JPH0687A - リパ−ゼ活性を有すタンパク質をコ−ドする遺伝子及びその製造法 - Google Patents
リパ−ゼ活性を有すタンパク質をコ−ドする遺伝子及びその製造法Info
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- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
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- C12N9/14—Hydrolases (3)
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- C12N9/18—Carboxylic ester hydrolases (3.1.1)
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 工業的に利用価値の高いシュードモナス属細
菌由来のリパーゼ活性を有するタンパク質の提供。 【構成】 シュードモナス属細菌由来のリパーゼ活性を
有すタンパク質をコードする遺伝子、該遺伝子を含むシ
ュードモナス属細菌内で複製可能な組換え体ＤＮＡ及び
該組換え体ＤＮＡを含むシュードモナス属細菌。 【効果】 本発明において得られた形質転換株は、リパ
ーゼ活性を有すタンパク質を大量生産上有効な分泌生産
した。従って本発明は酵素製造業界における有用な方法
を提供する。
菌由来のリパーゼ活性を有するタンパク質の提供。 【構成】 シュードモナス属細菌由来のリパーゼ活性を
有すタンパク質をコードする遺伝子、該遺伝子を含むシ
ュードモナス属細菌内で複製可能な組換え体ＤＮＡ及び
該組換え体ＤＮＡを含むシュードモナス属細菌。 【効果】 本発明において得られた形質転換株は、リパ
ーゼ活性を有すタンパク質を大量生産上有効な分泌生産
した。従って本発明は酵素製造業界における有用な方法
を提供する。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、シュ−ドモナス属細菌
由来のリパ−ゼ活性を有すタンパク質をコ−ドする遺伝
子、該遺伝子を含む組換え体ＤＮＡ及びそれを含むシュ
−ドモナス属細菌、更に菌体外分泌生産を特徴とするリ
パ−ゼ活性を有すタンパク質の製造法に関する。
由来のリパ−ゼ活性を有すタンパク質をコ−ドする遺伝
子、該遺伝子を含む組換え体ＤＮＡ及びそれを含むシュ
−ドモナス属細菌、更に菌体外分泌生産を特徴とするリ
パ−ゼ活性を有すタンパク質の製造法に関する。
【０００２】
【従来の技術とその問題点】リパ−ゼは脂質を加水分解
する酵素として油脂加工、臨床診断薬、洗剤、消化薬な
どに使用されているほか、近年は化成品、特に光学活性
化合物の製造法となるエステルの加水分解、エステル合
成、或はエステル変換を触媒する重要な酵素である。ま
た、シュ−ドモナス属細菌はエステルの加水分解、エス
テル合成或はエステル変換の触媒に有用なリパ−ゼを生
産することで知られている（特開昭６２−１６６８９
８）。この様な特性をもつシュ−ドモナス属細菌のリパ
−ゼを工業的に利用するためには、酵素の大量生産が望
まれる。しかも工業的スケ−ルでの生産には、連続培養
及び酵素回収の容易さなどの利点から酵素の培養液中へ
の分泌生産が有効とされている。近年遺伝子組換え技術
の応用が有用タンパク質の大量生産に導入されるように
なっており、シュ−ドモナス属細菌のリパ−ゼについて
も試みられている。しかしこれらは効率良い培養液中へ
のリパ−ゼ分泌生産系の完成まで至っておらず、工業的
に利用するには問題があった。例えば大腸菌を宿主菌と
した場合、生産されたリパ−ゼの回収は菌体内からおこ
なわれている（特開昭６２−１８８０７２、特開昭６２
−２２８２７９、特願平１−７７５７）。このような菌
体内生産の場合、生産物質の回収には超音波処理などの
菌破壊工程と宿主菌由来のきょう雑物質を除くための多
くの精製工程が必要で物質生産上不利とされている。ま
た、例えばシュ−ドモナス菌を宿主菌とした場合、リパ
−ゼの回収は工業的利用に有利な培養液中からおこなわ
れている（特願昭６３−３００３８６、特願平１−３３
８２５０）。しかしこれらの場合その生産には例えば３
日間の培養をしており、かならずしも効率よい生産とは
いえない。
する酵素として油脂加工、臨床診断薬、洗剤、消化薬な
どに使用されているほか、近年は化成品、特に光学活性
化合物の製造法となるエステルの加水分解、エステル合
成、或はエステル変換を触媒する重要な酵素である。ま
た、シュ−ドモナス属細菌はエステルの加水分解、エス
テル合成或はエステル変換の触媒に有用なリパ−ゼを生
産することで知られている（特開昭６２−１６６８９
８）。この様な特性をもつシュ−ドモナス属細菌のリパ
−ゼを工業的に利用するためには、酵素の大量生産が望
まれる。しかも工業的スケ−ルでの生産には、連続培養
及び酵素回収の容易さなどの利点から酵素の培養液中へ
の分泌生産が有効とされている。近年遺伝子組換え技術
の応用が有用タンパク質の大量生産に導入されるように
なっており、シュ−ドモナス属細菌のリパ−ゼについて
も試みられている。しかしこれらは効率良い培養液中へ
のリパ−ゼ分泌生産系の完成まで至っておらず、工業的
に利用するには問題があった。例えば大腸菌を宿主菌と
した場合、生産されたリパ−ゼの回収は菌体内からおこ
なわれている（特開昭６２−１８８０７２、特開昭６２
−２２８２７９、特願平１−７７５７）。このような菌
体内生産の場合、生産物質の回収には超音波処理などの
菌破壊工程と宿主菌由来のきょう雑物質を除くための多
くの精製工程が必要で物質生産上不利とされている。ま
た、例えばシュ−ドモナス菌を宿主菌とした場合、リパ
−ゼの回収は工業的利用に有利な培養液中からおこなわ
れている（特願昭６３−３００３８６、特願平１−３３
８２５０）。しかしこれらの場合その生産には例えば３
日間の培養をしており、かならずしも効率よい生産とは
いえない。
【０００３】
【発明が解決しようとする問題点】本発明者らは上記問
題点を解決するため、シュ−ドモナス属細菌由来のリパ
−ゼ活性を有すタンパク質の高分泌生産菌株を遺伝子組
換え技術を用いて創製することによって、リパ−ゼの工
業的スケ−ルでの生産が可能となると考え、鋭意検討し
た。その結果シュ−ドモナス属細菌の染色体ＤＮＡより
リパ−ゼ活性を有すタンパク質をコ−ドする遺伝子を含
むＤＮＡ断片を単離し、該ＤＮＡ断片を有する組換え体
ＤＮＡを得、この組換え体ＤＮＡをによって形質転換さ
れたシュ−ドモナス属細菌が培養液中に著量のリパ−ゼ
活性を有すタンパク質を分泌生産することを見いだし、
本発明を完成した。即ち、本発明の目的はシュ−ドモナ
ス属細菌由来のリパ−ゼ活性を有すタンパク質をコ−ド
する遺伝子を含むＤＮＡ断片、該ＤＮＡ断片を有す組換
え体ＤＮＡ、該組換え体ＤＮＡによって形質転換され、
リパ−ゼ活性を有すタンパク質の効率よい分泌生産に好
適であるシュ−ドモナス属細菌、及びそれを用いたリパ
−ゼ活性を有すタンパク質の製造法を提供することにあ
る。
題点を解決するため、シュ−ドモナス属細菌由来のリパ
−ゼ活性を有すタンパク質の高分泌生産菌株を遺伝子組
換え技術を用いて創製することによって、リパ−ゼの工
業的スケ−ルでの生産が可能となると考え、鋭意検討し
た。その結果シュ−ドモナス属細菌の染色体ＤＮＡより
リパ−ゼ活性を有すタンパク質をコ−ドする遺伝子を含
むＤＮＡ断片を単離し、該ＤＮＡ断片を有する組換え体
ＤＮＡを得、この組換え体ＤＮＡをによって形質転換さ
れたシュ−ドモナス属細菌が培養液中に著量のリパ−ゼ
活性を有すタンパク質を分泌生産することを見いだし、
本発明を完成した。即ち、本発明の目的はシュ−ドモナ
ス属細菌由来のリパ−ゼ活性を有すタンパク質をコ−ド
する遺伝子を含むＤＮＡ断片、該ＤＮＡ断片を有す組換
え体ＤＮＡ、該組換え体ＤＮＡによって形質転換され、
リパ−ゼ活性を有すタンパク質の効率よい分泌生産に好
適であるシュ−ドモナス属細菌、及びそれを用いたリパ
−ゼ活性を有すタンパク質の製造法を提供することにあ
る。
【０００４】
【問題点を解決するための手段】本発明は下記の構成を
有する。 （１）下記の塩基配列を有することを特徴とするシュ−
ドモナス（Pseudomonas)属細菌由来のリパ−ゼ活性を有
