DE69331658T2

DE69331658T2 - Ein für eine hyperthermostabile beta-Galaktosidase kodierendes Gen

Info

Publication number: DE69331658T2
Application number: DE1993631658
Authority: DE
Inventors: Kiyozo Asada; Kimikazu Hashino; Ikunoshin Kato; Nobuto Koyama; Miki Odate; Atsushi Shimada
Original assignee: Takara Shuzo Co Ltd
Current assignee: Takara Bio Inc
Priority date: 1993-01-08
Filing date: 1993-12-24
Publication date: 2002-10-31
Anticipated expiration: 2013-12-25
Also published as: JP3086115B2; DE69331658D1; EP0606008A2; EP0606008B1; JPH06253855A; EP0606008A3

Description

Diese Erfindung betrifft ein Gen, das für eine hyperthermostabile β-Galactosidase kodiert und eine genetische Verfahrenstechnik zur Herstellung des Enzyms, das beispielsweise in den Bereichen der Lebensmittelindustrie und in der Saccharidtechnik nutzvoll ist.
β-Galactosidase, die ein Enzym ist, das β-Galactosid abbauen kann, wurde in Tieren, Pflanzen und Mikroorganismen gefunden. Es ist bekannt, dass dieses Enzym insbesondere in Bakterien wie Escherichia coli, Streptococcus lactis, Bacillus subtillis, Streptococcus thermophilus und Sulfolobus solfataricus auftritt. Diese β-Galactosidase wird bei der Produktion von lactosearmer Milch eingesetzt, wobei ihre Fähigkeit zum Hydrolysieren von Lactose in Galactose und Glucose genutzt wird. Sie wird auch bei der Produktion von Galactose oder Glucose aus Lactose eingesetzt, die in Milchserum enthalten ist, das in grosser Menge beim Prozess der Käseherstellung gebildet wird.
Zur Anwendung von β-Galactosidase in der Lebensmittelverarbeitung wurde daher die Entwicklung eines Enzyms gefordert, das der Anwendung bei einer hohen Temperatur widerstehen kann, vom einen Gesichtspunkt, eine Kontaminierung mit Mikroorganismen während der Verarbeitung zu verhindern, und vom anderen Gesichtspunkt, die Löslichkeit von Lactose zu erhöhen, die als Substrat dient. Beispielsweise ist eine β-Galactosidase, die in Sulfolobus solfataricus vorkommt (siehe European Journal of Biochemistry, 187, 321-328 (1990)) ein thermophiles Enzym mit Aktivität bei einer Temperatur von 90ºC. Ihre Aktivität fällt jedoch um ungefähr 50% nach 180 Minuten Behandlung bei 85ºC.
Wie oben erwähnt ist ein thermophiles und thermostabiles Enzym bei der Lebensmittelverarbeitung bei hoher Temperatur erforderlich.
Um das oben genannte Problem zu lösen, zielt die vorliegende Erfindung darauf ab, ein Gen zu isolieren, das für β-Galactosidase kodiert, die eine verbesserte Thermophilie und eine ausgezeichnete Thermostabilität aufweist, und ein Verfahren zur Herstellung einer hyperthermostabilen β-Galactosidase unter Verwendung des Gens zur Verfügung zu stellen.
Der erste Aspekt der vorliegenden Erfindung stellt eine isolierte DNA zur Verfügung mit:
(a) der DNA-Sequenz von SEQ ID Nr. 2 oder ein Fragment davon,
(b) einer DNA-Sequenz, die für die Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 1 oder ein Fragment davon kodiert,
(c) einer DNA-Sequenz, die für die Aminosäuresequenz kodiert, die aus der Deletion, Addition, Insertion oder Substitution einer oder mehrerer Aminosäuren in der Aminosäuresequenz von SEQ ID No. 1 resultiert, oder
(d) einer DNA-Sequenz, die in der Lage ist, eine von (a) bis (c) unter stringenten Bedingungen zu hybridisieren,
worin die DNA-Sequenz oder das Fragment davon für ein Polypeptid kodiert, das hyperthermostabile β-Galactosidaseaktivität von ungefähr 100% besitzt, nachdem es 120 Minuten bei 90ºC behandelt wurde.
Die vorliegende Erfindung stellt ferner ein Verfahren zur Herstellung einer hyperthermostabilen β-Galactosidase zur Verfügung, die die Aktivität von ungefähr 100% aufweist, nachdem sie 120 Minuten lang bei 90ºC behandelt wurde, das umfasst:
(a) Konstruieren eines Plasmids, in dem eine isolierte DNA, die für eine hyperthermophile β-Galactosidase kodiert, durch Insertion eingefügt ist, gemäß einem ersten Aspekt der Erfindung,
(b) Transformieren eines geeigneten Mikroorganismus mit dem Plasmid, und
(c) Kultivieren des transformierten Mikroorganismus und Gewinnen der hyperthermostabilen β-Galactosidase aus der Kultur.
Das Gen für hyperthermostabile p-Galactosidase, das eine isolierte DNA enthält, die für eine hyperthermophile β-Galactosidase kodiert, kann in dieser Erfindung gescreent und durch Expressionsklonen unter Verwendung von Cosmidvektoren erhalten werden. Expressionsklonen ist ein Verfahren, das zum Klonen des Gens verwendet werden kann, das für einige Enzyme kodiert, ohne Information über die primäre Struktur des Zielenzyms. Beispielsweise wird ein Pullulanasegen von Pyrococcus furiosus (WO 92/02614) unter Verwendung des Expressionsklonverfahrens geklont. Das Verfahren kann jedoch nicht zum Klonen jeder Art von Enzym verwendet werden, weil falls der Plasmidvektor für dieses Verfahren verwendet wird, ein sehr geeignetes Restriktionsenzym benötigt wird; es muss das Zielgen in so kleine Stücke spalten, dass es in einen Plasmidvektor eingesetzt werden kann und das Zielgen nicht innen spalten. Ausserdem ist das Verfahren kompliziert, weil es eine Reihe von Klonen benötigt.
Anschliessend haben die Erfinder der vorliegenden Erfindung versucht, das β-Galactosidasegen durch Screening der β-Galactosidaseaktivitäten in einer Cosmidbibliothek, die mit genomischer DNA von Pyrococcus furiosus aufgebaut ist, und der Cosmidvektoren, in denen grössere DNA-Fragmente (35-50 kbp) eingesetzt werden können als in Plasmidvektoren, zu isolieren. Unter Verwendung von Cosmidvektoren können die Gefahren der Spaltung des Zielgens, das für das Enzym kodiert, durch ein Restriktionsenzym im Inneren verringert und die Anzahl der notwendigen Klone zum Prüfen kann reduziert werden. Im Gegenteil, es besteht die Gefahr, die Enzymaktivität nicht zu erkennen, wegen geringer Expression des Enzyms, weil die Cosmidvektoren weniger Kopien im Wirtsorganismus aufweisen als die Plasmidvektoren.
Die Erfinder der vorliegenden Erfindung fanden äusserst hohe Thermostabilität des Zielenzyms und kombinierten einen Prozess zum Kultivieren der Transformanten in der Cosmidbibliothek einzeln mit einem Prozess zum Herstellen der Lysate, die nur die thermostabilen Proteine enthalten. Die Gruppe dieser Lysate wird als "Cosmidproteinbibliothek" bezeichnet. Unter Verwendung der Bibliothek zum Nachweisen der Enzymaktivität erhöht sich die Nachweisempfindlichkeit im Vergleich zur Verwendung von Kolonien der Transformanten und schlechte Einflüsse wie Hintergrund durch Proteine von Wirten oder Inhibierung der Enzymaktivität können vermieden werden. Die Erfinder der vorliegenden Erfindung isolierten mehrere Cosmidklone, die β-Galactosidaseaktivität zeigen, durch Screening der Cosmidproteinbibliothek, die mit genomischer DNA von Pyrococcus furiosus aufgebaut wurde. Ausserdem isolierten die Erfinder der vorliegenden Erfindung das Gen, das für eine hyperthermostabile β-Galactosidase kodiert aus den DNA-Fragmenten, die in die Klone eingesetzt sind, die oben durch vollständige Nutzung verschiedener gentechnischer Techniken isoliert wurden, und bestimmten die DNA-Sequenz des Gens. Auch erreichten die Erfinder der vorliegenden Erfindung die Expression der hyperthermostabilen β-Galactosidase unter Verwendung des Gens, um auf diese Weise die vorliegende Erfindung zu vollenden.
Übrigens kann das Expressionsklonverfahren unter Verwendung von Cosmidvektoren, das hier beschrieben wird, nicht immer auf jedes thermostabile Enzym angewendet werden. Das Ergebnis wird durch die Eigenschaft des Zielgens bestimmt. Beispielsweise versuchten die Erfinder der vorliegenden Erfindung, das Gen zu isolieren, das für eine Protease von Pyrococcus furiosus kodiert (Appl. Env. Microbiol. 56, 1992- 1998 (1990)), aber sie erreichten die Isolation des Gens nicht.
Nun wird die vorliegende Erfindung ausführlicher beschrieben.
Es gibt keine besondere Einschränkung bezüglich des in der vorliegenden Erfindung zu verwendenden Mikroorganismus, so lange er ein Gen für hyperthermostabile β-Galactosidase produzieren kann. Beispielsweise sind Stämme der Gattung Pyrococcus, d. h. hyperthermostabile Bakterien wie Pyrococcus furiosus DMS 3638 und Pyrococcus woesei DMS 3773 dafür verwendbar. Diese Stämme sind beide von der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH erhältlich.
Beispielsweise kann eine Cosmidbibliothek des Gens von Pyrococcus furiosus auf folgende Weise hergestellt werden. Zunächst wird das Genomgen von Pyrococcus furiosus 3638 unter Verwendung eines geeigneten Restriktionsenzyms, beispielsweise Sau 3A1 (hergest. von Takara Shuzo Co., Ltd.) teilweise verdaut. Nach Fraktionierung entsprechend der Grösse von 35 bis 50 kbp, wird jedes so erhaltene DNA-Fragment einer Ligation mit einem geeigneten Cosmidvektor unterzogen, beispielsweise dem Triple Helix Cosmid Vector (hergest. von Stratagene). Die Genom-DNA-Fragmente von Pyrococcus furiosus werden zunächst nach dem in vitro Verpackungsverfahren in λ-Phagenpartikel verpackt und dann wird ein geeigneter Stamm von Escherichia coli, beispielsweise E. coli DH5αMCR (hergest. von BRL) mit der erhaltenen Phagenlösung transformiert, um dadurch die angestrebte Cosmidbibliothek zu ergeben. Dann werden Cosmid-DNAs aus verschiedenen Kolonien der Transformante hergestellt und die Insertion der Genom-DNA-Fragmente von 35 bis 50 kbp in die Transformante auf diese Weise bestätigt. Im allgemeinen können 300 bis 700 Kolonien inkubiert werden.
