TW212203B - - Google Patents

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ΑΓ. 212203 五、發明説明（1 ) 本發明為關於一種编碼酯酶之基因，含該基因之重組 質體，轉形以重組質體之新顆微生物，和培餐該撤生物 以産生酯酶之製法。 先前技術 近來，經常於水解反懕中嘗試使用如酯酶之酵素。己 知有許多酯酶用於此目的，例如，源自動物（如豬肝， 豬胰等 > 之酯酶，和源自微生物如球形節桿菌，白地霉 ,柱狀假絲酵母，螢光假單胞菌等之酯酶。 此外，己知有一種酯酶為於撤生物和耱化根霉（參見 日本專利首先公開（Kokai)No.87175/1991)，莓實假單 胞菌（參見 Biochemical and Biophysical Research C〇Bnunications，Vol. 141, 185-190(1986))中利用重组 DMA技術所取得。 然而，此已知酯酶或産生酯酶之己知方法有許多問題 。例如，動物來源之酯酶為非常昂貴。此外，上述節桿 菌，地霉，假絲酵母，假單胞菌或根霉屬撤生物來源之 酯酶有如於活性，安定性，或專一性之缺點或産生酯酶 撤生物不具高生産力之問題。 經濟部中央標準局Μ工消费合作社印纪 許多研究之結果，本發明者發現所欲之酯酶可由於沙 雷氏菌屬撤生物中使用DNA技術順利地産生。即，本發 明者成功地由沙雷氏菌靥徹生物取得編碼酯酶之基因， 並發現將含該基因之重組質體導入宿主撤生物中可取得 具有顯著增加酯酶生産力之轉形微生物，且更發現此所 81.9.20,000 本紙张又度適用中國國家標準（CNS)甲4規格（210 X 297公釐） ΑΓ, 1^03_^_ 五、發明説明（2 ) 欲酯酶可由使用該轉形微生物以一工業規樓生產β 發明之概要描述 本發明之一目的為提供一種编碼源自沙雷氏®屬微生 物酯酶之基因。本發明之另一目的為提供一種具有高酯 酶生産力之突變株。本發明之S —目的為提供一種由該 基因嵌入載體質醱所産生之重組質腥。本發明之更一目 的為提供一種含該重組質體之轉形撤生物β本發明之又 更一目的為提供一種由培養該轉形微生物並於微生物細 胞外部和内部收集所産生酯酶之製備酯酶的方法。 圖面之簡述 圖1示出由實施例2重組細胞單離之質醱DNA pLIPE 101,的限制内切核酸酶輿圖。 圖2示出使用限制内切核酸酶和DN A連接酶刪除質體 DNA pLIPElOl 所産生之各質體 DNAs pLIPE 111, pLIPE 121，pLIPE 131, pLIPE 141 和 pLIPE 151 之限制内切核 酸酶輿圖。 發明之詳細描述 本發明之编碼源自沙雷氏菌羼撤生物酯酶之基因為一 具有開讀取框之1839鹾基對的雙股DNA,特別為具有後 述示以SEQ ID NO: 1和SEQ ID N0: 2核甘酸序列之DHAs。 適於此類编碼酯酶之基因的供體檝生物包括任何具有 酯酶生産力之沙雷氏«屬撤生物，例如，黏質沙雷氏菌 Sr 41(FERM BP-487),液化沙雷氏菌 ATCC 27592,黏質 本紙张尺度適用中國國家標準（CNS)甲4規格（210 X 297公货） 裝· .1Τ. 經濟部中央標準局β工消费合作社印纪 81.9.20,000 ΑΓ.

Hii '發明説明（3) 谭氏®ATCC 13880,黏質沙雷氏鷓ATCC 14764.黏質 i/Κ 听具 爾氏菌ATCC 19180,黏質沙雷氏jgATCC 21074,黏質 沙霉氏菌ATCC 27117,黏質沙雷氏醣ATCC 21212等。 此供體撤生物亦包括由野生株所衍生之突變株，如各 基酸需求株，各種核酸需求株，各種維生素需求株 $，例如，黏質沙雷氏菌M-UFERM BP-4068)。該黏質 &雷氏菌M-1具有高於母株黏質沙笛氏菌Sr 41兩倍之酯 酶生産力且含有由SEQ ID NO: 2 DN A序列编碼之_酶基 因。等人之方法〔Biochemical and Biophysical Research Conmunications,Vol . 1 8,788 ( 1965)〕以N -甲基- Ν’ -硝基-d-亞硝基胍（HTG)處理母株 黏質沙雷氏菌Sr 41(FERM BP-487),將經此處理之微生 物培餐於含有乳化三酸甘油酯之洋菜培養基上，並收集 周圍形成最大澄淸區域之菌落而可取得突變株M-1。以 此方式，可由母株黏質沙雷氏菌Sr 41取得另一具有1.5 倍或更高酯酶生産力之突變株黏質沙雷氏菌6205。 將被嵌以编碼酿酶基因之載體質黼包括任何於轉形細 胞中可複製之質艨，但較佳為一具有1至數千複製數且 含有抗生素如安比西林*康纳徽素，氣徽素耐受樣記，且 更含有適當啓動子如lac，tac，或trP之質體。更且，此 載體質體可再含有一質體安定化基因如Par和parBe 這些載體質體例如包括PLG 339〔 Gene，v〇l.18,332( 1 9 8 2 )] , pBR 3 2 2 C Gene, Vo 1 . 2,9 5 ( 1 9 7 7 ) ] , pUC 18( .裝. *?T. 經濟部中央標準局β工消費合作社印纪 本紙張又度適用中园國家標準（CNS)肀4規格（2丨〇 X 297公釐） 81.9.20,000 212203 Αί, l；(i 五、發明説明（4 ) Gene , Vo I .3 3 , 1 0 3 ( 1 9 8 5 ) ] , pUC 1 9 [ Gene,V ο 1 . 33 , 1 03 (1985)〕，pHSG 298 〔Gene,Vol.61,63(1987)〕 ， pHSG 299 〔Gene，Vol.61, 63(198”〕等。 上述載醴質體為市售可得或由含有這些質體之微生物 細胞中以習知方法取得，例如，以"澄清溶菌物法"（參 見 Yasuyuki Takagi, "Procedure for Experiment in Genetic Engineering"，第 125頁，由 kodansha 出販， 1 9 8 0 ),或以"1¾性溶豳法"〔參見M a n i a t i s等人，” Molecular Cloning",第368頁，冷泉港實驗室，美國 (1982)〕。 宿主微生物《用於質餿重組和所欲酯酶之表現 > 包括任 何可轉形以重組質髖且可於其中複製質醱，並可表現質 體上之基因且可産生功能蛋白之撤生物。這些宿主撤生 物例如為屬於沙雷氏薗屬或埃希氏薗屬之撤生物，待別 為黏質沙雷氏菌Sr 41和各種因其衍生之突變株，例如 黏質沙雷氏菌M-1，黏質沙雷氏菌TT392〔參見Journal of Bacteriology，Vol.l61,l〔 19 85)〕，或大腾桿菌 K12 DH 5〔參見 Maniatis等人，"Molecular Cion ing"，2 n d volume,A10,冷泉港實驗室，美國（ 1 989 )〕。 -/ί L ：<) (*}- hn Vi 裝 訂 經濟部中央標準局8工消費合作社印絮 D 如 體例 色， 染得 之取 因易 基輕 酶而 酯法 碼方 编統 有傳 含以 物 生 撤 之 因 基 該 含 由 可 菌 溶 以 胞 細 物 生 微 將 ，劑 納溶 酸機 硫有 基以 烷胞 二細 十之 如理i處 _此 性 舌經 *71 面), 界等 以納 再酸 並胺 理肌 處基 酶醯 二 酚 如 81.9.20,000 本紙張又度適用中國國家標準（CNS>甲4規格（210 X 297公犛> ΛΓ, Ρ,Γι 212203 五、發明説明（5 ) 氛彷，二乙醚等）萃取以移除蛋白質，並其後以酒精沈 殺 DNA〔參見 Journal of Molecular Biology,Vol.3, 208(1961), fOBiochinica et Biophysica Acta.Vol. 72,619(1963)] 〇 包括含有鑕碼酯酶基因之染色體DNA及載體質體之重 組質體可以傳統方法輕易製得，例如，以適當的限制内 切核酸酶（如EcoRI,BaiHI,HindIII，SalI等）切開染色體 DNA和質體DN A且其後以DN A連結酶（如T 4 DN A連結酶， 大腸桿菌DNA連結酶等）處理，若需要，於以末端轉移酶 或DNA聚合酶處理後〔參見Methods in Enzymology，VoI 68,41(1979)，和 Yasuyuki Takagi，"Procedure for Experiment in Genetic Engineering",第 135頁，由 kodansha出版，1980〕。 於上述步驟所得之重組質體混合物中選取含有酯酶基 因之所欲的重組質體可如下進行。 經濟部中央標準局員工消費合作社印史 為限制内切核酸酶缺乏且無酯酶活性之徹生物細胞（ 如大腸桿菌K12 DH5)轉形以上述重組質體之混合物，並 將此轉形細胞塗布於一含有乳化三酸甘油酯之洋菜培養 基，例如含有甘油三丁酸酯乳化以聚氣乙烯鯨蟠醇_( Brij 58)且亦含有規定濃度抗生素之營養培養基。於30 至37 °C下培養1至2天後，單離周圍形成大透明區之轉 形體睹落。 上逑重組質體至宿主撤生物之導入作用為以傳統方法 本紙張义/1適ffl中®國家標準（CNS)甲4規格（210 X ‘297 ) 81.9.20,00« 2132G3_π,_ 五、發明説明（b) 進行，例如，《由將宿主細胞於低溫下以氣化納水溶液 處理以增加細胞之膜通透性，其後將重組質體導入宿主 細胞〔參見 Journal of Molecular Biology，Vol. 53， 159 (1 9 7 0 )]，或以電穿孔洗。 其次，以_性落菌法"自轉形體萃取質體DNA以得一含 有编碼酯酶基因之重組質體。 為便轉形作用有效率，乃將所得之重組質體於限制内 切核酸酶缺乏且為舆將用以表現酯酶之宿主撤生物為同 種之微生物中修飾。即，當宿主微生物為黏質沙雷氏菌 Sr 41時，將上述所得之重組質體導入限制酶缺乏之黏 質沙雷氏菌TT392中。經此修飾之重組質體自撤生物中 單離。 其後將此修飾之重組質體導入宿主撤生物中，以得適 於生産所欲酯酶之所欲轉形體。 重組質體至宿主微生物之導入作用可輕易地以Takagi & kizumi 法[參見 Journal of Bacteriology，Vol. 161， 經濟部中央標準局員工消費合作社印" 成 物 完 )- 5 5 8 徹 19之 1(述 用 可 形 轉 該 上 括 包 物 生 0 主 宿 之 用 株 菌 之 力 産 生 酶 酯 高 有 具 為 佳 較 但 菌 氏 。雷 離沙 單質 中黏 落如 菌例 之 ， 受物 耐生 素微 生形 抗轉 現之 表得 自所 可法 體方 形述 轉上 之 得 取 所 欲 所 由 將 為 Η 所質 段黏 8 2 / ί Μ 沙 Β 之 Ρ 因@由 ί 占 基useSIAS ®導1 酷體10 有s 1 I質E 含 i B 卩組 T 9Ϊ重菌 cl^K UC成雷 P 組沙 本紙张&度適用中园國家標準（CNS)甲4規格（210 X 297公坌） 81.9.20,000 212203 ΛΓ. HC. 經濟部中央標準局R工消費合作社印製