するタンパク質をコ−ドする遺伝子。 10 20 30 40 50 60 5'ATGAAACATT TAATACAGTT TGTTTTGCTA ATGTCTGCGC CCCAAACAAC AAAAACAGGT 70 80 90 100 110 120 CATCACATGC GCAGGCTCTC CCTACTCATC CCTTGGCGGG GATGCATCCT GTCCATCGTC 130 140 150 160 170 180 AGTGAACGTG CCATAGCAGC ACCCTCGCCG TATTCCACCA TGATCGTGTT CGGCGACAGC 190 200 210 220 230 240 CTGAGCGACT CGGGGCATTT TCCAGGGGTC GGCACAGGCA TGCGCTTCAC CAACCGCACC 250 260 270 280 290 300 GGGCCGACGT ACAGGGATTA CCGGGGGGAG GAATATGCTG CAGTAACGCC CACGCGGCTG 310 320 330 340 350 360 GGCACCCAAC TGGGGATCGC CCCCGCAGAC CTGCGCCCGT CCACTTCGCC GGGCAACTCT 370 380 390 400 410 420 CTTGCAGGGG AGCCCGACGG CAACAACTGG GCGGTCGGCG GCTATCGCAC AGACCAGATC 430 440 450 460 470 480 CTCAATTCCA TCAAGACCGA GTCAAAGGTC GCCATCCCGG ATGACTGGTC CTTCGTCGGC 490 500 510 520 530 540 GGCTACGTCC TGCGCAGCAA GCCTGGCTAC CTTGTGCAGA ACAGCTTCAC GGCTGACCCC 550 560 570 580 590 600 AAGGCGTTGT ATTTCATTTC AGGCGGCGGT AATGACTTTC TCCAAGGCAA GGTCACCAAC 610 620 630 640 650 660 CCCGCCGAGG CAGGCCAAGC CGCACAAAGG CTGGCGGCAA GCGCCCACAC CCTGCAACAG 670 680 690 700 710 720 GCAGGGGCAC GCTACATCAT GGTCTGGCTG CTGCCCGATC TGGGCCTGAC GCCAGCCGTT 730 740 750 760 770 780 TACGGTACAC CCACCCAGGC TGGCACCAGC GCCCTGAGCG CCCTGTTCAA TCATGAGCTA 790 800 810 820 830 840 ACCCAGCAAC TGGCGCAGAT AGACGCCGAA GTGATTCCCC TCAATATCCC GCTGCTGCTG 850 860 870 880 890 900 CGTGAAGCCA TCGCCGACCC CGCCCGTTAT GGCCTGGCAC TGGGGCAGGA CCTTGTCGCG 910 920 930 940 950 960 ACCTGTTTCA ATGGCGAAGA GTGTACGGAA AACCCGCAGT ACGGACTCAA CAGCGCAACC 970 980 990 1000 1010 1020 CCCAACCCGG CCAAACTGCT ATTCAACGAC TCGGTACACC CCACCGAGAC AGGGCAACAG 1030 1040 1050 1060 1070 1080 CTGATTGCCG ACTATGCCTA CTCATTGCTG GCCGTGCCGT GGGAGCTGAC CTTGTTACCC 1090 1100 1110 1120 1130 1140 GTTATGGCCC AAGGCTCGCT CAACGCCCAT CAAGACCAGT TGCGCAACCA ATGGGCTGGC 1150 1160 1170 1180 1190 1200 GACGACGGTC AATGGCAAGC CATTGGCCAG TGGCGAACCC TGCTCGCCGG TGGCGGGCAA 1210 1220 1230 1240 1250 1260 CGCCTGGAAA TCGACAAGCA GACCACGGCC GTGAAGGCAG ATGGCAAAGG CTATAACCTC 1270 1280 1290 1300 1310 1320 AATATCGGCA CCAGCTACAG GCTGGATGAC AACTGGCGAT TTGGCATTGC CGGCGGGTTT 1330 1340 1350 1360 1370 1380 TACCGGCAAC GCCTGGAAAC CGGGGCCAAT AAATCGGACT ACAAGCTCAA CAGCTATCTG 1390 1400 1410 1420 1430 1440 GGTAGCGTGT TTGCCCAATA CCAGCACAAT CACTGGTGGG GGGATGCGGC ACTGACGTTG 1450 1460 1470 1480 1490 1500 GGCAGGCTGG ATTACGACAG CCTGAAACGA AAATTCGCGC TTGGGGTGGG TAGTGATATG 1510 1520 1530 1540 1550 1560 GAGCAAGGCC AGGCTGACGG CCATTTGCGA GCATTGGTAC ACGCCTGGGT TATGAAATCG 1570 1580 1590 1600 1610 1620 CACAGGCATC TGACCTGTGG CAGCTCTCCC CCTTTATCAG CGCCGTTACT CGCGGGTGGA AGTTAA 3' （２）シュ−ドモナス属細菌がシュ−ドモナス フラジ
（Pseudomonas fragi)ＩＦＯ１２０４９株である前記第
１項記載の遺伝子。 （３）前記第１項、２項で確認されたリパ−ゼ活性を有
すタンパク質をコ−ドする遺伝子をグラム陰性菌広域宿
主ベクタ−に組み込んでなるシュ−ドモナス属細菌で複
製可能な組換え体ＤＮＡ。 （４）前記第３項記載の組換え体ＤＮＡによって形質転
換されたシュ−ドモナス属細菌。 （５）前記第３項記載の組換え体ＤＮＡを用いることを
特徴とするリパ−ゼ活性を有すタンパク質の製造法。 （６）前記第４項記載のシュ−ドモナス属細菌を培養し
リパ−ゼ活性を有するタンパク質を培養液中に産生せし
め、該培養液中より回収することを特徴とするリパ−ゼ
活性を有すタンパク質の製造法。
有する。 （１）下記の塩基配列を有することを特徴とするシュ−
ドモナス（Pseudomonas)属細菌由来のリパ−ゼ活性を有
するタンパク質をコ−ドする遺伝子。 10 20 30 40 50 60 5'ATGAAACATT TAATACAGTT TGTTTTGCTA ATGTCTGCGC CCCAAACAAC AAAAACAGGT 70 80 90 100 110 120 CATCACATGC GCAGGCTCTC CCTACTCATC CCTTGGCGGG GATGCATCCT GTCCATCGTC 130 140 150 160 170 180 AGTGAACGTG CCATAGCAGC ACCCTCGCCG TATTCCACCA TGATCGTGTT CGGCGACAGC 190 200 210 220 230 240 CTGAGCGACT CGGGGCATTT TCCAGGGGTC GGCACAGGCA TGCGCTTCAC CAACCGCACC 250 260 270 280 290 300 GGGCCGACGT ACAGGGATTA CCGGGGGGAG GAATATGCTG CAGTAACGCC CACGCGGCTG 310 320 330 340 350 360 GGCACCCAAC TGGGGATCGC CCCCGCAGAC CTGCGCCCGT CCACTTCGCC GGGCAACTCT 370 380 390 400 410 420 CTTGCAGGGG AGCCCGACGG CAACAACTGG GCGGTCGGCG GCTATCGCAC AGACCAGATC 430 440 450 460 470 480 CTCAATTCCA TCAAGACCGA GTCAAAGGTC GCCATCCCGG ATGACTGGTC CTTCGTCGGC 490 500 510 520 530 540 GGCTACGTCC TGCGCAGCAA GCCTGGCTAC CTTGTGCAGA ACAGCTTCAC GGCTGACCCC 550 560 570 580 590 600 AAGGCGTTGT