JPH0347079A - 耐熱性リパーゼ遺伝子、該遺伝子を有するベクターおよび耐熱性リパーゼの生産方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は耐熱性リパーゼをコードするＤＮＡ配列および
該リパーゼを生産する方法に間する。

更に詳しくは、耐熱性リパーゼ生産菌であるシュードモ
ナスＫＷＩ−５６菌株（微工研菌寄第９６５９号）に由
来する染色体ＤＮＡより調製された耐熱性リパーゼをコ
ードするＤＮＡ配列および該ＤＮＡを用いてリパーゼを
生産する方法に間する。

（従来技術） リパーゼはトリグリセリドを基質とし、これを脂肪酸と
グリセリンとに加水分解する酵素である。

しかし、長鎖飽和脂肪酸を多く含む油脂は常温で固体で
あり、リパーゼを工業的に利用する場合には、油脂が溶
融する様な高温下で反応を進めなければならない、さら
に、酵素を固定化し連続反応をおこなう場合には、高温
下で長期間の滞留が必要となる。このような反応系では
用いる酵素は、強い耐熱性を持つことが要求される。

耐熱性リパーゼという点においては、特にシュードモナ
ス（Ｐｓｅｕｄｏ＋＊ｏｎ＋ａｓ　）属細菌がこれらの
リパーゼを生産しうろことが報告されている０例えばシ
ュードモナス・メフィティカ・バリュタス・リボリティ
力（ｍ　　　　　’−１Ｌｃｉ上２月ｊ旦ｂ１力Ｊ４）
（特公昭５０−２５５５３）。

シュードモナス・フラジ−（’　ｂ剋伽ｌ団ＩＰＬ紅）
（特開昭６１−２８０２７４）　、シュードモナス・フ
ルオレセンス・バイオタイプＩ（ｂ皇−姐姐飢旺ｏ　　
　　　ｂｉｏｔｙｐｅ　　Ｉ）　　（特開昭５７−５８
８８５　）が知られている。

一方、近年酵素を大量に生産する際、遺伝子工学的技術
の応用が導入されるようになった。

すなわち、目的とする酵素をコードする遺伝子をクロー
ニングし、これを適当な高発現ベクターに連結する。さ
らに目的酵素遺伝子を含んだベクターを大腸菌等の宿主
細胞に形質転換し、この形質転換体を酵素生産に最適な
条件で培養することによって、容易かつ大量に目的とす
る酵素を得ることが可能となる。遺伝子工学的技術の応
用は、リパーゼにおいても試みられており、多数の微生
物よりリパーゼ遺伝子がクローニングされている０例え
ばスタフィロコッカス（゛）属、シュードモナス （し凹論丑…）属、バチルス（江Ｃ拝賎）属、ゲオトリ
クム（堕吐杜吐岨）属等が知られている。

（発明が解決しようとする問題点） 耐熱性リパーゼ遺伝子のクローニングに間してはバチル
ス・ステアロサーモフィルスＯ１に出且　　　　　　　
°　）の報告（特開昭６２−２２８２７９）があるのみ
である、特にシュードモナス属由来の耐熱性リパーゼ遺
伝子のクローニング、および該遺伝子を用いたリパーゼ
の生産方法は知られていない。

（問題点を解決するための手段） 本発明者らは、耐熱性リパーゼ生産菌シュードモナスＫ
ＷＩ−５６菌株より耐熱性リパーゼをコードする遺伝子
をクローニングし、下記のとおりその塩基配列を決定し
た。