五、發明説明（7 ) 322和含有酯酶基因之4.0 kb Sail DNA片段所組成之重 組質體導入黏質沙雷氏菌Sr 41所取得。這些轉形株均 具有同於宿主撤生物黏質沙雷氏_Sr 41之形態特擞。 以上述所得轉形撤生物進行酯酶之生産為將微生物培 餐於一培餐基中並由微生物之細胞外部和内部收集酯酶。 用以生産酯酶之培養基包括任何橄生物可於其中生長 之傳統培養基。適當的培餐基含有一硪源如糖類（如Μ 萄糖，蔗糖，糖蜜等），有機酸（如反丁烯二酸，擰檬酸 等），醇類（如甘油等），或胺基酸（如丙胺酸，毅胺醯胺 ，天冬醛胺等）和一氮源如無機銨鹽（如硫酸銨，氣化銨 等），尿素，蛋白練，毅物浸漬液，酵母萃取物，酪蛋 白水解物等。碩源通常以培養基绝重量為準為含有1至 15%重量比，而氮源通常為以培養基總重蛋為準為含有 0.1至2.0%重量比。此培養基可任意地再含有適置的無 機鹽（如磷酸鹽，鎂鹽，鉀鹽，鈣鹽等）和/或金颶離子 (如鐵，鎂，銅，鋅等）<»於合成培養基之情形中，其可 再含有維生素或胺基酸，且再可包括適於令重組質體於 徹生物中安定之酯酶産生誘發劑（如植物油，界面活性 剤等），消泡劑，抗生素。培養基較佳調整至ΡΗ 5至8。 轉形撤生物之培養為以傳統方法進行。例如，將微生 物接種至一培養基中並以振盪培養，通氣培養，靜置培 養等進行培養。培養條件視培養基種類和培養方法而定 ,但可為任何適於撤生物生長之條件，通常在起始pH 本紙張又度適用中國國家標準（CNS)甲4規格（210 X 297公釐） 81.9.20,000 2122G3 五、發明説明（8 ) ί Γ?·^,1Ί-'·'η',1;>/ ..1·"^·^^^.ν:7 衣:,ί、) 5-8, 20 至 4(TC 下 1 至 2 天。 於培養細胞外部和内部所産生的酯酶以傳統方法收集 。例如，培餐基内含之酯_以無機鹽鹽析，有機溶劑沈 澱，離子交換樹脂和各種柱層析趿附或解析，膠過濾， 使用蛋白質沈澱劑，或這些方法組合之方式收集。細胞 中番積之酯酶為以首先使用物理方法如摩擦碎裂裝置（

