定的藻酸盐过量生产者。
Kelco Biospecialties Ltd.的美国专利No.4,490,467描述了应用新的门多萨假单胞菌(Pseudomonas Mendocina)菌株生产的多糖产物。该菌株生产高产量的所需多糖，并且在连续发酵中相对稳定。所述菌株通过将一种野生型培养的门多萨假单胞菌与羧苄青霉素接触来生产，并采用诱变剂将选择的抗性黏液型克隆诱变。最稳定的并因而最优选的菌株以NCIB 11687保藏。高浓度的藻酸盐浓度，大约20g/l，在采用最低限葡萄糖培养基的氮限制的连续培养中获得。在培养中存在一种藻酸盐裂解酶活性，并产生低分子量、低粘性聚合物，其流变性相似于印刷级藻酸盐。裂解酶的降解可采用在培养基中加入蛋白水解酶来补救，Hacking A.J.等，(1983)J.Gen.Microbiol.，129，p.3473-3480。连续培养十代后出现了非粘液型变体，SenghaS.S.等，(1989)J.Gen.Microbiol.，135，p.795-804，p.799，第二段。Chitnis等(1990)J.Bacteriol.，135，p.2894-2900报导了一种机会病原体绿脓杆菌(P.aeruginosa)的差向异构酶阴性突变体。黏液型绿脓杆菌FDRl是化学诱变的突变体，其不能将古洛糖醛酸盐(G)-残基引入到藻酸盐中，被独立地分离。应用G-特异的藻酸盐裂解酶和1H-核磁共振分析显示，G-残基不存在于由这些突变体分泌的藻酸盐中。Goldberg和Ohman，1987，J.Bacteriol.，169，p.1593-1602在摇瓶中用FRDl生产出高达1.7g/l的藻酸盐。如常，对于自发的藻酸盐-产生者，非黏液型回复突变频繁出现(Flynn和Ohman，1988，J.Bacteriol.，170，p.1452-1460)。
因此，市场上仍然需要生产可靠的藻酸盐的合适的来源。特别地，需要稳定的来源以生产大量高质量藻酸盐，所述藻酸盐具有规定的结构以及所学户的分子量；并且尤其需要一种可用于生产大量具有生物活性的藻酸盐的来源。此外，也需要生产纯的甘露糖醛酸，其可进行体外差向异构作用，以获得具有预定古洛糖醛酸盐残基(G)-含量的藻酸盐。
发明概述
本发明提供了新的荧光假单胞菌突变菌株，它是稳定的并产生大量藻酸盐。本发明的一些实施方案是提供其变体，所述变体能产生就甘露糖醛酸盐和古洛糖醛酸盐残基含量而言具有规定结构的藻酸盐，可能存在确定水平的O-乙酰基和所需分子量的藻酸盐分子。同时，还描述了具有经过调节的藻酸盐生产能力的高产量突变体以及它们的生产方法。本发明的其它方面是：生产新的荧光假单胞菌突变菌株(包括其突变体)的方法，以及所得突变体在生产藻酸盐，尤其是生产藻酸盐的培养基或大规模发酵罐，更特别是生产生物活性藻酸盐或纯甘露糖醛酸(mannuronan)中的应用。所得藻酸盐可用于不同的食品和如营养物、动物饲料、化妆品和药物等工业生产，它们也能构成中间产物，适于由甘露糖醛酸-C5-差向异构酶(如由美国专利No.5,939,289描述的差向异构酶)形成进一步的改变。
发明详述
本发明提供了至少一种荧光假单胞菌突变菌株的生物纯的细菌培养物，其中，所述菌株生产大量藻酸盐。在本发明的第一个方面，所述菌株每升培养基可生产至少10g藻酸盐。在优选的实施方案中，至少一种荧光假单胞菌突变菌株的生物纯的细菌培养物每升培养基每40-55g碳源可生产至少10g藻酸盐；更优选每升培养基每50-55g碳源可生产至少10g藻酸盐；最优选至少一种荧光假单胞菌突变菌株的生物纯的细菌培养物每升培养基每40g碳源可生产至少10g藻酸盐。
本发明涉及的荧光假单胞菌的纯的突变菌株及其变体的例子有以下突变菌株：Pf201、Pf2012、Pf2013、Pf20118、Pf20137、Pf20118algIJΔ、Pf20118algFΔ、Pf20118AlgLH203R和Pf201MC。在一些实施方案中，本发明涉及至少一种荧光假单胞菌突变菌株的生物纯的细菌培养物，其中，生产具有Pf201及其变体的藻酸盐生产特性的菌株保留了所述特性。所述“藻酸盐生产特性”可以是以下的一种或多种：以每升培养基产生的藻酸盐克数(g/l)和每克碳源产生的藻酸盐克数(g/g碳源)的方式生产，藻酸盐生产的平均分子量、乙酰化程度和G-含量。
在本发明的第二方面包含一种荧光假单胞菌的纯的突变菌株，其中，所述突变体能够生产大量藻酸盐，仅由甘露糖醛酸盐残基组成。优选的变体可选自以下变体菌株：Pf2012、Pf2013、Pf20118和Pf20137。
在本发明的第三方面包含一种荧光假单胞菌的纯的突变菌株，其中，所述突变体能够生产大量藻酸盐，具有规定的古洛糖醛酸盐残基(G)-含量，该含量在0和30之间。该实施方案可通过本发明的方法生产，通过用突变基因交换野生型algG基因，或改变algG基因，使之编码具有比野生型酶更低的特异活性的甘露糖醛酸C-5-差向异构酶。
在本发明的第四方面，荧光假单胞菌的纯的突变菌株能够生产大量O-乙酰基数目未减少或减少的藻酸盐。该实施方案可通过删除部分或全部的algI、algJ和/或algF基因来生产。突变变体菌株Pf20118algIJΔ和Pf20118algFΔ能够生产大量O-乙酰基数目未减少或减少的藻酸盐，代表本发明的这个方面的优选实施方案。
在本发明的第五方面，荧光假单胞菌的纯的突变菌株能够生产大量具有所需分子量的藻酸盐，藻酸盐的分子量优选在50,000和3,000,000道尔顿之间。该实施方案可通过用具有比野生型裂解酶更低的特异活性的编码藻酸盐裂解酶的突变基因交换野生型algL。纯的突变变体菌株Pf20118AlgLH203R代表所述突变体的优选的实施方案，其能够生产大量具有所需分子量的藻酸盐。
在本发明的第六方面，荧光假单胞菌的纯的突变菌株能够生产大量藻酸盐，包含一种藻酸盐生物合成操纵子，其由一种与天然存在的启动子不同的诱导型启动子调节，以及包含任选地一种或多种效应基因。所述诱导型启动子优选Pm启动子，效应基因是xylS。在一种优选的实施方案中，所述突变菌株是Pf201MC。
在本发明的第七方面，提供了一种生产本发明的新的荧光假单胞菌突变菌株的方法，其中：
(a)将荧光假单胞菌野生菌株与一种诱变剂接触，和
(b)使步骤(a)中处理的细菌在一种或多种抗生素存在下生长，和
(c)通过选择分离抗生素抗性的黏液型突变体；和
(d)确定步骤(c)分离的黏液型突变体的藻酸盐生产特性。
步骤(a)的诱变剂优选亚硝基胍，并且在步骤(b)中应用的抗生素是β-内酰胺和/或氨基糖苷抗生素，优选所述抗生素是羧苄青霉素。抗生素可以800-1000μg/ml培养基的范围存在，更优选的是900μg/ml培养基的量。
在本发明的另一个方面，提供了一种生产荧光假单胞菌突变菌株的方法，所述荧光假单胞菌突变菌株能够生产大量藻酸盐，该藻酸盐的生物合成操纵子由一种与天然存在的启动子不同的诱导型启动子调节，以及任选地一种或多种效应基因。其中：
(i)通过同源重组，荧光假单胞菌野生菌株的藻酸盐生物合成操纵子被一种诱导型启动子更换，和
(ii)通过同源重组、转位子诱变或通过质粒的方式，将任选的效应基因引入到(i)的细菌中，和
(iii)使突变体生长，然后通过选择进行分离，和
(iv)确定(iii)中分离的突变体的藻酸盐生产特性。
在本发明的方法的一种实施方案中，诱导型启动子是来自P.putida Tol-质粒的Pm，或变异的Pm启动子，如在实施例9中所列举的。
在本发明的其它方面，包含一种生产权利要求8所述荧光假单胞菌突变菌株的方法，其中：
(a)将编码C-5差向异构酶的野生型algG基因克隆入一种质粒或小型转位子，并通过化学诱变或通过PCR进行诱变，
(b)构建一种荧光假单胞菌的藻酸盐生产菌株的衍生物，其缺少algG基因(ΔalgG-菌株)，和
(c)步骤(a)的诱变的algG的文库被转移到荧光假单胞菌的ΔalgG-菌株，并鉴定和测定所述包含质粒或转位子的菌株的藻酸盐生产和差向异构酶活性，和
(d)通过步骤(c)的测定，鉴定出包含质粒或转位子的菌株，其包含编码差向异构酶的突变algG，可提供古洛糖醛酸盐残基含量在0和30％之间的藻酸盐，和
(e)将突变的algG基因克隆入基因-置换载体，和
(f)然后将步骤(e)的基因置换载体转移到荧光假单胞菌的藻酸盐生产菌株，以用突变的algG基因置换其algG基因，并使它能够表达突变基因。
本发明的另一个方面涉及进一步的生产权利要求8的荧光假单胞菌突变菌株的方法，其中：
a)通过位点-特异的诱变，在基因水平上将一种或多种通过诱变和其后的筛选鉴定为对于差向异构作用重要的氨基酸和与突变型和野生型AlgG-蛋白中产生的氨基酸都不同的氨基酸交换，和
b)将突变基因克隆入基因置换载体，并将该载体转移入荧光假单胞菌的生产藻酸盐的菌株中，其取代了野生型algG基因，并能够被表达。
在本发明的其它方面，如这里所述，提供了至少一种荧光假单胞菌突变菌株的生物纯的细菌培养物的应用，以及应用生产的藻酸盐制备食品或工业产品，如药物、化妆品、动物饲料或营养品，或作为一种用于体外C-5-差向异构作用的中间产物。
本发明的突变菌株：Pf201、Pf2012、Pf2013、Pf20118、Pf20137、Pf20118algFΔ、Pf20118algIJΔ、Pf20118AlgLH203R和Pf201MC已被保藏在国立工业和海洋微生物保藏有限公司(NCIMB)中，日期为2002年7月16日，保藏编号分别如下：41137、41138、41139、41140、41141、41142、41143、41144和41145。所述保藏根据布达佩斯条约执行。
定义
本发明的新的突变菌株及其变体，生产大量藻酸盐，这里使用的“大量”是指每升至少10g藻酸盐。每升培养基10g藻酸盐的量优选获自每升培养基40-55g碳源，更优选获自每升培养基50-55g碳源，或最优选获自每升培养基40g碳源。藻酸盐产量可达到35g藻酸盐每升，但是更常见的是达到所用碳源重量的约20％-50％的量。
