JPH05344891A

JPH05344891A - エステラーゼをコードする遺伝子及び該遺伝子を含有する新規微生物

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Publication number: JPH05344891A
Application number: JP4312533A
Authority: JP
Inventors: Takeji Shibatani; 武爾柴谷; Saburo Komatsubara; 三郎小松原; Kenji Omori; 謙司大森; Hiroyuki Akatsuka; 浩之赤塚
Original assignee: Tanabe Seiyaku Co Ltd
Current assignee: Tanabe Seiyaku Co Ltd
Priority date: 1991-11-25
Filing date: 1992-11-24
Publication date: 1993-12-27
Anticipated expiration: 2011-03-13
Also published as: CA2083633A1; EP0544250B1; AU659237B2; US5487996A; TW212203B; JPH0824585B2; IL103846A0; ES2148160T3; DE69231145T2; AU2857192A; DE69231145D1; EP0544250A2; ATE193728T1; EP0544250A3; DK0544250T3; EP0837135A2; MY109510A

Abstract

(57)【要約】【構成】セラチア属微生物由来のエステラーゼをコー
ドする遺伝子、該遺伝子を有する高エステラーゼ生産性
変異株、該遺伝子をベクタープラスミドに組み込んだ組
換えプラスミド、該組換えプラスミドで形質転換された
新規微生物、該変異株または該新規微生物を培地で培養
し、菌体内外に生成したエステラーゼを採取することを
特徴とするエステラーゼの製法である。【効果】本発明の高エステラーゼ生産性変異株または
形質転換された新規微生物は、いずれもエステラーゼ生
産能が顕著に優れており、エステラーゼを容易に高純度
で大量生産することができる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、エステラーゼをコード
する遺伝子、該遺伝子を含有する組換えプラスミド、こ
の組換えプラスミドで形質転換された新規微生物、並び
に該微生物を用いるエステラーゼの製法に関する。

【０００２】

【従来の技術】近年、エステラーゼ等の酵素を利用して
加水分解反応を行う試みが盛んになされており、豚肝
臓、豚膵臓などの動物由来のエステラーゼや、アルスロ
バクター・ギロビホルムス、ゲオトリクム・カンジダ
ム、キャンディダ・シリンドラセ、シュードモナス・フ
ルオレッセンスなどの微生物由来のエステラーゼが知ら
れている。また、組換えＤＮＡ技術を用いて、リゾプス
・デレマー由来のエステラーゼを製造する方法も知られ
ている（特開平３−８７１７５）。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】しかしながら、動物由
来のエステラーゼは高価であるという問題があったり、
微生物由来のエステラーゼは、活性、安定性、基質特異
性などの点で満足しうるものではなかったり、あるいは
エステラーゼ生産株の生産能が十分でないなどの問題点
があった。

【０００４】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、鋭意研究
の結果、セラチア属の微生物からエステラーゼをコード
する遺伝子を得ることに成功すると共に、これをベクタ
ープラスミドに組み込んだ後、得られる組換えプラスミ
ドで宿主微生物を形質転換した場合には、エステラーゼ
生産能が顕著に増大した形質転換体が得られると共に、
この形質転換体を用いれば、エステラーゼを工業的有利
に製造し得ることを見い出し本発明を完成するに至っ
た。

【０００５】即ち、本発明は、セラチア属微生物由来の
エステラーゼをコードする遺伝子、該遺伝子を有する高
エステラーゼ生産性変異株、該遺伝子をベクタープラス
ミドに組み込んだ組換えプラスミド、該組換えプラスミ
ドを含む形質転換体、該形質転換体を培地で培養し、菌
体内外に生成したエステラーゼを採取することを特徴と
するエステラーゼの製法である。

【０００６】本発明のセラチア属微生物由来のエステラ
ーゼをコードする遺伝子は、１８３９塩基対のオープン
リーディングフレームを有する２本鎖のＤＮＡであっ
て、具体的には配列番号１又は配列番号２のＤＮＡ配列
を有するものがあげられる。

【０００７】かかるエステラーゼをコードする遺伝子の
供与微生物としては、セラチア属に属し、エステラーゼ
生産能を有する微生物であればいかなるものでも良く、
例えばセラチア・マルセッセンスＳｒ４１（微工研条寄
第４８７号）、セラチア・リケファシエンスＡＴＣＣ
27592、セラチア・マルセッセンスＡＴＣＣ 13880、
セラチア・マルセッセンスＡＴＣＣ 14764、セラチア
・マルセッセンスＡＴＣＣ 19180、セラチア・マルセ
ッセンスＡＴＣＣ 21074、セラチア・マルセッセンス
ＡＴＣＣ 27117、セラチア・マルセッセンスＡＴＣ
Ｃ 21212などが挙げられる。

【０００８】或いは野性株から突然変異によって誘導さ
れる各種アミノ酸要求性株、各種核酸要求株、或いは各
種ビタミン要求株等の変異株でもよく、かかる変異株と
しては、例えばセラチア・マルセッセンスＭ−１（微工
研条寄第４０６８号）があげられる。上記セラチア・マ
ルセッセンスＭ−１は、親株であるセラチア・マルセッ
センスＳｒ４１よりも２倍以上エステラーゼ生産能が増
加しており、配列番号２に記載されたＤＮＡ配列によっ
てコードされるエステラーゼ遺伝子を有している。該変
異株Ｍ−１は、セラチア・マルセッセンスＳｒ４１（微
工研条寄第４８７号）を、例えばエーデルバーグらの方
法〔バイオケミカル・アンド・バイオフィジカル・リサ
ーチ・コミュニケーションズ、第１８巻、７８８（１９
６５）〕によって、Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニ
トロソグアニジン（ＮＴＧ）で処理した後、乳化したト
リグリセリドを含有する寒天培地中で培養し、最も大き
なクリアゾーンを形成するコロニーを釣菌分離すること
により得ることができる。

【０００９】また同様にして、親株に対して１．５倍以
上エステラーゼ生産能が増加したセラチア・マルセッセ
ンスＧ２０５株も得ることができる。

【００１０】また、エステラーゼをコードする遺伝子を
組み込むベクタープラスミドとしては、形質転換細胞中
で複製可能なプラスミドであれば特に限定されないが、
例えばコピー数が１〜数千であり、アンピシリン、カナ
マイシン、クロラムフェニコールなどの薬剤に耐性なマ
ーカーを有し、かつlac 、tac 、trp など適当なプロモ
ーターを有するものが好ましい。更に、par 及び parＢ
などのプラスミド安定化遺伝子を含んでいるものであっ
てもよい。

【００１１】かかるプラスミドとしては、例えばｐＬＧ
３３９〔ジーン、１８巻、３３２（１９８２）〕、ｐＢ
Ｒ３２２〔ジーン、２巻、９５（１９７７）〕、ｐＵＣ
１８〔ジーン、３３巻、１０３（１９８５）〕、ｐＵＣ
１９〔ジーン、３３巻、１０３（１９８５）〕、ｐＨＳ
Ｇ２９８〔ジーン、６１巻、６３（１９８７）〕ｐＨＳ
Ｇ２９９〔ジーン、６１巻、６３（１９８７）〕などが
挙げられる。

【００１２】上記のベクタープラスミドは、市販のもの
を好適に使用し得る他、これらを保持する微生物菌体か
らクリアード・ライセイト法〔遺伝子操作実験法１２
５頁（高木康敬著，講談社、１９８０年）〕、アルカリ
リシス法〔モレキュラークローニング、マニアティス
等、３６８頁、（コールド・スプリング・ハーバー・ラ
ボラトリー、米国（１９８２））〕等の常法によって調
製することもできる。