Dy no Mill)或化學方式如以溶菌酶處理使細胞破裂，且 其後以上述方法收集於細胞萃取物中之酯酶而取得。 本發明之编碼酯酶之基因並不限於本説明書所特別掲 示之DNA序列而是包括任何具有得自序列修飾如插入，刪 除，取代之DNA序列的基因。即，此酯酶基因可於試管 中直接使用以此處掲示之酯酶基因的DNA序列為基準所 設計之合成的突變DNA引子，或使用化學突變劑如甲酸 ，亞硫酸阱人工修飾。此外，酯酶産生株以NTG或UV處 理可取得一突變基因。 實施例 本發明以下列實施例醐明但不應被解釋為將侷限於此。 於實施例中，酯酶活性以傳統方法測定（使用脂酶組 套S,由日本大曰本製藥股份有限公司製造）。其亦以其 他方法測定，包括令産物於橄欖油中pH 8.0, 37-C下酵 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 素反應20分鐘，並於其後測量脂肪酸生成量。酯酶活性 之單位以生成脂肪酸A m ο 1 /分鐘表示。此外，實施例 中所使用之培餐基具有下列形式，其中” ％ ”為W/ V %， ~ 1 0 - 81.9.20,000 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)甲4現格（210 X 297 Χίέ ) 2122C3 ΑΓ. I Μ； 五、發明説明（9 ) 除非待定外。 LB培资基：1.0% 之 Bactotryptone(由 Difco製造）， 0.5% 之 Bacto Yeast Extract(由 Difco製造），和 0.5% 之氦化銷。 LBG平板培養基：1.0% 之 Bactotrypt one (由 D i f c 〇 製 造），0.5% 之 Bacto Yeast Extract(由 Difco製迪），0.5 %之氣化納，和1 . 0 %之G e 1 1 an G u b (由日本和光純化工 業有限公司製造）。 含甘油三丁酸酯之LBG平板培養基：LBG平板培養基内 含0.5 ν/ν%之甘油三丁酸酯，0.5%之聚氣乙烯鯨播醚醇 ，和0 . 0 0 5 %之安比西林β 産生酯酶培餐基：1.0 %之糊精，2.0%之肉，0.2% 之硫酸銨，0.1¾之磷酸二氫鉀，0.05%之硫酸鎂七水 合物，0.01%之氛化鈣二水合物，0.001%之硫酸亞鐵 七水合物，0.5% 之 Tween 80,和 0.1% 之 color in。 實施例1 (1)製備含有编碼酯酶基因之染色體DNA 將黏質沙雷氏菌Sr 41(FERM BP-487)令以於LB培養基 振 氣 通 下 °c ο 3 中 ΤΑ 於 浮 懸 胞 且溶 ，水 夜納 過化 養氯 培 ％ 盪9 心 離 以 後 其 於

-M 裝 訂 經濟部中央標準局員工消費合作杜印製 内 於 浮 懸 胞 細 之 洗 胄 •VI 此 以 0 洗 清 其 將 以 Elc 身 細收 0心 胞離 細以 集後 收其 並 中 \—/ IX η ο ο 2 /V 液 之.£ 酶7 菌PH 溶 ί gi液 on溶 20水 含鈉 二 酸 醋 四 胺二 乙 時 小 一 置 靜 溫 室 於 其 令 並 本紙張尺Λ適用中围國家標準（CNS)甲4觇格（210 X 297 X釐） 81.9.20,000 Μ、 I if, 212203 五、發明説明（10 ) rJr!-eJn.v:T木1;f') 於混合液中加入0.5%濃度之十二烷基硫酸納，並再 加入蛋白酶K ,並將混合液於5 0 4C下溫和振通3小時以 分解細胞。混合液以等：！之以酚飽和的IGbM Tris-HCl-lmM乙二胺四醋酸二納水溶液（pH 8.0)(此後稱TE)萃取 丙次，並再以等董之TE-飽和酚和氛仿混合液萃取兩次 ，且於其後令所産生之水層以酒精沈澱β沈澱物溶入 ΤΕ中以製備-ΤΕ溶液内含2.5nig之含有编碼酯酶基因的染 色體DN A。 (2) 製備重組質髏DNA : 上述（1)製得之染色體DNA(20# g)以限制内切核酸酶 Sail完全切開，其以等量之TE-飽和酚和氣仿混合液萃 取兩次。於混合液中加入0.5體積之7.5M醋酸銨，以兩 倍體積酒精，離心回收DNA。 以上述相同限制酶完金切開之質體載體PUC 19DNA(0.5 /U g)以鹼性磷酸酶（由日本賫酒造股份有限公司製造， 0.4單位）在56eC下脱磷酸處理1小時，並以等量之TE-飽和酚和氣仿混合液萃取兩次，並於其中加入0.5體稹 之7.5M醋酸鞍，以兩倍體積酒精沈澱回收載體質體DNA 。由此所得之脱磷酸的質體載髏混合以上迷之染色體DNA (3// g)並以DNA連接組套（由寶酒造股份有限公司製造） 經 濟 部 中 央 標 準 局 在4 °C下連接1 6小時可得重組質體D N A。 (3) 轉形以重組質體並以大賜桿菌宿主製備菌落庫： 大腸桿KDH 5之細胞以Han a han方法處理〔參見Journal 消 -12 合 社 印 8].9.20,000 本紙張尺度適用中S國家標準（CNS)甲4規格（210 X 297公楚） 212203

ΑΓ. 1UI 五、發明説明（11) of Molecular Biology，Vol. 166,557(1983)〕並於其中 加入含有得自上述（2)之質體DNA方反應混液，以進行轉 形。由此處理之細胞塗布於含有安比西林之LB平板培餐 基（50 >ug/ml)並將其於37°C下培餐遇夜，可得含有嵌 人以黏質沙雷氏菌Sr 41染色體DNA片段之重組質醱的轉 形體（約2 0，0 G 0株）。 (4)單離並鑑定含有编碼酯酶基因之轉形株 當酯酶産生株被接種至一含甘油三丁酸酯之LBG平板 培養基時，培養基中所産生的酯酶分解甘油三丁酸酯而 産生脂肪酸，由此，菌落周圍之三酸甘油酯乳剤被修飾 而於菌落周圍形成圓形之澄清區。利用此現象，進行轉 形體之篩選β 將上述（3)所得之轉形體（約20,00G株）接種至一含甘 油三丁酸酯之LBG平板培養基中，於37-C下培養過夜， 而由Sail之DN Α庫單離出一株形成澄清區者。 此澄清區之形成為歸因於酯酶之活性，因為當黏質沙 雷氏菌Sr 41被接種於一含甘油三丁酸酯之LBG平板培養 基並在37 °C下培養過夜時，可觀察到澄清區的形成，但 當未轉形之大賜捍菌DH 5和帶有質體載體pUC 19之大腸 問 \ilj 二> j'- y.，; 木 裝 訂 經濟部中央標準局員工消費合作社印焚 基 養。 成 培 形 板Η 平的 ^ 0 LB清 之澄 酯到 酸察 丁觀 三未 油並 甘， 含時 1 夜 於過 種養 接培 被下 5Ρ Η 7 D 3 菌在 桿並 l· fl夕\ 此g/ ^ ο 夜 (2過 林養 西培 比盪 安振 含氣 内通 於下 體°c 形37 轉中 之1) 區OIB f 6 清ί 澄基 成 形 可LI 將之 養 培 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS〉甲4規格（210 X 297公楚） 81.9.20,000 212203_^_ 五 '發明説明（12) ，收集細胞並懸浮於200mM Tris-HCigi衡液（pH 8.0,20 η 1 )中。以音波作用將細胞打碎後，以簡便方法測定混 合液之酯酶活性。結果，觀察到1.5Χ103單位之酯期ί 活性。 再者，將上述所得之混合液令以SDS聚丙烯醯胺謬電 泳。結果，此産物顯示出一新的帶，以為於來自僅含載DH5 體質體之大腸桿菌Λ之産物所不顯示出者，其在同於來自 黏質沙雷氏菌Sr 41培養上清液所得之部分純化標準酯 酶之相同位置。 實施例2 質體之分析·. 由實施例1-(4)所得之轉形體細胞以傳統方法製得一 質體 DNA(參見 Maniatis等人，'‘Molecular Cloning·',第 368頁，冷泉港實驗室，美國（1982)〕，以各種限制内切 核酸酶切割並於其後令以洋菜耱膠電泳。結果，確定此 質體（此後稱"PLIPE 101")含有約4.0 kb之Sail DNA片 段。 PLIPE 101所含之約4.0 kb的重組DNA片段之限制内 切核酸酶輿圖示於附圖1。 經濟部中央標準局ta工消费合作社印5衣 割 10切 Ε 酶 IP酸 PL核 體切 質内 制 約 之 各 且 限 P 種體 各載 以體 段質 片至 NAS D選 II次 sa段 的 Η 用 B 作 L 形之 轉酯 之酸 5 丁 DH三 菌油 桿甘 賜含 大一 行於 進養 ,培 後式 中方 19述 上 同 體 形 轉 此 中 基 餐 培 板 平 本紙張又度適用中國國家標準（CNS)甲4規格（210 X 2(J7公犛） 81.9.20,000 212203 ΛΓ, IU； 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 五、發明説明（6 ) 測定其是否形成澄清區。 各D N AH段之限制内切核酸酶輿圖示於附圖2 ^於轉 形以含有約2 · 8 k b S a 1 I - B a m Η I D N A片段質體（p L I P E 1 U ) 之大腸桿菌DH5及轉形以含有約2.6 kb Sall-BstPI DNA 片段質體（P L I P E 1 2 1 )之菌株，可觀察到澄清區之形成 和酯酶活性（以簡便方法測定）。然而，於轉形以含有約 1 . 9 k b S a 1 I - P v u 1 I I D N A 片段質體（p L I P E 1 3 1 )，含有約 1.7kb Sall-BastPI DNA片段質體（pLIPE 141),和含有 約3.6kb Clal-Sall DMA片段質體（pLIPE 151)之大腸桿 菌D Η 5 ,並未觀察到澄清區之形成和酯酶活性（以簡便 方法測定）。 由以上結果發現编碼源自黏質沙雷氏菌靥S r 4 1酯酶 之基因，為存在於約2.6kb之Sall-BstPI DNA片段中。 實施例 3 選殖DNA之分析： 〔核甘酸序列之測定〕 重組質體P L I P E 1 2 1以仟鹼基刪除組套（K i 1 〇 b a s e Deletion Kit,由賫酒造股份有限公司製造）處理以製 備各種刪除之質體。將所得之質體令以依Sanger等人之 雙去氣鍊终止法[P r 〇 c · N a t, 1 . A c a d . S c i . U S A , V ο 1 . 7 4， 5 4 6 3 ( 1 9 7 7 )〕連接以引子，以D N A聚合酶之K 1 e η o w H段 〔以（cr -32 P)dGTP(14.8x 1 0 6 Bq/pmol， ( 7 4 x 1 0 4 B q 標幟）〕合成互補鐽，並以896-尿素 修飾聚丙烯醯胺膠電泳和自動放射照相之數據測定其核 -1 5 - -ΐ:ίΊ' .裝. .1T. 本紙張又度適用中國國家桴準（CNS)甲4規格（210 X 297么、釐〉 81.9.20,000