合适的“碳源”可选自但不限于：单糖、二糖、寡糖、多糖、乙醇、有机酸，比如果糖、葡萄糖、半乳糖、蔗糖、乳糖、甘油、淀粉、乳清、糖蜜、糖浆或乳酸(乳酸盐)，也包括其它如标准的教科书中阐述的碳源，如可使用《系统细菌学Bergeys手册》(Bergeys Manual of Systematic Bacteriology)，编者为Noel R.和JohnG.Holt，1984，巴尔的摩，美国。应理解，碳源不必被转化成它们相应的磷酸丙糖，在它们可被突变菌株利用于藻酸盐生产之前通过Entner-Doudoroff途径利用通常将产生最高的产量，Banerjee等，J.Bacteriol.，1983，p.238-245。优选通过本发明的荧光假单胞菌突变菌株生产多于每升培养基10g藻酸盐，在如果40g果糖或甘油每升培养基被用作碳源的前提下获得。大规模的藻酸盐生产可在任何本领域熟练人员已知的合适的工具中进行，但优选在发酵罐中进行。发酵是分批的、馈料批次的或连续的，可能伴随着加入碳源和其它合适的成分。发酵的温度在5-35℃的区间上。该区间的低位可在某些情况下被选择，但优选的发酵在20℃到30℃的温度下进行。
培养基、氧气、pH、发酵时间、搅拌和其它可能的发酵条件的选择是本领域的常规知识，应理解，大量两种或多种条件的组合可产生同样高的藻酸盐产量，本发明不限于这些条件的特异组合。
在本发明中，突变菌株及其变体是“稳定的”，就是说，当它们生长超过60代时，它们不会回复到不能生产藻酸盐的菌株。突变体生长在摇瓶中的PIA-培养基中，在如“材料和方法”中阐述的标准培养条件下培养，除了每24个小时将培养基用新鲜的PIA-培养基取代之外(连续培养)。
这里的“突变菌株”包含荧光假单胞菌Pf201的突变菌株，以及变体突变菌株，它们都能大量生产藻酸盐。在优选的实施方案中，“突变菌株”是指荧光假单胞菌Pf201的突变菌株，它们都能生产大量藻酸盐。变体可以是Pf201突变菌株的进一步诱变和/或进一步遗传改造的结果，或是野生型荧光假单胞菌菌株的遗传改造或诱变的结果。所述变体将生产大量具有某种规定的结构的藻酸盐。同样，包含任何这里规定的突变的组合的变体也被覆盖在这里的表述中。
本发明生产的藻酸盐将具有“所需的分子量”。优选地，藻酸盐的分子量(Mw.)范围为50,000至3,000,000道尔顿；更优选地，范围在200,000至2,000,000道尔顿；最优选地，生产高于300,000道尔顿的藻酸盐。
这里所表述的“生物学活性的藻酸盐”是指对生物系统具有影响的藻酸盐，即某些生物活性藻酸盐分子结构已知可诱导某种细胞系统的生物反应。这些生物藻酸盐具有低含量的古洛糖醛酸盐(古洛糖醛酸盐)残基，总糖醛酸含量为0-30％，并且优选古洛糖醛酸盐含量在1％和15％之间，更优选在1％和10％以内。
附图简述
图1：自杀载体pHE55和pMG48的限制性核酸内切酶图谱，参见表1。仅显示了特有的限制酶位点。
图2：在发酵中，荧光假单胞菌NCIMB 10525突变菌株的生长和藻酸盐生产。
图3：由荧光假单胞菌突变菌株Pf201和Pf20118产生的藻酸盐的1H-NMR-光谱。来自其它差向异构酶阴性突变体(表3)的甘露糖醛酸的1H-NMR-光谱与Pf20118的光谱相同。
图4：显示来自荧光假单胞菌的藻酸盐生物合成操纵子和上游开放读框。在图谱线上，克隆的片段被标记为盒子。仅显示用于克隆的限制位点。全长是18kb。
图5：质粒pMC1的限制性核酸内切酶图谱。仅显示独特的限制酶。
材料和方法的全面描述
用于细菌生长的起始材料和培养基
应用于本发明的细菌菌株、噬菌体和质粒列举在下表1中。大肠杆菌和荧光假单胞菌菌株通常生长在LB培养基中(10g/l胰化蛋白胨、5g/l酵母提取物以及5g/lNaCl)，或生长在LA-培养基上(它是包含15g/l琼脂的LB-培养基)，分别在7℃和30℃培养。假单胞菌分离琼脂(PIA，Difco)也被用于荧光假单胞菌的繁殖。用于λ噬菌体繁殖的大肠杆菌生长在添加麦芽糖(0.2％)和MgSO4(10mM)的LB-培养基中。抗生素当用在常规生长实验中时，以以下浓度存在：青霉素100-200μg/ml，卡那霉素40μg/ml，四环素12.5μg/ml(大肠杆菌)和30μg/ml(荧光假单胞菌)。
荧光假单胞菌藻酸盐的生产：培养基和生长条件
培养基
在摇瓶实验中藻酸盐的生产使用PIA-培养基进行，包含细菌蛋白胨(20g/l)、MgCl2(1.4g/l)、NaCl(5g/l)、K2SO4(10g/l)和87％甘油(20ml/l)，或在具有减少盐的PIA-培养基(没有K2SO4的PIA-培养基)中进行。除非另外说明，加入蛋白酶(Alkalase2.41(0.15ml/l)和Neutrase 0.51(0.15ml/l))以降低细胞外藻酸盐裂解活性。Alkalase和Neutrase购自Novo Nordisk。
在发酵罐中藻酸盐的生产在PM5-培养基中进行，该培养基中含有果糖(40g/l)、酵母提取物(12g/l)、(NH4)2SO4(0.6g/l)、Na2HPO4×2H2O(2g/l)、NaCl(11.7g/l)、MgSO4×7H2O(0.3g/l)和clerol FBA(防沫剂)(0.5g/l)。加入蛋白酶(Alkalase2.41(0.25ml/l)和Neutrase 0.51(0.25ml/l))以降低细胞外藻酸盐裂解活性。
标准接种体的制备(以甘油作为防冷冻剂，与甘油冰冻培养)
从琼脂板上将一个克隆(30℃培养2-3天，PIA-培养基)转移到含有100ml LB-培养基的摇瓶(500ml，带有挡板)中。将摇瓶置于定轨摇床(200rpm，振幅2.5cm)上在30℃培养16-20小时。需要保存时，在培养基中加入灭菌的甘油至浓度15％。将混合物转移到灭菌的低温瓶(Nunc)中，储藏在-80℃。
制备用于摇瓶和发酵罐生产实验的接种物
将1ml标准接种物转移到含有100ml LB-培养基的摇瓶(500ml，带有挡板)中。将摇瓶在30℃在定轨摇床(200rpm，振幅2.5cm)上培养16-20小时。
在摇瓶中藻酸盐的生产
1-2体积％接种物(见上)转移到含有100ml PIA-培养基或减少盐的PIA-培养基的摇瓶(500ml，带有挡板)中。摇瓶在25℃在定轨摇床(200rpm，振幅2.5cm)上培养48小时。
在发酵罐中藻酸盐的生产
2-3体积％来自摇瓶的接种物转移到含有1.4升PM5-培养基的3-升发酵罐(Applicon)中。发酵在25℃下进行。从开始时pH调节到7.0-7.2。pH用NaOH(2M)控制在7.0，并且当pH到达该值时pH-控制被活化。最初的8小时，培养基的气流为0.25升/升培养基(vvm)，然后逐步地升高到0.9-1.0vvm。溶解氧通过搅拌速度自动控制在20％饱和。
适用的标准技术
质粒分离、DNA的酶处理和凝胶电泳通过“Sambrook和Russell，2000，分子克隆：实验手册(Molecular Cloning：A Lavoratory Manual)(第三版)，冷泉港实验室出版社”描述的方法进行。使用Qiaquick凝胶抽提试剂盒以及Qiaquick PCR纯化试剂盒(QIAGEN)分别用于从琼脂糖凝胶中纯化DNA以及酶反应。大肠杆菌的转化如Chung等，1989，Proc Natl Acad Sci USA，86，p.2172-2175中描述的进行，应用热-休克-可用的氯化铷细胞。用于克隆和等位基因鉴定的的PCR应用Expand HighFidelity PCR-系统(Boehringer Mannheim)进行。模板被用于质粒DNA或1μl的过夜荧光假单胞菌培养。在第一次变性步骤中，反应混合物被加热到96℃3分钟，以确保细胞裂解和DNA的完全变性。应用QuickChange位点-直接诱变试剂盒(Stratagene)进行位点-特异的诱变。引物显示在表2中，购自Medprobe或购自MWG-Biotech AG。引物中的核苷酸，不同于野生型序列中的那些被以加黑标明，限制酶位点被加以下划线。应用Big-Dye试剂盒(Applied Biosystems)进行DNA测序。
用在荧光假单胞菌中的自杀载体的构建
为了在荧光假单胞菌中获得同源重组，构建两种不同的自杀载体pHE55和pMG48，参见图1。pHE55的构建描述在表1中。它是一种基于RK2的载体，缺少编码TrfA的基因，其对于质粒的复制是必要的。它进一步还对青霉素和四环素具有抗性，可被用于选择完整体。来自枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的编码果聚糖蔗糖酶的sacB的表达已经显示对于许多生长在5％蔗糖上的革兰氏阴性菌是致命的(Gay等，1985，J.Bacteriol.，164，p.918-921)。然而，在荧光假单胞菌的菌株NCIMB10525中，在蔗糖上生长非黏液型的和四环素抗性的转化结合子导致透明的克隆，似乎该菌株应用蔗糖生成聚合体。SacB和蔗糖的选择不能用于该菌株，以肯定地选择双交叉结果。pHE55在一些实验中被用作自杀载体，其中藻酸盐生产可被用作一种标记。
质粒pMG48被构建为一种选择性重组载体。pHE55的sacB基因被编码TrfA-LacZ融合蛋白的基因取代，如表1中所描述的。该蛋白显示β-半乳糖苷酶活性，但是失去了TrfA的基本部分。应用包含XGal(5-溴-4-氯-3-吲哚酰β-D-吡喃半乳糖)的板，加入60μl的20mg/ml储存液到每个用于筛选的琼脂板上。β-半乳糖苷酶活性可进行蓝/白筛选，选出完整体(蓝色克隆)以及后来用于第二次重组事件的(白色克隆)。
同源重组