１０　　　　　　　　２０　　　　　　　　３０ＧＣＣ
ＧＡＴＧＧＣＴ　　ＡＣＧＣＧＧＣＧＡＣＧＣＧＴＴＡ
ＴＣＣＧ４０　　　　　　　　５０　　　　　　　　６
０ＡＴＣＡＴＣＣＴＣＧ　　ＴＧＣＡＣＧＧＧＣＴ　　
ＣＴＣＧＧＧＴＡＣＣ？Ｏ８０９０ ＧＡＣＡＡＧＴＡＣＧ　　ＣＣＧＧＣＧＴＧＧＴ　　Ｃ
ＧＡＧＴＡＴＴＧＧｌｏｏ　　　　　　　　　１１０　
　　　　　　　１２０ＴＡＴＧＧＣＡＴＣＣＡＧＧＡＡ
ＧＡＣＣＴ　　ＧＣＡＧＣＡＧＡＡＣ１３０１４０１５
０ ＧＧＴＧＣＧＡＣＣＧ　　ＴＣＴＡＣＧＴＣＧＣＧＡＡ
ＣＣＴＧＴＣＧ１６０　　　　　　　　１７０　　　　
　　　　１８０ＧＧＧＴＴＣＣＡＧＡ　　ＧＣＧＡＣＧ
ＡＣＧＧ　　ＣＧＣＧＡＡＣＧＧＧ１９０　　　　　　
　２００　　　　　　　　２１０ＣＧＣＧＧＣＧＡＡＣ
ＡＧＴＴＧＣＴＣＧＣＴＴＡＣＧＴＧＡＡＧ２２０　　
　　　　　２３０　　　　　　　　２４０ＡＣＧＧＴＧ
ＣＴＣＧ　　ＣＧＧＣＧＡＣＧＧＧ　　ＣＧＣＧＡＣＣ
ＡＡＧ２５０　　　　　　　２６０　　　　　　　　２
７０ＧＴＣＡＡＴＣＴＣＧ　　ＴＣＧＧＣＣＡＣＡＧ　
　ＣＣＡＧＧＧＣＧＧＣ２８０２９０３００ ＣＴＣＡＣＧＴＣＧＣＧＣＴＡＴＧＴＣＧＣＧＧＣＣＧ
ＴＣＧＣＧ１０ ２０ ３０ ＧＧＣＡＣＧＣＣＧＣＡＴＣＧＣＧＧＣＴＣＣＧＡＧＴ
ＴＴＧＣＣ７０ ＧＡＣＴＴＣＧＴＧＣ ８０ ＡＧＡＡＣＧＴＧＣＴ ９０ ＧＧＣＧＴＡＣＧＡＴ ００ ＣＣＧＡＣＣＧＧＧＣ １０ ＴＴＴＣＧＴＣＡＴＣ ２０ ＧＧＴＧＡＴＣＧＣＣ ３０ ＧＣＧＴＴＣＧＴＣＡ ４０ ＡＴＧＴＧＴＴＣＧＧ ５０ ＣＡＴＣＣＴＧＡＣＧ ６０ ＡＧＣＡＧＣＡＧＣＣ ７０ ＡＣＡＡＣＡＣＧＡＡ ８０ ＣＣＡＧＧＡＣＧＣＧ ＣＧＧＧＣＴＧＣＣＡ　　ＣＧＴＡＣＡＡＣＣＡ　　Ｇ
ＡＡＣＴＡＴＣＣＧ５０ ＡＧＣＧＣＧＧＧＣＣ ６０ ＴＧＧＧＴＧＣＧＣＣ ７０ ＧＧＧＣＡＧＴＴＧＣ さらに耐熱性リパーゼ遺伝子を導入したプラスミドをベ
クターとし、これを大腸菌に保持せしめることによって
、大腸菌に耐熱性リパーゼを生産させるに至った。

以下、本発明の詳細な説明する。

■ｌパー　　　　　　口−二ゝ シュードモナスＫＷＩ−５６株より、耐熱性リパーゼ遺
伝子を含む染色体ＤＮＡは、常法に従って単離できシ。

例えば、Ｍａｒｍｕｒの方法（Ｍａｒｍｕｒ、　Ｊ、、
　Ｊ、　Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、：Ｊ、　２０Ｂ（１９６１
））や、Ｓｍ１ｔｈらの方法（Ｓｍｉｔｈ、Ｍ、、Ｇ、
。

“Ｍｅｔｈｏｄ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ”、　Ａ
ｃａｄｅｍｉｃｐｒｅｓｓ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、１２
．　ｐａｒｔ　Ａ、　Ｐ５４５（１９６７））等を用い
ることができる。

染色体ＤＮＡのベクターＤＮＡへの組込みは染色体ＤＮ
ＡおよびベクターＤＮＡを制限酵素で切断したのち、両
者を混合し、ＤＮＡリガーゼで処理することにより行う
ことができる。制限酵素としてはＢｍＮ　Ｉ　＋本立Ｒ
１，さ１１，８土■、カ旦３ＡＩ等があげられる。ベク
ターＤＮＡにはｐｕｃ１８　、ｐＵｃ１９、ｐＢＲ３２
２等の公知のプラスミドベクターやＭ１３ｗｐ１８、λ
ｇｔｌｏ等公知のファージベクターを利用できる。