經濟部中央標芈局R工消¢合作杜印纪 五、讦明説叫（14 ) 甘酸序列。 結果，發現编碼源自鲇質沙雷氏菌Sr 41酯雜之基因 為由起始密碼子ATG至密碼子GCC之1839個齡基對所組成。 此外，由核苜酸序列所定出之胺基酸序列示於S E Q I D NO: 3。此胺基酸序列之N -終端Met並未在源自沙雷氏菌 酯酶之純化酵素産物的胺基酸序列N終端被發現，此為 起因於細胞中存在之蛋胺酸胺基胜呔酶自細胞中所産生 之蛋白質移除N -終端的蛋胺酸。更且，雖然源自沙雷氏 菌之酯酶為一種胞外酵素，但其並没有通常存在於分泌 性蛋白質N終端之訊號胜呔。 實施例 4 將黏質沙雷氏菌Sr 41(FERM BP-487)培餐於一營餐 培養基（蕕萄糖0.5%,蛋白臃1.096，肉萃取物0.3%, 酵母萃取物1.0%,和氣化鈉0.5%, pH 7.0, 3 ml)過 夜，並將此培養物（Q.lml)接種至同上營餐培餐基之新 鮮培養基（3ml)中，於30°C培餐3小時，並於加入0.1»g /ml濃度之NTG後再培養30分鐘。離心培養液，並將此 細胞以生理食鹽水清洗三次（以離心法）^所得細胞懸浮 於生理食鹽水中並塗布至含甘油三丁酸酯0.5 %,葡萄 糖2%和EDTA 2mM之LBG平板培養基，以1-1000細胞/一 平板。於3 0 °C培養一天後，收集形成大澄清區之菌落以 取得黏質沙雷氏菌M-1菌株（FERM BP-4068)。將所得之 突變株（一白金耳）接種至一含安比西林（500# g/ ml) -1 6 - 1：(； 曰補充!~82.-4; "t6- 修 ΑΓ, 五、發叫·.'兑明（15 ) 之酯酶産生培餐基並令於3 0 °C下往復振潘培餐{振盪振 幅7 c m , 12 G r · p · m · ) 2 0小時。離心培養液可得具有約8 Ο X 1 0 3單位/ m ](以簡便方法測定）酯酶活性之上淸液。此 菌株具有高於母宿主菌株黏質沙雷氏菌Sr 41約2.5倍之 酯酶生産力。 丨裝. 同於實施例1至3所述方式，由上述黏質沙雷氏_ M-1單離染色體DNA,並分析序列。結果，其具有示於 SEQ ID NO: 2之核甘酸序列。由其顯知，此序列同於 得自黏質沙雷氏菌Sr 41之DNA序列，除了第9値鹾基 不同外，即，其為由起始密碼子ATG至密瑪子GCC之1839 個齡基對所組成。由其所定出之胺基酸序列同於SEQ ID N 0 : 1所推演者。 實施例5 製備具有高酯酶生産力之菌株： 質體pLIPE 111導入一限制内切核酸酶缺乏之g株， 黏質沙雷氏菌TT392,可得一轉形株。此修飾以黏質 沙雷氏菌之PLIPE 111質體DNA以驗性溶菌法自轉形株 之細胞萃取出》其次，黏質沙雷氏菌Sr 41細胞以電穿 孔法轉形以上述所得之質體DNA,以得轉形體黏質沙雷 氏菌TA 5025(FERM BP-4067)。將此所得之轉形體（一白 經濟部中夾標準局Η工消费合怍社印纪 至 HI11 種 接 在 於 令 並 耳基 金養

IX 時 小 ϊ ο位 培2 酶1 I 5 egB ο 生7CX1 産幅9X d 振1. 丨盪約 振有 / ( g赛員 3. 得 ο 培 1 o i 可 5潘 i11¾ 林cfi^ 复 西ii培 比下心 安°01離 含 ο 〇 衣紙倀义戍過片丨中阀丨U’NS)屮‘πια今（LM() X λ、ν ) 81 .9.：!0,000 ΛΓ, IK； 212203 五、發明説明（1ί> ) /ml(以簡便方法测定）酯酶活性之上淸液。此薗株具有 高於宿主菌株黏質沙雷氏豳Sr 41約6倍之酯_生産力。 實施例 6 生産酯酶： 將一含安比西林（500# g/ml)之産生能酶培餐基（20 升）裝入一値30升艚積之桶醱酵槽中並滅菌。首先，將 上述之黏質沙雷氏菌TA 5025於相同培餐基中以上逑相 同方式於3(TC下往復振盪培養20小時。所得之前培養液 (200ml)接種至上述培養基中並於30°C 200r.p.m·，0.5 vvm攪拌通氣培養18小時。離心培餐液以移除細胞，並 以超過濾器（A I L - 1 0 1 0 ,由朝日化工股份有限公司製造） 濃縮上清液，可得1.7X 1〇6單位/ al(以簡便方法測定） 酯酶活性之粗製酵素溶液（2000«1)。 實施例 7 生産酯酶： 將一産生酯酶培養基（20升）裝入一値30升體積之桶醱 酵槽中並滅菌。首先，將黏質沙雷氏菌M-1於相同培餐 基中以上述相同方式於30 °C下往復振遇培餐20小時。所 得之前培養液（2 G 0 m 1 )接種至上逑培養基中並於3 0°C妙〇 r.p. m. ,0.5vvm攪拌通氣培養18小時。離心培養液以移除細胞 ,並以超過濾器（AIL-1010,由朝日化工股份有限公司 製造）濃縮上清液（18升），可得7.9X105單位/ ml (以 簡便方法測定）酯酶活性之粗製酵素溶液（2ϋ00ηι〇。 -1 8 - 本紙张尺渡適用中阀國家標苹（CNS)甲4規格（21U X 297公坌） .裝， *^τ. 經濟部中央標準局R工消费合作社印 81.9.20,000 2122G5 Μ 五、發明説明（17 ) 質得 組可 重體 之形 因轉 基餐 酶培 酯且 碼， 编力 以産 入生 嵌酶 有酯 C 含的酶 和異酯 株優欲 效變有所 功突具之 之之體度 明明形純 發發轉高 本本的置 體大 fa?L:"]....lv:rlill之 d^木!!、) 經濟部中央標準局K工消費合作杜印製 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)甲4規格（210 X 297公釐） 81.9.20,000 212203 ΛΓ, Β(; 五、發明説明（18 ) S Ε Q ID NO: 1 : 長度：1 8 3 9 齡基對 類型：核酸 股性：雙股 拓蹼學：線型 分子類型：基因組DNA 菌株：黏質沙雷氏豳Sr· 41