包含感兴趣的突变的DNA序列，点突变、插入或删除的以及每边上至少0.5kb的侧翼DNA被克隆入自杀载体中，pHE55或pMG48。转化了感兴趣的质粒的大肠杆菌S17.1和待突变的荧光假单胞菌被培养在LB培养基中过夜。然后将它们培养在新鲜的LB培养基中，使用1％接种。在结合前，大肠杆菌生长2小时，荧光假单胞菌生长4小时。然后将1ml的每种培养物混合，在3000rpm离心15分钟。移走大多数上清，将细胞重新悬浮在剩余液体中。包含细胞的小滴被转移到LA-培养基中，在30℃培养过夜。细胞由灭菌刮刀转移，重新悬浮在LB-培养基中，稀释物被涂在假单胞菌分离琼脂(PIA，Difco)上，当载体需要篮/白选择时，琼脂上带有适当的抗生素和X-Gal。每种甘露糖醛酸生产菌株的非黏液型转化结合子克隆被培养在2-6顺序的液体过夜培养基中，其中缺少四环素，允许完整质粒的丧失。指数生长培养被稀释104-109倍，涂布在适当的培养基上，筛选不同的菌株。
通过NMR-光谱测量藻酸盐的G-含量和O-乙酰化程度
发酵样品稀释在0.2M NaCl中，离心以移走细菌细胞。为了制备用于确定乙酰化程度的样品，通过加入1体积的异丙醇(4℃)，将藻酸盐从去除细胞的上清中沉淀，然后离心收集。然后将离心的藻酸盐用70％乙醇洗涤2次，用96％乙醇洗涤一次，在进一步处理前重新溶解在蒸馏水中。为了制备用于确定G-含量的样品，通过温和的碱处理，将藻酸盐从去除细胞的上清中脱去乙酰基，如Ertesvag和Skjak-Brk，1999，生物技术方法10，碳水化合物生物技术草案，Bucke，pp.71-78，Humana出版社。通过加入HCl至pH2进行酸沉淀，脱去乙酰基的藻酸盐被从去除细胞的上清中分离。沉淀的藻酸盐离心收集，重新溶解在蒸馏水中，用碱中和。为了减少用于NMR分析的聚合体的粘性，将样品用温和的酸水解至最终平均聚合程度(DPn)约35，即聚合物链中有35个残基，中和并冷冻干燥，Ertesvag和Skjak-Brk，1999，supra。应用Bruker 300-MHz光谱仪获得NMR-光谱。将光谱汇总，古洛糖醛酸盐残基(FG)、甘露糖醛酸盐阻滞残基(FMM)和交互的阻滞残基(FMG＝GM)，以及乙酰化程度根据Grasdalen，1983，Carbohydr.Res.，118，p.255-260和Skjak-Brk，Grasdalen和Larsen，1986，Carbohydr.Res.，154，p.239-250中所描述的进行计算。
测量藻酸盐的自身粘性以及在发酵样品中直接测量藻酸盐含量
如前所述，产生的藻酸盐被分离、去乙酰基、酸沉淀、重新溶解和中和。在中和后的藻酸盐溶液中加入异丙醇，再次沉淀藻酸盐。沉淀的藻酸盐用乙醇洗涤两次(第一次70％乙醇，然后96％乙醇)，重新溶解在蒸馏水中，透析48小时。透析后的样品冷冻干燥和称重。藻酸盐的自身粘性在可自动稀释的Scott-Gerate装置上确定，应用Ubbelodhe毛细管(Φ＝0.53mm)、20℃，并添加0.1M NaCl的盐浓度。该方法的原理如Haug和Smidsrod，1962，Acta.Chem.Scand.，16，p1569-1578中所描述的。
发酵样品中藻酸盐含量的酶测定
藻酸盐含量应用来自鲍鱼的M-特异的裂解酶以及来自Klebsiella aerogenes的G-裂解酶测量，如stgaard，1992，19，Carbohydr.Polymers，p.51-59所描述的。
发酵样品在0.2M NaCl中稀释(2-20倍)，如前所述离心移走细菌细胞，脱去乙酰基。然后将去乙酰基的样品在缓冲液(Tris-HCl(50mM)、NaCl(0.25M)、pH7.5)中稀释至终浓度0.005-0.05％藻酸盐。LF10/60(FMC Biopolymer AS)或甘露糖醛酸，如这里所述生产和测量，被用作该测定的自诉标准。在测定中，1体积的样品或标准以及0.06体积的藻酸盐裂解酶溶液(约1u/ml)被加入到2体积的缓冲液(Tris-HCl(50mM)、NaCl(0.25M)、pH7.5)中，在25℃培养3小时。在培养之前和之后记录在230nm的吸光率。培养前后A230nm吸光率值的不同被用于计算样品中的藻酸盐含量。应用该测定所得结果与前述直接测量所得藻酸盐含量密切相关。
裂解酶活性的测定
通过离心收集发酵的细菌细胞，重悬在缓冲液(Tris-HCl(50mM)、NaCl(0.25M)、pH7.5)中，至660nm处光密度3-10，并进行声波处理。测量声波处理后的提取物的裂解酶活性。来自鲍鱼的M-裂解酶(如stgaard，1992，19，Carbohydr.Polymers，p.51-59所述)被用作标准。样品中的裂解酶活性通过测量甘露糖醛酸的降解率来确定，应用Scott-Gerate Ubbelodhe(instrumentnr.53620/ll)。甘露糖醛酸(1mg/ml)溶解在缓冲液(Tris-HCl(12.5mM)、NaCl(62.5mM)、pH7.5)中。4ml的甘露糖醛酸底物溶液和0.4ml的稀释的标准溶液、或样品被加入到Ubbelodhe毛细管中。在1小时的时间周期中每2分钟测量溶液通过Ubbelodhe毛细管的时间。分析在25℃下进行。基于来自分析的数据，计算甘露糖醛酸的降解率，与样品中裂解酶的活性相关联。应用鲍鱼M-裂解酶作为标准(0005-0.05u/ml)，获得一条标准曲线。1单位的裂解酶活性如Ertesvag等，J.Bacteriol.(1998)，180，p.3779-3784中所描述的来定义。
表1.应用的细菌菌株，质粒和噬菌体
菌株 描述 参考
大肠杆菌S17.1 recAl supE44 endAl hsdR17 gyrA96 relA1thiΔ(lac-proAB)，含有RK2复制和转移所必要的基因 Simon等，1983，Biotechnol.1，p.784-791
大肠杆菌S17.1λ-pir λ-pir，recA1 supE44 endA1 hsdR17 gyrA96 relA1thiΔ(lac-proAB)，包含RK2复制和转移以及pCB111复制所必要的基因 de Lorenzo等，1993，J.Bacteriol.175，p.6902-6907
大肠杆菌SURE el4-(McrA-) D(mcrCB-hsdSMROmrr)171 endAlsupE44 thi-1 gyrA96 relA1 lac recB recJ sbcCumuC::Tn5(Kanr)uvrC[F’proAB laclqZD(M15Tn10(retr)] Stratagene
大肠杆菌XL1-BlueMRA Δ(mcrA)183Δ(mcrCB-hsdSMR-mrr)173 endA1supE44 thi-1 gyrA96 relA1 lac  Stratagene
大肠杆菌XL1-Blue MRA(P2) XL1-Blue MRA(P2溶原性细菌) Stratagene
荧光假单胞菌 非黏液型荧光假单胞菌野生型 NCIMB
NCIMB10525
Pf201 algG，黏液型荧光假单胞菌 本工作
Pf2012 生产甘露糖醛酸的突变体，algG D361N 本工作
Pf2013 生产甘露糖醛酸的突变体，algG G430D 本工作
Pf20118 生产甘露糖醛酸的突变体，algG R408L 本工作
Pf20137 生产甘露糖醛酸的突变体，algG S337F 本工作
Pf0118algFΔ Pf20118的algF框内删除突变体 本工作
Pf0118algIJΔ Pf20118的algIF框内删除突变体 本工作
Pf0118algLΔ Pf20118的algL框内删除突变体 本工作
Pf0118algLH203R 编码AlgLH203R突变蛋白的Pf20118衍生物 本工作
Pf201ΔalgG algG框内删除突变体 本工作
Pf20118∷TnKB10 带有来自pKB10的转位子的Pf20118的衍生物 本工作
Pf201ΔalgG∷TnkB10 带有来自pKB10的转位子的Pf201ΔalgG的衍生物 本工作
Pf201MC Pf201的衍生物，其中，藻酸盐生物合成由诱导型启动子Pm控制 本工作
噬菌体
λDash II λ克隆载体 Strategene
Pfλ1 λDashII，其中，包含alg’EGXLIJFA的来自荧光假单胞菌NCIMB 10525的15kb的SauAI-部分消化的基因组DNA的插入物被插入 本工作
质粒
pCVD442 Ori R6K，Apr Donnenberg和Kaper，1991，59，p.4310-4317
pJB3Tc20 基于RK2的载体，Apr，Tcr Blatny等，1997，Appl.Environ.Microbiol.，63，p.370-379
PJB3Tc20trfA PJB3Tc20的衍生物，从中删除了编码TrfA的1.0kb的BsaAI-NdeI-DNA-片段 本工作
pHE55 PJB3Tc20trfA的衍生物，其中，插入编码来自枯草芽孢杆菌的SacB的来自pCVD442的2.6kb的PstI-XbaI-DNA-片段 本工作
pJB1002 编码TrfA-LacZ-融合蛋白的基于RK2的载体 Karunakaran等，1998，J.Bacteriol，180，p.3793-3798
pGEM5 ColE1.ApR. Promega
pMG47 pHE的衍生物，其中，来自pJB1002的编码TrfA-LacZ-融合蛋白的4.1kb NheI-PstI-DNA-片段被编码SacB的2.6kb XbaI-PstI DNA-片段取代 本工作
pMG48 pMG47的衍生物，其中，包含pGEM5的多连接的0.36kb SphI-SapI DNA-片段被插入 本工作
pBBg10 来自Pseudomonas aeuginosa藻酸盐生物合成操纵子的9.9kb BglII-BamHI插入物，包含alg’KEGXLIJF.Apr. 来自A.Chakrabarty的礼物
pGEM11 ColE1.ApR Promega
pMG24 包含来自Pfλ1的编码部分algE的1kb SalI-DNA-片段的pGEM11 本工作
pMG25 包含来自Pfλ1的编码藻酸盐操纵子的下游序列的 本工作