かかる組換えベクターを用いて大腸菌、枯草菌、酵母等
の形質転換をすることができる。形質転換は塩化カルシ
ウム法等の公知の方法を利用できる。

次に、上記方法で得られた形質転換体のなかから、リパ
ーゼ遺伝子を保持する株をスクリーニングすることがで
きる。例えばＫＵＧ団ＩＹＡらの方法（にｕｇｉｍｉｙ
ａ、　Ｓ、、ＢｉｏｃｈｉｍＢ　Ｉ　Ｏｐ　ｈ　Ｙ　Ｓ
　−Ｒｅ　Ｓ　−Ｃ０１１１ＩＩＵ　ｎ　−＋　ＬＬＬ
＋　ｌ　８５　（１９８６））を用い、トリブチリン寒
天培地上で、トリブチリンの加水分解にともなうクリア
ゾーンを形成する菌株を分離することによって行うこと
ができる。

本発明のリパーゼ遺伝子は、上記のようにして得られた
形質転換体よりアルカリ−５ＤＳ法等の公知の方法を用
いて組換えベクターを分離・精製することにより得るこ
とができる。

次にリパーゼ遺伝子が存在する領域は、上記組換えベク
ターを各種制限酵素を用いてサブクローニングし、かか
る形質転換体のトリブチリン寒天培地でのクリアゾーン
形成能を調べることにより決定できる。さらにはリパー
ゼ遺伝子の塩基配列を公知の方法、例えばジデオキシ法
（Ｓａｎｇｅ「、Ｆ、＋Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ１．Ａｃａｄ
、Ｓｃｉ、ＩＪ、Ｓ、Ａ、　、ｌ、５４６３（１９７７
））等を用いて決定することができる。

シュードモナスＫＷＩ−５６菌株が生産する耐熱性リパ
ーゼが、明らかに上記方法によって得られた遺伝子に由
来するものかどうかを確認するためには、リパーゼ蛋白
質の一次構造と、リパーゼ遺伝子の塩基配列より決定さ
れるアミノ酸配列とが一致するかどうかを調べることに
よって確認できる。

シュードモナスＫＷＩ−５６菌株の培！Ｉ液上清より精
製して得られた耐熱性リパーゼのアミノ酸絹成は、酸加
水分解したのち、アミノ酸分析計により測定することが
できる。また、部分的アミノ酸配列は、液相エドマン分
解法等によりＮ末端アミノ酸からカルボキシペプチダー
ゼ法等によりＣ末端アミノ酸から決定することができる
。

■　　　　　　に　　　　　　　　Ｉ　バー次に、本発
明で得られたリパーゼ遺伝子を利用してリパーゼを生産
することは可能である。リパーゼ遺伝子を挿入したプラ
スミドベクターを保持する形質転換体を、酵素生産に最
適の条件下で培養し、培養上清、あるいは破砕面体より
リパーゼを得ることができる。

以下、実験例を挙げて本発明を更に具体的に説明するが
、本発明はそれら実施例に限定されるものではない。

（実施例） シュードモナスＫＷＩ−５６株の一白金耳を２００ｉＪ
ＮＢ培地（肉エキス１％、ペプトン１％、Ｎａｃｌ　Ｏ
，５％、ＰＨ７，０）に植菌し３０℃、２４時時間上う
培養した。菌体を集菌し、洗浄した後、１２−００．Ｉ
Ｍ）リス−塩酸緩衝液（ｐＨ８，０）、ｌＯ園ＭＥＤＴ
Ａに懸濁し、１■のりゾチームを加え３７℃で１０分間
放置する０次に６００ＪのｌＯ％ＳＤＳを加え、３７℃
３０分間放置し溶菌をおこなった。さらに６００、ｄの
３ＭＮａＣｌを加えたのち、フェノール抽出を３回くり
返し、エーテル洗浄、エタノール沈殿をおこなった。得
られた沈殿物は乾燥後１０１１ＩのＳＳＣ溶液に溶解し
、リボヌクレアーゼ０．５■を加え３７℃に３０分間放
置した。再度フェノール処理を３回おこない、エーテル
洗浄後、エタノール沈殿でＤＮＡを回収し、乾燥後ＳＳ
Ｃ溶液に溶解した。その結果、３．５Ｔ＃ｇの染色体Ｄ
ＮＡを得た。