ATTTCATTTC AGGCGGCGGT AATGACTTTC TCCAAGGCAA GGTCACCAAC 610 620 630 640 650 660 CCCGCCGAGG CAGGCCAAGC CGCACAAAGG CTGGCGGCAA GCGCCCACAC CCTGCAACAG 670 680 690 700 710 720 GCAGGGGCAC GCTACATCAT GGTCTGGCTG CTGCCCGATC TGGGCCTGAC GCCAGCCGTT 730 740 750 760 770 780 TACGGTACAC CCACCCAGGC TGGCACCAGC GCCCTGAGCG CCCTGTTCAA TCATGAGCTA 790 800 810 820 830 840 ACCCAGCAAC TGGCGCAGAT AGACGCCGAA GTGATTCCCC TCAATATCCC GCTGCTGCTG 850 860 870 880 890 900 CGTGAAGCCA TCGCCGACCC CGCCCGTTAT GGCCTGGCAC TGGGGCAGGA CCTTGTCGCG 910 920 930 940 950 960 ACCTGTTTCA ATGGCGAAGA GTGTACGGAA AACCCGCAGT ACGGACTCAA CAGCGCAACC 970 980 990 1000 1010 1020 CCCAACCCGG CCAAACTGCT ATTCAACGAC TCGGTACACC CCACCGAGAC AGGGCAACAG 1030 1040 1050 1060 1070 1080 CTGATTGCCG ACTATGCCTA CTCATTGCTG GCCGTGCCGT GGGAGCTGAC CTTGTTACCC 1090 1100 1110 1120 1130 1140 GTTATGGCCC AAGGCTCGCT CAACGCCCAT CAAGACCAGT TGCGCAACCA ATGGGCTGGC 1150 1160 1170 1180 1190 1200 GACGACGGTC AATGGCAAGC CATTGGCCAG TGGCGAACCC TGCTCGCCGG TGGCGGGCAA 1210 1220 1230 1240 1250 1260 CGCCTGGAAA TCGACAAGCA GACCACGGCC GTGAAGGCAG ATGGCAAAGG CTATAACCTC 1270 1280 1290 1300 1310 1320 AATATCGGCA CCAGCTACAG GCTGGATGAC AACTGGCGAT TTGGCATTGC CGGCGGGTTT 1330 1340 1350 1360 1370 1380 TACCGGCAAC GCCTGGAAAC CGGGGCCAAT AAATCGGACT ACAAGCTCAA CAGCTATCTG 1390 1400 1410 1420 1430 1440 GGTAGCGTGT TTGCCCAATA CCAGCACAAT CACTGGTGGG GGGATGCGGC ACTGACGTTG 1450 1460 1470 1480 1490 1500 GGCAGGCTGG ATTACGACAG CCTGAAACGA AAATTCGCGC TTGGGGTGGG TAGTGATATG 1510 1520 1530 1540 1550 1560 GAGCAAGGCC AGGCTGACGG CCATTTGCGA GCATTGGTAC ACGCCTGGGT TATGAAATCG 1570 1580 1590 1600 1610 1620 CACAGGCATC TGACCTGTGG CAGCTCTCCC CCTTTATCAG CGCCGTTACT CGCGGGTGGA AGTTAA 3' （２）シュ−ドモナス属細菌がシュ−ドモナス フラジ
（Pseudomonas fragi)ＩＦＯ１２０４９株である前記第
１項記載の遺伝子。 （３）前記第１項、２項で確認されたリパ−ゼ活性を有
すタンパク質をコ−ドする遺伝子をグラム陰性菌広域宿
主ベクタ−に組み込んでなるシュ−ドモナス属細菌で複
製可能な組換え体ＤＮＡ。 （４）前記第３項記載の組換え体ＤＮＡによって形質転
換されたシュ−ドモナス属細菌。 （５）前記第３項記載の組換え体ＤＮＡを用いることを
特徴とするリパ−ゼ活性を有すタンパク質の製造法。 （６）前記第４項記載のシュ−ドモナス属細菌を培養し
リパ−ゼ活性を有するタンパク質を培養液中に産生せし
め、該培養液中より回収することを特徴とするリパ−ゼ
活性を有すタンパク質の製造法。
【０００５】以下、本発明を詳細に説明する。 リパ−ゼ活性を有すタンパク質をコ−ドする遺伝子の
クロ−ニング シュ−ドモナス フラジ(Pseudomonas fragi) ＩＦＯ１
２０４９株の染色体ＤＮＡは、例えばSmith らの方法(S
mith,M.G.,Methods in Enzymology,Academic press,New
York,12,partA,p545,(1967)) などを用いて調製するこ
とができる。染色体ＤＮＡのベクタ−ＤＮＡへの組み込
みは、染色体ＤＮＡ及びベクタ−ＤＮＡを制限酵素で切
断した後、両者を混合し、ＤＮＡリガ−ゼで処理するこ
とによっておこなうことができる。制限酵素としてはEc
oRI,BamHI,Sau3AIなどがあげられる。ベクタ−ＤＮＡに
はpUC9, λgt10,Charomid DNA など公知のものを利用で
きる。こうして得た組換え体ＤＮＡは塩化カルシウム
法、in vitroパッケ−ジング法などベクタ−の特徴にし
たがった公知の方法を用いて大腸菌を形質転換すること
ができる。リパ−ゼ活性を有する形質転換株の選択は、
トリブチリン寒天培地上でトリブチリンの加水分解にと
もなうクリア−ゾ−ンを形成する菌株を分離することに
よっておこなわれる。このようにして得られた形質転換
株より、アルカリ法など公知の手法を用いてリパ−ゼ活
性を有すタンパク質をコ−ドする遺伝子を含む組換え体
ＤＮＡを得ることができる。次に形質転換菌において、
リパ−ゼ活性を有すタンパク質の発現に必要な領域は上
記組換え体ＤＮＡを各種制限酵素を用いてサブクロ−ニ
ングし、かかる形質転換株のトリブチリン寒天培地上で
のクリア−ゾ−ン形成能を調べることによって決定でき
る。さらにはリパ−ゼ活性を有すタンパク質をコ−ドす
る遺伝子及びその発現に必要な領域の塩基配列は、ジデ
オキシ(dideoxy) 法(Sanger.F.,et al.Proc.Natl.Acad.
Sci.U.S.A.,74,5463(1977)) など公知の手法を用いて決
定することができる。
クロ−ニング シュ−ドモナス フラジ(Pseudomonas fragi) ＩＦＯ１
２０４９株の染色体ＤＮＡは、例えばSmith らの方法(S
mith,M.G.,Methods in Enzymology,Academic press,New
York,12,partA,p545,(1967)) などを用いて調製するこ
とができる。染色体ＤＮＡのベクタ−ＤＮＡへの組み込
みは、染色体ＤＮＡ及びベクタ−ＤＮＡを制限酵素で切
断した後、両者を混合し、ＤＮＡリガ−ゼで処理するこ
とによっておこなうことができる。制限酵素としてはEc
oRI,BamHI,Sau3AIなどがあげられる。ベクタ−ＤＮＡに
はpUC9, λgt10,Charomid DNA など公知のものを利用で
きる。こうして得た組換え体ＤＮＡは塩化カルシウム
法、in vitroパッケ−ジング法などベクタ−の特徴にし
たがった公知の方法を用いて大腸菌を形質転換すること
ができる。リパ−ゼ活性を有する形質転換株の選択は、
トリブチリン寒天培地上でトリブチリンの加水分解にと
もなうクリア−ゾ−ンを形成する菌株を分離することに
よっておこなわれる。このようにして得られた形質転換
株より、アルカリ法など公知の手法を用いてリパ−ゼ活
性を有すタンパク質をコ−ドする遺伝子を含む組換え体
ＤＮＡを得ることができる。次に形質転換菌において、
リパ−ゼ活性を有すタンパク質の発現に必要な領域は上
記組換え体ＤＮＡを各種制限酵素を用いてサブクロ−ニ
ングし、かかる形質転換株のトリブチリン寒天培地上で
のクリア−ゾ−ン形成能を調べることによって決定でき
る。さらにはリパ−ゼ活性を有すタンパク質をコ−ドす
る遺伝子及びその発現に必要な領域の塩基配列は、ジデ
オキシ(dideoxy) 法(Sanger.F.,et al.Proc.Natl.Acad.