【００１３】組換えプラスミドを組み込む宿主微生物と
しては、プラスミドで形質転換可能で、プラスミドがそ
の宿主内で複製し、プラスミドにコードされた遺伝子が
機能しうる蛋白として発現しうるものであれば、いかな
る微生物であってもよい。かかる宿主微生物としては、
例えばセラチア属微生物やエシェリシア属微生物があげ
られ、具体的には、セラチア・マルセッセンスＳｒ４１
及びそれから誘導される種々の変異株、例えば、セラチ
ア・マルセッセンスＭ−１、ＴＴ３９２株〔ジャーナル
オブバクテリオロジー、１６１巻、１（１９８
５）〕やエシェリシア・コリＫ１２ＤＨ５株〔モレキ
ュラークローニング、第２編、マニアティス等、Ａ１
０頁，コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー
米国（１９８９年）〕などがあげられる。

【００１４】エステラーゼをコードする遺伝子を含む染
色体ＤＮＡは、例えば微生物菌体をリゾチームで処理
し、更にラウリル硫酸ナトリウム、Ｎ−ラウロイルサル
コシン酸ナトリウム等の界面活性剤で処理した後、フェ
ノール、クロロホルム、エーテル等の有機溶媒で抽出す
ることによって除蛋白し、エタノールで沈澱せしめるな
どの常法〔ジャーナルオブモレキュラーバイオロ
ジー、３巻、２０８（１９６１）、バイオキミカエト
バイオフィジカアクタ、７２巻、６１９（１９６
３）〕により容易に調製することができる。

【００１５】エステラーゼ遺伝子を含む染色体ＤＮＡと
ベクタープラスミドＤＮＡからなる組換えプラスミドの
調製は、適当な制限エンドヌクレアーゼ（例えばＥｃｏ
ＲＩ，ＢａｍＨＩ，ＨｉｎｄＩＩＩ，ＳａｌＩ等）を用
いて染色体のＤＮＡ鎖とプラスミドのＤＮＡ鎖を切断し
た後、ＤＮＡリガーゼ（例えばＴ４ＤＮＡリガーゼや大
腸菌ＤＮＡリガーゼ等）で処理するか、或いはその切断
末端によってはターミナルトランスフェラーゼやＤＮＡ
ポリメラーゼ等で処理した後、ＤＮＡリガーゼを作用さ
せてＤＮＡ鎖を結合する等、この技術分野における常法
〔メソッドインエンザイモロジー、６８巻、４１
（１９７９）；遺伝子操作実験法１３５頁（高木康敬
著，講談社、１９８０年）〕により実施することができ
る。

【００１６】エステラーゼ生産能を有する組換えプラス
ミドを含む形質転換体の選択は、上記で得られる組換え
プラスミドを用いて、制限エンドヌクレアーゼ欠損性
で、かつエステラーゼ活性を有しない微生物菌体、例え
ばエシェリシア・コリＫ１２ＤＨ５株を形質転換し、次
いで得られる形質転換処理細胞を、該細胞が生育可能
で、かつ乳化したトリグリセリドを含む寒天培地、例え
ばポリオキシエチレンセチルアルコールエーテル（Ｂｒ
ｉｊ５８）で乳化したトリブチリンを含み、所定濃度の
抗生物質を有する栄養寒天培地、に塗布した後、３０〜
３７℃で１〜２日間培養し、得られるコロニーの中から
大きなクリアゾーンを形成する形質転換体を釣菌分離す
ることにより実施することができる。

【００１７】具体的には、例えば、低温下で細胞を塩化
カルシウム溶液で処理して宿主細胞の膜透過性を増大さ
せ、組換えプラスミドを宿主細胞中に取り込ませる方法
〔ジャーナルオブモレキュラーバイオロジー，５
３巻，１５９（１９７０）〕やエレクトロポレーション
法等の常法により、上記で調製した組換えプラスミドを
宿主微生物に導入する。

【００１８】上記形質転換体から、アルカリリシス法
によりプラスミドＤＮＡを抽出することにより、セラチ
ア・マルセッセンスのエステラーゼをコードする遺伝子
がベクタープラスミドに挿入された組換えプラスミドを
得ることができる。

【００１９】上記で得られた、目的の組換えプラスミド
は、宿主微生物での形質転換が容易なように、宿主微生
物と同種でかつ制限エンドヌクレアーゼ欠損株、例えば
宿主がセラチア・マルセッセンスＳｒ４１であれば、セ
ラチア・マルセッセンスのＴＴ３９２株に取り込ませて
組換えプラスミドを修飾した後、一旦組換えプラスミド
を単離し、これを宿主微生物に導入し、ついでこれから
目的微生物を分離することにより、形質転換体を得るこ
とができる。

【００２０】微生物への導入は、例えば高木と木住の方
法〔ジャーナルオブバクテリオロジー、１６１巻、
１（１９８５）〕により容易に実施でき、プラスミドの
単離は例えばアルカリリシス法により実施することが
できる。また、目的の形質転換体は、薬剤耐性のコロニ
ーを釣菌分離することにより得ることが出来る。宿主微
生物は、前記したものを好適に使用できるが、エステラ
ーゼ生産能のより高い菌株を宿主微生物として使用すれ
ば、さらに好ましい結果を得ることが出来る。

【００２１】かくして得られた本発明の微生物として
は、例えばセラチア・マルセッセンスＳｒ４１に、ｐＵ
Ｃ１９と約２．８ｋｂのエステラーゼ遺伝子を含むＳａ
ｌＩ−ＢａｍＨＩＤＮＡ断片からなる組換えプラスミド
を含有せしめたセラチア・マルセッセンスＴＡ５０２
５（微工研条寄第４０６７号）、セラチア・マルセッセ
ンスＳｒ４１に、ｐＢＲ３２２と約４．０ｋｂのエステ
ラーゼ遺伝子を含むＳａｌＩＤＮＡ断片からなる組換え
プラスミドを含有せしめたセラチア・マルセッセンスＴ
ＢＥ１０１等が挙げられる。これらの微生物は、いずれ
の菌株もセラチア・マルセッセンスＳｒ４１の形態的特
徴を有するものである。

【００２２】更に、本発明を微生物を使用してエステラ
ーゼを製造する場合には、上記のようにして得られた微
生物を培地で培養し、菌体内外に産生せしめたエステラ
ーゼを分離、採取することにより実施することができ
る。

【００２３】本発明において使用されるエステラーゼ生
産用培地としては、本発明の微生物が生育・増殖し得る
ものであれば、どのような培地であっても使用すること
ができる。例えば、炭素源としてはブドウ糖、庶糖、糖
蜜の如き糖類、フマル酸やクエン酸の如き有機酸または
グリセロールの如きアルコール類、アラニン、グルタミ
ン、アスパラギン等のアミノ酸を、窒素源としては、硫
酸アンモニウム、塩化アンモニウムの如き無機アンモニ
ウム塩または尿素、或いはペプトン、コーン・スティー
プ・リカー、酵母エキス、カゼイン加水分解物等を好適
に用いることができる。

【００２４】炭素源は、通常、培地に対し、１−１５重
量％、窒素源は０．１−２．０重量％の範囲で用いるの
が好ましい。また培地には必要に応じて、リン酸塩、マ
グネシウム塩、カリウム塩、カルシウム塩等の無機塩、
鉄、マンガン、銅、亜鉛等の金属イオンを適当量添加し
てもよく、合成培地を用いる場合には、必要に応じて、
例えば、ビタミン類或いはアミノ酸類を添加してもよ
い。更に、植物油、界面活性剤等のエステラーゼ生産誘
導物質、消泡剤や、微生物の組換えプラスミドの安定保
持に好ましい抗生物質等を添加することもできる。これ
らの培地は、ｐＨ５−８に調製して用いるのが好まし
い。