Nach Beendigung der Inkubation jeder Kolonie werden die inkubierten Zellen aufgenommen. Die Zellen werden zu Cosmidproteinbibliotheken verarbeitet, indem sie 10 Minuten bei 100ºC behandelt, einer Schallbehandlung unterzogen und nochmal 10 Minuten bei 100ºC behandelt werden. Dann wird die β-Galactosidaseaktivität in den erhaltenen Lysaten bestimmt, wodurch Kolonien gescreent werden können, die eine hyperthermostabile β-Galactosidase exprimieren, die nach der oben beschriebenen Behandlung stabil bleibt. Die β-Galactosidaseaktivität wird beispielsweise unter Verwendung von o-Nitrophenyl-β-D-galactopyranosid oder Lactose als Substrat bei einer Reaktionstemperatur von beispielsweise 95ºC bestimmt. Danach wird das in die Cosmid-DNA der Transformante, die die Aktivität zeigt, durch Insertion eingefügte Fragment analysiert.
Durch Insertion eingefügte Fragmente in den Cosmid-DNAs von sieben aktiven Transformanten, unter 500 durch die Erfinder der vorliegenden Erfindung präparierten Transformanten, enthalten gemeinsam ein EcoRI-Fragment von ungefähr 2,2 kbp. Daher wird dieses gemeinsame DNA-Fragment hergestellt, um seine Eigenschaften zu untersuchen. Zum Beispiel wird eine Cosmid-DNA, die die Aktivität exprimiert, mit einem Restriktionsenzym EcoRI (hergest. von Takara Shuzo Co., Ltd.) vollständig verdaut und auf einem Gel einer Elektrophorese unterzogen, um dadurch das EcoRI-DNA-Zielfragment von ungefähr 2,2 kbp zu reinigen. Dann wird das erhaltene Fragment an der EcoRI-Stelle eines geeigneten Vektors durch Insertion eingefügt, beispielsweise pUC19 (hergest. von Takara Shuzo Co., Ltd.). Auf diese Weise kann ein Plasmid hergestellt werden, das das gemeinsame DNA-Fragment enthält, das von den Erfindern der vorliegenden Erfindung mit pTGE-101 benannt wurde. Mit diesem Plasmid pTGE-101 wird ein geeigneter Stamm von Escherichia coli wie E. coli JM109 transformiert. Auf diese Weise kann eine Transformante erhalten werden, die von den Erfindern der vorliegenden Erfindung mit Escherichia coli JM109/pTGE-101 benannt wurde. Nach Inkubieren dieser Transformante von E. coli werden die Zellen aufgenommen und die β-Galactosidaseaktivität des in den Zellen exprimierten Proteins bestimmt. Die Aktivität kann auf folgende Weise bestimmt werden. Die Zellen und zerstörten Zellen, die entweder zweimal 10 Minuten lang bei 100ºC thermisch behandelt wurden oder unbehandelt sind, werden verwendet und das oben genannte o-Nitrophenyl-β-D- galactopyranosid wird als Substrat verwendet, um eine Reaktion bei 70 ºC oder 95ºC durchzuführen, wodurch die Thermostabilität des exprimierten Proteins untersucht werden kann. Wie Tabelle 1 zeigt wurde ein Gen, das für eine thermostabile β-Galactosidase kodiert, die bei zweimal 10 Minuten Behandlung bei 100ºC inaktiviert wurde, aber seine Aktivität bei einer Reaktionstemperatur von 70ºC zeigt, in pTGE-101 durch Insertion eingefügt. Tabelle 1
In der obigen Tabelle bedeutet das Symbol + das Vorhandensein von β- Galactosidaseaktivität, während das Symbol - das Fehlen dieser Aktivität bedeutet.
Fig. 1 zeigt eine Restriktionsenzymkarte des Plasmids pTGE-101, worin ein dicke durchgezogene Linie das EcoRI-DNA-Fragment von ungefähr 2,2 kbp darstellt, das durch Insertion in das Plasmid pUC19 eingefügt ist. Dieses Fragment kodiert für die thermostabile β-Galactosidase. Dieses Fragment kodiert ferner für einen Teil der Zielverbindung der hyperthermostabilen β-Galactosidase.
Das oben genannte EcoRI-DNA-Fragment von ungefähr 2,2 kbp wird markiert. Unter Verwendung des so erhaltenen markierten DNA-Fragments als Probe werden DNA-Fragmente, die durch vollständiges Verdauen von Cosmiden mit einem Gen für hyperthermostabile β-Galactosidase mit einem Restriktionsenzym Hind III (hergest. von Takara Shuzo Co., Ltd.) und Auftrennen durch Agarosegelelektrophorese erhalten wurden, der Southern-Hybridisierung unterzogen. Auf diese Weise kann ein mit der Probe hybridisiertes Hind-III-DNA-Fragment (ungefähr 3,5 kbp) identifiziert werden. Dann wird dieses Fragment vom Agarosegel extrahiert und in die Hind-III-Stelle eines geeigneten Vektors, beispielsweise pUC19, durch Insertion eingefügt. Auf diese Weise kann ein Plasmid hergestellt werden, das von den Erfindern der vorliegenden Erfindung mit pTGH-301 benannt wurde. Durch Transformieren von E. coli JM109 mit diesem Plasmid kann eine Transformante erhalten werden, die von den Erfindern der vorliegenden Erfindung mit Escherichia coli JM 109/pTGH-301 benannt wurde. Diese Transformante wird inkubiert und nach Beendigung der Inkubation werden die Zellen aufgenommen. Die in diesen Zellen exprimierte β-Galactosidase bleibt nach zweimal 10 Minuten Behandlung bei 100ºC stabil. Auf diese Weise wurde die Zielverbindung der hyperthermostabilen β-Galactosidase darin exprimiert.
Fig. 2 zeigt eine Restriktionsenzymkarte des Plasmids pTGH-301, worin ein dicke durchgezogene Linie das Hind-III-DNA-Fragment von ungefähr 3,5 kbp darstellt, das in das Plasmid pUC19 durch Insertion eingefügt ist. Dieses Fragment enthält ein Gen für hyperthermostabile β-Galactosidase. Dieses Fragment enthält auch das EcoRI-DNA-Fragment von ungefähr 2,2 kbp, wie es in Fig. 1 gezeigt ist.
Ein Teil der DNA-Sequenz, die für die hyperthermostabile β-Galactosidase kodiert, die im Plasmid pTGH-301 enthalten ist, ist in SEQ ID Nr. 2 des Sequenzprotokolls gezeigt. SEQ ID Nr. 1 des Sequenzprotokolls zeigt die Aminosäuresequenz, die von der in SEQ ID Nr. 1 gezeigten DNA-Sequenz angenommen wird. Insbesondere ist die SEC ID Nr. 1 des Sequenzprotokolls die Aminosäuresequenz der hyperthermostabilen β-Galactosidase, die mit der Verwendung einer isolierten DNA erzeugt wurde, die für eine hyperthermostabile β-Galactosidase der vorliegenden Erfindung kodiert. Die isolierte DNA, die für eine hyperthermostabile β-Galactosidase der vorliegenden Erfindung kodiert, wird auch als eine isolierte DNA bereitgestellt, die eine DNA-Sequenz aufweist, die für die Aminosäuresequenz kodiert, wie sie in SEQ ID Nr. 1 des Sequenzprotokolls gezeigt ist, die aus jeglichen Kombinationen der genetischen Kodes besteht, die aus degenerierten Kodons ausgewählt wurden.
Die in SEQ ID Nr. 2 des Sequenzprotokolls gezeigte DNA-Sequenz ist nämlich ein Beispiel des in der vorliegenden Erfindung gegebenen Gens für hyperthermostabile β-Galactosidase.
Ausserdem stimmt die N-terminale Aminosäuresequenz der gereinigten Probe der hyperthermostabilen β-Galactosidase, die durch Escherichia coli JM109/pTGH-301 erzeugt wird, mit der N-terminalen Aminosäuresequenz der in SEQ ID Nr. 1 des Sequenzprotokolls gezeigten Aminosäuresequenz überein.
Aus diesem Plasmid pTGH-301 kann ein Hind-III-EcoRI-DNA-Fragment (ungefähr 1,0 kbp) ohne das Gen für hyperthermostabile β-Galactosidase auf folgende Weise eliminiert werden.
Von 3 Typen von DNA-Fragmenten, die durch Verdauen des Plasmids pTGH-301 mit EcoRI erhalten wurden, wird nämlich nur das eine mit ungefähr 1,0 kbp eliminiert und es wird eine Ligation vorgenommen, gefolgt von einer Transduktion in E. coli JM109. Dann werden die hyperthermostabile β-Galactosidaseaktivitäten der erhaltenen Kolonien bestimmt und von einer Kolonie, die eine Aktivität zeigt, wird ein Plasmid hergestellt.
Dieses Plasmid wird pTGEH-401 genannt, während durch dieses Plasmid transformierte E. coli JM109 Escherichia coli JM109/pTGEH-401 genannt werden und beim National Institute of Bioscience and Human- Technology Agency of Industrial Science and Technology, Japan unter der Zugangsnummer FERM BP-4469 hinterlegt sind.
Fig. 3 zeigt eine Restriktionsenzymkarte des Plasmids pTGEH-401, worin eine dicke, durchgezogene Linie das DNA-Fragment darstellt, das durch Insertion in das Plasmid pUC19 eingefügt ist.
Fig. 4 zeigt eine Restriktionsenzymkarte eines DNA-Fragments, das von Pyrococcus furiosus stammt, das in das Plasmid pTGEH-401 durch Insertion eingefügt wurde. Insbesondere zeigt Fig. 4 die Restriktionsenzymkarte eines Beispiels des Gens für hyperthermostabile β-Galactosidase, das gemäß der vorliegenden Erfindung erhalten wurde.
Wenn eine durch Transduktion eines rekombinanten Plasmids, das ein Gen für hyperthermostabile β-Galactosidase enthält wie Escherichia coli JM109/pTGH-301 oder Escherichia coli JM109/pTGEH-401, konstruierte Transformante inkubiert wird, wird die hyperthermostabile β-Galactosidase in der Kultur angereichert. Die hyperthermostabile β-Galactosidase kann beispielsweise durch Ernten der Zellen, Zerstören der Zellen durch Ultraschallbehandlung und Behandlung des durch Zentrifugieren erhaltenen Überstandes durch eine Kombination von Reinigungsverfahren wie Gelfiltrationschromatographie, Ionenaustauschchromatographie und hydrophober Chromatographie aus dieser Kultur gereinigt werden.
Wenn die hyperthermostabile β-Galactosidase in der vorliegenden Erfindung gereinigt werden soll, ist es insbesondere vorteilhaft, die Zellen entweder vor oder nach der Ultraschallbehandlung thermisch zu behandeln, da die verunreinigenden Proteine dadurch denaturiert werden und auf diese Weise die Reinigung leicht ausgeführt werden kann.
Die durch Expression eines Gens der vorliegenden Erfindung erhaltene hyperthermostabile β-Galactosidase, beispielsweise durch ein Gen, das im Plasmid pTGH-301 integriert ist, weist die folgenden physikalisch- chemischen Eigenschaften auf.