Sci.U.S.A.,74,5463(1977)) など公知の手法を用いて決
定することができる。
【０００６】リパ−ゼ活性を有すタンパク質の生産 上記のようにして得られたリパ−ゼ活性を有すタンパク
質をコ−ドする遺伝子を含むＤＮＡ断片をシュ−ドモナ
ス属細菌内で複製可能なプラスミドベクタ−に公知の接
合伝達法などを用いて導入することにより、リパ−ゼ発
現用組換え体ＤＮＡを構築することができる。このプラ
スミドベクタ−として例えば広域宿主ベクタ−ＲＳＦ１
０１０やＲＳＦ１０１０にカナマイシン耐性遺伝子など
の適当な選択マ−カ−を導入したものなどが利用でき
る。さらにこのようにして得られた組換え体ＤＮＡによ
って形質転換させられたシュ−ドモナス属細菌を酵素生
産に最適の条件下で培養し、リパ−ゼ活性を有すタンパ
ク質を生産させる。そして培養液中のリパ−ゼ活性を測
定することによって、リパ−ゼ活性を有すタンパク質を
分泌発現させるのに最適な宿主シュ−ドモナス属細菌を
得ることができる。このようにして得られるシュ−ドモ
ナス属細菌として、例えばシュ−ドモナス プチダ(Pse
udomonas putida)ＡＣ１０株などが利用できる。またリ
パ−ゼ活性の測定は、市販のリパ−ゼ活性測定キットな
どを用いておこなうことができる。本発明で得られた組
換え体ＤＮＡを導入されたシュ−ドモナスプチダＡＣ１
０株を酵素生産に最適な条件下で培養し、培養液よりリ
パ−ゼ活性を有すタンパク質を分離、精製して得ること
ができる。
質をコ−ドする遺伝子を含むＤＮＡ断片をシュ−ドモナ
ス属細菌内で複製可能なプラスミドベクタ−に公知の接
合伝達法などを用いて導入することにより、リパ−ゼ発
現用組換え体ＤＮＡを構築することができる。このプラ
スミドベクタ−として例えば広域宿主ベクタ−ＲＳＦ１
０１０やＲＳＦ１０１０にカナマイシン耐性遺伝子など
の適当な選択マ−カ−を導入したものなどが利用でき
る。さらにこのようにして得られた組換え体ＤＮＡによ
って形質転換させられたシュ−ドモナス属細菌を酵素生
産に最適の条件下で培養し、リパ−ゼ活性を有すタンパ
ク質を生産させる。そして培養液中のリパ−ゼ活性を測
定することによって、リパ−ゼ活性を有すタンパク質を
分泌発現させるのに最適な宿主シュ−ドモナス属細菌を
得ることができる。このようにして得られるシュ−ドモ
ナス属細菌として、例えばシュ−ドモナス プチダ(Pse
udomonas putida)ＡＣ１０株などが利用できる。またリ
パ−ゼ活性の測定は、市販のリパ−ゼ活性測定キットな
どを用いておこなうことができる。本発明で得られた組
換え体ＤＮＡを導入されたシュ−ドモナスプチダＡＣ１
０株を酵素生産に最適な条件下で培養し、培養液よりリ
パ−ゼ活性を有すタンパク質を分離、精製して得ること
ができる。
【０００７】以下実施例にて本発明を具体的に説明す
る。 実施例 （１）染色体ＤＮＡの調製 シュ−ドモナス フラジ(Pseudomonas fragi) ＩＦＯ１
２０４９株を２００ｍｌのＬＢ培地（１％バクトトリプ
トン、０．５％酵母エキス、０．５％塩化ナトリウム）
で３０℃にて一晩培養した。菌体を集菌し、洗浄した
後、１２ｍｌの５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液(pH8.0)、１
０ｍＭＥＤＴＡ溶液に懸濁した。この懸濁液に１ｍｇの
リゾチ−ムを加え、１時間室温に放置した。この溶液に
０．５％ＳＤＳ存在下、１００μｇ／ｍｌの濃度となる
ようにプロテナ−ゼＫ（メルク製）を加え、３時間５５
℃でゆるやかに振とうさせ菌体を溶菌させた。この試料
をフェノ−ル抽出し、エタノ−ル沈澱することによって
染色体ＤＮＡを調製した。
る。 実施例 （１）染色体ＤＮＡの調製 シュ−ドモナス フラジ(Pseudomonas fragi) ＩＦＯ１
２０４９株を２００ｍｌのＬＢ培地（１％バクトトリプ
トン、０．５％酵母エキス、０．５％塩化ナトリウム）
で３０℃にて一晩培養した。菌体を集菌し、洗浄した
後、１２ｍｌの５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液(pH8.0)、１
０ｍＭＥＤＴＡ溶液に懸濁した。この懸濁液に１ｍｇの
リゾチ−ムを加え、１時間室温に放置した。この溶液に
０．５％ＳＤＳ存在下、１００μｇ／ｍｌの濃度となる
ようにプロテナ−ゼＫ（メルク製）を加え、３時間５５
℃でゆるやかに振とうさせ菌体を溶菌させた。この試料
をフェノ−ル抽出し、エタノ−ル沈澱することによって
染色体ＤＮＡを調製した。
【０００８】（２）リパ−ゼ活性を有すタンパク質をコ
−ドする遺伝子のクロ−ニングと解析 調製した染色体ＤＮＡを制限酵素ＥｃｏＲＩ切断し、ア
ガロ−スゲル中で電気泳動し、その２〜４Ｋｂ断片を回
収した。この回収ＤＮＡ断片をCharomid９−４２（日本
ジ−ン製）のＥｃｏＲＩ部位にＤＮＡリガ−ゼを用いて
連結した。連結したＤＮＡはλDNA インビトロパッケ−
ジングキットGigapack IIPLUS(STRATAGENE製 )を用いて
ファ−ジ粒子として大腸菌ＶＣＳ２５７を感染させ、形
質導入した。この形式転換株を５０μｇ／ｍｌアンピシ
リン、１％トリブチリンを含むＬＢ培地にプレ−ティン
グした。３７℃で２４時間培養した後、約１１００個の
形質転換体より２個のクリア−ゾ−ン形成株を得た。こ
のクリア−ゾ−ン形成株２株よりプラスミドを抽出し、
ＥｃｏＲＩ消化しアガロ−スゲル電気泳動で挿入された
ＤＮＡ断片を解析したところ、２株共に約３．７Ｋｂの
ＥｃｏＲＩ断片が確認された。この３．７Ｋｂ Ｅｃｏ
ＲＩ ＤＮＡ断片をｐＴＶ１１９Ｎ（宝酒造製）のＥｃ
ｏＲＩ部位にサブクロ−ニングしプラスミドｐＣＣＢと
した。図１にｐＣＣＢにおけるＥｃｏＲＩ挿入３．７Ｋ
ｂ ＤＮＡ断片の制限酵素地図を示す。次に、プラスミ
ドｐＣＣＢの３．７Ｋｂ ＥｃｏＲＩ断片を各種制限酵
素で切断し、各ＤＮＡ断片をｐＴＶ１１９Ｎにサブクロ
ーニングして、大腸菌ＭＶ１１８４株を形質転換させ、
前記と同様にしてトリブチリン含有ＬＢ培地でのクリア
ーゾーン形成の有無を調べた。その結果、図１に示した
ようなＥｃｏＲＩ−ＸｈｏＩ２．１Ｋｂ断片を有するプ
ラスミドｐＣＣＢ−ＸＳを有する大腸菌にクリアーゾー
ン形成が認められた。この結果、リパーゼ活性を有する
タンパク質をコードする遺伝子とその発現に必要な領域
が、ＥｃｏＲＩ−ＸｈｏＩ２．１Ｋｂ断片中に存在する
ことが示唆された。
−ドする遺伝子のクロ−ニングと解析 調製した染色体ＤＮＡを制限酵素ＥｃｏＲＩ切断し、ア
ガロ−スゲル中で電気泳動し、その２〜４Ｋｂ断片を回
収した。この回収ＤＮＡ断片をCharomid９−４２（日本
ジ−ン製）のＥｃｏＲＩ部位にＤＮＡリガ−ゼを用いて
連結した。連結したＤＮＡはλDNA インビトロパッケ−
ジングキットGigapack IIPLUS(STRATAGENE製 )を用いて
ファ−ジ粒子として大腸菌ＶＣＳ２５７を感染させ、形
質導入した。この形式転換株を５０μｇ／ｍｌアンピシ
リン、１％トリブチリンを含むＬＢ培地にプレ−ティン
グした。３７℃で２４時間培養した後、約１１００個の
形質転換体より２個のクリア−ゾ−ン形成株を得た。こ
のクリア−ゾ−ン形成株２株よりプラスミドを抽出し、
ＥｃｏＲＩ消化しアガロ−スゲル電気泳動で挿入された
ＤＮＡ断片を解析したところ、２株共に約３．７Ｋｂの
ＥｃｏＲＩ断片が確認された。この３．７Ｋｂ Ｅｃｏ
ＲＩ ＤＮＡ断片をｐＴＶ１１９Ｎ（宝酒造製）のＥｃ
ｏＲＩ部位にサブクロ−ニングしプラスミドｐＣＣＢと
した。図１にｐＣＣＢにおけるＥｃｏＲＩ挿入３．７Ｋ
ｂ ＤＮＡ断片の制限酵素地図を示す。次に、プラスミ
ドｐＣＣＢの３．７Ｋｂ ＥｃｏＲＩ断片を各種制限酵
素で切断し、各ＤＮＡ断片をｐＴＶ１１９Ｎにサブクロ
ーニングして、大腸菌ＭＶ１１８４株を形質転換させ、
前記と同様にしてトリブチリン含有ＬＢ培地でのクリア
ーゾーン形成の有無を調べた。その結果、図１に示した
ようなＥｃｏＲＩ−ＸｈｏＩ２．１Ｋｂ断片を有するプ
ラスミドｐＣＣＢ−ＸＳを有する大腸菌にクリアーゾー
ン形成が認められた。この結果、リパーゼ活性を有する
タンパク質をコードする遺伝子とその発現に必要な領域
が、ＥｃｏＲＩ−ＸｈｏＩ２．１Ｋｂ断片中に存在する
ことが示唆された。
【０００９】（３）塩基配列の決定 ｄｉｄｅｏｘｙ法（F.Sangerら、Proc.Natl.Acad.Sci.