【００２５】培養は、常法によって実施することがで
き、例えば培地に微生物を接種後、振盪培養、通気培
養、静置培養、連続培養等のいずれの方法によっても行
うことができる。培養条件は、培地の種類、培養法によ
り若干異なるが、本発明の微生物が増殖する条件を適宜
選択すれば良い。通常は培養開始のｐＨを５〜８に調製
し、例えば２０〜４０℃で培養することが望ましい。培
養日数は通常１〜２日が適当である。

【００２６】培養菌体内外に産生されたエステラーゼ、
例えば培地中に含まれるエステラーゼは、無機塩類によ
る塩析、有機溶媒による分画沈澱、イオン交換樹脂、及
び各種カラムクロマトグラフィーによる吸脱着法、ゲル
濾過法、蛋白沈澱剤を利用する方法などの公知方法によ
り、又はこれらを適宜組み合わせることによって分離、
採取することができる。また菌体内に蓄積されたエステ
ラーゼは、摩擦型破砕装置ダイノミル（Dyno Mill)など
物理的な手法、あるいは、リゾチーム処理など化学的な
手法により菌体を破砕し、その細胞抽出液から上記と同
様な方法で分離、採取することができる。

【００２７】なお、本発明のエステラーゼをコードする
遺伝子は、この明細書において具体的に開示されたＤＮ
Ａ配列のみに限定されるものではなく、ＤＮＡの挿入、
欠失、置換など、自明の変更を行わせたＤＮＡ配列をも
含むものである。すなわち、エステラーゼをコードする
遺伝子のＤＮＡ配列をもとにデザインした合成変異ＤＮ
Ａプライマーを用いた試験管内人工変異や、蟻酸、ヒド
ラジン亜硫酸などの化学変異剤を用いて、直接に試験管
内で遺伝子に変異を導入して改変を加えたものや、エス
テラーゼ生産菌株に変異処理、例えばＮＴＧ処理やＵＶ
処理を行って変異を誘発させた菌株から得られた変異エ
ステラーゼ遺伝子も本発明のエステラーゼをコードする
遺伝子に含まれるものである。

【００２８】以下、実施例を挙げて本発明を更に具体的
に説明する。なお、実施例におけるエステラーゼ活性の
測定は主に簡便法（大日本製薬製リパーゼキットＳを用
いる方法）により行った。また、オリーブ油を基質と
し、ｐＨ８．０、３７℃で２０分間酵素反応させ、１分
間に１μｍｏｌの脂肪酸を遊離する酵素量を１単位とす
る活性測定法も併用した。また、以下の実施例で使用し
た培地の組成は、以下に示す通りである。（組成におけ
る％は、特にことわらない限り、Ｗ／Ｖ％を表わ
す。）。

【００２９】ＬＢ培地：バクトトリプトン（ディフコ社
製）１．０％、バクトイ−ストエキストラクト（ディフ
コ社製）０．５％、塩化ナトリウム０．５％。

【００３０】ＬＢＧ平板培地：バクトトリプトン（ディ
フコ社製）１．０％、バクトイ−ストエキストラクト
（ディフコ社製）０．５％、塩化ナトリウム０．５％、
ゲランガム（和光純薬製）１．０％。

【００３１】トリブチリン含有ＬＢＧ平板培地：トリブ
チリン０．５ｖ／ｖ％、ポリオキシエチレンセチルアル
コールエーテル０．５％、アンピシリン０．００５％を
含むＬＢＧ平板培地。

【００３２】エステラーゼ生産培地：デキストリン１．
０％、ミースト２．０％、硫酸アンモニウム０．２％、
リン酸１カリウム０．１％、硫酸マグネシウム７水和物
０．０５％、塩化カルシウム２水和物０．０１％、硫酸
第１鉄７水和物０．００１％、Ｔｗｅｅｎ８００．５
％、カラリン０．１％。

【００３３】

【実施例】

実施例１（１）エステラーゼをコードする遺伝子を含む染色体Ｄ
ＮＡの取得セラチア・マルセッセンスＳｒ４１（微工研条寄第４８
７号）を、ＬＢ培地２００ｍｌ中、３０℃で一夜好気的
に振盪培養し、遠心分離により集菌した。この菌体を２
００ｍｌの０．９％塩化ナトリウム水溶液で１回懸濁
後、遠心集菌することによって菌体を洗浄した。つい
で、この菌体をリゾチウム２００ｍｇを含む５０ｍＭト
リス塩酸−５０ｍＭエチレンジアミン四酢酸二ナトリウ
ム（ｐＨ７．５）水溶液２００ｍｌに懸濁し、室温で１
時間放置した。

【００３４】この溶液に、０．５％濃度になるようにラ
ウリル硫酸ナトリウムを加え、更にプロテナーゼＫを加
えて５０℃で３時間緩やかに振盪させ菌体を溶解させ
た。この溶解物に、１０ｍＭトリス塩酸−１ｍＭエチレ
ンジアミン四酢酸二ナトリウム（ｐＨ８．０）水溶液
（以下ＴＥ）で飽和したフェノールを等量加え、２回抽
出を行った。ＴＥで飽和したフェノールとクロロホルム
の等量混合液で２回抽出した後、エタノール沈澱させ、
沈澱物をＴＥに溶解することにより、エステラーゼをコ
ードする遺伝子を含む染色体ＤＮＡを２．５ｍｇ含有す
るＴＥ溶液を調製した。

【００３５】（２）組換えプラスミドＤＮＡの調製上記（１）で調製した染色体ＤＮＡ２０μｇを制限酵素
ＳａｌＩを用いて完全分解した。これをＴＥ飽和フェノ
ールとクロロホルムの等量混合液で２回抽出し、０．５
倍量の７．５Ｍ酢酸アンモニウムを加え、その２倍量の
エタノールを加えて沈澱させ、ＤＮＡを回収した。

【００３６】次に、同じ制限酵素で完全分解したプラス
ミドベクターｐＵＣ１９のＤＮＡ０．５μｇを０．４単
位のアルカリホスファターゼ（宝酒造製）で５６℃，１
時間処理することによって脱リン酸化した後、ＴＥ飽和
フェノールとクロロホルムの等量混合液で２回抽出し、
更に０．５倍量の７．５Ｍ酢酸アンモニウムを加え、そ
の２倍量のエタノールを加えて沈澱させ、プラスミドベ
クターＤＮＡを回収した。この脱リン酸化プラスミドベ
クターと上記の回収染色体ＤＮＡ３μｇとを混合し、宝
酒造社製ＤＮＡライゲーションキットを用いて、４℃で
１６時間反応させてＤＮＡ鎖の連結反応を行うことによ
って、組換えプラスミドＤＮＡを作製した。

【００３７】（３）組換えプラスミドによる形質転換と
大腸菌を宿主とするコロニーバンクの作製大腸菌ＤＨ５株の細胞を、ハナハンの方法〔ジューナル
オブモレキュラーバイオロジー、１６６巻、５５７
頁、（１９８３）〕に従って処理し、上記（２）で作製
したプラスミドＤＮＡを含有する反応液を加えることに
よって、形質転換処理を行う。ついでこの細胞を、アン
ピシリン（５０μｇ／ｍｌ）を含むＬＢＧ平板培地に塗
布し、３７℃で一夜培養した。かくしてセラチア・マル
セッセンスＳｒ４１株の染色体ＤＮＡの断片が挿入され
た組換えプラスミドを含む形質転換体約２００００株を
得た。

【００３８】（４）エステラーゼをコードする遺伝子を
含む形質転換株の分離と同定トリブチリン含有ＬＢＧ平板培地にエステラーゼ生産菌
株を植菌すると培地中に生産されたエステラーゼによっ
てトリブチリンが分解されて脂肪酸が出来、脂質の乳化
状態が変化してコロニー周辺に円形のクリアゾーンが形
成される。この現象を利用して形質転換体をスクリーニ
ングした。