ATG GGC ATC TTT AGC TAT AAG GAT CTG GAC CTG TTT TCC GAC GCC TTG GCC ATC TCT ACC GAT AAC GGC TTC GAT GAA GGC TAT CAC CAG CTG CCG CTG ACG CTG ATC ACG GCG CTC ATC GGC GGC CTG CCC GGT CTT CCC TGG AAC CCC CAG GAC GCG GTG AAC AAT GCC GGC TGG TCA TTG GGA TAC GCC GGC AAA ACC GAT GCG CGC ACC GCC GGT TAC ACC ACC GCT CAG GCC GAG AGC GAA GGC AAT CTC ACC GCC ATT GGC ATC GGC CCG CGC GAG TCG CTG ATC GGC GAT ACC GAT CTG TTG GCC GGG TTC GGG CCG AAA GCT AAG GCC TTC GGC AAT TTG CTG GGG GAC GTG CAC GGG CTG AGC GGC GAA GAC GTG GTG ATC GGG CTG GCG GTC AAC AGC ATG GCG GCG CAG GGC TTC TAC GCG CAG TCC AAC TAT GTC GCC TAC GAA GCC GGC GGC AAG GTG ATC AAC ATC GTG TTT CGC GCG CTC GAC {3GC ACC TCG CTG GTT CAC GAT GCG CCG CAT ACC TCC GCC ACC AAC GAC CAC TAC GCG TCG GAC GCC TGG AAT CTC AAC ATT CCG ACC TGG CTA TCC CAC CTG GGT CTG ATG CGG GTG CTG AAC TCC GAG TTT GAC TCG ACC ATC ATC GTC TCC AAC CTG TCG ACC TGG GTG GAA GAT CTG AAC CGC AAC GCG ACG TTT ATC ATC GGC AGC GAC GGC AAT GAT GGC AAC GAC TAT CTC GAG GGC CGC GAC GGT GCC GGC GGC TAT AAC CTG ATC GCC GGC GGC GAT ACC CAG CAG GCG TTG11

AAC ACC GAG

GAA AAC GCG TAC GCT TAC ACC GGT TTC GGC AGC ACC GAC TCC GAA GTG ATC GAC GGC ACC TAC GTG CTG GGC TCA TTT CGC ATC GGC GAT ATG CGA CGC GCG AAA TTC AGC GGC CAC AGC GAC GCA TTC GCC TCG GGC TAT GAG ACC CTG CCG AAC AAT ATC CTG TTG CCG CCG TTC TTC TAT TCG CTG AAC GTC ACG GAA ACG CAC TTG ATC AAG GAC GAT ATC AAA GGC CAC GTC GCC TAC TCA AAG GCG 48 CAC AAT ATC 96 GGC CTC GGT 144 CAG TCG CAG 192 CAG GCC GCG 240 GCC GCG CAA 288 TAC GGC GAA 336 AAA TAT GAC 384 GGT ACC AGC 432 GTG ATT AAC 480 TAT ACG CTG 528 GCG CAG GCC 576 AGC CTC GGC 624 ACC TGG GGC 672 CCG ACC CAG 720 AAC GAT CCG 768 TCA TTG GGC 816 GTC AAC TTC 864 TTC TCC ATT 912 TAT CAG GAT 960 ACC GAC AAA 1008 CGC GGC AGT 1056 AGC GGG CCG 1104 GGC GGC AAA 1152 TTC CGC GAC 1200 AAT ATC TTC 1248 GAC GGC AAT 1296 f»At:"]..:lt.:--§f.u^-Jrifr堵.；^木;!) 裝 訂 本紙張又度適用中园园家標準（CNS)甲.1規格（210 X M7 H ) 20- 81.9.20,000 212203 ΑΓ, IU； 五、發明説明（19) ACG CTT TAG CTG CGC GAC GCC AAA GAA GGC GGC ATT ACG CTG GCG GAC GAC 1344 ATC AGC ACC CTG CGC AGC AAA ACC TCC TGG CTG ATT TTC AGC AAA 1392 GAG GTG GAT CAT CAG GTG ACC GCC GCC GGA TTG AAA TCG GAT TCG GGC 1440 CTC AAA GCC TAT GCG GCC GCC ACC ACC GGC GGC GAC GGC GAT GAC GTC 1488 CTG CAG GCT CGC AGC CAC GAC GCC TGG CTG TTC GGC AAC GCC GGC AAC 1536 GAC ACG CTT ATC GGC CAT GCC GGC GGC AAC CTG ACC TTC GTC GGC GGC 1584 AGC GGC GAT GAC ATC CTG AAG GGG GTC GGC AAC GGC AAT ACC TTC CTG 1632 TTC AGC GGC GAT TTC GGC CGC GAC CAG CTG TAT GGC TTC AAC GCC ACC 1680 GAC AAA CTG GTA TTT ATC GGC ACC GAG GGC GCC AGC GGG AAT ATC CGC 1728 GAC TAT GCC ACG CAG CAA AAC GAC GAT CTG GTG CTG GCC TTC GGC CAC 17 76 AGC CAG GTC ACG CTG ATC GGC GTC TCG CTC GAT CAT TTC AAC CCC GAT 1824 CAG GTG GTG TTG GCC \ 1839 ,:/i '1. r*'；i ώ] 之ί; Vj-mu木 Yf SEQ ID NO : 2 : 裝 訂 長度：1 8 3 9 齡基對 類型：核酸 股性：雙股 拓蹼學：線型 分子類型：基因組DNA 菌株：黏質沙雷氏菌M-1 ATG GGC ATT TTT AGC TAT AAG GAT CTG GAC GAA AAC GCG TCA AAG GCG 48 CTG TTT TCC GAC GCC TTG GCC ATC TCT ACC TAC GCT TAC CAC AAT ATC 96 GAT AAC GGC TTC GAT GAA GGC TAT CAC CAG ACC GGT TTC GGC CTC GGT .144 CTG CCG CTG ACG CTG ATC ACG GCG CTC ATC GGC AGC ACC CAG TCG CAG 192 GGC GGC CTG CCC GGT CTT CCC TGG AAC CCC GAC TCC GAA CAG GCC GCG 240 CAG GAC GCG GTG AAC AAT GCC GGC TGG TCA GTG ATC GAC GCC • GCG CAA 288 TTG GGA TAC GCC GGC AAA ACC GAT GCG CGC GGC ACC TAC TAC GGC GAA 336 ACC GCC GGT TAC ACC ACC GCT CAG GCC GAG GTG CTG GGC AAA TAT GAC 384 AGC GAA GGC AAT CTC ACC GCC ATT GGC ATC TCA TTT CGC GGT ACC AGC 432 GGC CCG CGC GAG TCG CTG ATC GGC GAT ACC ATC GGC GAT GTG ATT AAC 480 GAT CTG TTG GCC GGG TTC GGG CCG ΑΑΆ GCT ATG CGA CGC TAT ACG CTG 528 AAG GCC TTC GGC AAT TTG CTG GGG GAC GTG GCG ΆΑΑ TTC GCG CAG GCC 576 CAC GGG CTG AGC GGC GAA GAC GTG GTG ATC AGC GGC CAC AGC CTC GGC 624 社 印 21 本紙掁&度適用中國國家標準（CNS)甲4規格（210 X 297 H ) 81.9.20.000 A(i ΗΓ» 五、發明説明（20 ) 6GG CTG GCG GTC AAC CAG AGC ATG GCG GCG CAG AGC GAC GCA ACC TGG GGC 672 GGC TTC TAC GCG TCC AAC TAT GTC GCC TTC GCC TCG CCG ACC CAG 720 TAC GAA GCC GGC GGC AAG GTG ATC AAC ATC GGC TAT GAG AAC GAT CCG 768 GTG TTT CGC GCG CTC GAC GGC ACC TCG CTG ACC CTG CCG TCA TTG GGC 816 GTT CAC GAT GCG CCG CAT ACC TCC GCC ACC AAC AAT ATC GTC AAC TTC 864 AAC GAC CAC TAC GCG TCG GAC GCC TGG AAT CTG TTG CCG TTC TCC ATT 912 CTC AAC ATT CCG ACC TGG CTA TCC CAC CTG CCG TTC TTC TAT CAG GAT 960 GGT CTG ATG CGG GTG CTG AAC TCC GAG TTT TAT TCG CTG ACC GAC AAA 1008 GAC TCG ACC ATC ATC GTC TCC AAC CTG TCG AAC GTC ACG CGC GGC AGT 1056 ACC TGG GTG GAA GAT CTG AAC CGC AAC GCG GAA ACG CAC AGC GGG CCG 1104 ACG TTT ATC ATC GGC AGC GAC GGC AAT GAT TTG ATC AAG GGC GGC AAA 1152 GGC AAC GAC TAT CTC GAG GGC CGC GAC GGT GAC GAT ATC TTC CGC GAC 1200 GCC GGC GGC TAT AAC CTG ATC GCC GGC GGC AAA GGC CAC AAT ATC TTC 1248 GAT ACC CAG CAG GCG TTG AAA AAC ACC GAG GTC GCC TAC GAC GGC AAT 1296 ACG CTT TAC CTG CGC GAC GCC AAA ΑΆλ GAA GGC GGC ATT ACG CTG GCG GAC GAC 1344 ATC AGC ACC CTG CGC AGC ACC TCC TGG CTG ATT TTC AGC AAA 1392 GAG GTG GAT CAT CAG GTG ACC GCC GCC GGA TTG AAA TCG GAT TCG GGC 1440 CTC AAA GCC TAT GCG GCC GCC ACC ACC GGC GGC GAC GGC GAT GAC GTC 1488 CTG CAG GCT CGC AGC CAC GAC GCC TGG CTG TTC GGC AAC GCC GGC AAC 1536 GAC ACG CTT ATC GGC CAT GCC GGC GGC AAC CTG ACC TTC GTC GGC GGC 1584 AGC GGC GAT GAC ATC CTG AAG GGG GTC GGC AAC GGC AAT ACC TTC CTG 1632 TTC AGC GGC GAT TTC GGC CGC GAC CAG CTG TAT GGC TTC AAC GCC ACC 1680 GAC AAA TAT CTG GTA TTT ATC GGC ACC GAG GGC GCC AGC GGG AAT ATC CGC 1728 GAC GCC ACG CAG CAA AAC GAC GAT CTG GTG CTG GCC TTC GGC CAC 1776 AGC CAG GTC ACG CTG ATC GGC GTC TCG CTC GAT CAT TTC AAC CCC GAT 1824 CAG GTG GTG TTG GCC \ 1839 (.·Λ12·-:νί)而之：iv?pJr!再填寫本頁) ,装， 訂. 經濟部中央標準局員工消費合作社印*·!水 -22- 表紙張儿度適用中阀囷家榫準（CNS)甲4規恪（21u x 297公笼） 21220^ 从 __IU； 五.發明説明（21 ) SEQ ID NO: 3: 長度：613胺基酸 類型：胺基酸 拓睽學：線型 分子類型：胜肽