(1) Wirkung und Substratspezifität:

Sie weist eine Wirkung zum Hydrolysieren von Lactose in Galactose und Glucose auf. Ferner weist sie eine Wirkung zum Hydrolysieren von o- Nitrophenyl-β-D-galactopyranosid in o-Nitrophenol und Galactose auf.

(2) Verfahren zum Bestimmen der enzymatischen Aktivität

(2)-a

Bei der Bestimmung der enzymatischen Aktivität kann die o-Nitrophenylβ-D-galactopyranosid-Hydrolyseaktivität eines Enzyms durch spektroskopisches Verfolgen des bei der Hydrolyse gebildeten o-Nitrophenols bestimmt werden. Es werden 5 ul der Enzymlösung der vorliegenden Erfindung zu 199 ul einer 100 mM Phosphatpufferlösung (pH 7,3) hinzugefügt, die 112 mM 2-Mercaptoethanol und 1 mM Magnesiumchlorid enthält. Dann wird 1 ul einer Dimethylsulfoxidlösung, die 0,4 M o- Nitrophenyl-β-D-galactopyranosid enthält, hinzugegeben. Nach Durchführen einer Umsetzung bei 95ºC über 30 Minuten wird die Reaktion durch Zugabe von 100 ul 0,1 M Natriumcarbonat unterbrochen und die Absorption der Reaktionsmischung bei 410 nm gemessen, um dadurch die Menge des auf diese Weise gebildeten o-Nitrophenol zu bestimmen.
Eine Einheit der gemäß der vorliegenden Erfindung erhaltenen hyperthermostabilen β-Galactosidase ist in einer Menge des Enzyms ausgedrückt, durch die die Absorption bei 410 nm bei 95ºC in 1 Minute um 1,0 erhöht werden kann. Das in der vorliegenden Erfindung erhaltene Enzym weist eine Aktivität zum Zersetzen von o-Nitrophenyl-β-D-galactopyranosid bei pH 7,3 bei 95ºC auf, wie es oben gemessen wurde.

(2)-b

Die Hydrolyseaktivität für o-Nitrophenyl-β-D-galactopyranosid der β- Galactosidase kann auch durch das wie folgt gezeigte Verfahren bestimmt werden; Die Enzymreaktion wird gestartet durch Zugabe von 15 ul einer Dimethylsulfoxidlösung, die 1 M o-Nitrophenyl-β-D-galactopyranosid enthält, zu 1485 ul Mchlvaine-Pufferlösung, die das Enzym enthält, die sich in einer Quarzküvette für Spektrometer befinden, so dass sich eine Endkonzentration an o-Nitrophenyl-β-D-galactopyranosid von 10 mM ergibt. Die Reaktion wurde durch Messen der Veränderung des Absorptionsvermögens bei 410 nm in Zeitabhängigkeit am Spektrophotometer verfolgt. Ausgehend von der Veränderung des Absorptionsvermögens bei 410 nm pro Minute, wurde das pro Minute gebildete o-Nitrophenol berechnet, wobei der zuvor bestimmte Absorptionskoeffizient verwendet wurde. Eine Einheit der Enzymaktivität ist definiert als die erforderliche Menge, um die Bildung von 1 umol o-Nitrophenol pro Minute zu katalysieren. Die Proteinbestimmung des Enzymproteins wurde nach dem Verfahren von Lowly durchgeführt.

2-c

Ferner kann die Enzymaktivität des in der vorliegenden Erfindung erhaltenen Enzyms auch durch Messen der Aktivität zum Abbau von Lactose bestimmt werden. Die Aktivität zum Abbau von Lactose wird durch Bestimmen der Menge an durch den Abbau des Substrats gebildeter Glucose gemessen, wie es nachfolgend beschrieben wird. 5 ul der Enzymlösung werden zu 70 ul einer 100 mM Natriumglycinpufferlösung (pH 7,5) zugegeben, die 4 mM Magnesiumsulfat enthält. Danach werden 25 ul einer 2%igen Lactoselösung hinzugegeben und die Mischung bei 95ºC 30 Minuten lang umgesetzt. Nach Unterbrechung der Reaktion durch Abkühlen mit Eis, wird die Menge an freigesetzter Glucose unter Verwendung eines Glucosemesskits Glucose B-Test Wako (hergest. von Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) bestimmt. Das in der vorliegenden Erfindung erhaltene Enzym weist eine Aktivität zum Abbau von Lactose bei pH 7,5 bei 95ºC auf.