4.2kb SalI-DNA-片段的pGEM11
pMG26 包含来自Pfλ1的编码algGXLI’的4.6kbSalI-DNA-片段的pGEM11 本工作
pMG27 包含来自Pfλ1的编码alg’IJFA的4.8kbSalI-DNA-片段的pGEM11 本工作
pLitmus28 ColE1.ApR. New England Biolabs
pMG23 pLitmus28，其中，包含algG和135bp的algX的1.8kb PCR扩增的BglII-Pst1 DNA片段被插入 本工作
pMG31 pHE55的衍生物，其中，来自pMG23的编码AlgG的1.8kb BglII-XbaI-DNA-片段被插入 本工作
pMG49 pMG27-衍生物，其中，1.4kb NruI-HpaI DNA-片段被删除，创建一个框内algl”J-删除 本工作
pMG50 pHE55带有来自pMG49的包含algIJΔ的3441bpSacI-XbaI插入物 本工作
pMG77 pMG27的衍生物，其中，SacII-位点被引入，应用引物对algF-SacII-1和algF-SacII-2(表2) 本工作
pMG78 pMG77的衍生物，其中，删除了algF中285bpSacII-DNA片段 本工作
pMG79 SphI-SpeI-限制的pMG48的衍生物，其中，来自pMG78的1.7kb的NspI-NheI-DNA片段被插入 本工作
pMG67 pMG26的衍生物，其中，AgeI-位点和algLH203R被引入，应用AlgLH203R1和AlgLH203R2引物 本工作
pMG70 pMG48的衍生物，其中，来自pMG67的2.5kb PstI-NotI-DNA-片段被插入到载体的Nsil和NotI-位点 本工作
pJB658celB 包含Pm启动子和xylS Apr.的表达载体 Blatny等，1997，Plasmid，38，p.35-51
pHE138 pJB658celB的衍生物，其中，编码N-末端部分AlgD的0.8kb NdeI-NsiI-消化的PCR片段被插入到NdeI和PstI-位点，取代celB 本工作
pHE139 pMG48的衍生物，其中，编码藻酸盐启动子ORF上游C-末端部分的0.7kb BspLUIII-SpeI-消化的PCR-片段被插入到NcoI和SpeI-位点 本工作
pHE140 pHE138的衍生物，其中，0.6kb NsiI-DNA-片段被移走，并且突出末端由T4-DNA-聚合酶移走 本工作
pHE141 BglII接头被插入Nsil消化的pHE139中，其被用T4-DNA-聚合酶钝化 本工作
pHE142 在部分用Eco571消化的pHE140中，NotI-接头被插入到xylS的下游 本工作
pMC1 来自pHE142的2.3kb NotI-BamHI-DNA-片段被插入到NOtI-BgIII消化的pHEl41中 本工作
pMG51 pMG26的衍生物，其中，SmaI-位点被引入algG中核苷酸位置368，应用引物algG-SamI-1和algG-SmaI-2 本工作
pMG52 pMG51的衍生物，其中，0.6kb SmaI-DNA-片段被删除，在algG中创建框内删除 本工作
pMG53 NsiI-NcoI-限制的pMG48衍生物，其中，来自pMG52的2.1kb Pstl-BspHI-DNA片段被删除 本工作
pCNB111 oriR6K，mobRP4，pUT/mini-Tn5 xylS/Pm，Apr，Kmr Winther-Larsen等，2000，Metabol.Eng.2p
79-91
pKB4 pMG26的衍生物，其中，3.0kb BlpI-XhoI-DNA片段被删除，Apr.4.9kb 本工作
pKB10 pCNB111的衍生物，其中，包含algG的1.7kb NdeI-NotI限制的PCR-片段被插入。pKB4被用作PCR模板，PfalgG-NdeI-2和M13/PUC反向作为引物 本工作
pJT19bla 编码β-内酰胺酶pJB655的衍生物，由Pm启动子控制 Winther-Larsen等，2000，Metabol.Eng.2p92-103
pJT19D2luc pJT19bla的衍生物。编码luc基因作为报道基因 Winther-Larsen等，2000，Metabol.Eng.2p92-103
pIB11 pJT19bla的衍生物，在Pm启动子的上游包含rrnBT1T2终止子，并且Spel位点被改变为BspLU11I位点 Ingrid Bakke，未出版
pHH100 pIB11的衍生物，其中，bla基因被来自pJT19D2luc的luc基因取代，应用酶NdiI和BamHI 本工作
pHH100-A2 pHH100的衍生物，包含突变体Pm-启动子，给予低的非诱导活性 本工作
pHH100-B1 pHH100的衍生物，包含突变体Pm-启动子，给予低的非诱导活性 本工作
pHH100-D6 pHH100的衍生物，包含突变体Pm-启动子，给予低的非诱导活性 本工作
pHH100-D9 pHH100的衍生物，包含突变体Pm-启动子，给予低的非诱导活性 本工作
pHH100-G5 pHH100的衍生物，包含突变体Pm-启动子，给予低的非诱导活性 本工作
pHM2 宽-宿主-范围的质粒，编码来自大肠杆菌的lacOPZY Mostafa等，2002，Appl.Environment.Microbiol.68：2619-2623
表2：应用的引物
名称  序列*
PfalgG3r  CAGG CTGCAGCACGGTTCGGC
PfalgG4f  AAAA AGATCTAGTCGACTCGTACATGCACC
PfacetylFw  CTGCTGGTGGTGATGGGCTGGG
PfacetylRev  AGACGCGCACGAAGCTTGAGCC
algF-SacII-1  GTCAAACTCG CCGCGGATCACTAC
algF-SacII-2  GTAGTGAT CCGCGGCGAGTTTGAC
algF-1-Fw  AGCGATGACTTCAAGAACAACCCG
algF-2-Rev  CAATTTGGGTCAGAGCTACGAAGG
algLH203R1  AACCAACA ACCGGTCCTACTGGGCCGCC3’
algLH203R2  GGCGGCCCAGTAGG ACCGGTTGTTGGTT
PfalgL-BspHI-pMG26  AAAAAAAG TC ATGAGGTTACCTATGCAGAAGTTATTG
algG-SmaI-1  CACGGCATTC CCCGGGCGATCTTC
 algG-SmaI-2  GAAGATCG CCCGGGGAATGCCGTG
 PfalgG-NdeI-2  AAAAAA CATATGGGAGCCTGCGCAATGAACC
 PfalgL Revl  AAAGATCGGCAAGAACAGAAACAGG
 HypBspLUIII  GTT ACATGTCAGCCGCAATACCTCGACC
 HypSpe  GTT ACTAGTTTATTCGGGGGCGTGATCG
 AlgDNdel  GGTAATT CATATGCGCATCAGCATATTTG
 AlgDNsil  GTA ATGCATGTAGTACTGGGACAGG
*引物以5’-3’方向书写。在原始序列中没有显示的核苷酸用加黑标记。引入的限制位点以下划线表示
本发明的实施例
实施例1
突变菌株Pf201的制备
野生型荧光假单胞菌NCIMB 10525购自国立工业和海洋微生物保藏有限公司(NCIMB)。野生型不生产显著量的藻酸盐。为了分离过量生产藻酸盐的突变体，将指数生长的荧光假单胞菌NCIMB 10525用亚硝基胍(NG)诱变。菌株生长在含有0.5％的酵母提取物的营养肉汤中(CM67，Oxoid)，在0.1M柠檬酸盐缓冲液(pH5.5)中洗涤2次，然后用25μg/ml亚硝基胍(NG)处理细胞，在柠檬酸盐缓冲液中30℃进行1小时。经诱变的细胞用pH7.0的包含KH2PO4(13.6g/l)和NaOH(约2.32g/l)的0.1M磷酸缓冲液洗涤，接种(2％)到含有酵母提取物的营养肉汤中。细胞生长过夜，然后以1ml等分的NG-储存液冰冻。
将培养的稀释物涂布在包含羧苄青霉素(900μg/ml)的PIA-培养基上，在30℃培养。观察到少量的黏液型突变体。通过包括观察多于4×105个克隆的筛选，选出两个最具黏液型的突变体，用于进一步在发酵研究中评估。更好的突变体Pf201在发酵中产生11-13g的藻酸盐每升PM5-培养基，培养基中每升包含40g果糖作为碳源，如图2所显示的。生长条件和培养基组合物可参考“材料和方法”。应用包含果糖的PM5-培养基，在标准的生长条件下，由Pf201突变体产生的藻酸盐包含约30％G(古洛糖醛酸盐残基)，完全不存在G-阻滞，如可在图3中所评估的。基于独特的藻酸盐生产特性，Pf201菌株被选择用于进一步的菌株开发。实施例1的荧光假单胞菌突变体Pf201保藏在NCIMB中，保藏编号为41137。
实施例2
藻酸盐生物合成操纵子部分的克隆和测序
在λDASH II(lambda Dash II)(购自Stratagene)中构建野生菌株NCIMB10525的基因文库。如Ausubel等，1983，Current protocols in molecular biology(GreenePublishing Association，Inc和John Wiley&Sons Inc，纽约)中所描述的方法分离染色体DNA。然后通过将来自NCIMB 10525的部分Sau3AI-消化的染色体DNA插入BamHI-消化的λDash II构建基因文库，用体外包装的噬菌体感染大肠杆菌XL-1Blue MRA(P2)，根据厂家的说明进行(Stratagene BamHI/Gigapack III GoldExtract)。通过应用DIG DNA标记和检测试剂盒(Boehringer Mannheim)，标记DNA-探针并检测杂交的λ-克隆，根据厂家的说明进行。来自包含algG的pBBg10的3.8MfeI-NcoI DNA片段侧翼连接来自荧光假单胞菌的部分algE和algX，被标记和用于筛选荧光假单胞菌文库。一种杂交噬菌体，称为Pfλ1，应用该系统被检测到，并且应用Lambda Midi试剂盒(QIAGEN)分离λDNA。插入物作为SalI消化的DNA片段被亚克隆入pGEM11中，产生4中亚克隆pMG24-27。亚克隆的末端测序以及与荧光假单胞菌的藻酸盐生物合成操纵子比较显示，Pfλ1包含藻酸盐生物合成操纵子的下游部分，从algE的3’部分起(图4)。