Met Gly lie Phe Ser Tyr Lys Asp Leu Asp Glu Asn Ala Ser Lys Ala 1 5 10 15 rai'Mt 5Γ -:H:r1(1)之 J;tfJr«冉增.¾木ϊ!) 經濟部中央標準局員工消費合作社印製

Leu Phe Ser Asp Ala Leu Ala He Ser Thr Tyr Ala Tyr His Asn lie 20 25 30 Asp Asn Gly Phe Asp Glu Gly Tyr His Gin Thr Gly Phe Gly Leu Gly 35 40 45 Leu Pro Leu Thr Leu lie Thr Ala Leu lie Gly Ser Thr Gin Ser Gin 50 55 60 Gly Gly Leu Pro Gly Leu Pro Trp Asn Pro Asp Ser Glu Gin Ala Ala 65 70 75 80 Gin Asp Ala Val Asn Asn Ala Gly Trp Ser Val lie Asp Ala Ala Gin 85 90 95 Leu Gly Tyr Ala Gly Lys Thr Asp Ala Arg Gly Thr Tyr Tyr Gly Glu 100 105 110 Thr Ala Gly Tyr Thr Thr Ala Gin Ala Glu Val Leu Gly Lys Tyr Asp 115 120 . 125 Ser Glu Gly Asn Leu Thr Ala lie Gly lie Ser Phe Arg Gly Thr Ser 130 135 140 Gly Pro Arg Glu Ser Leu He Gly Asp Thr He Gly Asp Val He Asn 145 150 155 160 Asp Leu Leu Ala Gly Phe Gly Pro Lys Ala Met Arg Axg Tyr Thr Leu 165 170 175 Lys Ala Phe Gly Asn Leu Leu Gly Asp Val Ala Lys Phe Ala Gin Ala 180 185 190 His Gly Leu Ser Gly Glu Asp Val Val lie Ser Gly His Ser Leu Gly 195 200 205 -23- 本紙張八·度適用肀國园家標準（CNTS)甲4規格（210 X 2ί)7公梦） 81.9.20,000 裝· 訂· Λβ ΗΓ. 212203 五、發明説明（22 )

Gly Leu Ala Val Asn Ser Met Ala Ala Gin Ser Asp Ala Thr Trp Gly 210 215 220

Gly Phe Tyr Ala Gin Ser Asn Tyr Val Ala Phe Ala Ser Pro Thr Gin 225 230 235 240

Tyr Glu Ala Gly Gly Lys Val lie Asn lie Gly Tyr Glu Xsn Asp Pro 245 250 255

Val Phe Arg Ala Leu Aep Gly Thr Ser Leu Thr Leu Pro Ser Leu Gly 260 265 270

Val His Asp Ala Pro His Thr Ser Ala Thr Asn Asn He Val Asn Phe 280

Ala Ser.Asp Ala Trp Aen Leu Leu Pro Phe Ser lie 295 300

Leu Asn lie Pro Thr Trp Leu Ser His Leu Pro Phe Phe Tyr Gin Asp 305 310 315 320

Gly Leu Met Arg Val Leu Asn Ser Glu Phe Tyr Ser Leu Thr Asp Lys 325 330 335

Asp Ser Thr lie lie Val Ser Asn Leu Ser Asn Val Thr Arg Gly Ser 340 345 350

Thr Trp Val Glu Asp Leu Asn Arg Asn Ala Glu Thr His Ser Gly Pro 355 360 365

Thr Phe lie lie Gly Ser Asp Gly Asn Asp Leu lie Lys Gly Gly Lys 370 375 380

Gly Asn Asp Tyr Leu Glu Gly Arg Asp Gly Asp Asp lie Phe Arg Asp 385 390 395 400

Ala Gly Gly Tyr Asn Leu lie Ala Gly Gly Lys Gly His 'Asn lie Phe 405 410 415

Asp Thr Gin Gin Ala Leu Lys Asn Thr Glu Val Ala Tyr Asp Gly Asn 420 425 430

Thr Leu Tyr Leu Arg Asp Ala Lys Gly Gly lie Thr Leu Ala Asp Asp 435 440 445

He Ser Thr Leu Arg Ser Lys Glu Thr Ser Trp Leu He Phe Ser Lys 450 455 460 . 24- 本紙張又茂適用中园K家標苹（CN’S>甲4规格（2丨(丨X 297公楚） -',|1閲-,,1而之;1'&菸項再項."本頁} 275 Asn Asp His 290 285 裝 訂 經濟部中央標準局B工消費合作社印裝

