DE3108152C2

DE3108152C2 -

Info

Publication number: DE3108152C2
Application number: DE3108152A
Authority: DE
Inventors: Toshizo Mitaka Tokio/Tokyo Jp Sakurai; Toshiyuki Tachikawa Tokio/Tokyo Jp Kosaka
Original assignee: Yakult Honsha Co Ltd
Current assignee: Yakult Honsha Co Ltd
Priority date: 1980-04-02
Filing date: 1981-03-04
Publication date: 1987-06-11
Also published as: GB2073202A; FR2479850B1; US4542099A; GB2073202B; JPS56140888A; CH655947A5; DE3108152A1; FR2479850A1

Description

Gegenstand der Erfindung sind bestimmte Restriktionsenzyme von bestimmten Bifidusbakterien und ein Verfahren zu ihrer Gewinnung.

Restriktionsenzyme sind Endonucleasen, die bestimmte Nucleotidsequenzen an doppelsträngigen Desoxyribonucleinsäuren (DNA) erkennen und die DNA an oder nahe bei diesen Sequenzen schneiden, wobei einzelne DNA-Bruchstücke erhalten werden.

Seit der Entdeckung eines Restriktionsenzyms in Haemophilus influenzae wurde eine Anzahl von Restriktionsenzymen aus einer Vielzahl von Bakterien isoliert; vgl. R. J. Roberts, Gene 8 (1980), S. 329-343.

Wegen ihrer einzigartigen Eigenschaft, DNA an bestimmten Stellen zu schneiden, haben sich diese Enzyme in einer Vielzahl von Anwendungsmöglichkeiten bei der DNA-Rekombinationstechnologie als wertvoll erwiesen, beispielsweise bei der Aufstellung physikalischer Genkarten, DNA-Sequenzanalysen, Genisolierung und Klonierungs-Verfahren.

Zwar sind zahlreiche Restriktionsenzyme mit unterschiedlicher Spezifität bekannt. Trotzdem besteht nach wie vor Bedarf an neuen Spezifitäten, um DNA-Moleküle weiter zu charakterisieren und die Klonierung von DNA-Molekülen in vitro (Aufbau neuer DNA) zu ermöglichen. Außerdem wird nach besseren Quellen für einige der bekannten Enzyme zur praktischen Verwendung gesucht.

Bei der Untersuchung zahlreicher Arten von nicht pathogenen Bakterien des Verdauungsstraktes auf die Anwesenheit von Restriktionsenzymen wurde festgestellt, daß Bifidusbakterien eine Anzahl dieser Enzyme mit vorteilhaften Eigenschaften für eine praktische Verwendung erzeugen.

Bifidusbakterien können leicht in großem Maßstab gezüchtet werden und die Enzyme können einfach gereinigt werden, da sie bemerkenswert stabil sind und störende Nucleaseaktivitäten in den rohen Extrakten nur in geringem Maße vorhanden sind.

Unter den Bifidusbakterien, die auf Restriktionsenzyme geprüft wurden, zeigten zwei Enzymaktivität. Diese Stämme sind nachstehend aufgeführt.

B.bifidum YIT4007FERM BP-791 und B.breve YIT4006FERM BP-752.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, bestimmte Restriktionsenzyme und ein Verfahren zu ihrer Herstellung zu schaffen. Diese Aufgabe wird gemäß den Patentansprüchen 1 bis 4 gelöst.

Die Kultivierung eines erfindungsgemäßen Restriktionsenzym erzeugenden Stammes kann auf jede übliche Art in jedem herkömmlichen Medium durchgeführt werden. Das Kultivierungsverfahren und das verwendete Medium sind deshalb nicht kritisch und unterliegen keiner besonderen Begrenzung.

Zur Gewinnung der Restriktionsenzyme aus Bifidusbakterien werden die Zellen bei 37°C in einem geeigneten anaeroben Medium bis zur frühen stationären Phase kultiviert. Dies bedeutet, daß die Kultur nicht besonders sorgfältig überwacht werden muß. Die Zellen werden dann durch Zentrifugieren geerntet und bei -20°C bis zur Verwendung aufbewahrt.

Ein typisches Verfahren zur Reinigung von Restriktionsenzymen aus Bifidusbakterien wird nachstehend beschrieben:

Die gefrorenen Zellproben werden aufgetaut und in 4 Volumen 10 mmol K₂HPO₄-KH₂PO₄, pH-Wert 7,0, 7 mmol 2-Mercaptoäthanol und 1 mmol EDTA (Äthylendiamintetraacetat) (Puffer A) mit einem Gehalt von 25 µg Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF), 1 mmol NaN₃ und 0,4 mol NaCl/l suspendiert.