【００３９】上記（３）で得られた形質転換体約２００
００株をトリブチリン含有ＬＢＧ平板培地に植菌して３
７℃で一夜培養した結果、ＳａｌＩによるＤＮＡバンク
の中からクリアゾーンを形成する菌株が１株得られた。

【００４０】一方、セラチア・マルセッセンスＳｒ４１
株をトリブチリン含有ＬＢＧ平板培地で一夜培養すると
クリアゾーンの形成が認められたが、大腸菌ＤＨ５株及
びプラスミドベクターｐＵＣ１９を有する同株はこのト
リブチリン含有ＬＢＧ平板培地で３７℃一夜培養しても
クリアゾーンの形成は認められないことから、このクリ
アゾーンの形成はエステラーゼに由来するものと考えら
れる。

【００４１】また、クリアゾーンを形成する形質転換体
を２００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む６０ｍｌのＬ
Ｂ培地で３７℃一夜好気的に振盪培養した後、集菌し、
２０ｍｌの２００ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）
に懸濁した。超音波にて菌体を破砕して得られた細胞抽
出液について、簡便法によりエステラーゼ活性を測定し
たところ１．５×１０³単位のエステラーゼ活性が認め
られた。更に、前記細胞抽出液についてＳＤＳポリアク
リルアミドゲル電気泳動を行った結果から、セラチア・
マルセッセンスＳｒ４１株の培養上清から得た部分精製
エステラーゼ標品と同じ位置に、ベクターのみを保持す
る大腸菌ＤＨ５株には存在しない新たなバンドが存在す
ることがわかった。

【００４２】実施例２プラスミドの解析実施例１（４）で得た形質転換体の細胞からプラスミド
ＤＮＡを常法〔モレキュラークローニング、マニアテ
ィス等３６８頁、コールド・スプリング・ハーバー・
ラボラトリー米国（１９８２）〕に従って調製し、各
種制限酵素で切断後、アガロース電気泳動を行った。そ
の結果、このプラスミド（以下、ｐＬＩＰＥ１０１と称
する）には約４．０ｋｂのＳａｌＩＤＮＡ断片が含まれ
ていることがわかった。このｐＬＩＰＥ１０１に含まれ
る約４．０ｋｂの挿入ＤＮＡ断片の制限酵素切断地図を
図１に示す。

【００４３】次にプラスミドｐＬＩＰＥ１０１の約４．
０ｋｂＳａｌＩＤＮＡ断片を各種制限酵素で切断し、各
ＤＮＡ断片をｐＵＣ１９にサブクローニングして大腸菌
ＤＨ５を形質転換させ、その形質転換体を前記と同様に
してトリブチリン含有ＬＢＧ平板培地で培養して、クリ
アゾーンの形成の有無を調べた。

【００４４】各ＤＮＡ断片についての制限酵素切断地図
は図２に示す通りであるが、約２．８ｋｂのＳａｌＩ−
ＢａｍＨＩＤＮＡ断片を含むプラスミド（ｐＬＩＰＥ１
１１）と約２．６ｋｂのＳａｌＩ−ＢｓｔＰＩＤＮＡ断
片を有するプラスミド（ｐＬＩＰＥ１２１）を有する大
腸菌ＤＨ５にクリアゾーンの形成とエステラーゼ活性
（簡便法による測定）が認められた。しかし、約１．９
ｋｂのＳａｌＩ−ＰｖｕＩＩＤＮＡ断片を含むプラスミ
ド（ｐＬＩＰＥ１３１）、約１．７ｋｂのＳａｌＩ−Ｂ
ｓｔＰＩＤＮＡ断片を含むプラスミド（ｐＬＩＰＥ１４
１）、約３．６ｋｂのＣｌａＩ−ＳａｌＩＤＮＡ断片を
含むプラスミド（ｐＬＩＰＥ１５１）を有する大腸菌Ｄ
Ｈ５にクリアゾーンの形成とエステラーゼ活性（簡便法
による測定）が認められなかった。このことから、セラ
チア・マルセッセンスＳｒ４１由来のエステラーゼをコ
ードする遺伝子が約２．６ｋｂのＳａｌＩ−ＢｓｔＰＩ
ＤＮＡ断片中に存在するがわかる。

【００４５】実施例３クローンＤＮＡの解析塩基配列の決定ｐＬＩＰＥ１２１をキロベース・デレーション・キット
（宝酒造製）を用い、種々デレーション・プラスミドを
作製した。これを用い、サンガーらのジデオキシ・チェ
イン・ターミネーション法〔プロシーディングスオブ
ザナショナルアカデミーオブサイエンスオ
ブザユナイテッドステイツオブアメリカ、７４
巻、５４６３頁（１９７７）〕により、プライマーのア
ニール、ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウ・フラグメン
トによる相補鎖合成〔（α−³²Ｐ）ｄＣＴＰ（１４．８
×１０⁶Ｂｑ／ｐｍｏｌ，７４×１０⁴Ｂｑ）で標
識〕、尿素変性８％ポリアクリルアミドゲル電気泳動及
びオートラジオグラフィーから塩基配列を決定した。

【００４６】その結果、マルセッセンスＳｒ４１のエス
テラーゼをコードするＤＮＡ配列は配列番号１に示すよ
うに、ＡＴＧの開始コドンから始まり、ＧＣＣで終わる
１８３９塩基対から構成されることがわかった。また、
この塩基配列から決定したアミノ酸配列は、配列番号３
に示す通りである。

【００４７】なお塩基配列から決定されるアミノ酸配列
のＮ末端に存在するＭｅｔは、セラチア・エステラーゼ
の精製酵素標品から決定されたＮ末端アミノ酸配列には
認められなかった。これは細胞中に存在するメチオニン
アミノペプチダーゼによって、菌体中で産生される蛋白
質のＮ末端のメチオニンが除去されるものと解釈され
る。また、セラチア・エステラーゼは細胞外分泌酵素で
あるが、通常の分泌蛋白においてＮ末端部分に存在する
シグナルペプチドは存在しない。

【００４８】実施例４セラチア・マルセッセンスＳｒ４１（微工研条寄第４８
７号）を３ｍｌの栄養培地（グルコース０．５％、ペプ
トン１．０％、肉エキス０．３％、酵母エキス１．０
％、塩化ナトリウム０．５％、ｐＨ７．０）中で一晩培
養したものを、新しい栄養培地３ｍｌへ０．１ｍｌ植菌
する。これを３０°Ｃで３時間培養し、そこへ０．１ｍ
ｇ／ｍｌとなるようにＮＴＧを加えて更に３０分培養す
る。この培養液を遠心分離し、得られる菌体を生理食塩
水で遠心分離法によって３回洗浄する。この菌体を生理
食塩水に懸濁し、トリブチン０．５％、グルコース２
％、ＥＤＴＡ２ｍＭを含むＬＢＧ平板培地に１平板あた
り１〜１０００個の細胞を塗布する。３０°Ｃで１日培
養した後、大きなクリアゾーンを形成しているコロニー
を釣菌分離することにより、高エステラーゼ生産菌のセ
ラチア・マルセッセンスＭ−１株（微工研条寄第４０６
８号）を得た。得られた変異株を５００μｇ／ｍｌのア
ンピシリンを含むエステラーゼ生産培地に１白金耳植菌
し、３０℃で２０時間往復振盪培養（振幅７ｃｍ、１２
０回転／分）する。遠心分離によりエステラーゼ活性約
８０×１０³単位／ｍｌ（簡便法による測定）の培養上
清が得られた。本菌株の生産性は親株宿主菌セラチア・
マルセッセンスＳｒ４１株のエステラーゼ生産性の約
２．５倍である。