U.S.A.,74,5463,(1977)）により、プラスミドｐＣＣＢ
の挿入ＥｃｏＲＩ３．７ＫｂＤＮＡ断片の塩基配列を決
定した。その結果図１の→で示した領域にオ−プンリ−
ディングフレームが存在した。この遺伝子の塩基配列と
対応するアミノ酸配列表を発明の詳細な説明の最後に示
す。
U.S.A.,74,5463,(1977)）により、プラスミドｐＣＣＢ
の挿入ＥｃｏＲＩ３．７ＫｂＤＮＡ断片の塩基配列を決
定した。その結果図１の→で示した領域にオ−プンリ−
ディングフレームが存在した。この遺伝子の塩基配列と
対応するアミノ酸配列表を発明の詳細な説明の最後に示
す。
【００１０】（４）リパーゼ活性を有するタンパク質の
生産 図２の工程にしたがって発現プラスミドｐＵＣ−ＲＳＦ
ＫｍＣＣＢを構築した。広域宿主ベクターＲＳＦ１０１
０をＰｓｔＩ，ＰｖｕＩＩ消化５．９Ｋｂ断片にｐＵＣ
１９のＰｓｔＩ，ＳｍａＩ消化２．７Ｋｂ断片を連結し
たプラスミドｐＵＣ−ＲＳＦのＰｓｔＩ部位に、ｐＵＣ
４Ｋよりカナマイシン耐性遺伝子を含むＰｓｔＩ１．３
Ｋｂ断片を導入した。このプラスミドをｐＵＣ−ＲＳＦ
Ｋｍとし、このＥｃｏＲＩ部位にｐＣＣＢのＥｃｏＲＩ
３．７Ｋｂ断片を導入し発現プラスミドｐＵＣ−ＲＳＦ
ＫｍＣＣＢを構築した。このプラスミドｐＵＣ−ＲＳＦ
ＫｍＣＣＢをＳｉｍｏｎらの接合伝達法（R.Simon ら、
Biotechnology,1.784.(1983)）を用いＰｓｅｕｄｏｍｏ
ｎａｓ ｐｕｔｉｄａＡＣ１０株に導入した。このＰｓ
ｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａＡＣ１０（ｐＵＣ−
ＲＳＦＫｍＣＣＢ）株を、それぞれ５０μｇ／ｍｌのア
ンピシリンとカナマイシンを含むＬＢ培地で３０℃一晩
培養した。この培養濾液のリパーゼ活性をリパーゼキッ
トＳ（大日本製薬社）を用いて測定した結果、培養濾液
１００μｌあたり２６８ＢＡＬＢ単位であった。同様な
条件測定したＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｒａｇｉ Ｉ
ＦＯ１２０４９株及びＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔ
ｉｄａ ＡＣ株の結果は、培養濾液１００μｌあたりと
もに測定感度下限（５０ＢＡＬＢ単位）以下の値であっ
た。なお測定法及び測定単位の計算法はリパーゼキット
Ｓの方法に従った。
生産 図２の工程にしたがって発現プラスミドｐＵＣ−ＲＳＦ
ＫｍＣＣＢを構築した。広域宿主ベクターＲＳＦ１０１
０をＰｓｔＩ，ＰｖｕＩＩ消化５．９Ｋｂ断片にｐＵＣ
１９のＰｓｔＩ，ＳｍａＩ消化２．７Ｋｂ断片を連結し
たプラスミドｐＵＣ−ＲＳＦのＰｓｔＩ部位に、ｐＵＣ
４Ｋよりカナマイシン耐性遺伝子を含むＰｓｔＩ１．３
Ｋｂ断片を導入した。このプラスミドをｐＵＣ−ＲＳＦ
Ｋｍとし、このＥｃｏＲＩ部位にｐＣＣＢのＥｃｏＲＩ
３．７Ｋｂ断片を導入し発現プラスミドｐＵＣ−ＲＳＦ
ＫｍＣＣＢを構築した。このプラスミドｐＵＣ−ＲＳＦ
ＫｍＣＣＢをＳｉｍｏｎらの接合伝達法（R.Simon ら、
Biotechnology,1.784.(1983)）を用いＰｓｅｕｄｏｍｏ
ｎａｓ ｐｕｔｉｄａＡＣ１０株に導入した。このＰｓ
ｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａＡＣ１０（ｐＵＣ−
ＲＳＦＫｍＣＣＢ）株を、それぞれ５０μｇ／ｍｌのア
ンピシリンとカナマイシンを含むＬＢ培地で３０℃一晩
培養した。この培養濾液のリパーゼ活性をリパーゼキッ
トＳ（大日本製薬社）を用いて測定した結果、培養濾液
１００μｌあたり２６８ＢＡＬＢ単位であった。同様な
条件測定したＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｒａｇｉ Ｉ
ＦＯ１２０４９株及びＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔ
ｉｄａ ＡＣ株の結果は、培養濾液１００μｌあたりと
もに測定感度下限（５０ＢＡＬＢ単位）以下の値であっ
た。なお測定法及び測定単位の計算法はリパーゼキット
Ｓの方法に従った。
【００１１】以上の実施例における菌体からのプラスミ
ド調製や制限酵素などを用いた反応及びＤＮＡ断片の処
理は、特に指定されている以外は通常用いられる方法に
よって行った。また制限酵素類、ＤＮＡリガーゼなどは
宝酒造社と日本ジーンのものを使用した。なお本発明に
おける配列表は以下の通りである。 配列表 配列番号：１ 配列の長さ：１６２６ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ ＨＹＰＯＴＨＥＴＩＣＡＬ：ＹＥＳ 起源 生物名：Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｒａｇｉ 株名：ＩＦＯ１２０４９ ATG AAA CAT TTA ATA CAG TTT GTT TTG CTA ATG TCT GCG CCC CAA ACA Met Lys His Leu Ile Gln Phe Val Leu Leu Met Ser Ala Pro Gln Thr ACA AAA ACA GGT CAT CAC ATG CGC AGG CTC TCC CTA CTC ATC CCT TGG Thr Lys Thr Gly His His Met Arg Arg Leu Ser Leu Leu Ile Pro Trp CGG GGA TGC ATC CTG TCC ATC GTC AGT GAA CGT GCC ATA GCA GCA CCC Arg Gly Cys Ile Leu Ser Ile Val Ser Glu Arg Ala Ile Ala Ala Pro TCG CCG TAT TCC ACC ATG ATC GTG TTC GGC GAC AGC CTG AGC GAC TCG Ser Pro Tyr Ser Thr Met Ile Val Phe Gly Asp Ser Leu Ser Asp Ser GGG CAT TTT CCA GGG GTC GGC ACA GGC ATG CGC TTC ACC AAC CGC ACC Gly His Phe Pro Gly Val Gly Thr Gly Met Arg Phe Thr Asn Arg Thr GGG CCG ACG TAC AGG GAT TAC CGG GGG GAG GAA TAT GCT GCA GTA ACG Gly Pro Thr Tyr Arg Asp Tyr Arg Gly Glu Glu Tyr Ala Ala Val Thr CCC ACG CGG CTG GGC ACC CAA CTG GGG ATC GCC CCC GCA GAC CTG CGC Pro Thr Arg Leu Gly Thr Gln Leu Gly Ile Ala Pro Ala Asp Leu Arg CCG TCC ACT TCG CCG GGC AAC TCT CTT GCA GGG GAG CCC GAC GGC AAC Pro Ser Thr Ser Pro Gly Asn Ser Leu Ala Gly Glu Pro Asp Gly Asn AAC TGG GCG GTC GGC GGC TAT CGC ACA GAC CAG ATC CTC AAT TCC ATC Asn Trp Ala Val Gly Gly Tyr Arg Thr Asp Gln Ile Leu Asn Ser Ile AAG ACC GAG TCA AAG GTC GCC ATC CCG GAT GAC TGG TCC TTC GTC GGC Lys Thr Glu Ser Lys Val Ala Ile Pro Asp Asp Trp Ser Phe Val Gly GGC TAC GTC CTG CGC AGC AAG CCT GGC TAC CTT GTG CAG AAC AGC TTC Gly Tyr Val Leu Arg Ser Lys Pro Gly Tyr Leu Val Gln Asn Ser Phe ACG GCT GAC CCC AAG GCG TTG TAT TTC ATT TCA GGC GGC GGT AAT GAC Thr Ala Asp Pro Lys Ala Leu Tyr Phe Ile Ser Gly Gly Gly Asn Asp TTT CTC CAA GGC AAG GTC ACC AAC CCC GCC GAG GCA GGC CAA GCC GCA Phe Leu Gln Gly Lys Val Thr Asn Pro Ala Glu Ala Gly Gln Ala Ala CAA AGG CTG GCG GCA AGC GCC CAC ACC CTG CAA CAG GCA GGG GCA CGC Gln Arg Leu Ala Ala Ser Ala His Thr Leu Gln Gln Ala Gly Ala Arg TAC ATC ATG GTC TGG CTG CTG CCC GAT CTG GGC CTG ACG CCA GCC GTT Tyr Ile Met Val Trp Leu Leu Pro Asp Leu Gly Leu Thr Pro Ala