Hierauf wird die Zellsuspension auf Eis mit 100 µg/ml Lysozym behandelt um die Zellen gegen Ultraschall empfindlich zu machen. Die Behandlung mit Ultraschall wird dann durchgeführt, bis mehr als 90% der Zellen aufgebrochen sind. Dabei wird darauf geachtet, daß die Temperatur unter 10°C bleibt. Alle weiteren Verfahrensschritte werden unter 5°C durchgeführt.

Die mit Ultraschall behandelte Zellsuspension wird 1 Stunde bei 100 000 g zentrifugiert und der Überstand abdekantiert. Anschließend wird eine 10% (Gewicht/Volumen) Lösung von Streptomycinsulfat langsam bis auf eine Endkonzentration von 1,2% zugesetzt. Nach mindestens 30 Minuten Rühren werden die ausgeschiedenen Nucleinsäuren durch Zentrifugieren bei niedriger Geschwindigkeit entfernt.

Der DNA-freie Überstand wird mit Ammoniumsulfat fraktioniert und die Restriktionsenzym-Aktivität enthaltenden Fraktionen werden durch Kombinationen von Gelfiltration, Ionenaustausch- und Affinitätschromatographie weiter gereinigt. Überlicherweise sind zwei oder drei Säulenchromatographieschritte ausreichend, um ein teilweise gereinigtes Enzym zu erhalten, das im wesentlichen frei von Nucleasen als Verunreinigung ist.

Die durch Reinigung aus Bifidusbakterien gewonnenen Restriktionsenzyme haben einige gemeinsame Eigenschaften. Eine ihrer vorteilhaften Eigenschaften ist die bemerkenswerte Stabilität. Deshalb können diese Enzyme ohne nennenswerten Verlust an Aktivität in Abwesenheit von Glycerin oder Serumalbumin gereinigt werden.

Wie erwähnt, zeigen acht von fünfzehn Stämmen aus neun Arten, die untersucht wurden, Restriktionsenzym-Aktivität. Diese Enzyme wurden nach der Nomenklatur von Smith and Nathans (1973) benannt. Die Enzyme sind in nachstehender Tabelle I aufgeführt. Bisher wurden noch nicht alle diese Enzyme vollständig gereinigt und charakterisiert. Einige allgemeine Eigenschaften wurden jedoch bereits an den teilweise gereinigten Enzymen festgestellt.

(1) Substratspezifizität

Restriktionsenzyme von acht Stämmen von Bifidusbakterien wurden auf ihre Substratspezifizität bei Standard DNA's geprüft. Folgenden DNA's wurden verwendet:
E. coli Phage λ -DNA, E. coli Phage ϕ X174 RFI DNA, Animal Virus Adenovirus Typ 2 DNA und Animal Virus SV40 DNA. Die durch die Enzyme erzeugten Fragmente dieser DNA's werden durch Elektrophorese auf Agarosegel analysiert. Die Fragment-Muster werden unter UV-Licht photographiert. Aus nachstehender Tabelle II ist zu sehen, daß diese Enzyme in ihrer Substratspezifizität verschieden zu sein scheinen.

(2) pH-Optimum

Das pH-Optimum dieser Enzyme liegt zwischen pH 6,8 und 8,0.

(3) Optimale Temperatur

Die optimale Temperatur für diese Enzyme liegt um 37°C.

(4) Hemmung, Aktivierung und Stabilisierung

Die Anwesenheit vom Mg²⁺ ist wesentlich, dagegen wird aber weder Adenosintriphosphat noch S-Adenoxylmethionin benötigt. Einwertige Kationen sind nicht erforderlich und hemmen die Enzymaktivität bei höherer Konzentration.

Tabelle I

P:TAB

Tabelle II

Restriktionsenzyme in Bifidusbakterien

Die Beispiele erläutern die Erfindung.

Beispiel 1

Ein Stamm Bifidobacterium breve YIT 4006 (FERM BP-752) wird auf einem modifizierten VL-G Medium (Azuma und Suto, 1970) gezüchtet, das nach der modifizierten Hungate-Methode hergestellt wurde (Azuma und Suto, 1970; Hungate, 1969). Das modifizierte VL-G Medium enthält in 1 Liter:
75 ml 0,1% K₂HPO₄ (Salzlösung I), 75 ml Salzlösung II, bestehend aus 0,6% KH₂PO₄, 1,2% (NH₄)₂SO₄, 1,2% NaCl, 0,12% MgSO₄ · 7 H₂O und 0,12% CaCl₂ · 2 H₂O, 0,1 ml 0,1% Resazulin, 1 g Trypticase, 0,5 g Hefeextrakt, 0,2 g Fleischextrakt, 0,5 g Glucose, 5 ml 8% Na₂CO₃, 1 ml 3% Cystein-HCl und 790 ml destilliertes Wasser.