【００４９】上記で得られたセラチア・マルセッセンス
Ｍ−１から、実施例１〜３と同様に染色体ＤＮＡを単離
し、その配列を解析した場合、配列番号２に示す通り、
９番目の塩基が相違する以外は、全くセラチア・マルセ
ッセンスＳｒ４１のＤＮＡ配列と同様に、ＡＴＧの開始
コドンから始まり、ＧＣＣで終わる１８３９塩基対から
構成されることがわかった。また、この塩基配列から決
定したアミノ酸配列も、配列番号１のものと同様に配列
番号３に示す通りであった。

【００５０】実施例５エステラーゼ高生産菌株の作製制限エンドヌクレアーゼ欠損性のセラチア・マルセッセ
ンスＴＴ３９２株にｐＬＩＰＥ１１１を導入し、形質転
換株を得た。次に、この形質転換株の細胞からセラチア
・マルセッセンスによって修飾されたｐＬＩＰＥ１１１
プラスミドＤＮＡを、アルカリリシス法により抽出し
た。次に、このプラスミドＤＮＡを用いてセラチア・マ
ルセッセンスＳｒ４１の細胞をエレクトロポレーション
法によって形質転換することにより、形質転換体である
セラチア・マルセッセンスＴＡ５０２５（微工研条寄
第４０６７号）を得た。得られた形質転換体を５００μ
ｇ／ｍｌのアンピシリンを含むエステラーゼ生産培地に
１白金耳植菌し、３０℃で２０時間往復振盪培養（振幅
７ｃｍ、１２０回転／分）する。遠心分離によりエステ
ラーゼ活性約１．９×１０⁵単位／ｍｌ（簡便法による
測定）の培養上清が得られた。本菌株の生産性は宿主菌
セラチア・マルセッセンスＳｒ４１株のエステラーゼ生
産性の約６倍である。

【００５１】実施例６エステラーゼの製造５００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むエステラーゼ生
産培地２０Ｌを３０Ｌ容ジャーファーメンターに入れ滅
菌した。あらかじめ同培地で、３０℃、２０時間往復振
盪培養した前記セラチア・マルセッセンスＴＡ５０２
５の前培養液２００ｍｌを接種し、３０℃で２００ｒｐ
ｍ、０．５ｖｖｍで撹拌、通気を行い、１８時間培養し
た。この培養液を遠心分離し、菌体を除去した後、得ら
れた上澄み液１８Ｌを限外ろ過膜（ＡＩＬ−１０１０、
旭化成製）を用い濃縮した。その結果、大日本製薬製リ
パーゼキットＳを用いた簡便法にてエステラーゼ活性が
１．７×１０⁶単位／ｍｌの粗酵素液２０００ｍｌを得
た。

【００５２】実施例７エステラーゼの製造エステラーゼ生産培地２０Ｌを３０Ｌ容ジャーファーメ
ンターに入れ滅菌した。あらかじめ同培地で、３０℃、
２０時間往復振盪培養したセラチア・マルセッセンスＭ
−１の前培養液２００ｍｌを接種し、３０℃で２００ｒ
ｐｍ、０．５ｖｖｍで撹拌、通気を行い、１８時間培養
した。この培養液を遠心分離し、菌体を除去した後、得
られた上澄み液１８Ｌを限外ろ過膜（ＡＩＬ−１０１
０、旭化成製）を用い濃縮した。その結果、大日本製薬
製リパーゼキットＳを用いた簡便法にてエステラーゼ活
性が７．９×１０⁵単位／ｍｌの粗酵素液２０００ｍｌ
を得た。

【００５３】

【発明の効果】本発明の高エステラーゼ生産性変異株お
よびエステラーゼをコードする遺伝子を組み込んだ組換
えプラスミドを含有する形質転換体は、いずれもエステ
ラーゼ生産能が顕著に優れており、この形質転換体を培
養することにより、エステラーゼを容易に高純度で大量
生産することができる。