(3) Thermostabilität:

Unter Verwendung von 32 mU des in der vorliegenden Erfindung erhaltenen Enzyms wird die Thermostabilität des Enzyms gemessen. Die Messung wird durch Bestimmen der Hydrolyseaktivität des Enzyms für o-Nitrophenyl-β-D-galactopyranosid gemäß dem oben unter (2)-a beschriebenen Verfahren vorgenommen, mit der Ausnahme, dass die Phosphatpufferlösung durch Mchlvaine-Pufferlösung (pH 6, 6) ersetzt wird, die 112 mM 2-Mercaptoethanol und 1 mM MgCl&sub2; enthält. Nach Behandeln des Enzyms in 204 ul der oben genannten Pufferlösung bei 90 ºC über verschiedene Zeiträume wird 1 ul einer Dimethylsulfoxidlösung, die 0,4 M o-Nitrophenyl-β-D-galactopyranosid enthält, zugegeben, gefolgt von einer 30 minütigen Umsetzung bei 95ºC. Dann wird die Reaktion durch Zugabe von 100 ul 0,1 M Natriumcarbonat unterbrochen und die Absorption bei 410 nm wird gemessen, um dadurch die Menge an auf diese Weise gebildetem o-Nitrophenol zu bestimmen.
Das in der vorliegenden Erfindung erhaltene Enzym zeigt eine Hyperthermostabilität und erleidet keine Verringerung der Enzymaktivität selbst nach 120 Minuten Behandlung bei 90ºC.
Die Thermostabilität von β-Galactosidase wurde gemäß dem in (2)-b beschriebenen Verfahren bestimmt. 1 ml Mchlvaine-Pufferlösung, die das Enzym enthält (pH 5,0) wurde bei 90ºC inkubiert und es wurden zu bestimmten Zeiten Probenmengen abgezogen. Die Enzymreaktion wurde gestartet durch Zugabe von 10 ul der Probenmenge zu 1490 ml Mchlvaine-Pufferlösung (pH 5,0), die 10 mM o-Nitrophenyl-β-D-galactopyranosid enthält, das bei 90ºC in der Küvette inkubiert worden war.
Die Umsetzung wurde durch Messen des Absorptionsvermögens bei 410 nm in Zeitabhängigkeit im Spektrophotometer verfolgt. Ausgehend von der Veränderung des Absorptionsvermögens bei 410 nm pro Minuten, wurde das pro Minute gebildete o-Nitrophenol berechnet, wobei der zuvor bestimmte Absorptionskoeffizient verwendet wurde. Eine Einheit der Enzymaktivität ist definiert als die erforderliche Menge, um die Bildung von 1 umol o-Nitrophenol pro Minute zu katalysieren.
Wie Fig. 5 zeigt blieben ungefähr 100% der Aktivität der β-Galactosidase im Verhältnis (%) erhalten, selbst nach 150 min Behandlung bei 90ºC. Fig. 5 ist ein Schaubild, das die Thermostabilität der β-Galactosidase zeigt, worin die Ordinate das Restaktivitätverhältnis (%) angibt, während die Abszisse die Behandlungszeit (Minuten) bei 90ºC angibt.

(4) Optimaler pH-Wert

Der optimale pH-Wert der β-Galactosidase wurde gemäß dem oben unter (2)-b beschriebenen Verfahren gemessen. 1490 ml Mchlvaine- Pufferlösung, deren pH auf einen bestimmten Wert (pH 4-8) bestimmt wurde und die 10 mM o-Nitrophenyl-β-D-galactopyranosid enthält, wurden bei 90ºC in der Küvette inkubiert und die Enzymreaktion wurde gestartet durch Zugabe von 10 ul Mchlvaine-Pufferlösung (pH 5,0), die das Enzym enthält, in die Küvette. Die Umsetzung wurde durch Messen der Veränderung des Absorptionsvermögens bei 410 nm in Zeitabhängigkeit im Spektrophotometer verfolgt. Die Veränderung des Absorptionsvermögens bei 410 nm pro Minute wurde bestimmt. Ausgehend von der Veränderung des Absorptionsvermögens bei 410 nm pro Minute, wurde das pro Minute gebildete o-Nitrophenol berechnet, wobei der zuvor bestimmte Absorptionskoeffizient bei jeder pH-Bedingung verwendet wurde. Eine Einheit der Enzymaktivität ist definiert als die erforderliche Menge, um die Bildung von 1 umol o-Nitrophenol pro Minute zu katalysieren. Wie in Fig. 6 gezeigt ist, zeigt die β-Galactosidase ihre maximale Aktivität in einem pH-Bereich von 4,5 bis 6,5. Fig. 6 ist ein Schaubild, das den optimalen pH-Wert der β-Galactosidase zeigt, worin die Ordinate die spezifische Aktivität (Einheiten/mg Protein) angibt, während die Abszisse den pH-Wert der Behandlung angibt.

(5) Optimale Temperatur:

Die optimalen Temperaturen der β-Galactosidase wurden gemäß dem in (2)-b beschriebenen Verfahren gemessen. 1485 ul Mchlvaine-Pufferlösung (pH 5,0), die die β-Galactosidase enthalten, wurden bei bestimmter Temperatur (45ºC-90ºC) in der Küvette inkubiert und die Enzymreaktion wurde gestartet durch Zugabe von 15 ul einer Dimethylsulfoxidlösung, die 1 M o-Nitrophenyl-β-D-galactopyranosid enthält, so dass sich eine Endkonzentration an o-Nitrophenyl-β-D-galactopyranosid von 10 mM ergibt. Die Umsetzung wurde durch Messen der Veränderung des Absorptionsvermögens bei 410 nm in Zeitabhängigkeit im Spektrophotometer verfolgt. Die Veränderung des Absorptionsvermögens bei 410 nm pro Minute wurde bestimmt. Ausgehend von der Veränderung des Absorptionsvermögens bei 410 nm pro Minute, wurde das pro Minute gebildete o-Nitrophenol berechnet, wobei der zuvor bestimmte Absorptionskoeffizient bei jeder Temperatur verwendet wurde. Eine Einheit der Enzymaktivität ist definiert als die erforderliche Menge, um die Bildung von 1 umol o-Nitrophenol pro Minute zu katalysieren. Wie in Fig. 7 gezeigt ist, zeigt die β-Galactosidase ihre maximale Aktivität über 90ºC.
Fig. 7 ist ein Schaubild, das die optimale Temperatur der β-Galactosidase zeigt, worin die Ordinate die spezifische Aktivität (Einheiten/mg Protein) angibt, während die Abszisse die Behandlungstemperatur (ºC) angibt.

(6) pH-Stabilität

Die pH-Stabilität von β-Galactosidase wurde gemäß dem in (2)-b beschriebenen Verfahren gemessen. 1485 ul Mchlvaine-Pufferlösung, die 20 Einheiten/ml der β-Galactosidase enthalten, wurden bei bestimmten pH (pH 3-8) 10 Minuten lang bei 90ºC inkubiert. Um die Reaktion zu starten, wurden 10 ul einer Probenmenge der Enzymlösung zu 1490 ul Mchlvaine-Pufferlösung (pH 5,0) zugegeben, die 10 mM o-Nitrophenyl-β- D-galactopyranosid enthält und bei 90ºC vorinkubiert wurde.
Die Umsetzung wurde durch Messen der Veränderung des Absorptionsvermögens bei 410 nm in Zeitabhängigkeit im Spektrophotometer verfolgt. Die Veränderung des Absorptionsvermögens bei 410 nm pro Minute wurde bestimmt. Ausgehend von der Veränderung des Absorptionsvermögens bei 410 nm pro Minute, wurde das pro Minute gebildete o-Nitrophenol berechnet, wobei der zuvor bestimmte Absorptionskoeffizient verwendet wurde. Eine Einheit der Enzymaktivität ist definiert als die erforderliche Menge, um die Bildung von 1 umol o-Nitrophenol pro Minute zu katalysieren. Wie in Fig. 8 gezeigt ist, erhält die β-Galactosidase ihre Aktivität selbst nach 10 Minuten Behandlung in einem pH- Bereich von 4,5 bis 8,0 bei 90ºC. Fig. 8 ist ein Schaubild, das den optimalen pH-Wert der β-Galactosidase zeigt, worin die Ordinate das Restaktivitätsverhältnis (%) angibt, während die Abszisse den pH-Wert der Behandlung angibt.