Für die Herstellung in kleinem Maßstab wird modifiziertes VL-G Medium (6 × 1 Liter) mit 1/250 Volumen der über Nacht gezüchteten Kultur von B. breve überimpft. Die Zellen werden dann etwa 15 Stunden bei 37°C bis zur frühen stationären Phase gezüchtet, durch Zentrifugieren geerntet und bei -20°C gelagert. Die Ausbeute beträgt etwa 35 g.

Der DNA-freie Zellextrakt wird in der vorstehend beschriebenen Weise erhalten. Der DNA-freie Extrakt wird sodann innerhalb von 30 Minuten mit festem Ammoniumsulfat versetzt.

Die aktiven Fraktionen werden vereinigt und gegen 3× gewechselte Pufferlösung von 10 mmol Tris-HCl/l, pH 7,4, 7 mmol 2-Mercaptoäthanol/l und 1 mmol EDTA/l (Puffer B) dialysiert. Hierauf wird das Produkt auf eine Whatman DEAE-Cellulose DE-52-Säule (1,0 × 20 cm) aufgebracht, die vorher mit Puffer B äquilibriert wurde. Nach dem Waschen mit 30 ml Puffer wird die Säule mit 150 ml linearem Gradienten von 0 bis 0,5 mol NaCl/l eluiert. Die Enzymaktivität enthaltenden Fraktionen, die bei 0,25 bis 0,35 mol NaCl/l eluiert werden, werden vereinigt, gegen Puffer B mit einem Gehalt von 0,25 mol NaCl/l dialysiert und danach auf eine Heparin-Sepharose CL-6B Säule (1,0 × 7 cm) aufgebracht, die vorher mit dem gleichen Puffer äquilibriert wurde. Nach dem Waschen wird die Säule mit 60 ml linearem Gradienten von NaCl in Puffer B entwickelt. Die Enzymaktivität wird bei 0,4 bis 0,5 mol NaCl/l eluiert. Die aktiven Fraktionen werden wieder vereinigt, durch Dialyse gegen Puffer B, der 50% Glycerin enthält, konzentriert und bei -20°C aufbewahrt.

Nach der Inkubation mit überschüssigem Enzym über längere Zeit ergibt der BthI-Verdau von λ -DNA scharfe Banden ohne Geschmier auf Agarosegel. Wie in Tabelle II zu sehen ist, wird SV40 DNA durch BthI nicht gespalten. Wenn superhelicale SV40 DNA mit überschüssigem Enzym über längere Zeit inkubiert wird, erfolgt keine nennenswerte Umwandlung dieser DNA in die entspannte Ringform. Diese Ergebnisse zeigen an, daß keine feststellbare Verunreinigung des partiell gereinigten BthI mit nicht spezifischen Nucleasen vorliegt.

Der Vergleich der mit verschiedenen DNA-Molekülen erhaltenen Spaltprodukte zeigt, das BthI ein Isoschizomeres von XhoI ist, das die Nucleotidsequenz 5′-CTCGAG- 3′ erkennt.

Die meiste Enzymaktivität wird im Abschnitt 40 bis 60% gefunden und in Puffer A mit einem Gehalt von 0,1 mol NaCl/l suspendiert. Nach der Dialyse gegen den gleichen Puffer wird das Dialysat auf eine Whatman Phosphocellulose P-11 Säule (1,5 × 35 cm) aufgebracht, die vorher mit Puffer A mit einem Gehalt von 0,1 mol NaCl/l äquilibriert wurde. Die Säule wird gespült und mit 450 ml linearem Gradienten von 0,1 bis 0,6 mol NaCl/l in Puffer A entwickelt. Die bei 0,25 bis 0,35 mol NaCl/l eluierte Enzymaktivität wird gesammelt und gegen Puffer B dialysiert.

Eine Whatman DEAE-Cellulose DE-52-Säule (1,0 × 15 cm) wird vorbereitet und mit Puffer B äquilibriert. Die Phosphocellulosefraktionen werden auf die Säule aufgebracht. Nach dem Waschen wird die Säule mit 120 ml Gradienten von 0 bis 0,5 mol NaCl/l in Puffer B eluiert.