染色体ＤＮＡは制限酵素カ旦３ＡＩを用い、得られるＤ
ＮＡ断片の鎖長が４〜１０Ｋｂの範囲となるような条件
下で部分分解した。

ベクターＤＮＡはプラスミドｐＵＣ１９を用いた。ｐＵ
ｃ１９は制限酵素ｂ１旧切断し、アルカリホスファター
ゼで処理した。

部分分解したシュードモナスＫＷＩ−５６株染色体ＤＮ
Ａとｌ１ＪｕＬＨ工消化したプラスミド１）ＵＣｌ３を
２＝１の割合で混合したのち、宝酒造製ＤＮＡライゲー
ションキットを用いて１６℃、３０分間の反応によって
連結させた。

大腸菌ｎｅｉｏｔ株はＨａｎａｈａｎの方法（Ｈａｎ−
ａｈａｎ、０．、Ｇｅｎｅ、１ｉ、６３（１９８０））
に基づき、カルシウム処理をほどこすことによって形質
転換細胞として調製し、上記組み換えプラスミドを形質
転換した。

■１パー　　　　　　　　　　−脣 駁 上記、形質転換体を、５０μｇ／−アンピシリン、１％
トリブチリンを含むＬＢ培地にブレーティングした。３
７℃で４８時閏培養したのち、約１６，４００個の形質
転換体より１４個のコロニー周辺にクリアゾーンを形成
する株を得た。

１４個のクリアゾーン形成株は５０μｇ／ｗｌのアンピ
シリンを含む５ｉ／ＬＢ液体培地で３７℃、２４時時間
上う培養した。培養液は菌体を破砕する目的で超音波処
理し、そのリパーゼ活性を測定した。測定には回転攪拌
法を用いた。すなわち、反応容器に５ｒＩ１１／２０Ｍ
リン酸緩衝液（ｐＨ７，０）、１ｗｌ１オリーブ油、１
１１Ｉｌ酵素液を加え、３７℃、６０分間、スターラー
回転５００ｒｐｍで反応をおこなった。

エタノール２０−を加えて反応を停止したのち、生成し
た遊離脂肪酸を１／２ＯＮのＫＯＨで滴定した。酵素活
性は１分間に１マイクロモルの脂肪酸を遊離せしめる酵
素量を１ユニツト（ＩＵ）とした。

その結果、１４個のクリアゾーン形成株の中から、０．
０２５　Ｕ／ｉｓ／のリパーゼ活性を示す一株を単離し
た０本形質転換体は５Ａ−３株と命名した。

次に５Ａ−３株を５０μｇ／−のアンピシリンを含む５
ＷＩＬＢ液体培地で３７℃、２４時時間上う培養し、ア
ルカリ−９ＤＳ法によリブラスミドを抽出した０本プラ
スミドは１１．５にｂの外来ＤＮＡ断片を保持していた
。

本プラスミドはｐＬＰ６と命名した。

■旦ニー五旦１すＷ折− プラスミドｐＬＰ６を各種制限酵素を用いて断片化し、
サブクローニングした６組み換えプラスミドを保持する
大腸１ｉｕｓｔｏｔ株のトリブチリン−ＬＢ平板上での
クリアゾーン形成を指標として、リパーゼ遺伝子がコー
ドされる最小ＤＮＡ断片を明らかにした。

その結果２．ＩＫｂの凪■−ハｆｉｌｌ　Ｉ断片をリパ
ーゼ遺伝子がコードされる最小ＤＮＡ断片とし、本断片
をＢａｍＨｌで消化したプラスミドｐｕｃ１９に結合し
た。得られたプラスミドをｐＬＰ６５と命名した。　ｐ
ＬＰ６５の制限酵素切断地図を第１図に示す。

■暑　バー 塩基配列の決定に先立ちＭｅｓｓ　ｉ　ｎｇらの方法（
Ｊ、Ｍｅｓｓｉｎｇ、Ｇｅｎｅ　ｌｊｌ、２６９（１９
８２））に従って、２．　ｌｋｂのＩＩＩｍＩＩ　−１
ｕ−ＨＩ断片をファージＭ１３ｍｐ１８、もしくはｍｐ
１９にサブクローニングし、宝酒造■製キロベース・デ
レージョン・キットを用い種々デレージョン・ファージ
を作製した。これらを鋳型としジデオキシ法により　２
．ＩＫｂのむ土ＩＩ　−ＢＬＬＨＩ断片の全塩基配列を
決定した。その結果、第２図に示すオープンリーディン
グフレームの存在を認めた。また、第３図には第２図の
塩基配列より決定されるアミノ酸配列を示す。