(7) Substratspezifität

Substratspezifität der β- Galactosidase kann unter Verwendung von p- Nitrophenolderivaten bestimmt werden, wie sie in Tabelle 2 gezeigt sind. Das Verfahren ist wie folgt gezeigt:
1485 ul 150 mM Natriumcitratpufferlösung (pH 5,0), die die β-Galactosidase enthält, werden in eine Quarzküvette für Spektrometer gefüllt. 15 ul 0,1 M Substratösung, gezeigt in Tabelle 2, werden der Enzymlösung zugegeben und vermischt. Unmittelbar wird die Reaktion durch Messen der Veränderung des Absorptionsvermögens bei 410 nm in Zeitabhängigkeit im Spektrophotometer verfolgt. Als Blindversuch werden 1485 ul 150 mM Natriumcitratpuffer (pH 5,0) ohne Enzymgehalt verwendet, und die oben beschriebene Bestimmung durchgeführt. Beim Test wurde die Reaktion bei 90ºC durchgeführt. Eine Einheit der Enzymaktivität wurde definiert als die Menge, die erforderlich ist, um die Bildung von 1 umol p- Nitrophenol pro Minute zu katalysieren.
Gemäß dem oben beschriebenen Verfahren wurde die Hydrolyseaktivität für p-Nitrophenyl-β-D-glucopyranosid (GlcpβNp), p-Nitrophenyl-β-D- galactopyranosid (GalpβNp), p-Nitrophenyl-β-D-mannopyranosid (ManpβNp), p-Nitrophenyl-β-D-xylopyranosid (XylpβNp), p-Nitrophenyl- β-D-fucopyranosid (FucpβNp), p-Nitrophenyl-α-D-galactopyranosid (GalpαNp) bestimmt.
Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 gezeigt. Die Tabelle zeigt die spezifische Aktivität (Einheiten/mg Protein) der β-Galactosidase zu den oben beschriebenen Substraten und ihre relative Aktivität (%). Tabelle 2 Tabelle 2 Spezifische Aktivität von β-Galactosidase
Die Substratspezifität der β-Galactosidase wurde auch unter Verwendung natürlicher Substrate bestimmt wie es in Tabelle 3 gezeigt ist. Das Verfahren ist wie folgt gezeigt: jedes in Tabelle 3 gezeigte Substrat wird in 2 ml 150 mM Natriumcitratpuffer (pH 5,0) gelöst, so dass sich eine Endkonzentration äquivalent zu 17 g/l, für Carboxymethylcellulose, Avicel oder Laminarin und von 50 mM für die anderen Substrate ergibt. Nach Inkubieren dieser Lösungen bei 90ºC werden 5 ul Phosphatpuffer (pH 5,0), der β-Galactosidase enthält, zugegeben und die Umsetzung wurde 5 Minuten lang bei 90ºC durchgeführt. Nach Unterbrechung der Reaktion durch Kühlen mit Eis wurde die Menge der freigesetzten Glucose unter Verwendung eines Glucosemesskits Glucose C-Test Wako (hergest. von Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) bestimmt. Eine Einheit der Enzymaktivität ist definiert als die erforderliche Menge, um die Hydrolyse von 1 umol des Substrats in einer Minute zu katalysieren. Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 gezeigt.

Tabelle 3

Tabelle 3 Substratspezifität von β-Galactosidase

Substrat Relative Aktivität %

Lactose 100
Cellobiose 209,3
β-Methyl-D-glucosid 6,5
Salicin 89,0
Arbutin 4,5
Sucrose 0
Maltose 0
Carboxymethylcellulose 0
Avicel 0
Laminarin 0
Wie oben ausführlich beschrieben wurde, stellt die vorliegende Erfindung ein Gen zur Verfügung, das für eine hyperthermostabile β-Galactosidase kodiert und ein genetisches Verfahren zur Herstellung einer hyperthermostabilen β-Galactosidase unter Verwendung dieses Gens. Dieses Enzym weist eine hohe Thermostabilität auf und ist insbesondere in der Lebensmittelverarbeitung bei hohen Temperaturen und in der Saccharidverfahrenstechnik nutzvoll.
Die vorliegende Erfindung stellt ferner ein EcoRi-Fragment von ungefähr 2,2 kbp zur Verfügung, das für das aktive Zentrum der hyperthermostabilen β-Galactosidase kodiert. Die Inkubation einer Transformante, die ein rekombinantes Plasmid aufweist, das das obige Fragment durch Transduktion darin enthält, ergibt die hyperthermostabile β-Galactosidase. Dieses Enzym ist nicht nur industriell anwendbar, sondern auch bei Untersuchungen der Thermostabilität von Enzymen und so weiter nutzvoll.
Ausserdem ist das gemäß der Erfindung isolierte Gen oder ein Gen, das aus einem Teil davon besteht, auch als Probe für das Screening nutzvoll. Die Verwendung dieses Gens als Probe macht es einfach, Gene für hyperthermostabile β-Galactosidase zu klonen, die mit diesem Gen aus einer Reihe von Organismen hybridisierbar sind.
Die über die Expression des Gens für hyperthermostabile β-Galactosidase gemäß der Erfindung erhaltene hyperthermostabile β-Galactosidase kann durch Inkubieren eines Stamms der Gattung Pyrococcus furiosus DSM 3638 oder Pyrococcus woesei DSM 3773 in einem geeigneten Wachstumsmedium und Reinigen des Zielenzyms aus den Zellen oder der Kulturbrühe erhalten werden. Zum Inkubieren eines Bakteriums der Gattung Pyrococcus kann ein Verfahren verwendet werden, das üblicherweise zum Inkubieren eines hyperthermostabilen Bakteriums eingesetzt wird. Es kann jeglicher Nährstoff, der vom eingesetzten Stamm genutzt werden kann, dem Medium zugesetzt werden. Beispielsweise ist Stärke als Kohlenstoffquelle verwendbar und Trypton und Pepton sind als Stickstoffquelle verwendbar. Als andere Nährstoffe können Hefeextrakt und dergleichen verwendet werden. Das Medium kann Metallsalze wie Magnesiumsalze, Natriumsalze oder Eisensalze als Spurenelemente enthalten. Es ist vorteilhaft, künstliches Meerwasser zur Herstellung des Mediums zu verwenden. Das Medium ist bevorzugt transparent und frei von festem Schwefelelement, da ein solches Medium es leicht macht, das Wachstum der Zellen durch Messen der optischen Dichte der Kultur zu verfolgen. Die Inkubation kann entweder stationär oder unter Rühren vorgenommen werden. Beispielsweise kann eine Belüftungskultur (siehe Japanische Patentveröffentlichung Nr. 503757/1992) oder eine Dialysekultur (siehe Appl. Env. Microbiol. 55, 2086-2088 (1992)) durchgeführt werden. Im allgemeinen beträgt die Inkubationstemperatur bevorzugt um 95ºC. Üblicherweise wird innerhalb von ungefähr 16 Stunden eine beträchtlich grosse Menge an hyperthermostabiler β-Galactosidase in der Kultur angereichert. Es ist selbstverständlich, dass die Inkubationsbedingungen in der Weise bestimmt werden sollten, dass eine maximale Ausbeute an hyperthermostabiler β-Galactosidase in Abhängigkeit vom ausgewählten Stamm und der Zusammensetzung des Mediums erzielt wird.
Die hyperthermostabile β-Galactosidase der vorliegenden Erfindung kann beispielsweise durch Aufnehmen der Zellen aus der Kulturbrühe durch Zentrifugieren oder Filtern und dann Zerstören der Zellen geerntet werden. Die Zellzerstörung kann beispielsweise durch Ultraschallzerstörung, Mahlzerstörung oder lytische Enzymbehandlung vorgenommen werden. Unter Verwendung dieser Techniken kann die hyperthermostabile β-Galactosidase aus den Zellen extrahiert werden. Das Enzym kann durch ein Verfahren extrahiert werden, das in der Lage ist, in Abhängigkeit vom ausgewählten Bakterium den höchsten Extraktionseffekt zu ergeben, und auf diese Weise wird eine rohe Enzymlösung erhalten. Aus der so erhaltenen rohen Enzymlösung kann die hyperthermostabile β- Galactosidase durch Kombination von gemeinhin zum Reinigen von Enzymen eingesetzten Techniken isoliert werden, beispielsweise Aussalzen mit Ammoniumsulfat, Ionenaustauschchromatographie, hydrophobe Chromatographie und Gelfiltration.
Beispielsweise wird eine aus inkubierten Zellen von Pyrococcus furiosus DSM 3638 hergestellte rohe Enzymlösung mit dem Ionenaustauscher DEAE Toyopearl M650 (hergest. von der Tosoh Corporation) chromatographiert, um dadurch eine aktive Fraktion zu eluieren. Die so erhaltene aktive Fraktion wird in eine HIC-Säulenkartusche (hergest. von BioRad) gegossen, um dadurch eine aktive Fraktion zu eluieren. Die so eluierte aktive Fraktion wird in eine Säule mit Superose 12 (hergest. von Pharmacia) gegossen, um dadurch eine aktive Fraktion zu eluieren. Auf diese Weise kann die hyperthermostabile β-Galactosidase erhalten werden.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Fig. 1 stellt eine Restriktionsenzymkarte eines Plasmids pTGE-101 dar.
Fig. 2 stellt eine Restriktionsenzymkarte eines Plasmids pTGE-301 dar.
Fig. 3 stellt eine Restriktionsenzymkarte eines Plasmids pTGEH-401 dar.
Fig. 4 stellt eine Restriktionsenzymkarte eines Beispiels des Gens für hyperthermostabile β-Galactosidase gemäß der vorliegenden Erfindung dar.
Fig. 5 stellt in einem Schaubild die Thermostabilitäten der hyperthermostabilen β-Galactosidase gemäß der vorliegenden Erfindung dar.
Fig. 6 stellt in einem Schaubild den optimalen pH der hyperthermostabilen β-Galactosidase gemäß der vorliegenden Erfindung dar.
Fig. 7 stellt in einem Schaubild die optimale Temperatur der hyperthermostabilen β-Galactosidase gemäß der vorliegenden Erfindung dar.
Fig. 8 stellt in einem Schaubild die pH-Stabilität der hyperthermostabilen β-Galactosidase gemäß der vorliegenden Erfindung dar.