pMG26和pMG27通过Quiagen Sequencing&Genomics来测序，获得algGXLIJFA的全长序列。该基因构造似乎与以前报导的藻酸盐生物合成簇相似，以前报导在May和Chakrabarty，1994，Trends Microbiol.，2，p.151-157，Rehm等，1996，J.Bacteriol.，178，p.5884-5889，Penaloza-Vazquez等，1997，J.Bacteriol.，179，p.4464-4472，Vazquez等，1999，Gene，232，p.217-222。序列已经提交GenBank，其登录号为AF527790。
实施例3
差向异构酶阴性的变体菌株的制备
实施例1中的突变菌株Pf201进行进一步的诱变，使用亚硝基胍，应用对实施例1的方法进行改变的方法。荧光假单胞菌NCIMB 10525的指数生长细胞用亚硝基胍(NG)诱变：细菌细胞用等体积的Tris/马来酸(TM)缓冲液(pH6.0，包含NH4SO4(1.0g/l)、CaCl2*2H2O(4.4mg/l)、KNO3(6.1mg/l)、马来酸(5.8g/l)、Tris(羟甲基)-氨基甲烷(6.05g/l)、FeSO4*7H2O(0.25mg/l)和MgSO4*7H2O(0.1g/l))洗涤2次。细胞在80％原始培养体积的TM-缓冲液中重悬，在30℃与NG(50μg/ml)接触1小时。经诱变的细胞用0.1M磷酸缓冲液(pH7.0，包含KH2PO4(13.6g.l)和NaOH(约2.31g/l))洗涤，然后接种(2％接种物)到LB-培养基中，培养过夜。应用一种非诱变的等分培养物作为对照，计算出诱变过程的死亡率大约90％。在诱变后，培养物在LB培养基中生长过夜，细胞的稀释物被涂布在LA培养基上，其还包含来自产气克雷伯氏菌(Klebsiellaaerogenes)的G-裂解酶(约0.1u/盘)，如Chitnis等，1990，J.Bacteriol.，172，p.2894-2900所描述的。G-裂解酶仅分裂藻酸盐中G-M(古洛糖醛酸盐-甘露糖醛酸盐残基)和G-G(古洛糖醛酸盐-古洛糖醛酸盐残基)键，Haugen等，1990，Carbohydr.Res.，198，p.101-109。
在这种选择板上，粘液样突变体的出现频率约为7500个中出现1个。一种黏液型突变体被分离并被命名为Pf20118。Pf20118在标准生长条件下生长在发酵罐中，应用PM5培养基，参见“材料和方法”。产生的聚合物用1H-NMR光谱仪分析。分析的结果显示，该突变体产生纯的甘露糖醛酸，参见图3。用Pf20118进行了一些发酵，应用标准的生长条件和PM5-培养基。体积产量的范围为每升14-16g甘露糖醛酸，从每升含40g果糖的培养基中获得，进行约35小时的发酵。获自Pf201的荧光假单胞菌突变体Pf20118在发酵罐中被进行了多于70次不同的发酵实验，没有一次显示甘露糖醛酸生产特性的不稳定。Pf201和Pf20118都已经生长了60代，没有出现非粘液样克隆。尽管似乎很可能Pf20118在甘露糖醛酸C-5-差向异构酶基因algG中具有缺陷，不能排除该突变影响了其它蛋白，这些蛋白可能对于差向异构作用是必要的。引起甘露糖醛酸生产显型的突变的初步的定位通过基因取代进行，用野生型algG取代每个突变体的algG等位基因。一种编码野生型algG和algX下游的最初135bp的基因取代载体pMG31被构建，如表1。该质粒被连接到Pf20118中，如“材料和方法”中所述，应用包含四环素的PIA作为培养基。pMG31重组入algG，由于藻酸盐生物合成操纵子的破坏，出现非粘液样克隆。非粘液样转化结合子克隆在2-6连续的液体中培养，过夜培养，其中不存在四环素，允许完整的质粒丧失。指数生长培养物被稀释104-109倍，涂布在PIA琼脂板上，筛选黏液型回复子。然后在包含G-裂解酶的L-琼脂上将粘液样克隆再划线，检测它们是否生产差向异构的藻酸盐。发现一些非粘液样回复子，证明该突变肯定在相应于pMG31的algGX’片段的DNA-片段中。algG基因通过PCR扩增，应用引物PfalgG3r和PfalgG4f，测序和突变的鉴定见表3。
三种其它差向异构酶阴性的突变衍生菌株根据前面提供的步骤制备，分别命名为Pf2012、Pf2013和Pf20137。它们在algG基因中都具有可识别的突变，在它们的AlgG基因产物中产生不同的氨基酸，如下面表3所提供的，该氨基酸的变化足以使蛋白失活。当在相同条件下生长时，突变体产生大约与Pf20118相同水平的纯的甘露糖醛酸。突变体的差向异构酶的缺陷可通过与在pMG31中的野生型基因结合而被回复。
表3
突变体     algG中的突变     基因产物中的氨基酸取代
Pf2012     G(1081)→A(1081)     Asp(361)→Asn(361)
Pf2013     G(1289)→A(1289)     Gly(430)→Asp(430)
Pf20118     C(1222)→T(1222)     Arg(408)→Leu(408)
Pf20137     C(-3)→T(-3)C(1010)→T(1010) Ser(337)→Phe(337)
表3中的突变菌株保藏在NCIMB中，Pf2012的NCIMB编号为41138，Pf2013的NCIMB编号为41139，Pf20118的NCIMB编号为41140，Pf20137的NCIMB编号为44141。
实施例4
乙酰基转移酶阴性以及修改的变体菌株Pf20118algFΔ和Pf20118algIJΔ的制备
首先制作Pf20118algF删除菌株，通过构建包含框内删除algF部分的侧序列的突变DNA-片段，然后将该片段与自杀载体pMG48相连，如表1所描述的。所得质粒，命名为pMG79，通过如“材料和方法”中所描述的结合方法，被转移到荧光假单胞菌菌株Pf20118，该转位结合子以在包含XGal和四环素的PIA-板上呈现蓝色克隆而被选出。双重组体以在包含XGal的PIA-板上呈现白色和黏液状克隆被选出。这些候选菌株被进一步测试对四环素的敏感性。对24个白色、四环素敏感的候选菌株进行PCR检测，应用表2中提供的引物对algF-1-Fw和algF-2-Rev，并且产物用凝胶电泳分析。22个候选菌株PCR-产物具有野生型algF-等位基因预期的长度(1.0kb)。然而，另外2个具有突变ΔalgF-等位基因预期的长度(0.7kb)。其中一个被命名为Pf20118algFΔ。
通过首先创建pMG27的衍生物(pMG49)，从pMG27上将包含261个algI的3’核苷酸和1140个algJ的5’核苷酸的1.4kb NruI-Hpal DNA-片段移走。该删除结构编码AlgI和AlgJ的框内融合，确保AlgF和AlgA可被正常翻译。然后，将pMG49的3.4kb SacI-XbaI DNA-片段连接到经相同的酶消化的自杀载体pHE55上，创建pMG50。通过结合大肠杆菌S17.1，该包含侧翼删除的序列的质粒被引入到Pf20118，在包含四环素的PIA-培养基上选择非粘液样转化结合子。转化结合子回复子在LA-培养基上以粘液样四环素敏感克隆被鉴定。4个algIJΔ-突变体候选菌株通过PCR-扩增来检测，检测包含删除区域的区域，应用引物对PfacetylFw和PfacetylRev(表2)，并且PCR-产物通过凝胶电泳分析。2个克隆包含野生型片段(1.8kb)，另2个克隆包含突变片段(0.4kb)。其中一个命名为Pf20118algIJΔ。Pf20118algFΔ和Pf20118algIJΔ在发酵罐中生长，采用PM5-培养基和标准生长条件，如“材料和方法”中所提供的，收集所得藻酸盐，如前述方法测量。结果见下表4中。两种突变体都生产甘露糖醛酸藻酸盐，产量为每升培养基16-17g藻酸盐。通过1H-NMR-光谱仪测定乙酰基是否存在，如“材料和方法”所描述的。Pf20118algFΔ不生产乙酰化的藻酸盐，而Pf20118algIJΔ生产的藻酸盐中包含少量O-乙酰基。
表4在发酵中，不同荧光假单胞菌菌株的藻酸盐产量，古洛糖醛酸盐残基含量分数(FG)，乙酰化程度(da)和自身粘度(η)
突变体 藻酸盐(g/l)     FG(％)     da     η(dl/g)
Pf201 11.3     29     0.44     16.5
Pf20118 16.0     0     0.60     17.3
Pf20118algIJΔ 16.8     0     0.03     10.9
Pf20118algFΔ 16.2     0     0     8.9
该发酵在3-1发酵罐中进行，应用PM5-培养基以及标准生长调节。分析如“材料和方法”中所述进行。
Pf20118algFΔ和Pf20118algIJΔ保藏在NCIMB中，保藏编号为41142和41143。
实施例5
呈现低藻酸盐裂解酶活性的修改的衍生突变菌株Pf20118AlgLH203R的制备
根据现有知识，荧光假单胞菌菌只有一个藻酸盐裂解酶(AlgL)，由基因algL编码。因此，一种控制由该细菌生产的藻酸盐的分子量的选择是修改同时生产的AlgL基因产物。