【００５４】

【配列表】

配列番号：１配列の長さ：１８３９配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：Genomic ＤＮＡ起源生物名：セラチア・マルセッセンス（ Serratia marces
cens） Sr 41 配列ＡＴＧＧＧＣＡＴＣＴＴＴＡＧＣＴＡＴＡＡＧＧＡＴ 24 ＣＴＧＧＡＣＧＡＡＡＡＣＧＣＧＴＣＡＡＡＧＧＣＧ 48 ＣＴＧＴＴＴＴＣＣＧＡＣＧＣＣＴＴＧＧＣＣＡＴＣ 72 ＴＣＴＡＣＣＴＡＣＧＣＴＴＡＣＣＡＣＡＡＴＡＴＣ 96 ＧＡＴＡＡＣＧＧＣＴＴＣＧＡＴＧＡＡＧＧＣＴＡＴ 120 ＣＡＣＣＡＧＡＣＣＧＧＴＴＴＣＧＧＣＣＴＣＧＧＴ 144 ＣＴＧＣＣＧＣＴＧＡＣＧＣＴＧＡＴＣＡＣＧＧＣＧ 168 ＣＴＣＡＴＣＧＧＣＡＧＣＡＣＣＣＡＧＴＣＧＣＡＧ 192 ＧＧＣＧＧＣＣＴＧＣＣＣＧＧＴＣＴＴＣＣＣＴＧＧ 216 ＡＡＣＣＣＣＧＡＣＴＣＣＧＡＡＣＡＧＧＣＣＧＣＧ 240 CAG GAC GCG GTG AAC AAT GCC GGC 264 ＴＧＧＴＣＡＧＴＧＡＴＣＧＡＣＧＣＣＧＣＧＣＡＡ 288 ＴＴＧＧＧＡＴＡＣＧＣＣＧＧＣＡＡＡＡＣＣＧＡＴ 312 ＧＣＧＣＧＣＧＧＣＡＣＣＴＡＣＴＡＣＧＧＣＧＡＡ 336 ＡＣＣＧＣＣＧＧＴＴＡＣＡＣＣＡＣＣＧＣＴＣＡＧ 360 ＧＣＣＧＡＧＧＴＧＣＴＧＧＧＣＡＡＡＴＡＴＧＡＣ 384 ＡＧＣＧＡＡＧＧＣＡＡＴＣＴＣＡＣＣＧＣＣＡＴＴ 408 ＧＧＣＡＴＣＴＣＡＴＴＴＣＧＣＧＧＴＡＣＣＡＧＣ 432 ＧＧＣＣＣＧＣＧＣＧＡＧＴＣＧＣＴＧＡＴＣＧＧＣ 456 ＧＡＴＡＣＣＡＴＣＧＧＣＧＡＴＧＴＧＡＴＴＡＡＣ 480 ＧＡＴＣＴＧＴＴＧＧＣＣＧＧＧＴＴＣＧＧＧＣＣＧ 504 ＡＡＡＧＣＴＡＴＧＣＧＡＣＧＣＴＡＴＡＣＧＣＴＧ 528 ＡＡＧＧＣＣＴＴＣＧＧＣＡＡＴＴＴＧＣＴＧＧＧＧ 552 ＧＡＣＧＴＧＧＣＧＡＡＡＴＴＣＧＣＧＣＡＧＧＣＣ 576 ＣＡＣＧＧＧＣＴＧＡＧＣＧＧＣＧＡＡＧＡＣＧＴＧ 600 ＧＴＧＡＴＣＡＧＣＧＧＣＣＡＣＡＧＣＣＴＣＧＧＣ 624 ＧＧＧＣＴＧＧＣＧＧＴＣＡＡＣＡＧＣＡＴＧＧＣＧ 648 ＧＣＧＣＡＧＡＧＣＧＡＣＧＣＡＡＣＣＴＧＧＧＧＣ 672 ＧＧＣＴＴＣＴＡＣＧＣＧＣＡＧＴＣＣＡＡＣＴＡＴ 696 ＧＴＣＧＣＣＴＴＣＧＣＣＴＣＧＣＣＧＡＣＣＣＡＧ 720 ＴＡＣＧＡＡＧＣＣＧＧＣＧＧＣＡＡＧＧＴＧＡＴＣ 744 ＡＡＣＡＴＣＧＧＣＴＡＴＧＡＧＡＡＣＧＡＴＣＣＧ 768 ＧＴＧＴＴＴＣＧＣＧＣＧＣＴＣＧＡＣＧＧＣＡＣＣ 792 ＴＣＧＣＴＧＡＣＣＣＴＧＣＣＧＴＣＡＴＴＧＧＧＣ 816 ＧＴＴＣＡＣＧＡＴＧＣＧＣＣＧＣＡＴＡＣＣＴＣＣ 840 ＧＣＣＡＣＣＡＡＣＡＡＴＡＴＣＧＴＣＡＡＣＴＴＣ 864 ＡＡＣＧＡＣＣＡＣＴＡＣＧＣＧＴＣＧＧＡＣＧＣＣ 888 ＴＧＧＡＡＴＣＴＧＴＴＧＣＣＧＴＴＣＴＣＣＡＴＴ 912 ＣＴＣＡＡＣＡＴＴＣＣＧＡＣＣＴＧＧＣＴＡＴＣＣ 936 CAC CTG CCG TTC TTC TAT CAG GAT 960 ＧＧＴＣＴＧＡＴＧＣＧＧＧＴＧＣＴＧＡＡＣＴＣＣ 984 ＧＡＧＴＴＴＴＡＴＴＣＧＣＴＧＡＣＣＧＡＣＡＡＡ 1008 ＧＡＣＴＣＧＡＣＣＡＴＣＡＴＣＧＴＣＴＣＣＡＡＣ 1032 ＣＴＧＴＣＧＡＡＣＧＴＣＡＣＧＣＧＣＧＧＣＡＧＴ 1056 ＡＣＣＴＧＧＧＴＧＧＡＡＧＡＴＣＴＧＡＡＣＣＧＣ 1080 ＡＡＣＧＣＧＧＡＡＡＣＧＣＡＣＡＧＣＧＧＧＣＣＧ 1104 ＡＣＧＴＴＴＡＴＣＡＴＣＧＧＣＡＧＣＧＡＣＧＧＣ 1128 ＡＡＴＧＡＴＴＴＧＡＴＣＡＡＧＧＧＣＧＧＣＡＡＡ 1152 ＧＧＣＡＡＣＧＡＣＴＡＴＣＴＣＧＡＧＧＧＣＣＧＣ 1176 ＧＡＣＧＧＴＧＡＣＧＡＴＡＴＣＴＴＣＣＧＣＧＡＣ 1200 ＧＣＣＧＧＣＧＧＣＴＡＴＡＡＣＣＴＧＡＴＣＧＣＣ 1224 ＧＧＣＧＧＣＡＡＡＧＧＣＣＡＣＡＡＴＡＴＣＴＴＣ 1248 ＧＡＴＡＣＣＣＡＧＣＡＧＧＣＧＴＴＧＡＡＡＡＡＣ 1272 ＡＣＣＧＡＧＧＴＣＧＣＣＴＡＣＧＡＣＧＧＣＡＡＴ 1296 ＡＣＧＣＴＴＴＡＣＣＴＧＣＧＣＧＡＣＧＣＣＡＡＡ 1320 ＧＧＣＧＧＣＡＴＴＡＣＧＣＴＧＧＣＧＧＡＣＧＡＣ 1344 ＡＴＣＡＧＣＡＣＣＣＴＧＣＧＣＡＧＣＡＡＡＧＡＡ 1368 ＡＣＣＴＣＣＴＧＧＣＴＧＡＴＴＴＴＣＡＧＣＡＡＡ 1392 ＧＡＧＧＴＧＧＡＴＣＡＴＣＡＧＧＴＧＡＣＣＧＣＣ 1416 ＧＣＣＧＧＡＴＴＧＡＡＡＴＣＧＧＡＴＴＣＧＧＧＣ 1440 ＣＴＣＡＡＡＧＣＣＴＡＴＧＣＧＧＣＣＧＣＣＡＣＣ 1464 ＡＣＣＧＧＣＧＧＣＧＡＣＧＧＣＧＡＴＧＡＣＧＴＣ 1488 ＣＴＧＣＡＧＧＣＴＣＧＣＡＧＣＣＡＣＧＡＣＧＣＣ 1512 ＴＧＧＣＴＧＴＴＣＧＧＣＡＡＣＧＣＣＧＧＣＡＡＣ 1536 ＧＡＣＡＣＧＣＴＴＡＴＣＧＧＣＣＡＴＧＣＣＧＧＣ 1560 ＧＧＣＡＡＣＣＴＧＡＣＣＴＴＣＧＴＣＧＧＣＧＧＣ 1584 ＡＧＣＧＧＣＧＡＴＧＡＣＡＴＣＣＴＧＡＡＧＧＧＧ 1608 ＧＴＣＧＧＣＡＡＣＧＧＣＡＡＴＡＣＣＴＴＣＣＴＧ 1632 TTC AGC GGC GAT TTC GGC CGC GAC 1656 ＣＡＧＣＴＧＴＡＴＧＧＣＴＴＣＡＡＣＧＣＣＡＣＣ 1680 ＧＡＣＡＡＡＣＴＧＧＴＡＴＴＴＡＴＣＧＧＣＡＣＣ 1704 ＧＡＧＧＧＣＧＣＣＡＧＣＧＧＧＡＡＴＡＴＣＣＧＣ 1728 ＧＡＣＴＡＴＧＣＣＡＣＧＣＡＧＣＡＡＡＡＣＧＡＣ 1752 ＧＡＴＣＴＧＧＴＧＣＴＧＧＣＣＴＴＣＧＧＣＣＡＣ 1776 ＡＧＣＣＡＧＧＴＣＡＣＧＣＴＧＡＴＣＧＧＣＧＴＣ 1800 ＴＣＧＣＴＣＧＡＴＣＡＴＴＴＣＡＡＣＣＣＣＧＡＴ 1824 ＣＡＧＧＴＧＧＴＧＴＴＧＧＣＣ 1839 。