Die aktiven Fraktionen, die bei 0,20 bis 0,25 mol NaCl/l eluiert werden, werden vereinigt, gegen Puffer B mit einem Gehalt von 0,25 mol NaCl/l dialysiert und auf eine Heparin- Sepharose CL-6B Säule (1,0 × 5 cm) aufgebracht, die vorher mit dem gleichen Puffer äquilibriert wurde. Nach dem Waschen wird die Säule mit 40 ml Gradienten von 0,25 bis 0,75 mol NaCl/l entwickelt. Enzymaktivität wird in den Fraktionen mit 0,4 bis 0,5 mol NaCl/l erhalten. Diese Fraktionen werden vereinigt, durch Dialyse gegen Puffer B, der 50% Glycerin enthält, konzentriert und bei 20°C aufbewahrt.

Es wird festgestellt, daß das teilweise gereinigte Enzym BbeI praktisch keine nicht-spezifischen Nucleasen als Verunreinigung enthält. Nach längerer Inkubation mit überschüssigem Enzym ergibt nämlich der BbeI-Verdau von λ -DNA ein Bruchstückmuster, das keine Bandaufweitung auf Agarosegel zeigt, und nur eine Spurenmenge von Nicht-Substrat SV40 DNA wird aus der superhelicalen in die entspannte Form umgewandelt.

BbeI schneidet verschiedene Standard DNA's in der in Tabelle II angegebenen Weise. Aufgrund dieser Schnittmuster ist die Erkennungssequenz für BbeI vermutlich das palindrome Hexanucleotid GGCGCC. Da dieses Enzym demnach eine neue Sequenzspezifizität zeigt, ist es besonders wertvoll für die DNA-Forschung.

Beispiel 2

B. bifidum YIT 4007 (FERM BP-791) wird in modifiziertem VL-G Medium in der in Beispiel 1 Für B. breve beschriebenen Weise gezüchtet. Die Ausbeute beträgt etwa 25 g aus 6 Liter Kultur.

Der DNA-freie Extrakt wird wie vorstehend beschrieben hergestellt und mit festem Ammoniumsulfat bis zu 65prozentiger Sättigung versetzt. Der Niederschlag wird durch Zentrifugieren gesammelt, in 10 mmol K₂HPO₄-KH₂PO₄, pH 7,4, 7 mmol 2-Mercaptoäthanol und 1 mmol EDTA (Puffer C) gelöst und gegen den Puffer dialysiert.

Es wird eine Whatman Phosphocellulose P-11 Säule (1,5 × 35 cm) vorbereitet und mit Puffer C äquilibriert. Das Dialysat wird auf die Säule aufgebracht. Nach dem Waschen wird die Säule mit 450 ml Gradienten 0 bis 0,7 mol NaCl/l In Puffer C entwickelt. Es werden mindestens zwei verschiedene Enzymaktivitäten aufgelöst, die als Bbi I und BbiII bezeichnet werden. BbiI fließt durch die Säule, während BbiII bei 0,1 bis 0,2 mol NaCl/l eluiert wird.

Der Durchfluß und die Waschflüssigkeit, die BbiI-Aktivität enthalten, werden vereinigt, durch Zusatz von Ammoniumsulfat auf 60% Sättigung gefällt und in einem möglichst kleinen Volumen Puffer B mit einem Gehalt von 0,1 mol NaCl/l suspendiert. Die erhaltene Suspension wird auf eine Sphadex G-200 Säule (2,5 × 55 cm) aufgebracht, die vorher mit dem genannten Puffer äquilibriert wurde. Die Säule wird mit Puffer B mit einem Gehalt von 0,1 mol NaCl/l entwickelt. Die bei 0,6 bis 0,8 Bettvolumen eluierte BbiI-Aktivität wird vereinigt und erschöpfend gegen Puffer B dialysiert.

Eine Whatman DEAE-Cellulose DE-52-Säule (1,0 × 10 cm) wird vorbereitet und mit Puffer B äquilibriert. Sodann wird die BbiI Sephadex-Fraktion auf die Säule aufgebracht. Nach dem Waschen wird die Säule mit 80 ml Gradienten 0 bis 0,5 mol NaCl/l in Puffer B entwickelt. Die bei 0,25 bis 0,30 mol NaCl/l eluierte Enzymaktivität wird vereinigt und gegen Puffer A mit einem Gehalt von 0,2 mol NaCl/l dialysiert.

Das Dialysat wird auf eine Hydroxylapatitsäule (1,0 × 10 cm) aufgebracht, die vorher mit Puffer A mit einem Gehalt von 0,2 mol NaCl/l äquilibriert wurde. Die Säule wird gewaschen und mit 80 ml Gradienten von 0,01 bis 0,5 mol Kaliumphosphat/l in Puffer A mit einem Gehalt von 0,2 mol NaCl/l eluiert. Das BbiI wird bei 0,1 bis 0,25 mol Kaliumphosphat/l eluiert.