Val TAC GGT ACA CCC ACC CAG GCT GGC ACC AGC GCC CTG AGC GCC CTG TTC Tyr Gly Thr Pro Thr Gln Ala Gly Thr Ser Ala Leu Ser Ala Leu Phe AAT CAT GAG CTA ACC CAG CAA CTG GCG CAG ATA GAC GCC GAA GTG ATT Asn His Glu Leu Thr Gln Gln Leu Ala Gln Ile Asp Ala Glu Val Ile CCC CTC AAT ATC CCG CTG CTG CTG CGT GAA GCC ATC GCC GAC CCC GCC Pro Leu Asn Ile Pro Leu Leu Leu Arg Glu Ala Ile Ala Asp Pro Ala CGT TAT GGC CTG GCA CTG GGG CAG GAC CTT GTC GCG ACC TGT TTC AAT Arg Tyr Gly Leu Ala Leu Gly Gln Asp Leu Val Ala Thr Cys Phe Asn GGC GAA GAG TGT ACG GAA AAC CCG CAG TAC GGA CTC AAC AGC GCA ACC Gly Glu Glu Cys Thr Glu Asn Pro Gln Tyr Gly Leu Asn Ser Ala Thr CCC AAC CCG GCC AAA CTG CTA TTC AAC GAC TCG GTA CAC CCC ACC GAG Pro Asn Pro Ala Lys Leu Leu Phe Asn Asp Ser Val His Pro Thr Glu ACA GGG CAA CAG CTG ATT GCC GAC TAT GCC TAC TCA TTG CTG GCC GTG Thr Gly Gln Gln Leu Ile Ala Asp Tyr Ala Tyr Ser Leu Leu Ala Val CCG TGG GAG CTG ACC TTG TTA CCC GTT ATG GCC CAA GGC TCG CTC AAC Pro Trp Glu Leu Thr Leu Leu Pro Val Met Ala Gln Gly Ser Leu Asn GCC CAT CAA GAC CAG TTG CGC AAC CAA TGG GCT GGC GAC GAC GGT CAA Ala His Gln Asp Gln Leu Arg Asn Gln Trp Ala Gly Asp Asp Gly Gln TGG CAA GCC ATT GGC CAG TGG CGA ACC CTG CTC GCC GGT GGC GGG CAA Trp Gln Ala Ile Gly Gln Trp Arg Thr Leu Leu Ala Gly Gly Gly Gln CGC CTG GAA ATC GAC AAG CAG ACC ACG GCC GTG AAG GCA GAT GGC AAA Arg Leu Glu Ile Asp Lys Gln Thr Thr Ala Val Lys Ala Asp Gly Lys GGC TAT AAC CTC AAT ATC GGC ACC AGC TAC AGG CTG GAT GAC AAC TGG Gly Tyr Asn Leu Asn Ile Gly Thr Ser Tyr Arg Leu Asp Asp Asn Trp CGA TTT GGC ATT GCC GGC GGG TTT TAC CGG CAA CGC CTG GAA ACC GGG Arg Phe Gly Ile Ala Gly Gly Phe Tyr Arg Gln Arg Leu Glu Thr Gly GCC AAT AAA TCG GAC TAC AAG CTC AAC AGC TAT CTG GGT AGC GTG TTT Ala Asn Lys Ser Asp Tyr Lys Leu Asn Ser Tyr Leu Gly Ser Val Phe GCC CAA TAC CAG CAC AAT CAC TGG TGG GGG GAT GCG GCA CTG ACG TTG Ala Gln Tyr Gln His Asn His Trp Trp Gly Asp Ala Ala Leu Thr Leu GGC AGG CTG GAT TAC GAC AGC CTG AAA CGA AAA TTC GCG CTT GGG GTG Gly Arg Leu Asp Tyr Asp Ser Leu Lys Arg Lys Phe Ala Leu Gly Val GGT AGT GAT ATG GAG CAA GGC CAG GCT GAC GGC CAT TTG CGA GCA TTG Gly Ser Asp Met Glu Gln Gly Gln Ala Asp Gly His Leu Arg Ala Leu GTA CAC GCC TGG GTT ATG AAA TCG CAC AGG CAT CTG ACC TGT GGC AGC Val His Ala Trp Val Met Lys Ser His Arg His Leu Thr Cys Gly Ser TCT CCC CCT TTA TCA GCG CCG TTA CTC GCG GGT GGA AGT TAA Ser Pro Pro Leu Ser Ala Pro Leu Leu Ala Gly Gly Ser ***
ド調製や制限酵素などを用いた反応及びＤＮＡ断片の処
理は、特に指定されている以外は通常用いられる方法に
よって行った。また制限酵素類、ＤＮＡリガーゼなどは
宝酒造社と日本ジーンのものを使用した。なお本発明に
おける配列表は以下の通りである。 配列表 配列番号：１ 配列の長さ：１６２６ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ ＨＹＰＯＴＨＥＴＩＣＡＬ：ＹＥＳ 起源 生物名：Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｒａｇｉ 株名：ＩＦＯ１２０４９ ATG AAA CAT TTA ATA CAG TTT GTT TTG CTA ATG TCT GCG CCC CAA ACA Met Lys His Leu Ile Gln Phe Val Leu Leu Met Ser Ala Pro Gln Thr ACA AAA ACA GGT CAT CAC ATG CGC AGG CTC TCC CTA CTC ATC CCT TGG Thr Lys Thr Gly His His Met Arg Arg Leu Ser Leu Leu Ile Pro Trp CGG GGA TGC ATC CTG TCC ATC GTC AGT GAA CGT GCC ATA GCA GCA CCC Arg Gly Cys Ile Leu Ser Ile Val Ser Glu Arg Ala Ile Ala Ala Pro TCG CCG TAT TCC ACC ATG ATC GTG TTC GGC GAC AGC CTG AGC GAC TCG Ser Pro Tyr Ser Thr Met Ile Val Phe Gly Asp Ser Leu Ser Asp Ser GGG CAT TTT CCA GGG GTC GGC ACA GGC ATG CGC TTC ACC AAC CGC ACC Gly His Phe Pro Gly Val Gly Thr Gly Met Arg Phe Thr Asn Arg Thr GGG CCG ACG TAC AGG GAT TAC CGG GGG GAG GAA TAT GCT GCA GTA ACG Gly Pro Thr Tyr Arg Asp Tyr Arg Gly Glu Glu Tyr Ala Ala Val Thr CCC ACG CGG CTG GGC ACC CAA CTG GGG ATC GCC CCC GCA GAC CTG CGC Pro Thr Arg Leu Gly Thr Gln Leu Gly Ile Ala Pro Ala Asp Leu Arg CCG TCC ACT TCG CCG GGC AAC TCT CTT GCA GGG GAG CCC GAC GGC AAC Pro Ser Thr Ser Pro Gly Asn Ser Leu Ala Gly Glu Pro Asp Gly Asn AAC TGG GCG GTC GGC GGC TAT CGC ACA GAC CAG ATC CTC AAT TCC ATC Asn Trp Ala Val Gly Gly Tyr Arg Thr Asp Gln Ile Leu Asn Ser Ile AAG ACC GAG TCA AAG GTC GCC ATC CCG GAT GAC TGG TCC TTC GTC GGC Lys Thr Glu Ser Lys Val Ala Ile Pro Asp Asp Trp Ser Phe Val Gly GGC TAC GTC CTG CGC AGC AAG CCT GGC TAC CTT GTG CAG AAC AGC TTC Gly Tyr Val Leu Arg Ser Lys Pro Gly