2l22〇S Λ(; B(； 五、發明説明（23 )

Glu Val Asp His Gin Val Thr Ala Ala Gly Leu Lys Ser Asp Ser Gly 465 .470 475 480 Leu Lys Ala Tyr Ala Ala Ala Thr Thr Gly Gly Asp Gly Asp Asp Val 485 490 495 Leu Gin Ala Arg Ser His Asp Ala Trp Leu Phe Gly Asn Ala Gly Asn 500 505 510 Asp Thr Leu lie Gly His Ala Gly Gly Asn Leu Thr Phe Val Gly Gly 515 520 525 Ser Gly Asp Asp lie Leu Lys Gly Val Gly Asn Gly Asn ihr Phe Leu 530 535 540 Phe Ser Gly Aep Phe Gly Arg Aep Gin Leu Tyr Gly Phe Asn Ala Thr 545 550 555 560 Asp Lys Leu Val Phe He Gly Thr Glu Gly Ala Ser Gly Asn He Arg 565 570 575 Asp Tyr Ala Thr Gin Gin Asn Asp Asp Leu Val Leu Ala Phe Gly His 580 585 590

Ser Gin Val Thr Leu lie Gly Val Ser Leu Asp His Phe Asn Pro Asp 595 600 605 Gin Val Val Leu Ala 610 f^ts?-.f.r«-1s»之注念菸項再填寫本頁) f —裝- 訂. 經濟部中央標箏扇®:工消费合作杜印製 -25- 本紙张尺度適用中圃《家標準（CNS)甲〇見格（2l0 x 297公;>

Claims (1)