Beispiele

Um die vorliegende Erfindung ausführlicher zu erläutern, und nicht als Einschränkung, werden die folgenden Beispiele angegeben.

Beispiel 1

(1) Herstellung von Genom-DNA von Pyrococcus furiosus

Pyrococcus furiosus DSM 3638 wurden auf folgende Weise inkubiert.
2 l eines Mediums, das 1% Trypton, 0,5% Hefeextrakt, 1% lösliche Stärke, 3,5% Jamann S Solid (hergest. von Jamann Laboratory), 0,5% Jamann S Liquid (hergest. von Jamann Laboratory), 0,003% MgSO&sub4;, 0,001% NaCl, 0,0001% FeSO&sub4;·7H&sub2;O, 0,0001% CoSO&sub4;, 0,0001% CaCl&sub2;·7H&sub2;O, 0,0001% ZnSO&sub4;, 0,1 ppm CuSO&sub4;·5H&sub2;O, 0,1 ppm KAI(SO&sub4;)&sub2;, 0,1 ppm H&sub3;BO&sub3;, 0,1 ppm Na&sub2;MoO&sub4;·2H&sub2;O und 0,25 ppm NiCl&sub2;·6H&sub2;O enthält, wurden in eine Mediumflasche von 2 l eingefüllt und bei 120ºC 20 Minuten lang sterilisiert. Nach Entfernen des gelösten Sauerstoffs durch Einblasen von Stickstoffgas wurde das Medium mit dem oben genannten Stamm beimpft, der dann 16 Stunden lang bei 95 ºC stationär inkubiert wurde. Nach Beendigung der Inkubation, wurden die Zellen durch Zentrifugieren aufgenommen.
Dann wurden die aufgenommenen Zellen in 4 ml 0,05 M Tris-HCl (pH 8,0) suspendiert, das 25% Sucrose enthält. Zu der erhaltenen Suspension wurden 0,8 ml Lysozym (5 mg/ml, 0,25 M Tris-HCl (pH 8,0)) und 2 ml 0,2 M EDTA zugegeben. Nach 1 Stunde Verweilen bei 20ºC wurden 24 ml einer SET-Lösung (150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 20 mM Tris-HCl (pH 8,0)) zugegeben. Ferner wurden 4 ml 5%iges SDS und 400 ul Proteinase K (10 mg/ml) hinzugefügt, gefolgt von einer 1 Stunde dauernden Umsetzung bei 37ºC. Nach Beendigung der Umsetzung wurde die Reaktionsmischung mit Chloroform/Phenol extrahiert und aus Ethanol ausgefällt. Auf diese Weise wurden ungefähr 3,2 mg einer Genom-DNA hergestellt.

(2) Herstellung der Cosmidproteinbibliothek

400 ug der Genom-DNA von Pyrococcus furiosus DSM 3638 wurden mit Sau 3Al in einer Pufferlösung für Sau 3Al (50 mM Tris-HCl (pH 7,5), 10 mM MgCl&sub2;, 1 mM Dithiothreitol, 100 mM NaCl) teilweise verdaut und entsprechend der Grösse durch Dichtegradientenzentrifugieren fraktioniert. Ein Mikrogramm (ug) Triple Helix Cosmid Vector wurden mit Bam HI gespalten und mit 140 ug der Genom-DNA-Fragmente von 35 bis 50 kbp vermischt, die wie oben beschrieben durch Fraktionierung erhalten wurden. Nach Ligation unter Verwendung eines Ligationskits (hergest. von Takara Shuzo Co., Ltd.) wurden die Pyrococcus Genom-DNA- Fragmente nach dem in vitro Verpackungsverfahren unter Verwendung von Gigapack II Gold (hergest. von Stratagene) in λ-Phagenpartikel verpackt. Unter Verwendung eines Teils der so erhaltenen Phagenlösung, wurde E. coli DH5αMCR transformiert, so dass sich dadurch eine Cosmidbibliothek ergibt. Aus einigen so erhaltenen Kolonien wurden Cosmid-DNAs hergestellt und es wurde bestätigt, dass sie ein durch Insertion eingefügtes Fragment einer geeigneten Grösse gemeinsam haben. Als nächstes wurden 500 Kolonien in 2 ml eines L- Brühemediums suspendiert, das 0,01% Ampicillin enthält, und unter Schütteln 16 Stunden bei 37ºC inkubiert. Die Kultur wurde zentrifugiert und Zellen als Niederschlag aufgenommen. Diese Zellen wurden in 20 mM Trix-HCl (pH 8,0) suspendiert und 10 Minuten lang bei 100ºC thermisch behandelt. Anschliessend wurden sie einer Ultraschallbehandlung unterzogen und nochmals 10 Minuten lang bei 100ºC thermisch behandelt. Nach Zentrifugieren wurde der Überstand aufgenommen und als rohe Enzymlösung bezeichnet. Auf diese Weise wurden 500 Cosmidproteinbibliotheken hergestellt.

(3) Auswahl von Cosmid enthaltendem β-Galactosidasegen

Die im obigen Beispiel 1-(2) erhaltenen Cosmidproteinbibliotheken wurden in 50 Gruppen unterteilt, die jeweils 10 Cosmidproteinbibliotheken aufweisen. Dann wurde die β-Galactosidaseaktivität der rohen Enzymlösung jeder Proteinbibliotheksgruppe bestimmt. Es wurden nämlich 10 ul der rohen Enzymlösung zu 99,5 ul einer 100 mM Phosphatpufferlösung (pH 7,3) zugegeben, die 112 mM 2-Mercaptoethanol und 1 mM Magnesiumchlorid enthält. Nach Zugabe von 0,5 ul Dimethylsulfoxidlösung, die 0,4 M o-Nitrophenyl-β-D-galactopyranosid enthält, wurde die Mischung 30 Minuten lang bei 95ºC umgesetzt. Dann wurde die Reaktion durch Zugabe von 50 ul 0,1 M Natriumcarbonat unterbrochen und die Absorption bei 410 nm gemessen. Auf diese Weise wurde die Menge an gebildetem o-Nitrophenol bestimmt.
Als nächstes wurden die β-Galactosidaseaktivitäten von 60 Proteinbibliotheken gemessen, die sechs Gruppen von Cosmidproteinbibliotheken bilden, die β-Galactosidaseaktivität zeigen. Auf diese Weise wurden sieben Cosmidproteine spezifiziert, die β-Galactosidaseaktivität aufweisen, und sieben Cosmid-DNAs spezifiziert, die diesen entsprechen.