在Pf20118的algL基因中，应用诱变引物对algLH203R1/algLH203R2创建His203Arg(H203R)突变。引物也包含静止突变，创建AgeI-位点，用于等位基因鉴定。构建诱变质粒pMG70，如表1中所述，并通过结合进入到Pf20118染色体中，在含有四环素和XGal的PIA-培养基上选择转位结合子。转位结合子生长在连续的不存在四环素的过夜培养基中，涂布在含有XGal的PIA-培养基上，分离AlgL突变。白色四环素敏感的突变候选菌株通过algL-等位基因的PCR-扩增筛选，应用引物PfalgL-BspHI-pMG26和PfalgLRevl(表2)，通过用AgeI消化PCR-片段来鉴定等位基因。选择的突变菌株被命名为Pf20118AlgLH203R。
当变体菌株Pf20118AlgLH203R生长在含有减少盐的PIA-培养基的摇瓶中时，它产生的甘露糖醛酸量大约与变体菌株Pf20118相同水平。同样，生长在发酵罐中，这两种变体菌株生产大约相同量的甘露糖醛酸(H203R生产每升12g甘露糖醛酸藻酸盐)。在摇瓶中(使用减少盐的PIA-培养基，不加入蛋白酶)，Pf20118(自身粘度为15dl/g)和Pf20118AlgLH203R(自身粘度为37dl/g)产生的甘露糖醛酸的自身粘度测量显示，后者产生的甘露糖醛酸具有提高的分子量。Pf201产生的藻酸盐具有的自身粘度类似Pf20118(14dl/g)。
在摇瓶发酵的最后，收集Pf201、Pf20118和Pf20118AlgLH203R的细菌细胞并进行声波处理。在声波处理后，分析提取物的藻酸盐裂解酶活性，通过如“材料和方法”中提供的方法测量。定义Pf201的裂解酶活性为100％，使用该方法可以检测低至2％的活性。Pf20118显示93％活性。Pf20118AlgLH203R没有检测到活性，表明它是菌株Pf201活性的少于2％。然而，当蛋白酶Alkalase和Neutrase都以1.15ml/l加入后，Pf201和Pf20118的自身粘性升高到约50dl/g，Pf20118AlgLH203R的自身粘度升高到70dl/g，表明突变体裂解酶具有某些残留活性。变体菌株Pf20118AlgLH203R保藏在NCIMB中，保藏编号为41144。
实施例6
带有降低的差向异构酶活性的变体突变菌株的制备
突变菌株Pf201和Pf20118提供了体内制作藻酸盐的工具，分别具有约30％古洛糖醛酸盐残基含量和纯的甘露糖醛酸。具有在约0和30％之间的中间量古洛糖醛酸盐(古洛糖醛酸盐残基)含量的藻酸盐也可被制作。获得这些菌株的一个途径是从操纵子中删除差向异构酶基因，然后将该由启动子控制的基因引入到质粒或转位子上。质粒pMG53如表1所述构建，该质粒包含algG的变体，其中，内部40％的基因被移走。然后将该质粒转移到Pf201中，通过同源重组，获得包含该删除的菌株，命名为Pf201ΔalgG。该菌株不能生产藻酸盐，尽管它生产小的寡糖醛，在非还原末端包含一个不饱和的残基。质粒pCNB111是自杀质粒，其包含一个基于Tn5的小型转位子。基因可被克隆入该小型转位子，它们的表达由可诱导的Pm启动子控制。野生型algG-基因被转移到该质粒中，如表1所述，创建质粒pKB10。该质粒被结合到Pf201ΔalgG中，如在“材料和方法”中所描述的，通过同源重组。但是在这种情况中，合并入染色体依赖于转位子，而非同源性。所得菌株命名为
Pf201ΔalgG::TnkB10。该菌株即使在诱导物不存在的情况下也能生产藻酸盐，但是随着诱导物浓度的提高，聚合物的量提高(未显示)。当产物用NMR和质谱仪分析时，发现该菌株生产藻酸盐和低聚物的混合物。pKB10也被转移到Pf20118，创建菌株Pf20118::TnKB10。该菌株生产野生型藻酸盐的混合物，包含30％G和甘露糖醛酸(结果未显示)。这些结果显示，差向异构酶不仅对于藻酸盐生产是必须的，它也作为蛋白复合物的一部分。为了获得同源的藻酸盐，仅可存在一种形式的藻酸盐。
一种制备带有降低的差向异构酶活性的变体菌株的方法是用编码具有降低活性的突变蛋白的突变基因交换野生型algG。现在建立了一种用于获得所述突变体的方法，应用Pf201ΔalgG和pKB10的特性。大肠杆菌S17.1λ-pir(pKB10)的指数生长细胞(OD600nm：0.5)通过亚硝基胍诱变。将来自5ml培养基的细胞在TM-缓冲液(1.0g/l(NH4)2SO4、0.1g/l MgSO4×7H2O、5mg/l Ca(NO3)2、0.25mg/l FeSO4×7H2O、5.8g/l马来酸、6.05g/lTris，pH用NaOH调节到6.0)中洗涤2次。将细胞重新悬浮在2.85mlTM-缓冲液中，用100μg/ml亚硝基胍处理，37℃进行30分钟。将悬浮液在冰上冷却3分钟，然后通过离心将细胞沉淀，在5ml LB中洗涤3次。加入甘油至终浓度10％，将该重新悬浮的悬浮液冰冻在-80℃。仅0.007％的细胞在诱变后存活。质粒被从解冻的细胞中分离，转化到大肠杆菌S17.1λ-pir中。该质粒现在命名为pKB10-M*，以强调它们构成了一个pKB10突变方式的文库。
  然后将pKB10-M*结合到荧光假单胞菌Pf201ΔalgG中，如“材料和方法”部分(在“同源重组”中)所描述的，除了在与荧光假单胞菌菌株混合之前，将100μl冰冻的大肠杆菌S17.1λ-pir(pKB10-M*)直接培养在10ml LB-培养基中，生长2小时。每个培养的OD600nm是0.4。在培养在LA-培养基上30℃、36小时后，将结合混合物涂布在包含40μg/ml卡那霉素(Km)的PIA-培养基(Difco)上。只有那些转位子TnKB10-M*已经整合入染色体的荧光假单胞菌细胞将生长在该培养基上，引物pKB10和它的衍生物不能在荧光假单胞菌中复制。即使在诱导物不存在的情况下，一些AlgG被从荧光假单胞菌中的Pm-启动子表达，其水平足以在菌株Pf201ΔalgG::TnKB10中引起黏液型克隆。约0.5％的克隆是非-黏液型的，表明或者这些细胞中algG基因由于Pm-启动子或mRNA前导序列中产生突变而不表达，或者或AlgG蛋白是无功能的。
每个板(245×245mm)包含4-5000个克隆，并且使用克隆挑取工具(GenetixQ-pixII，Genetix Limited，英国)，其中1200至1400可从板上挑出。调节参数使小的(非黏液型)克隆不被挑出。开发了一种筛选包含突变文库的菌株的方法。在该筛选中，参数细胞生长、藻酸盐生产(应用M-和G-裂解酶的混合物测量)和G-含量(仅应用G-裂解酶测量)被分别测量。
细菌生长
使用Genetix Q-pixII克隆挑取工具，将克隆一式两份加入到两种不同的置于96孔板的液体培养基中。为了保存克隆，一份生长在110μl包含三氯生(0.025g/l)和卡那霉素(Km，40mg/l)的LB-培养基中，在25℃培养48小时。每个孔中加入甘油(60％，40μl)，将溶液混合，并将板冰冻在-80℃。
另一份生长在0.5×PIA(细菌蛋白胨(10g/l)、NaCl(2g/l)、MgCl2(0.7g/l)、K2SO4(5g/l)、甘油(5g/l)、三氯生(0.025g/l)和Km(40mg/l))中，加入m-甲苯甲酸盐(诱导物)至0.1mM。细菌生长在灭菌的Nunc 96-V-孔板中，每孔包含110μl培养基，在25℃培养72小时，使用900rpm、3mm振幅轨道运动。
藻酸盐生产的测定
在每个孔中加入NaCl(0.2M，120μl)，离心(3900g，200℃，30分钟)使细胞沉淀。从每孔中转移50μl上清到Nunc96-flatwell板上。通过在每个孔中加入NaOH(0.6M，10μl)使藻酸盐脱去乙酰基，混合25秒，在室温培养1小时。然后加入100μl裂解酶反应缓冲液(50mM Tris-HCl，1.5％NaCl(pH7.5))，溶液混合60秒。
从每孔中转移75μl至Costar-UV 96-孔板。再加入150μl裂解酶反应缓冲液，溶液混合25秒。读取230nm(A2)的吸光率，然后每孔中加入8μl的G-特异的藻酸盐裂解酶(0.2u/ml)。溶液混合25秒，室温下培养60分钟。溶液再次混合25秒，读取A230nm(A2)。然后每孔加入8μl的M-特异的藻酸盐裂解酶(1u/ml)，溶液混合25秒，再室温下培养60分钟。溶液再次混合25秒，读取A230nm(A3)。加入的裂解酶的吸光率被从A2和A3读取值中减除。使用已知成分的藻酸盐(由Pf20118产生的多聚甘露糖醛酸盐，以及由Pf201产生的具有30％G-含量的藻酸盐)作为本测定的标准。
基于以下公式计算藻酸盐的总量：
Aalg＝A3-A1
通过比较样品的Aalg与具有已知藻酸盐浓度的标准的Aalg，计算样品中的藻酸盐浓度。
古洛糖醛酸盐(G)含量的测定
样品中相对G-含量(Gr)通过以下公式计算：
Gr＝(A2-A1)/(A3-A1)
通过比较样品的Gr和标准的Gr，计算样品中的G-含量。
1万克隆通过这种途径来筛选，选出少数候选克隆具有改变的活性，但不是零。然后使这些突变体在摇瓶中生长，如“材料和方法”中描述的。使用的PIA-培养基中加入了三氯生(0.025g/l)、卡那霉素(40mg/l)和m-甲苯甲酸盐(0.1mM)，生产的藻酸盐通过NMR分析，如“材料和方法”部分所描述的。一种突变体产生包含仅13％古洛糖醛酸盐残基的藻酸盐，而野生型产生包含约30％古洛糖醛酸盐残基的藻酸盐(表4)。也发现一些产生纯的甘露糖醛酸的其它菌株。该方法使筛选比野生型产生更少古洛糖醛酸盐的突变形式的AlgG成为可能。
为了生产进一步的产生所需藻酸盐产物的变体突变菌株，可使用已知的PCR技术来使突变基因恢复，使用同源重组，克隆入pMG48并转移入Pf201或任何实际上可过量生产的菌株，如在前面的描述中所描述的。类似于甘露糖醛酸生产菌株：Pf2012、Pf2013、Pf20118和Pf20137，在algG中的一个点突变影响差向异构作用，而不影响藻酸盐的生产量。