1. ,補充本Μ 月Μ Α7 Β7 C7 D7 六、申請專利ia圍 第81109400號「编鼉酯W之基因和其製法」專利案 (82年7月6日修正） ，申請專利範園： 1.—種编碼源自沙雷氏菌靥微生物酯酶之基因，其具有 如下SEQ ID N0:1或SEQ ID N0:2所示之DNA序列： SEQ ID NO. 1： {請先閱讀背面之注意事項再蜞寫本頁) 經濟部中央標準局e：工消費合作杜印< ATG GGC ATC TTT AGC TAT AAG GAT CTG GAC GAA AAC GCG TCA AAG GCG 48 CTG TTT TCC GAC GCC TTG GCC ATC TCT ACC TAC GCT TAC CAC AAT ATC 96 GAT AAC GGC TTC GAT GAA GGC TAT CAC CAG ACC GGT TTC GGC CTC GGT 144 CTG CCG CTG ACG CTG ATC ACG GCG CTC ATC GGC AGC ACC CAG CAG TCG CAG 192 GGC GGC CTG CCC GGT CTT CCC TGG AAC CCC GAC TCC GAA GCC GCG 240 CAG GAC GCG GTG AAC AAT GCC GGC TGG TCA GTG ATC GAC GCC GCG CAA 288 TTG GGA TAC GCC GGC AAA ACC GAT GCG CGC GGC ACC TAC TAC GGC GAA 336 ACC GCC GGT TAC ACC ACC GCT CAG GCC GAG GTG CTG GGC ΑΑΛ TAT GAC 384 AGC GAA GGC AAT GAG CTC ACC GCC ATT GGC ATC TCA TTT CGC GGT ACC AGC 432 GGC CCG CGC TCG CTG ATC GGC GAT ACC ATC GGC GAT GTG ATT AAC 480 GAT CTG TTG GCC GGG TTC GGG CCG AAA GAC GCT ATG CGA CGC TAT ACG CTG 528 AAG GCC TTC GGC AAT TTG CTG GGG GTG GCG AAA TTC GCG CAG GCC 576 CAC GGG CTG AGC GGC GAA GAC GTG GTG ATC AGC GGC CAC AGC CTC GGC 624 GGG CTG GCG GTC AAC AGC ATG GCG GCG CAG AGC GAC GCA ACC TGG GGC 672 GGC TTC TAC GCG CAG TCC AAC TAT GTC GCC TTC GCC TCG CCG ACC CAG 720 TAC GAA GCC GGC GGC AAG GTG ATC AAC ATC GGC TAT GAG AAC GAT CCG 768 GTG TTT CGC GCG CTC GAC QGC ACC TCG CTG ACC CTG CCG TCA TTG GGC 816 GTT CAC GAT GCG CCG CAT ACC TCC GCC ACC AAC AAT ATC GTC AAC TTC 日64 AAC GAC CAC TAC GCG TCG GAC GCC TGG AAT CTG TTG CCG TTC TCC ATT 912 CTC AAC ATT CCG ACC TGG CTA TCC CAC CTG CCG TTC TTC TAT CAG GAT 960 GGT CTG ATG CGG GTG CTG AAC TCC GAG TTT TAT TCG CTG ACC GAC AAA 1008 GAC TCG ACC ATC ATC GTC TCC AAC CTG TCG AAC GTC ACG CGC GGC AGT 1056 ACC TGG GTG GAA ATC GAT CTG AAC CGC AAC AAT GCG GAA ACG CAC AAG AGC GGG CCG GGC AAA 1104 ACG TTT ATC GGC AGC GAC GGC GAT TTG ATC GGC 1152 GGC AAC GAC TAT CTC GAG GGC CGC GAC GGT GAC GAT ATC TTC CGC GAC 1200 GCC GGC GGC TAT AAC CTG ATC GCC GGC GGC AAA GGC CAC AAT ATC TTC 1248 GAT ACC CAG CAG GCG TTG ΑΑΛ AAC ACC GAG GTC GCC TAC GAC GGC AAT 1296 本紙张Α度逋用中國a家標準（CNS>甲4規格·（210 X 297公釐） 212203 A7 B7 C7 D7 六、申請專利範团 ACG CTT TAC CTG CGC GAC GCC AAA GGC GGC ATT ACG CTG GCG GAC GAC 1344 ATC AGC ACC CTG CGC AGC AAA GAA ACC TCC TGG CTG ATT TTC AGC AAA 1392 GAG GTG GAT CAT CAG GTG ACC GCC GCC GGA TTG AAA TCG GAT TCG GGC 1440 CTC AAA GCC TAT GCG GCC GCC ACC ACC GGC GGC GAC GGC GAT GAC GTC 1488 CTG CAG GCT CGC AGC CAC GAC GCC TGG CTG TTC GGC AAC GCC GGC AAC 1536 GAC ACG CTT ATC GGC CAT GCC GGC GGC AAC CTG ACC TTC GTC GGC GGC 1584 AGC GGC GAT GAC ATC CTG AAG GGG GTC GGC AAC GGC AAT ACC TTC CTG 1632 TTC AGC GGC GAT TTC GGC CGC GAC CAG CTG TAT GGC TTC AAC GCC ACC 1680 GAC AAA CTG GTA TTT ATC GGC ACC GAG GGC GCC AGC GGG AAX ATC CGC 1728 GAC TAT GCC ACG CAG CAA AAC GAC GAT CTG GTG CTG GCC TTC GGC CAC 1776 AGC CAG GTC ACG CTG ATC GGC GTC TCG CTC GAT CAT TTC AAC CCC GAT 1824 CAG GTG GTG TTG GCC 1839 (請先閲讀背面之注意事項再壜寫本頁) «濟部中喪標準场工消费合作杜印製 SEQ ID NO:2: * ATG GGC ATT TTT AGC TAT AAG GAT CTG GAC GAA AAC GCG TCA AAG GCG 48 CTG TTT TCC GAC GCC TTG GCC ATC TCT ACC TAC GCT TAC CAC AAT ATC 96 GAT AAC GGC TTC GAT GAA GGC TAT CAC CAG ACC GGT TTC GGC CTC GGT 144 CTG CCG CTG ACG CTG ATC ACG GCG CTC ATC GGC AGC ACC CAG TCG CAG 192 GGC GGC CTG CCC GGT CTT CCC TGG AAC CCC GAC TCC GAA CAG GCC GCG 240 CAG GAC GCG GTG AAC AAT GCC GGC TGG TCA GTG ATC GAC GCC GCG CAA 288 TTG GGA TAC GCC GGC AAA ACC GAT GCG CGC GGC ACC TAC TAC GGC GAA 335 ACC GCC GGT TAC ACC ACC GCT CAG GCC GAG GTG CTG GGC AAA TAT GAC 384 AGC GAA GGC AAT CTC ACC GCC ATT GGC ATC TCA TTT CGC GGT ACC AGC 432 GGC CCG CGC GAG TCG CTG ATC GGC GAT ACC ATC GGC GAT GTG ATT AAC 480 GAT CTG TTG GCC GGG TTC GGG CCG AAA GCT ATG CGA CGC TAT ACG CTG 528 AAG GCC TTC GGC AAT TTG CTG GGG GAC GTG GCG AAA TTC GCG CAG GCC 576 CAC GGG CTG AGC GGC GAA GAC GTG GTG ATC AGC GGC CAC AGC CTC GGC 624 GGG CTG GCG GTC AAC AGC ATG GCG GCG CAG AGC GAC GCA ACC TGG GGC 672 GGC TTC TAC GCG CAG TCC AAC TAT GTC GCC TTC GCC TCG CCG ACC CAG 720 TAC GAA GCC GGC GGC AAG GTG ATC AAC ATC GGC TAT GAG AAC GAT CCG 768 GTG TTT CGC GCG CTC GAC GGC ACC TCG CTG ACC CTG CCG TCA TTG GGC 816 GTT CAC GAT GCG CCG CAT ACC TCC GCC ACC AAC AAT ATC GTC AAC TTC 864 AAC GAC CAC TAC GCG TCG GAC GCC TGG AAT CTG TTG CCG TTC TCC ATT 912 i裝· 訂. .線. 212203 A7 B7 C7 D7 六、申請專利範園 CTC AAC ATT CCG ACC TGG CTA TCC CAC CTG CCG TTC TTC TAT CAG GAT 960 GGT CTG ATG CGG GTG CTG AAC TCC GAG TTT TAT TCG CTG ACC GAC AAA 1008 GAC TCG ACC ATC ATC GTC TCC AAC CTG TCG AAC GTC ACG CGC GGC AGT 1056 ACC TGG GTG GAA GAT CTG AAC CGC AAC GCG GAA ACG CAG AGC GGG CCG 1104 ACG TTT ATC ATC GGC AGC GAC GGC AAT GAT TTG ATC AAG GGC GGC AAA 1152 GGC AAC GAC TAT CTC GAG GGC CGC GAC GGT GAC GAT ATC TTC CGC GAC 1200 GCC GGC GGC TAT AAC CTG ATC GCC GGC GGC AAA GGC CAC AAT ATC TTC 1248 GAT ACC CAG CAG GCG TTG AAA AAC ACC GAG GTC GCC TAC GAC GGC AAT 1296 ACG CTT TAC CTG CGC GAC GCC AAA GGC GGC ATT ACG CTG GCG GAC GAC 1344 ATC AGC ACC CTG CGC AGC AAA GAA ACC TCC TGG CTG ATT TTC AGC AAA 1392 GAG GTG GAT CAT CAG GTG ACC GCC GCC GGA TTG AAA TCG GAT TCG GGC 1440 CTC AAA GCC TAT GCG GCC GCC ACC ACC GGC GGC GAC GGC GAT GAC GTC 1488 CTG CAG GCT CGC AGC CAC GAC GCC TGG CTG TTC GGC AAC GCC GGC AAC 1536 GAC ACG CTT ATC GGC CAT GCC GGC GGC AAC CTG ACC TTC GTC GGC GGC 1584 AGC GGC GAT GAC ATC CTG AAG GGG GTC GGC AAC GGC AAT ACC TTC CTG 1632 TTC AGC GGC GAT TTC GGC CGC GAC CAG CTG TAT GGC TTC AAC GCC ACC 1680 GAC AAA CTG GTA TTT ATC GGC ACC GAG GGC GCC AGC GGG AAT ATC CGC 1728 GAC TAT GCC ACG CAG CAA AAC GAC GAT CTG GTG CTG GCC TTC GGC CAC 1776 AGC CAG GTC ACG CTG ATC GGC GTC TCG CTC GAT CAT TTC AAC CCC GAT 1824 CAG GTG GTG TTG GCC 1839 2. —種製備新穎重組質腥之方法，其步®包括將一含有 编碼源自沙笛氏菌颶撤生物酯酶基因之染色醱DNA K 段（該基因具有申請專利範園第1項SEQ ID N0:1或 SEQ ID N0:2所示之DMA序列），嵌人一載龌質體DNA 中。 (請先Μ讀背面之注意事項再璜窝本頁) •-裝_ 訂. -線 嫌濟部中夹螵準屬霣工消费合作杜印 製 為 體 質 體 載 中 其 法 製 之 項 2 第圃範 利 専 請 Φ 〇 如193. 法 方 之 物 生微 力 産 生酶酯高 有 具 之隳 新鏞括 製包 種» 1 步4. 其 沙。 A7 B7 C7 __D7 六、申請專利範園 1) 將一重組質_，其包括一含有编碼源自沙笛氏豳屬 撖生物酯酶基因之載腥霣醱（該基因具有申誚專利 範圔第1項SEQ ID N0:1或SEQ ID N0:2所示之DNA 序列），導入蘧自黏質沙雷氏菌和大賜桿菌之宿主 撖生物中，並 2) 選取並單離含有此重組霣臞之宿主撤生物。 5. 如申請專利範圍第4項之製法，其中重組質《為包括 -具有申請專利範園第1項SEQ ID N0:1所示DNA序 列之基因。 6. 如申誚專利範圍第4項之製法，其中重组質體為包括 一具有申請專利範圍第1項SEQ ID N0:2所示DNA序 列之基因，且宿主撖生物為大腸桿菌。 7. —種生産酯酶之方法，其包括培養一轉形以重組質體 之撖生物（該質醴包括有一載釀質體，其内含编碼源 自沙雷氏菌屬微生物酯酶之具有申誚專利範圍第1項 SEQ ID N0:1或SEQ ID N0:2所示DNA序列之基因）， 並由細胞外部和内部收集所産生之酯酶。 (請先閲讀背面之注意事項再塡寫本頁) --裝- 訂· -線. β濟部中央標準局貝工消t合作杜印f 本紙張尺度適用tB國家標举（CNS) f 4规烙（210 X 297公釐）