【００５５】配列番号：２配列の長さ：１８３９配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：Genomic ＤＮＡ起源生物名：セラチア・マルセッセンス（ Serratia marces
cens）Ｍ−１配列ＡＴＧＧＧＣＡＴＴＴＴＴＡＧＣＴＡＴＡＡＧＧＡＴ 24 ＣＴＧＧＡＣＧＡＡＡＡＣＧＣＧＴＣＡＡＡＧＧＣＧ 48 ＣＴＧＴＴＴＴＣＣＧＡＣＧＣＣＴＴＧＧＣＣＡＴＣ 72 ＴＣＴＡＣＣＴＡＣＧＣＴＴＡＣＣＡＣＡＡＴＡＴＣ 96 ＧＡＴＡＡＣＧＧＣＴＴＣＧＡＴＧＡＡＧＧＣＴＡＴ 120 ＣＡＣＣＡＧＡＣＣＧＧＴＴＴＣＧＧＣＣＴＣＧＧＴ 144 ＣＴＧＣＣＧＣＴＧＡＣＧＣＴＧＡＴＣＡＣＧＧＣＧ 168 ＣＴＣＡＴＣＧＧＣＡＧＣＡＣＣＣＡＧＴＣＧＣＡＧ 192 ＧＧＣＧＧＣＣＴＧＣＣＣＧＧＴＣＴＴＣＣＣＴＧＧ 216 AAC CCC GAC TCC GAA CAG GCC GCG 240 ＣＡＧＧＡＣＧＣＧＧＴＧＡＡＣＡＡＴＧＣＣＧＧＣ 264 ＴＧＧＴＣＡＧＴＧＡＴＣＧＡＣＧＣＣＧＣＧＣＡＡ 288 ＴＴＧＧＧＡＴＡＣＧＣＣＧＧＣＡＡＡＡＣＣＧＡＴ 312 ＧＣＧＣＧＣＧＧＣＡＣＣＴＡＣＴＡＣＧＧＣＧＡＡ 336 ＡＣＣＧＣＣＧＧＴＴＡＣＡＣＣＡＣＣＧＣＴＣＡＧ 360 ＧＣＣＧＡＧＧＴＧＣＴＧＧＧＣＡＡＡＴＡＴＧＡＣ 384 ＡＧＣＧＡＡＧＧＣＡＡＴＣＴＣＡＣＣＧＣＣＡＴＴ 408 ＧＧＣＡＴＣＴＣＡＴＴＴＣＧＣＧＧＴＡＣＣＡＧＣ 432 ＧＧＣＣＣＧＣＧＣＧＡＧＴＣＧＣＴＧＡＴＣＧＧＣ 456 ＧＡＴＡＣＣＡＴＣＧＧＣＧＡＴＧＴＧＡＴＴＡＡＣ 480 ＧＡＴＣＴＧＴＴＧＧＣＣＧＧＧＴＴＣＧＧＧＣＣＧ 504 ＡＡＡＧＣＴＡＴＧＣＧＡＣＧＣＴＡＴＡＣＧＣＴＧ 528 ＡＡＧＧＣＣＴＴＣＧＧＣＡＡＴＴＴＧＣＴＧＧＧＧ 552 ＧＡＣＧＴＧＧＣＧＡＡＡＴＴＣＧＣＧＣＡＧＧＣＣ 576 ＣＡＣＧＧＧＣＴＧＡＧＣＧＧＣＧＡＡＧＡＣＧＴＧ 600 ＧＴＧＡＴＣＡＧＣＧＧＣＣＡＣＡＧＣＣＴＣＧＧＣ 624 ＧＧＧＣＴＧＧＣＧＧＴＣＡＡＣＡＧＣＡＴＧＧＣＧ 648 ＧＣＧＣＡＧＡＧＣＧＡＣＧＣＡＡＣＣＴＧＧＧＧＣ 672 ＧＧＣＴＴＣＴＡＣＧＣＧＣＡＧＴＣＣＡＡＣＴＡＴ 696 ＧＴＣＧＣＣＴＴＣＧＣＣＴＣＧＣＣＧＡＣＣＣＡＧ 720 ＴＡＣＧＡＡＧＣＣＧＧＣＧＧＣＡＡＧＧＴＧＡＴＣ 744 ＡＡＣＡＴＣＧＧＣＴＡＴＧＡＧＡＡＣＧＡＴＣＣＧ 768 ＧＴＧＴＴＴＣＧＣＧＣＧＣＴＣＧＡＣＧＧＣＡＣＣ 792 ＴＣＧＣＴＧＡＣＣＣＴＧＣＣＧＴＣＡＴＴＧＧＧＣ 816 ＧＴＴＣＡＣＧＡＴＧＣＧＣＣＧＣＡＴＡＣＣＴＣＣ 840 ＧＣＣＡＣＣＡＡＣＡＡＴＡＴＣＧＴＣＡＡＣＴＴＣ 864 ＡＡＣＧＡＣＣＡＣＴＡＣＧＣＧＴＣＧＧＡＣＧＣＣ 888 ＴＧＧＡＡＴＣＴＧＴＴＧＣＣＧＴＴＣＴＣＣＡＴＴ 912 CTC AAC ATT CCG ACC TGG CTA TCC 936 ＣＡＣＣＴＧＣＣＧＴＴＣＴＴＣＴＡＴＣＡＧＧＡＴ 960 ＧＧＴＣＴＧＡＴＧＣＧＧＧＴＧＣＴＧＡＡＣＴＣＣ 984 ＧＡＧＴＴＴＴＡＴＴＣＧＣＴＧＡＣＣＧＡＣＡＡＡ 1008 ＧＡＣＴＣＧＡＣＣＡＴＣＡＴＣＧＴＣＴＣＣＡＡＣ 1032 ＣＴＧＴＣＧＡＡＣＧＴＣＡＣＧＣＧＣＧＧＣＡＧＴ 1056 ＡＣＣＴＧＧＧＴＧＧＡＡＧＡＴＣＴＧＡＡＣＣＧＣ 1080 ＡＡＣＧＣＧＧＡＡＡＣＧＣＡＣＡＧＣＧＧＧＣＣＧ 1104 ＡＣＧＴＴＴＡＴＣＡＴＣＧＧＣＡＧＣＧＡＣＧＧＣ 1128 ＡＡＴＧＡＴＴＴＧＡＴＣＡＡＧＧＧＣＧＧＣＡＡＡ 1152 ＧＧＣＡＡＣＧＡＣＴＡＴＣＴＣＧＡＧＧＧＣＣＧＣ 1176 ＧＡＣＧＧＴＧＡＣＧＡＴＡＴＣＴＴＣＣＧＣＧＡＣ 1200 ＧＣＣＧＧＣＧＧＣＴＡＴＡＡＣＣＴＧＡＴＣＧＣＣ 1224 ＧＧＣＧＧＣＡＡＡＧＧＣＣＡＣＡＡＴＡＴＣＴＴＣ 1248 ＧＡＴＡＣＣＣＡＧＣＡＧＧＣＧＴＴＧＡＡＡＡＡＣ 1272 ＡＣＣＧＡＧＧＴＣＧＣＣＴＡＣＧＡＣＧＧＣＡＡＴ 1296 ＡＣＧＣＴＴＴＡＣＣＴＧＣＧＣＧＡＣＧＣＣＡＡＡ 1320 ＧＧＣＧＧＣＡＴＴＡＣＧＣＴＧＧＣＧＧＡＣＧＡＣ 1344 ＡＴＣＡＧＣＡＣＣＣＴＧＣＧＣＡＧＣＡＡＡＧＡＡ 1368 ＡＣＣＴＣＣＴＧＧＣＴＧＡＴＴＴＴＣＡＧＣＡＡＡ 1392 ＧＡＧＧＴＧＧＡＴＣＡＴＣＡＧＧＴＧＡＣＣＧＣＣ 1416 ＧＣＣＧＧＡＴＴＧＡＡＡＴＣＧＧＡＴＴＣＧＧＧＣ 1440 ＣＴＣＡＡＡＧＣＣＴＡＴＧＣＧＧＣＣＧＣＣＡＣＣ 1464 ＡＣＣＧＧＣＧＧＣＧＡＣＧＧＣＧＡＴＧＡＣＧＴＣ 1488 ＣＴＧＣＡＧＧＣＴＣＧＣＡＧＣＣＡＣＧＡＣＧＣＣ 1512 ＴＧＧＣＴＧＴＴＣＧＧＣＡＡＣＧＣＣＧＧＣＡＡＣ 1536 ＧＡＣＡＣＧＣＴＴＡＴＣＧＧＣＣＡＴＧＣＣＧＧＣ 1560 ＧＧＣＡＡＣＣＴＧＡＣＣＴＴＣＧＴＣＧＧＣＧＧＣ 1584 ＡＧＣＧＧＣＧＡＴＧＡＣＡＴＣＣＴＧＡＡＧＧＧＧ 1608 GTC GGC AAC GGC AAT ACC TTC CTG 1632 ＴＴＣＡＧＣＧＧＣＧＡＴＴＴＣＧＧＣＣＧＣＧＡＣ 1656 ＣＡＧＣＴＧＴＡＴＧＧＣＴＴＣＡＡＣＧＣＣＡＣＣ 1680 ＧＡＣＡＡＡＣＴＧＧＴＡＴＴＴＡＴＣＧＧＣＡＣＣ 1704 ＧＡＧＧＧＣＧＣＣＡＧＣＧＧＧＡＡＴＡＴＣＣＧＣ 1728 ＧＡＣＴＡＴＧＣＣＡＣＧＣＡＧＣＡＡＡＡＣＧＡＣ 1752 ＧＡＴＣＴＧＧＴＧＣＴＧＧＣＣＴＴＣＧＧＣＣＡＣ 1776 ＡＧＣＣＡＧＧＴＣＡＣＧＣＴＧＡＴＣＧＧＣＧＴＣ 1800 ＴＣＧＣＴＣＧＡＴＣＡＴＴＴＣＡＡＣＣＣＣＧＡＴ 1824 ＣＡＧＧＴＧＧＴＧＴＴＧＧＣＣ 1839 。