Tyr Leu Val Gln Asn Ser Phe ACG GCT GAC CCC AAG GCG TTG TAT TTC ATT TCA GGC GGC GGT AAT GAC Thr Ala Asp Pro Lys Ala Leu Tyr Phe Ile Ser Gly Gly Gly Asn Asp TTT CTC CAA GGC AAG GTC ACC AAC CCC GCC GAG GCA GGC CAA GCC GCA Phe Leu Gln Gly Lys Val Thr Asn Pro Ala Glu Ala Gly Gln Ala Ala CAA AGG CTG GCG GCA AGC GCC CAC ACC CTG CAA CAG GCA GGG GCA CGC Gln Arg Leu Ala Ala Ser Ala His Thr Leu Gln Gln Ala Gly Ala Arg TAC ATC ATG GTC TGG CTG CTG CCC GAT CTG GGC CTG ACG CCA GCC GTT Tyr Ile Met Val Trp Leu Leu Pro Asp Leu Gly Leu Thr Pro Ala Val TAC GGT ACA CCC ACC CAG GCT GGC ACC AGC GCC CTG AGC GCC CTG TTC Tyr Gly Thr Pro Thr Gln Ala Gly Thr Ser Ala Leu Ser Ala Leu Phe AAT CAT GAG CTA ACC CAG CAA CTG GCG CAG ATA GAC GCC GAA GTG ATT Asn His Glu Leu Thr Gln Gln Leu Ala Gln Ile Asp Ala Glu Val Ile CCC CTC AAT ATC CCG CTG CTG CTG CGT GAA GCC ATC GCC GAC CCC GCC Pro Leu Asn Ile Pro Leu Leu Leu Arg Glu Ala Ile Ala Asp Pro Ala CGT TAT GGC CTG GCA CTG GGG CAG GAC CTT GTC GCG ACC TGT TTC AAT Arg Tyr Gly Leu Ala Leu Gly Gln Asp Leu Val Ala Thr Cys Phe Asn GGC GAA GAG TGT ACG GAA AAC CCG CAG TAC GGA CTC AAC AGC GCA ACC Gly Glu Glu Cys Thr Glu Asn Pro Gln Tyr Gly Leu Asn Ser Ala Thr CCC AAC CCG GCC AAA CTG CTA TTC AAC GAC TCG GTA CAC CCC ACC GAG Pro Asn Pro Ala Lys Leu Leu Phe Asn Asp Ser Val His Pro Thr Glu ACA GGG CAA CAG CTG ATT GCC GAC TAT GCC TAC TCA TTG CTG GCC GTG Thr Gly Gln Gln Leu Ile Ala Asp Tyr Ala Tyr Ser Leu Leu Ala Val CCG TGG GAG CTG ACC TTG TTA CCC GTT ATG GCC CAA GGC TCG CTC AAC Pro Trp Glu Leu Thr Leu Leu Pro Val Met Ala Gln Gly Ser Leu Asn GCC CAT CAA GAC CAG TTG CGC AAC CAA TGG GCT GGC GAC GAC GGT CAA Ala His Gln Asp Gln Leu Arg Asn Gln Trp Ala Gly Asp Asp Gly Gln TGG CAA GCC ATT GGC CAG TGG CGA ACC CTG CTC GCC GGT GGC GGG CAA Trp Gln Ala Ile Gly Gln Trp Arg Thr Leu Leu Ala Gly Gly Gly Gln CGC CTG GAA ATC GAC AAG CAG ACC ACG GCC GTG AAG GCA GAT GGC AAA Arg Leu Glu Ile Asp Lys Gln Thr Thr Ala Val Lys Ala Asp Gly Lys GGC TAT AAC CTC AAT ATC GGC ACC AGC TAC AGG CTG GAT GAC AAC TGG Gly Tyr Asn Leu Asn Ile Gly Thr Ser Tyr Arg Leu Asp Asp Asn Trp CGA TTT GGC ATT GCC GGC GGG TTT TAC CGG CAA CGC CTG GAA ACC GGG Arg Phe Gly Ile Ala Gly Gly Phe Tyr Arg Gln Arg Leu Glu Thr Gly GCC AAT AAA TCG GAC TAC AAG CTC AAC AGC TAT CTG GGT AGC GTG TTT Ala Asn Lys Ser Asp Tyr Lys Leu Asn Ser Tyr Leu Gly Ser Val Phe GCC CAA TAC CAG CAC AAT CAC TGG TGG GGG GAT GCG GCA CTG ACG TTG Ala Gln Tyr Gln His Asn His Trp Trp Gly Asp Ala Ala Leu Thr Leu GGC AGG CTG GAT TAC GAC AGC CTG AAA CGA AAA TTC GCG CTT GGG GTG Gly Arg Leu Asp Tyr Asp Ser Leu Lys Arg Lys Phe Ala Leu Gly Val GGT AGT GAT ATG GAG CAA GGC CAG GCT GAC GGC CAT TTG CGA GCA TTG Gly Ser Asp Met Glu Gln Gly Gln Ala Asp Gly His Leu Arg Ala Leu GTA CAC GCC TGG GTT ATG AAA TCG CAC AGG CAT CTG ACC TGT GGC AGC Val His Ala Trp Val Met Lys Ser His Arg His Leu Thr Cys Gly Ser TCT CCC CCT TTA TCA GCG CCG TTA CTC GCG GGT GGA AGT TAA Ser Pro Pro Leu Ser Ala Pro Leu Leu Ala Gly Gly Ser ***
【図１】プラスミドｐＣＣＢ挿入ＥｃｏＲＩ３．７Ｋｂ
断片の制限酵素地図の一例とクリアーゾーン形成の有無
を指標とした欠失実験の結果を示した説明図である。＋
はクリアーゾーン形成を示す。
断片の制限酵素地図の一例とクリアーゾーン形成の有無
を指標とした欠失実験の結果を示した説明図である。＋
はクリアーゾーン形成を示す。
【図２】リパーゼ活性を有すタンパク質の発現プラスミ
ドｐＵＣ−ＲＳＦＫｍＣＣＢの構築図を示した説明図で
ある。
ドｐＵＣ−ＲＳＦＫｍＣＣＢの構築図を示した説明図で
ある。
Claims (6)
- 【請求項１】 下記の塩基配列を有することを特徴とす
るシュ−ドモナス(Pseudomonas) 属細菌由来のリパ−ゼ
活性を有すタンパク質をコ−ドする遺伝子。 10 20 30 40 50 60 5'ATGAAACATT TAATACAGTT TGTTTTGCTA ATGTCTGCGC CCCAAACAAC AAAAACAGGT 70 80 90 100 110 120 CATCACATGC GCAGGCTCTC CCTACTCATC CCTTGGCGGG GATGCATCCT GTCCATCGTC 130 140 150 160 170 180 AGTGAACGTG CCATAGCAGC ACCCTCGCCG TATTCCACCA TGATCGTGTT CGGCGACAGC 190 200 210 220 230 240 CTGAGCGACT CGGGGCATTT TCCAGGGGTC GGCACAGGCA TGCGCTTCAC CAACCGCACC 250 260 270 280 290 300 GGGCCGACGT ACAGGGATTA CCGGGGGGAG GAATATGCTG CAGTAACGCC CACGCGGCTG 310 320 330 340 350 360 GGCACCCAAC TGGGGATCGC CCCCGCAGAC CTGCGCCCGT CCACTTCGCC GGGCAACTCT 370 380 390 400 410 420 CTTGCAGGGG AGCCCGACGG CAACAACTGG GCGGTCGGCG GCTATCGCAC AGACCAGATC 430 440 450 460 470 480 CTCAATTCCA TCAAGACCGA GTCAAAGGTC GCCATCCCGG ATGACTGGTC CTTCGTCGGC 490 500 510 520 530 540 GGCTACGTCC TGCGCAGCAA GCCTGGCTAC CTTGTGCAGA ACAGCTTCAC