(4) Herstellung von Plasmid pTGE-101 und Bildung von thermostabiler β-Galactosidase

Die im obigen Beispiel 1-(3) erhaltenen sieben Cosmid-DNAs wurden mit einem Restriktionsenzym EcoRI vollständig verdaut und auf einem Gel der Elektrophorese unterzogen. Auf diese Weise wurde ein EcoRI- DNA-Fragment von ungefähr 2,2 kbp gereinigt, das diesen sieben Cosmid-DNAs gemeinsam ist. Dann wurde ein Vektor pUC19 an der EcoRI- Stelle abgespalten und am Ende desphosphoryliert. Dann wurde das oben genannte EcoRI-DNA-Fragment von ungefähr 2,2 kbp unter Verwendung eines Ligationskits durch Ligation auf diesem Plasmid eingefügt. Unter Verwendung der so erhaltenen Reaktionsmischung wurde E. coli JM109 transformiert Dann wurde eine DNA aus der Transformante extrahiert, mit EcoRI gespalten und auf einem Agarosegel einer Elektrophorese unterzogen. Auf diese Weise wurde das Vorhandensein des durch Insertion darin eingefügten EcoRI-DNA-Fragments von ungefähr 2,2 kbp bestätigt. Das erhaltene Plasmid und die Transformante wurden entsprechend pTGE-101 und Escherichia coli JM109/pTGE-101 genannt.
Dieses EcoRI-DNA-Fragment von ungefähr 2,2 kbp wurde mit verschiedenen Restriktionsenzymen gespalten und durch Agarosegelelektrophorese analysiert. Fig. 1 zeigt die Ergebnisse. Sie ist eine Zeichnung, die eine Restriktionsenzymkarte des erhaltenen Plasmids pTGE-101 zeigt, das das EcoRI-DNA-Fragment von ungefähr 2,2 kbp aufweist.
Escherichia coli JM109/pTGE-101 wurde in 5 ml eines L-Brühemediums suspendiert, das 0,01% Ampicillin enthält und unter Schütteln 16 Stunden bei 37ºC inkubiert. Die Kultur wurde zentrifugiert und die so aufgenommenen Zellen wurden in einer 50 mM Phosphatpufferlösung (pH 7,0) suspendiert, die 1 mM EDTA enthält und 10 Minuten lang bei 100 ºC thermisch behandelt. Dann wurden die Zellen einer Ultraschallbehandlung unterzogen und nochmals 10 Minuten bei 100ºC thermisch behandelt. Nach Zentrifugieren wurde der Überstand zur Verwendung als rohe Enzymlösung abgetrennt. Dann wurde die β-Galactosidaseaktivität gemäß dem Verfahren bestimmt wie es oben in Beispiel 1-(3) beschrieben ist, mit der Ausnahme, dass 5 ul dieser rohen Enzymlösung verwendet wurden. Als Ergebnis zeigte diese rohe Enzymlösung keine Aktivität. Dann wurde eine andere rohe Enzymlösung auf dieselbe Weise hergestellt wie es oben beschrieben ist, mit der Ausnahme, dass die thermischen Behandlungen (zweimal 10 Minuten lang bei 100ºC) weggelassen wurden. Dann wurde die β-Galactosidaseaktivität der rohen Enzymlösung gemäß dem Verfahren von Beispiel 1-(3) bestimmt, mit der Ausnahme, dass die Reaktionstemperatur auf 70ºC eingestellt wurde. Diese rohe Enzymlösung wies eine Aktivität zum Abbau von o- Nitrophenyl-β-D-galactopyranosid bei pH 7,3 bei 70ºC auf. Es wurde nämlich ein Gen in pTGE-101 durch Insertion eingefügt, das für eine thermostabile β-Galactosidase kodiert, die eine Aktivität bei 70ºC zeigt.

(5) Herstellung von Plasmid pTGH-301

Das EcoRI-DNA-Fragment (ungefähr 2,2 kbp), das im obigen Beispiel 1- (4) erhalten wurde, wurde unter Verwendung eines Random Primer Labeling Kit (hergest. von Takara Shuzo Co., Ltd.) mit (α-³²P)dCTP (3000 Cl/mmol, hergest. von Amersham) markiert. Mit dem so erhaltenen markierten DNA-Fragment als Probe wurden die im obigen Beispiel 1-(3) spezifizierten Cosmid-DNAs, die mit Hind III vollständig verdaut und durch Elektrophorese getrennt wurden, durch Southern Hybridisierung analysiert. Auf diese Weise wurde ein Hind-III-DNA-Fragment von ungefähr 3,5 kbp hybridisiert durch die obige Probe identifiziert und gereinigt. Als nächstes wurde pUC19 an der Hind-III-Stelle abgespalten und am Ende desphosphoryliert. Das oben genannte Hind-III-DNA-Fragment wurde unter Verwendung eines Ligationskits durch Ligation auf dieses Plasmid angefügt und dadurch wurde E. coli JM109 transformiert. Das erhaltene Plasmid wurde Plasmid pTGH-301 genannt, während die Transformante Escherichia coli JM109/pTGH-301 genannt wurde. Escherichia coli JM109/pTGH-301 wurde in 5 ml eines L-Brühemediums suspendiert, das 0,01% Ampicillin enthält und unter Schütteln 16 Stunden bei 37ºC inkubiert. Die Kultur wurde zentrifugiert und die so aufgenommenen Zellen wurden in einer 50 mM Phosphatpufferlösung (pH 7,0) suspendiert, die 1 mM EDTA enthält und 10 Minuten lang bei 100 ºC thermisch behandelt. Anschliessend wurden die Zellen einer Ultraschallbehandlung unterzogen und nochmals 10 Minuten bei 100ºC thermisch behandelt. Nach Zentrifugieren wurde der Überstand zur Verwendung als rohe Enzymlösung abgetrennt. Die β-Galactosidaseaktivität wurde gemäß dem Verfahren bestimmt wie es oben in Beispiel 1-(3) beschrieben ist, mit der Ausnahme, dass 5 ul dieser rohen Enzymlösung verwendet wurden. Als Ergebnis wurde in der rohen Enzymlösung die Aktivität einer hyperthermostabilen β-Galactosidase beobachtet, die der 20 minütigen thermischen Behandlung bei 100ºC widerstehen kann.
Das oben genannte Hind-III-DNA-Fragment von ungefähr 3,5 kbp wurden mit verschiedenen Restriktionsenzymen gespalten und durch Agarosegelelektrophorese analysiert. Fig. 2 zeigt die Ergebnisse. Sie ist eine Zeichnung, die eine Restriktionsenzymkarte des erhaltenen Plasmids pTGH-301 zeigt, das das oben erhaltene Hind-III-DNA-Fragment (ungefähr 3,5 kbp) aufweist. Durch das Plasmid pTGH-301 transformierte E. coli JM109 mit dem Gen für hyperthermostabile β-Galactosidase wurden als Escherichia coli JM109/pTGH-301 exprimiert und wurden bei der Fermentation Research Institute of the Agency of Industrial Science and Technology unter der Zugangsnummer FERM P-13348 hinterlegt.

(6) Herstellung von Plasmid pTGEH-401

Das oben genannte Plasmid pTGH-301 wurde mit EcoRI verdaut und auf einem Agarosegel einer Elektrophorese unterzogen. Unter den auf diese Weise abgetrennten DNA-Fragmenten von ungefähr 3,0 kbp, ungefähr 2,2 kbp und ungefähr 1,0 kbp wurden die beiden DNA-Fragmente (von ungefähr 3,0 kbp und ungefähr 2,2 kbp) gewonnen. Das DNA- Fragment von ungefähr 3,0 kbp wurde unter Verwendung von alkalischer Phosphatase (hergest. von Takara Shuzo Co., Ltd.) desphosphoryliert und durch Vermischen mit dem DNA-Fragment von ungefähr 2,2 kbp einer Ligation unterzogen, gefolgt von einer Transduktion in E. coli JM109. Die Aktivitäten der hyperthermostabilen β-Galactosidase der auf diese Weise gebildeten Kolonien wurden bestimmt. Aus den Kolonien, die Aktivität zeigen, wurde ein Plasmid hergestellt und pTGEH-401 genannt. E. coli JM109 mit diesem Plasmid wurde Escherichia coli JM109/pTGEH-401 genannt und beim National Institute of Bioscience and Human-Technology Agency of Industrial Science and Technology, Japan unter der Zugangsnummer FERM BP-4468 hinterlegt.
Fig. 3 zeigt eine Restriktionsenzymkarte des Plasmids pTGEH-401. Fig. 4 zeigt eine Restriktionsenzymkarte des Gens für hyperthermostabile β- Galactosidase von ungefähr 2,5 kbp, das von Pyrococcus furiosus herstammt und in das Plasmid pTGEH-401 durch Insertion eingefügt, gemäß der vorliegenden Erfindung erhalten wird.

Beispiel 2

Bestimmung der DNA-Sequenz des Gens für hyperthermostabile β-Galactosidase

Das DNA-Fragment von ungefähr 3,5 kbp, das das Gen für hyperthermostabile β-Galactosidase enthält, das in das Plasmid pTGH-31 durch Insertion eingefügt ist, wurde mit verschiedenen Restriktionsenzymen gespalten und in den Plasmidvektor pUC118 untergeklont. Die DNA-Sequenzen jedes untergeklonten Fragments wurden nach dem Didesoxyverfahren unter Verwendung von BcaßestTM Dideoxy Sequencing Kit (hergest. von Takara Shuzo Co., Ltd.) bestimmt. Die SEQ ID Nr. 2 im Sequenzprotokoll zeigt die DNA-Sequenz des DNA-Fragments, das das Gen für hyperthermostabile β-Galactosidase enthält, das in das Plasmid pTGH-301 durch Insertion eingefügt ist. Die SEQ ID Nr. 1 im Sequenzprotokoll zeigt die Aminosäuresequenz der hyperthermostabilen β-Galactosidase, die von der in SEQ ID Nr. 1 gezeigten DNA-Sequenz angenommen wird.