【００５６】配列番号：３配列の長さ：６１３配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド配列 Met Gly Ile Phe Ser Tyr Lys Asp Leu Asp Glu Asn Ala Ser Lys Ala 16 Leu Phe Ser Asp Ala Leu Ala Ile Ser Thr Tyr Ala Tyr His Asn Ile 32 Asp Asn Gly Phe Asp Glu Gly Tyr His Gln Thr Gly Phe Gly Leu Gly 48 Leu Pro Leu Thr Leu Ile Thr Ala Leu Ile Gly Ser Thr Gln Ser Gln 64 Gly Gly Leu Pro Gly Leu Pro Trp Asn Pro Asp Ser Glu Gln Ala Ala 80 Gln Asp Ala Val Asn Asn Ala Gly Trp Ser Val Ile Asp Ala Ala Gln 96 Leu Gly Tyr Ala Gly Lys Thr Asp Ala Arg Gly Thr Tyr Tyr Gly Glu 112 Thr Ala Gly Tyr Thr Thr Ala Gln Ala Glu Val Leu Gly Lys Tyr Asp 128 Ser Glu Gly Asn Leu Thr Ala Ile Gly Ile Ser Phe Arg Gly Thr Ser 144 Gly Pro Arg Glu Ser Leu Ile Gly Asp Thr Ile Gly Asp Val Ile Asn 160 Asp Leu Leu Ala Gly Phe Gly Pro Lys Ala Met Arg Arg Tyr Thr Leu 176 Lys Ala Phe Gly Asn Leu Leu Gly Asp Val Ala Lys Phe Ala Gln Ala 192 His Gly Leu Ser Gly Glu Asp Val Val Ile Ser Gly His Ser Leu Gly 208 Gly Leu Ala Val Asn Ser Met Ala Ala Gln Ser Asp Ala Thr Trp Gly 224 Gly Phe Tyr Ala Gln Ser Asn Tyr Val Ala Phe Ala Ser Pro Thr Gln 240 Tyr Glu Ala Gly Gly Lys Val Ile Asn Ile Gly Tyr Glu Asn Asp Pro 256 Val Phe Arg Ala Leu Asp Gly Thr Ser Leu Thr Leu Pro Ser Leu Gly 272 Val His Asp Ala Pro His Thr Ser Ala Thr Asn Asn Ile Val Asn Phe 288 Asn Asp His Tyr Ala Ser Asp Ala Trp Asn Leu Leu Pro Phe Ser Ile 304 Leu Asn Ile Pro Thr Trp Leu Ser His Leu Pro Phe Phe Tyr Gln Asp 320 Gly Leu Met Arg Val Leu Asn Ser Glu Phe Tyr Ser Leu Thr Asp Lys 336 Asp Ser Thr Ile Ile Val Ser Asn Leu Ser Asn Val Thr Arg Gly Ser 352 Thr Trp Val Glu Asp Leu Asn Arg Asn Ala Glu Thr His Ser Gly Pro 368 Thr Phe Ile Ile Gly Ser Asp Gly Asn Asp Leu Ile Lys Gly Gly Lys 384 Gly Asn Asp Tyr Leu Glu Gly Arg Asp Gly Asp Asp Ile Phe Arg Asp 400 Ala Gly Gly Tyr Asn Leu Ile Ala Gly Gly Lys Gly His Asn Ile Phe 416 Asp Thr Gln Gln Ala Leu Lys Asn Thr Glu Val Ala Tyr Asp Gly Asn 432 Thr Leu Tyr Leu Arg Asp Ala Lys Gly Gly Ile Thr Leu Ala Asp Asp 448 Ile Ser Thr Leu Arg Ser Lys Glu Thr Ser Trp Leu Ile Phe Ser Lys 464 Glu Val Asp His Gln Val Thr Ala Ala Gly Leu Lys Ser Asp Ser Gly 480 Leu Lys Ala Tyr Ala Ala Ala Thr Thr Gly Gly Asp Gly Asp Asp Val 496 Leu Gln Ala Arg Ser His Asp Ala Trp Leu Phe Gly Asn Ala Gly Asn 512 Asp Thr Leu Ile Gly His Ala Gly Gly Asn Leu Thr Phe Val Gly Gly 528 Ser Gly Asp Asp Ile Leu Lys Gly Val Gly Asn Gly Asn Thr Phe Leu 544 Phe Ser Gly Asp Phe Gly Arg Asp Gln Leu Tyr Gly Phe Asn Ala Thr 560 Asp Lys Leu Val Phe Ile Gly Thr Glu Gly Ala Ser Gly Asn Ile Arg 576 Asp Tyr Ala Thr Gln Gln Asn Asp Asp Leu Val Leu Ala Phe Gly His 592 Ser Gln Val Thr Leu Ile Gly Val Ser Leu Asp His Phe Asn Pro Asp 608 Gln Val Val Leu Ala 613 。

【図面の簡単な説明】

【図１】実施例２の形質転換体細胞から単離したプラス
ミドＤＮＡｐＬＩＰＥ１０１の制限酵素切断地図。

【図２】プラスミドＤＮＡｐＬＩＰＥ１０１を制限酵素
で切断して部分的に欠失させたプラスミドＤＮＡであ
る、ｐＬＩＰＥ１１１、同１２１、同１３１、同１４１
および同１５１の各制限酵素切断地図。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所Ｃ１２Ｒ 1:43） (Ｃ１２Ｎ 9/18 Ｃ１２Ｒ 1:425）

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】セラチア属微生物由来のエステラーゼを
コードする遺伝子。
【請求項２】配列番号１又は配列番号２記載のＤＮＡ
配列を有する請求項１記載の遺伝子。
【請求項３】セラチア属微生物由来のエステラーゼを
コードする遺伝子をベクタープラスミドに組み込んだ組
換えプラスミド。
【請求項４】セラチア属微生物由来のエステラーゼを
コードする遺伝子をベクタープラスミドに組み込んだ組
換えプラスミドを含む形質転換体。
【請求項５】宿主微生物がセラチア属微生物またはエ
シェリシャ属微生物である請求項４記載の形質転換体。
【請求項６】セラチア属微生物由来のエステラーゼを
コードする遺伝子を含有する組換えプラスミドで形質転
換された微生物を培地で培養し、菌体内外に生成したエ
ステラーゼを採取することを特徴とするエステラーゼの
製法。
【請求項７】配列番号２記載のＤＮＡ配列を有する遺
伝子を有し、高エステラーゼ生産能を有するセラチア属
微生物。
【請求項８】請求項７記載の微生物を培地で培養し、
菌体内外に生成したエステラーゼを採取することを特徴
とするエステラーゼの製法。