实施例7
具有降低的差向异构酶活性的变体突变菌株的制备
一种制备具有降低的差向异构酶活性的变体突变菌株的可选的方法是用编码低活性突变蛋白的突变基因交换野生型algG。四种不同的氨基酸取代物显示在表3中，获得差向异构酶阴性的AlgG突变体。在这四种情况中，氨基酸的变化影响氨基酸的长度或电荷，它们中的两种长度和电荷特性都发生了改变。通过实施例6中描述的方法，通过对突变体测序，也可鉴定出可能的附加氨基酸。在这些氨基酸中，编码更多保守性变化的algG的可选择的等位基因通过位点特异的诱变制造，使用pMG26作为模板。制作诱变引物，其包含一个编码新的氨基酸的密码子，加上约10-15个与已知序列相同的核苷酸。在Ser337的突变将毁坏SmlI位点，用于其它氨基酸的引物优选包含静止突变，引入一个限制酶位点，以协助鉴定新的突变菌株。用于每条链的引物进行合成，并如“材料和方法”中所描述的进行诱变。然后将突变的algG-等位基因以2.7kb BspHI-PstI消化的DNA片段转移到用NsiI-NcoI消化的pMG48。所得质粒转移到Pf201，选择非黏液型的、四环素抗性的、在包含XGal的琼脂板上呈现蓝色的转位结合子。在生长后，一些选择的克隆连续转移到LB-培养基中，双重组子在包含XGal的琼脂板上呈现白色、黏液型克隆，对四环素敏感。可扩增这些候选克隆的algG，使用引物对PfalgG5f和PfalgG3r。扩增的产物1.7kb长。如果移走一个限制位点，或通过引物引入，正确的突变体可通过使用相应的限制酶来鉴定。可选择地，候选克隆通过DNA-测序来验证。
突变菌株生长在摇瓶中，如“材料和方法”中描述的方法分离产生的藻酸盐。藻酸盐的量和G-含量通过M-裂解酶和G-裂解酶确定，如“材料和方法”中所述。从感兴趣的菌株所得结果通过NMR-光谱验证。
实施例8
带有用于调节藻酸盐产量的可诱导Pm启动子的变体突变菌株Pf201MC的制备
已知Pm启动子以及它的效应蛋白XylS是一种强效可诱导启动子，其可被用在很多革兰氏阴性菌中，Blatny等，1997，63，Appl.Environ.Microbiol.p.370-379。经常使用的诱导物是甲苯甲酸盐，其可通过细菌膜自由地扩散。荧光假单胞菌菌株Pf0-1目前已经在JGI(The DOE Joint Genome Institute)上登出了序列(http://spider.jgipsf.org/JGI microbial/html/pseudomonas/pseudo homepage.html)。该菌株的藻酸盐操纵子与已知的来自其它假单胞菌种类的藻酸盐操纵子序列相比较，我们发现，它们的结构是相似的。所有测序的生产假单胞菌藻酸盐的种类也具有相同的保守的开放读框，位于藻酸盐启动子的上游。它潜在地编码一种蛋白，其功能是未知的。本实验的目的把终止密码子下游的序列交换为该开放读框，并把起始密码子的上游交换为algD，藻酸盐操纵子的第一个基因，带有编码XylS的序列，Pm启动子和来自载体pJB658的Shine-Dalgarno序列描述在Blatny等，1997，38，p.35-51。多数DNA-片段，其在pJB658中分离xylS和Pm启动子，被移走。
第一步是克隆假设蛋白(简写的hyp)的3’部分和algD的5’部分，以获得用于插入的侧序列。当菌株Pf0-1的algEGXLIJFA序列与NCIMB10525序列相比较时，发现该两个序列不是相同的。然后使用部分hyp和algD基因构建引物，它们在一些种类中高度保守。Hyp的3’部分作为0.7kb BspLU11I-SpeI-消化的PCR片段(使用表2中的引物HypBspLU11I和HypSpel)被克隆入自杀载体pMG48中，生成pHE139。algD的5’部分以0.8kb NdeI-NsiI限制的PCR片段被克隆入NdeI-PstI-限制的pJB658celB中，生成pHE138。然后，通过一系列的克隆步骤(表1)，构建替换的载体pMC1，参见图5。
通过结合，将质粒转移入菌株Pf201，如“材料和方法”中描述的。选择XGal和四环素抗性/敏感性来筛选重组子和随后的双重组。选择在包含1mM甲苯甲酸盐的PIA-培养基上比在不包含甲苯甲酸盐的培养基上更具黏液型特性的克隆，进行进一步PCR分析。应用引物对HypBspLU11I和AlgDNsiI(表2)，预期的野生菌株的PCR产物长度为2.3kb，而突变菌株是3.0kb。选出的菌株被命名为Pf201MC。然后将该菌株在作为诱导物的甲苯甲酸盐(0.025mM)不存在和存在下进行发酵。在发酵过程中使用PM5-培养基和标准条件，如“材料和方法”中所描述的。非诱导的培养每升培养基生产3.5g藻酸盐，而诱导的培养每升培养基生产13g藻酸盐。突变菌株Pf201MC保藏在NCIMB中，保藏编号为41145。
实施例9
使用可诱导的突变的Pm启动子调节藻酸盐生产
野生型Pm-启动子能够发挥作用，但是，非诱导水平的表达是相当高的。目前已经发展了一种方法，筛选所述启动子的突变体，基于Winther-Larsen等，Metabol.Eng.(2000)，2，p.92-103。改变原始的pJT19-bla，在Pm启动子的上游插入一条终止序列和一个AflIII位点，启动子下游的Spel位点改变为BspLU11I位点。新的质粒命名为pIB11。在该质粒中，Pm启动子带有独立的XbaI和BspLU11I限制位点。然后，覆盖该DNA片段的两条互补的50bp DNA-低聚体被合成。选择条件以在使这些限制位点侧翼链的核苷酸获得约12％的错误率。相应的野生型链也被合成。然后，通过退火每个包含带有互补野生型寡核苷酸的突变体的寡核苷酸，制作一个双链的寡核苷酸文库。寡核苷酸的末端被构建成可与由XbaI和BspLU11I限制的pIB11互补。然后将退火的寡核苷酸连接到由XbaI和BspLU11I限制的pIB11上，获得50000转化子。在大肠杆菌中，该文库必须进行筛选，使用青霉素抗性作为标记。但是，荧光假单胞菌已经存在相当高的β-内酰胺抗性。针对β-内酰胺酶的基因用编码荧光素酶的基因交换，如表1中所描述的，创建包含野生型启动子的载体pHH100以及包含启动子文库的pHH100-文库。pH100-文库包含8000个独立的转化子。然后通过如“材料和方法”中所述结合，将其转移到荧光假单胞菌中。
使用Wood，K.V.和DeLuca，M.(1987，Anal.Biochem.161：501-507)所描述的测定，筛选突变的Pm启动子的文库，找出具有荧光素酶活性的。为了获得可再现的结果，我们发现细菌首先必须生长在包含110μl带有40μg/ml卡那霉素(Km)的液体PIA培养基的微量滴定板上(25℃，48小时，900rpm摇动)。然后将一些细菌稀释在新的培养基中，使用一种灭菌的印章来转移，然后印在两张尼龙滤纸上。滤纸置于带有和不带有诱导物(1mMm-甲苯甲酸盐)的PIA-培养基上，细菌面朝上，在30℃培养14小时。然后将滤纸置于包含3ml虫萤光素(Promega)(1mM在0.1M柠檬酸钠中，pH5.0)的Petri盘上，摇动直至液体分布均匀，培养10分钟。将其置于滤纸上以移走液体，并向下放置在透明的塑料膜上。一张干燥的滤纸置于其上，以移走残留的潮湿。然后将尼龙膜曝光10分钟，使用Kodak 2000IR相机。通过该方法筛选到1200克隆，鉴定出84个来自未加诱导物的生长克隆显示没有或低的活性，在诱导物存在下生长的克隆具有可检测的活性。这些克隆中79个被重新筛选，与野生型pHH100相比，其中75个在诱导物不存在下显示明显的低活性。
这些克隆中6个生长在10ml包含50mg/l卡那霉素的LB中。选出5个，因为在没有诱导物时它们的表达水平非常低，第6个(Pf201(pHH100-E1))在不加入诱导物时具有中等水平的表达，但是在诱导物存在下具有明显高的表达水平。然后固定阶段培养(100μl)被转移到两个包含10ml新鲜LB-培养基的摇瓶中，在加入m-甲苯甲酸盐至终浓度1mM之前培养2小时。在诱导进行14小时后，收集培养液，将90μl培养液加入到包含10μl缓冲液(1M K2HPO4、20mM EDTA、pH7.8)的1.5ml试管中，冰冻在-80℃。使用Promega公司的荧光素酶测定系统(Cat.nr.E1500)测量荧光素酶活性(表5)。该方法证明，对于寻找与野生型相比，达到不仅非常低的非-诱导表达水平，也具有低的非-诱导表达水平以及仍然相当高的诱导表达水平的突变的启动子是有用的。结果见下表。
表5在荧光假单胞菌中Pm表达的荧光素酶活性
克隆 非诱导的 细胞     诱导的细胞 概率c
活性a ％b 活性a ％b
NCIMB10525(pHH100) 11.6 100 605 100 512
NCIMB10525(pHH100-A2) 0.7 6.0 3.2 0.5 5
NCIMB10525(pHH100-B1) 1.3 11 5.7 0.9 4
NCIMB10525(pHH100-D6) 1.2 11 15 2.4 12
NCIMB10525(pHH100-D9) 0.5 4.2 8.7 1.4 18
NCIMB10525(pHH100-E1) 7.8 67 1050 173 134
NCIMB10525(pHH100-G5) 0.5 4.3 69 11.4 138
菌株NCIMB被用作空白，没有可测量的活性。显示了每种菌株的两个独立的接种物所得平均结果。a：活性以任意单位给出(其值依赖于仪器的设置)。b：活性以野生型水平的百分数的百分数表示。c：诱导的/非诱导的值。
实施例10
甘露糖醛酸藻酶盐产物的体外差向异构作用