Beispiel 3

(1) Herstellung von hyperthermostabiler β-Galactosidase

Escherichia coli JM109/pTGH-301 (FERM P-13348) mit dem Plasmid pTGH-301, das das Gen für hyperthermostabile β-Galactosidase der vorliegenden Erfindung durch Transduktion darin enthält, das im obigen Beispiel 1 erhalten wurde, wurde in 5 ml eines L-Brühemediums suspendiert, das 0,01% Ampicillin enthält und unter Schütteln 16 Stunden bei 37ºC inkubiert. Dann wurde die Kultur in 1,2 l eines Mediums derselben Bedingungen suspendiert und unter Schütteln 16 Stunden bei 37 ºC inkubiert. Nach Zentrifugieren der Kultur wurden die so aufgenommenen Zellen in einer 50 mM Phosphatpufferlösung (pH 7,0) suspendiert, die 1 mM EDTA enthält, und 10 Minuten bei 100ºC thermisch behandelt. Danach wurden die Zellen einer Ultraschallbehandlung unterzogen und nochmals 10 Minuten bei 100ºC thermisch behandelt. Nach Zentrifugieren wurde der Überstand zur Verwendung als rohe Enzymlösung abgetrennt. Diese rohe Enzymlösung wies 20 U o-Nitrophenyl-β-D-galactopyranosidabbauaktivität pro Milliliter des L-Brühemediums bei pH 7,3 bei 95ºC auf. Diese rohe Enzymlösung wurde mit MOLCUT II aufkonzentriert (Cutoff-Molekulargewicht 10000, hergest. von Millipore Corp.) und durch eine Säule mit Superose 12 (10 · 300 mm, hergest. von Pharmacia) einer Gelfiltration unterzogen, die mit einer 50 mM Phosphatpufferlösung (pH 7,2), die 100 mM NaCl enthält, abgeglichen wurde, und es wurde eine aktive Fraktion aufgefangen. Die aktive Fraktion wurde mit MOLCUT II konzentriert (Cutoff-Molekulargewicht 10000, hergest. von Millipore Corp.) und von 1 ml einer APTG-Affinitätssäule (hergest. von Moβi Tec) adsorbiert, die mit einer 20 mM Glycinnatriumpufferlösung (pH 7,5), die 10 mM MgCl&sub2; und 200 mM NaCl enthält, abgeglichen wurde. Nach 1 Stunde Verweilen bei Raumtemperatur wurde die Säule mit 12,5 ml einer Glycinnatriumpufferlösung (pH 7,5), die 10 mM MgCl&sub2; und 200 mM NaCl enthält, gewaschen und dann mit einer 100 mM Glycinnatriumpufferlösung (pH 10,0) eluiert. Es wurde eine aktive Fraktion abgetrennt und auf diese Weise ein gereinigtes Enzympräparat erhalten. Bei Elektrophorese auf einem 7,5%igen SDS- Polyacrylamidgel zeigte dieses Präparat eine einzelne Bande.
Gleichermassen wurde Escherichia coli JM109/pTGEH-401 mit dem Plasmid pTGEH-401, das das Gen für hyperthermostabile β-Galactosidase gemäß der vorliegenden Erfindung durch Transduktion darin enthält, auf dieselbe Weise wie oben beschrieben inkubiert. Aus der Kultur wurde eine aktive Fraktion der hyperthermostabilen β-Galactosidase gereinigt und auf diese Weise ein hyperthermostabiles β- Galactosidasepräparat erhalten.

Wirkung der Erfindung

Die Verwendung des Gens für hyperthermostabile β-Galactosidase der vorliegenden Erfindung macht es möglich, eine hyperthermostabile β- Galactosidase vorteilhaft industriell herzustellen.
Unter Verwendung des Gens für hyperthermostabile β-Galactosidase der vorliegenden Erfindung oder eines Teils davon als Probe, können von verschiedenen Organismen stammende Gene für hyperthermostabile β-Galactosidase erhalten werden.

SEQUENZPROTOKOLL

INFORMATION ZU SEQ ID Nr. 1:
(i) SEQUENZMERKMALE:
(A) LÄNGE: 510 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(C) STRANGFORM: einzeln
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
(iii) HYPOTHETISCH:
(iv) ANTISENSE:
(v) ART DES FRAGMENTS:
(vi) URSPRUNGSQUELLE:
(A) ORGANISMUS: Pyrococcus furiosus
(B) STAMM:
(C) INDIVIDUELLES ISOLAT:
(D) ENTWICKLUNGSSTUFE:
(E) HAPLOTYP:
(F) GEWEBETYP:
(G) ZELLTYP:
(H) ZELL-LINIE:
(I) ORGANELLE:
(vii) DIREKTE QUELLE:
(A) BIBLIOTHEK:
(B) KLON:
(viii) POSITION IM GENOM:
(A) CHROMOSOM/SEGMENT:
(B) POSITION IN DER KARTE:
(C) EINHEITEN:
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL:
(B) LAGE:
(C) IDENTIFIKATIONSVERFAHREN:
(D) WEITERE INFORMATION:
(x) PUBLIKATIONSINFORMATION:
(A) VERFASSER:
(B) TITEL:
(C) ZEITSCHRIFT:
(D) BAND:
(E) AUSGABE:
(F) SEITEN:
(G) DATUM:
(H) DOKUMENT NUMMER:
(I) ANMELDEDATUM:
(J) VERÖFFENTLICHUNGSDATUM:
(K) RELEVANTE RESTE: (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR. 1:
INFORMATION ZU SEQ ID Nr. 2:
(i) SEQUENZMERKMALE:
(A) LÄNGE: 1533 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: doppelt
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: genomische DNA
(iii) HYPOTHETISCH: nein
(iv) ANTISENSE: nein
(v) ART DES FRAGMENTS:
(vi) URSPRUNGSQUELLE:
(A) ORGANISMUS: Pyrococcus furiosus
(B) STAMM:
(C) INDIVIDUELLES ISOLAT:
(D) ENTWICKLUNGSSTUFE:
(E) HAPLOTYP:
(F) GEWEBETYP:
(G) ZELLTYP:
(H) ZELL-LINIE:
(I) ORGANELLE:
(vii) DIREKTE QUELLE:
(A) BIBLIOTHEK:
(B) KLON:
(viii) POSITION IM GENOM:
(A) CHROMOSOM/SEGMENT:
(B) POSITION IN DER KARTE:
(C) EINHEITEN:
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL:
(B) LAGE:
(C) IDENTIFIKATIONSVERFAHREN:
(D) WEITERE INFORMATION:
(x) PUBLIKATIONSINFORMATION:
(A) VERFASSER:
(B) TITEL:
(C) ZEITSCHRIFT:
(D) BAND:
(E) AUSGABE:
(F) SEITEN:
(G) DATUM:
(H) DOKUMENT NUMMER:
(I) ANMELDEDATUM:
(J) VERÖFFENTLICHUNGSDATUM:
(K) RELEVANTE RESTE: (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR. 2:

Claims

1. Isolierte DNA mit:

(a) der DNA-Sequenz von SEQ ID Nr. 2 oder ein Fragment davon,

(b) einer DNA-Sequenz, die für die Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 1 oder ein Fragment davon kodiert,

(c) einer DNA-Sequenz, die für die Aminosäuresequenz kodiert, die aus Deletion, Addition, Insertion oder Substitution einer oder mehrerer Aminosäuren in der Aminosäuresequenz von SEQ ID No. 1 resultiert, oder

(d) einer DNA-Sequenz, die in der Lage ist, irgendeine von (a) bis (c) unter stringenten Bedingungen zu hybridisieren,

worin die DNA-Sequenz oder das Fragment davon für ein Polypeptid kodiert, das hyperthermostabile β-Galactosidaseaktivität von ungefähr 100% besitzt, nachdem es 120 Minuten lang bei 90ºC behandelt wurde.

2. Verfahren zur Herstellung einer hyperthermostabilen β- Galactosidase, die die Aktivität von ungefähr 100% aufweist, nachdem sie 120 Minuten lang bei 90ºC behandelt wurde, das umfasst:

(a) Konstruieren eines Plasmids, in das eine isolierte DNA durch Insertion eingefügt wird, die für eine hyperthermophile β-Galactosidase kodiert, wie es in Anspruch 1 beansprucht ist,

(b) Transformieren eines geeigneten Mikroorganismus mit dem Plasmid, und

(c) Kultivieren des transformierten Mikroorganismus und Gewinnen der hyperthermostabilen β-Galactosidase aus der Kultur.