シュードモナスＫＷＩ−５６菌株の培養液上清より精製
して得られた耐熱性リパーゼ１１１ｇを用い、液相エド
マン分解法によりＮ末端アミノ酸よりアミノ酸配列を順
次決定した。その結果、リパーゼのＮ末端からのアミノ
酸配列は、アラニン−アスパラギン酸−グリシンである
ことがわかった。この配列は第３図の４５番目から４７
番目に存在した。

次に、耐熱性リパーゼ２１１ｇを約３６μｇのカルボキ
シペブチターゼＡで処理し、経時的に遊離したアミノ酸
を測定した結果、著しいバリンの遊離がみられた。この
結果より、耐熱性リパーゼＣ末端のアミノ酸はバリンと
決定された。また第３図に示すように、塩基配列から決
定されたアミノ酸配列Ｃ末端もバリンであった。

さらに、耐熱性リパーゼ蛋白のアミノ酸組成と塩基配列
から決定されたアミノ酸組成との比較をおこなった。耐
熱性リパーゼ５０μｇを６Ｎ塩酸中、１１０℃、２４時
間処理し、加水分解されたアミノ酸を測定した。

システィン残基は耐熱性リパーゼを過ギ酸酸化したのち
、上記の要領で測定した。トリプトファン残基は０．１
％耐熱性リパーゼ水溶液の２９４．４１と２８０．Ｏｎ
ｍの吸光度からチロシン残基との比較をおこない算出し
た。

また、塩基配列より決定されたリパーゼのアミノ酸組成
は、第３図４５番目から３６４番目までのアミノ酸組成
として算出した。その結果、第１表に示されるように、
耐熱性リパーゼのアミノ酸組成と塩基配列より決定され
たアミノ酸組成は大略一致した。

以上の結果より、クローニングされたリパーゼ遺伝子は
、シュードモナスＫＷＩ−５６菌株由来の耐熱性リパー
ゼをコードする遺伝子であることがわかった。

また、耐熱性リパーゼのＮ末端アミノ酸は第３図４５番
目のアラニンであることから、リパーゼは翻訳後第３図
４４番目のプロリンと４５番目のアラニンの間で切断を
うけ完成される。

■　　　　　　　　　１バー ５００ｗＩ！坂ロフラスコに５０℃ｇ／−アンピシリン
を添加したＬＢ培地５０１ｍ１を分注し、プラスミドｐ
ＬＰ６５を保持した大腸菌ＨＢ１０ｉ株前培養を１％の
植苗量で接種し、３７℃、２４時間の振どう培養をおこ
なフた。菌体を集菌し洗浄したのち、５０−の２０ｎＭ
　）リス塩酸緩衝液（ｐＨ７，５）に懸濁した。懸濁液
は超音波処理によって菌体を破砕し、残存菌体を取り除
くため遠心分離をおこなった。

遠心上清のリパーゼ活性を前記の回転攪拌法によって測
定したところ、２．ＯＵ／−のリパーゼ活性を得た。ま
た、この遠心上清を６０℃、１時閉熱処理し残存リパー
ゼ活性測定したが、失活はみとめられなかった。

（発明の効果） 本発明の耐熱性リパーゼ遺伝子の発明によって大腸菌、
枯草菌、酵母等の微生物を用いての耐熱性リパーゼ生産
が可能となる。さらに、遺伝子に位置特異的変異導入法
等を採用し、耐アルカリ性、界面活性剤耐性等の新たな
能力を持ったリパーゼを生産させるための材料にもなる
。

【図面の簡単な説明】

第１図はプラスミドｐＬＰ６５の制限酵素切断地図を示
す。図中細線はプラスミドρＵＣＩ９由来の遺伝子を、
太線はシュードモナスＫＷＩ−５６菌株染色体ＤＮＡ由
来の遺伝子を示す。第２図は耐熱性リパーゼをコードす
る遺伝子のオーブンリーディングフレーム塩基配列を示
す。第３図は第２図のオーブンリーディングフレームよ
り決定されるアミノ酸配列を示す。

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. （１）下記の塩基配列を有することを特徴とする耐熱性
   リパーゼをコードする遺伝子。 【遺伝子配列があります】
2. （２）請求項（１）記載の遺伝子を有するベクター。
3. （３）請求項（２）記載のベクターを保持した宿主を培
   養し、その培養液から耐熱性リパーゼを分離することを
   特徴とする耐熱性リパーゼの生産方法。