如实施例4中所述，产生的甘露糖醛酸溶解在缓冲液(Mops(50mM)、CaCl2(2.5mM)、NaCl(10mM)，pH6.9)中，至0.259％甘露糖醛酸藻酸盐的浓度。如Ramstad等，Enzymeand Microbial Technology，(1999)，24，p.636-646所述生产和纯化甘露糖醛酸C5-差向异构酶AlgE4，加入到甘露糖醛酸，浓度为1mg酶/200mg甘露糖醛酸。该溶液在37℃培养23小时。通过酸沉淀藻酸盐，终止差向异构作用。然后将藻酸盐重新溶解在蒸馏水中，用碱中和。在藻酸盐溶液中加入NaCl至0.2％浓度，加入1体积的乙醇(96％)沉淀藻酸盐。沉淀的藻酸盐用70％乙醇洗涤3次，用96％乙醇洗涤2次，冻干。冻干的藻酸盐进一步处理和用NMR分析，如“材料和方法”中所述。所得产物是几乎完全聚合的交互的藻酸盐(PolyMG，表6)。
Poly MG重新溶解在缓冲液(Mops(50mM)、CaCl2(2.5mM)、NaCl(10mM)，pH6.9)中。如Ramstad等，Enzyme and Microbial Technology，(1999)，24，p.636-646所述生产和纯化甘露糖醛酸C5-差向异构酶AlgE4，除了将其仅通过离子交换层析进行纯化。加入到甘露糖醛酸，浓度为1mg酶/200mg甘露糖醛酸。该溶液在37℃培养4天。在1、2和3天培养后，加入附加的AlgE1(1mg酶/200mg甘露糖醛酸)。如前所述终止差向异构作用。如前所述分离藻酸盐和NMR分析。差向异构作用的结果是藻酸盐具有＞95％的G-含量(表6)。
表6在用AlgE4和AlgE1对甘露糖醛酸进行差向异构作用后，藻酸盐的组分
藻酸盐 FG  FM  FGG  FGM/MG  FMM
甘露糖醛酸 0  1.0  0  0  1.0
PolyMG(甘露糖醛酸+AlgE4) 0.45  0.55  0  0.45  0.1
PolyG(PolyMG+AlgE1) ＞0.95  ＜0.05  ＞0.9  ＜0.05  ＜0.02
实施例11
利用不同碳源的藻酸盐生产
已知假单胞菌具有利用许多化合物进行生长的能力。在本实施例中，使用PM5-培养基取代果糖作为实际的碳源，将不同的碳源变换为藻酸盐的能力得到了证实。在发酵实验中，培养基组分、生长条件和藻酸盐浓度分析如“材料和方法的全面描述”中所描述的进行，除非另外作出说明。
生产藻酸盐的能力通过乙醇(甘油)、单糖(果糖，葡萄糖)和二糖(乳糖)(见表7)证明。
荧光假单胞菌不编码β-半乳糖苷酶，从而不能利用乳糖作为碳源，但它能生长在葡萄糖和半乳糖上。我们通过如在“描述”中同源重组那一段所描述的结合，将编码大肠杆菌β-半乳糖苷酶(LacZ)和乳糖通透酶(lactose permase)(LacY)的pHM2(描述在Mostafa，H.E.，Heller，K.J.，Geis，A.2002.Appl.Environment.Microbiol.68：2619-2623)转移入菌株Pf201。所得菌株成为Pf201(pHM2)。为了避免质粒遗失的问题，使用质粒pCNB111的衍生物，lacZ和lacy可优选插入到染色体中。乳清，从干酪生产中所得废品，包含高含量的乳糖。当Pf201(pHM2)生长在包含27.5％经超滤的乳清的PM5-培养基中时，相当于培养基中含50.9g/l乳糖，生产出13.3g/l的藻酸盐。
所得结果给出在表7中，表明通过藻酸盐过量表达突变体菌株，可利用大量碳源生产大量藻酸盐。
表7通过利用不同的碳源(C-源)，藻酸盐的生产
菌株 C-源 C-源的量(g/l) 藻酸盐的体积产量(g/l)  C-产量(g藻酸盐/g C-源)
Pf20118 果糖1) 40 16.0  0.40
Pf20118 葡萄糖2) 40 13.0  0.33
Pf20118 甘油1) 40 17.1  0.43
Pf201(pHM2) 乳糖3) 51 13.3  0.26
1)所有碳源(40g/l)在发酵接种前加入。
2)在发酵开始之前，4.5g/l葡萄糖加入到培养基中。剩下的葡萄糖(35.5g/l)以连续的速率给料(1g葡萄糖/升，小时)。在接种10小时后葡萄糖-给料开始。
3)包含经超滤的乳清作为主要成分乳糖以及矿物作为次要成分，加入到PM5培养基中。经超滤的乳清也包含微量的牛乳蛋白。在加入超滤的乳清后，在培养基中乳糖浓度是51g/l。在发酵接种前加入经超滤的乳清。

Claims (26)

1.至少一种荧光假单胞菌突变菌株的生物纯的细菌培养物，其特征在于，所述菌株每升培养基至少生产10g藻酸盐。
2.如权利要求1所述的至少一种荧光假单胞菌突变菌株的生物纯的细菌培养物，其特征在于，所述菌株每升培养基每40-55g碳源至少生产10g藻酸盐。
3.如权利要求1所述的至少一种荧光假单胞菌突变菌株的生物纯的细菌培养物，其特征在于，所述菌株每升培养基每50-55g碳源至少生产10g藻酸盐。
4.如权利要求1所述的至少一种荧光假单胞菌突变菌株的生物纯的细菌培养物，其特征在于，所述菌株每升培养基每40g碳源至少生产10g藻酸盐。
5.如权利要求1所述的纯的荧光假单胞菌突变菌株，其特征在于，所述突变菌株选自：Pf201、Pf2012、Pf2013、Pf20118、Pf20137、Pf20118algIJΔ、Pf20118algFΔ、Pf20118AlgLH203R和Pf201MC。
6.如权利要求1所述的纯的荧光假单胞菌突变菌株，其特征在于，所述突变体能够生产大量仅由甘露糖醛酸盐残基组成的藻酸盐。
7.如权利要求5和6所述的纯的荧光假单胞菌突变菌株，其特征在于，所述突变体选自：Pf2012、Pf2013、Pf20118和Pf20137。
8.如权利要求1所述的纯的荧光假单胞菌突变菌株，其特征在于，所述突变体能够生产具有规定的古洛糖醛酸盐残基(G)-含量的藻酸盐，其含量在0和30％之间。
9.如权利要求1所述的纯的荧光假单胞菌突变菌株，其特征在于，所述突变体能够生产O-乙酰基数目未减少或减少的藻酸盐。
10.如权利要求5和9所述的纯的荧光假单胞菌突变菌株，其特征在于，所述突变体选自突变变体菌株Pf20118algIJΔ和Pf20118algFΔ。
11.如权利要求1、2、3、4或5所述的纯的荧光假单胞菌突变菌株，其特征在于，所述突变体能够生产分子量在50,000和3,000,000道尔顿之间的藻酸盐。
12.如权利要求11所述的纯的荧光假单胞菌突变菌株，其特征在于，所述突变体选自变体突变菌株Pf20118AlgLH203R。
13.如权利要求1、2、3、4或5所述的纯的荧光假单胞菌突变菌株，它包含一个由与天然存在的启动子不同的诱导型启动子调节的藻酸盐生物合成操纵子，并任选含有一种或多种效应基因。
14.如权利要求13所述的纯的荧光假单胞菌突变菌株，其特征在于，所述诱导型启动子是Pm启动子，并进一步包含效应基因xylS。
15.如权利要求13和14所述的纯的荧光假单胞菌突变菌株，其特征在于，所述突变菌株是Pf201MC。
16.生产如权利要求1所述的新的荧光假单胞菌突变菌株的方法，其特征在于：
(a)将荧光假单胞菌野生菌株与一种诱变剂接触，和
(b)使步骤(a)中处理的细菌在一种或多种抗生素存在下生长，和
(c)通过选择分离抗生素抗性的黏液型突变体；和
(d)确定步骤(c)分离的黏液型突变体的藻酸盐生产特性。
17.如权利要求16所述的方法，其特征在于，所述诱变剂是亚硝基胍。
18.如权利要求16或17所述的方法，其特征在于，步骤(a)中处理的细菌在β-内酰胺或氨基糖苷抗生素存在下生长。
19.如权利要求16或17所述的方法，其特征在于，步骤(a)中处理的细菌在羧苄青霉素存在下生长。
20.生产权利要求13所述的荧光假单胞菌突变菌株的方法，其特征在于：
(i)通过同源重组，荧光假单胞菌野生菌株的藻酸盐生物合成操纵子被一种诱导型启动子更换，和
(ii)通过同源重组、转位子诱变或通过质粒的方式，将任选的效应基因引入到(i)的细菌中，和
(iii)使突变体生长，然后通过选择进行分离，和
(iv)确定(iii)中分离的突变体的藻酸盐生产特性。
21.如权利要求20所述的方法，其特征在于，所述诱导型启动子是来自恶臭假单胞菌Tol-质粒的Pm，或突变的Pm启动子。
22.生产权利要求8所述的荧光假单胞菌突变菌株的方法，其特征在于
(a)将编码C-5差向异构酶的野生型algG基因克隆入一种质粒或小型转位子，并通过化学诱变或通过PCR进行诱变，
(b)构建一种荧光假单胞菌的藻酸盐生产菌株的衍生物，其缺少algG基因(ΔalgG-菌株)，和
(c)步骤(a)的诱变的algG的文库被转移到荧光假单胞菌的ΔalgG-菌株，并鉴定和测定所述包含质粒或转位子的菌株的藻酸盐生产和差向异构酶活性，和
(d)通过步骤(c)的测定，鉴定出包含质粒或转位子的菌株，其包含编码差向异构酶的突变algG，可提供古洛糖醛酸盐残基含量在0和30％之间的藻酸盐，和
(e)将突变的algG基因克隆入基因-置换载体，和
(f)然后将步骤(e)的基因置换载体转移到荧光假单胞菌的藻酸盐生产菌株，以用突变的algG基因置换其algG基因，并使它能够表达突变基因。
23.生产权利要求8所述的荧光假单胞菌突变菌株的方法，其特征在于，
a)通过位点-特异的诱变，在基因水平上将一种或多种通过诱变和其后的筛选鉴定为对于差向异构作用重要的氨基酸和与突变型和野生型AlgG-蛋白中产生的氨基酸都不同的氨基酸交换，和
b)将突变基因克隆入基因置换载体，并将该载体转移入荧光假单胞菌的生产藻酸盐的菌株中，其取代了野生型algG基因，并能够被表达。
24.如上述权利要求1-15中任何一项所述的至少一种荧光假单胞菌突变菌株的生物纯的细菌培养物的应用，它被用于生产藻酸盐。
25.如上述权利要求1-15中任何一项所述的至少一种荧光假单胞菌突变菌株的生物纯的细菌培养物的应用，它被用于大规模生产藻酸盐。
26.如上述权利要求1-15中任何一项所述的至少一种荧光假单胞菌突变菌株生产的藻酸盐的应用，它被用于制备食品或药物、化妆品、动物饲料、营养品等工业产品，或作为体外C-5-差向异构作用的中间产物。
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