GGCTGACCCC 550 560 570 580 590 600 AAGGCGTTGT ATTTCATTTC AGGCGGCGGT AATGACTTTC TCCAAGGCAA GGTCACCAAC 610 620 630 640 650 660 CCCGCCGAGG CAGGCCAAGC CGCACAAAGG CTGGCGGCAA GCGCCCACAC CCTGCAACAG 670 680 690 700 710 720 GCAGGGGCAC GCTACATCAT GGTCTGGCTG CTGCCCGATC TGGGCCTGAC GCCAGCCGTT 730 740 750 760 770 780 TACGGTACAC CCACCCAGGC TGGCACCAGC GCCCTGAGCG CCCTGTTCAA TCATGAGCTA 790 800 810 820 830 840 ACCCAGCAAC TGGCGCAGAT AGACGCCGAA GTGATTCCCC TCAATATCCC GCTGCTGCTG 850 860 870 880 890 900 CGTGAAGCCA TCGCCGACCC CGCCCGTTAT GGCCTGGCAC TGGGGCAGGA CCTTGTCGCG 910 920 930 940 950 960 ACCTGTTTCA ATGGCGAAGA GTGTACGGAA AACCCGCAGT ACGGACTCAA CAGCGCAACC 970 980 990 1000 1010 1020 CCCAACCCGG CCAAACTGCT ATTCAACGAC TCGGTACACC CCACCGAGAC AGGGCAACAG 1030 1040 1050 1060 1070 1080 CTGATTGCCG ACTATGCCTA CTCATTGCTG GCCGTGCCGT GGGAGCTGAC CTTGTTACCC 1090 1100 1110 1120 1130 1140 GTTATGGCCC AAGGCTCGCT CAACGCCCAT CAAGACCAGT TGCGCAACCA ATGGGCTGGC 1150 1160 1170 1180 1190 1200 GACGACGGTC AATGGCAAGC CATTGGCCAG TGGCGAACCC TGCTCGCCGG TGGCGGGCAA 1210 1220 1230 1240 1250 1260 CGCCTGGAAA TCGACAAGCA GACCACGGCC GTGAAGGCAG ATGGCAAAGG CTATAACCTC 1270 1280 1290 1300 1310 1320 AATATCGGCA CCAGCTACAG GCTGGATGAC AACTGGCGAT TTGGCATTGC CGGCGGGTTT 1330 1340 1350 1360 1370 1380 TACCGGCAAC GCCTGGAAAC CGGGGCCAAT AAATCGGACT ACAAGCTCAA CAGCTATCTG 1390 1400 1410 1420 1430 1440 GGTAGCGTGT TTGCCCAATA CCAGCACAAT CACTGGTGGG GGGATGCGGC ACTGACGTTG 1450 1460 1470 1480 1490 1500 GGCAGGCTGG ATTACGACAG CCTGAAACGA AAATTCGCGC TTGGGGTGGG TAGTGATATG 1510 1520 1530 1540 1550 1560 GAGCAAGGCC AGGCTGACGG CCATTTGCGA GCATTGGTAC ACGCCTGGGT TATGAAATCG 1570 1580 1590 1600 1610 1620 CACAGGCATC TGACCTGTGG CAGCTCTCCC CCTTTATCAG CGCCGTTACT CGCGGGTGGA AGTTAA 3' - 【請求項２】 シュ−ドモナス属細菌がシュ−ドモナス
フラジ(Pseudomonas fragi) ＩＦＯ１２０４９株であ
る請求項第１項記載の遺伝子。 - 【請求項３】 請求項第１項、２項で確認されたリパ−
ゼ活性を有すタンパク質をコ−ドする遺伝子をグラム陰
性菌広域宿主ベクタ−に組み込んでなるシュ−ドモナス
属細菌で複製可能な組換え体ＤＮＡ。 - 【請求項４】 請求項第３項記載の組換え体ＤＮＡによ
って形質転換されたシュ−ドモナス属細菌。 - 【請求項５】 請求項第３項記載の組換え体ＤＮＡを用
いることを特徴とするリパ−ゼ活性を有すタンパク質の
製造法。 - 【請求項６】 請求項第４項記載のシュ−ドモナス属細
菌を培養しリパ−ゼ活性を有すタンパク質を培養液中に
産生せしめ、該培養液中より回収することを特徴とする
リパ−ゼ活性を有すタンパク質の製造法。
Priority Applications (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP18309392A JPH0687A (ja) | 1992-06-17 | 1992-06-17 | リパ−ゼ活性を有すタンパク質をコ−ドする遺伝子及びその製造法 |
| SG1996002647A SG47524A1 (en) | 1992-06-17 | 1993-06-15 | A gene coding a protein having a lipase activity and a process for producing the same |
| EP19930109539 EP0576899B1 (en) | 1992-06-17 | 1993-06-15 | A gene coding a protein having a lipase activity and a process for producing the same |
| DE69320555T DE69320555D1 (de) | 1992-06-17 | 1993-06-15 | Gen, das für ein Protein mit Lipase-Aktivität kodiert und Verfahren zur Herstellung |
| DK93109539T DK0576899T3 (da) | 1992-06-17 | 1993-06-15 | Gen, som koder for et protein med lipaseaktivitet, og fremgangsmåde til fremstilling deraf |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP18309392A JPH0687A (ja) | 1992-06-17 | 1992-06-17 | リパ−ゼ活性を有すタンパク質をコ−ドする遺伝子及びその製造法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0687A true JPH0687A (ja) | 1994-01-11 |
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Family Applications (1)
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Family Cites Families (3)
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| DE3887656T2 (de) * | 1987-12-03 | 1994-06-16 | Chisso Corp | Lipasegen. |
| JP3079276B2 (ja) * | 1988-02-28 | 2000-08-21 | 天野製薬株式会社 | 組換え体ｄｎａ、それを含むシュードモナス属菌及びそれを用いたリパーゼの製造法 |
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-
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- 1993-06-15 SG SG1996002647A patent/SG47524A1/en unknown
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|---|---|---|---|---|
| DE102022103663A1 (de) | 2021-02-26 | 2022-09-01 | Kel Corporation | Schwimmender steckverbinder |
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| EP0576899B1 (en) | 1998-08-26 |
| DE69320555D1 (de) | 1998-10-01 |
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| DK0576899T3 (da) | 1999-02-22 |
| EP0576899A1 (en) | 1994-01-05 |
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