Die Spezifität von Bbi I wird mit einigen Standard-DNA's geprüft und mit dem Schnittmuster von bekannten Enzymen verglichen. Dabei wird eine Ähnlichkeit der Schnittmuster von BbiI und PstI festgestellt. Die Muster der Bruchstücke, die von g -DNA oder Adenovirus Typ 2 DNA, verdaut mit PstI allein erhalten werden, sind identisch mit denen, die aus den gleichen DNA's erhalten werden, wenn sie mit BbiI und danach mit PstI verdaut werden. Dies weist darauf hin, daß BbiI isochizomer mit PstI ist und das symmetrische Hexanucleotid CTGCAG erkennt.

BbiI ist viel stabiler als PstI und deshalb für den praktischen Gebrauch in vorteilhafter Weise geeignet.

Die BbiII-aktiven Fraktionen werden vereinigt und gegen Puffer A mit einem Gehalt von 0,2 mol NaCl/l dialysiert. Das Dialysat wird sodann auf eine Hydroxylapatit-Säule (1,0 × 10 cm) aufgebracht, die vorher mit dem vorstehend genannten Puffer äquilibriert wurde. Nach dem Waschen wird die Säule mit 80 ml Gradienten von 0,01 bis 0,5 mol Kaliumphosphat/l in Puffer A mit einem Gehalt von 0,2 mol NaCl/l entwickelt. Die Enzymaktivität wird bei 0,05 bis 0,1 mol Kaliumphosphat/l eluiert.

In vorläufigen Versuchen wurde festgestellt, daß BbiII isoschizomer mit AcyI ist, das Hexanucleotide GRCGYC erkennt, wobei R eine Purinbase und Y eine Pyrimidinbase ist. AcYI wird aus Anabaena cylindrica isoliert, einem Stamm von blaugrünen Algen. Die Kultur dieses Mikroorganismus ist mühsam und zeitraubend. Deshalb ist B. bifidum YIT4007 eine wesentlich bessere Quelle für dieses Enzym als A. cylindrica.

Claims

1. Restriktionsenzym BbiI, das die DNA-Sequenz CTGCAG erkennt, erhält durch
Kultivierung von Bifidobacterium bifidum FERM BP 791 bis zur frühen stationären Phase, Ernten, Aufbrechen bei einer Temperatur von unter 10°C und Abzentrifugieren der Zellen, wobei die Temperatur bei diesem wie bei allen weiteren Verfahrensschritten unter 5°C bleibt, Entfernen der Nucleinsäuren aus dem Überstand, Fraktionierung des DNA- freien Überstands mit Ammoniumsulfat und weitere Reinigung der Enzymaktivität aus der aktiven Fraktion durch Chromatographie an Phosphocellulose P-11, Sephadex G 200, DEAE- Cellulose DE 52, wobei mit einem NaCl-Gradienten eluiert wird, und an Hydroxylapatit, wobei mit einem Kaliumphosphatgradienten eluiert wird.

2. Restriktionsenzym BbiII, das die DNA-Sequenz GRCGYC erkennt, wobei R eine Purinbase und Y eine Pyrimidinbase ist, erhältlich durch Kultivierung von Bifidobacterium bifidum FERM BP 791 bis zur frühen stationären Phase, Ernten, Aufbrechen bei einer Temperatur von unter 10°C und Abzentrifugieren der Zellen, wobei die Temperatur bei diesem wie bei allen weiteren Verfahrensschritten unter 5°C bleibt, Entfernen der Nucleinsäuren aus dem Überstand, Fraktionierung des DNA-freien Überstands mit Ammoniumsulfat und weitere Reinigung der Enzymaktivität aus der aktiven Fraktion durch Chromatographie an Phosphocellulose P-11, wobei mit einem NaCl-Gradienten eluiert wird, und an Hydroxylapatit, wobei mit einem Kaliumphosphatgradienten eluiert wird.

3. Restriktionsenzym BbeI mit der (angenommenen) Erkennungssequenz GGCGCC, erhältlich durch Kultivierung von Bifidobacterium breve FERM BP 752 bis zur frühen stationären Phase, Ernten, Aufbrechen bei einer Temperatur von unter 10°C und Abzentrifugieren der Zellen, wobei die Temperatur bei diesem wie bei allen weiteren Verfahrensschritten unter 5°C bleibt, Entfernen der Nucleinsäuren aus dem Überstand, Fraktionierung des DNA- freien Überstands mit Ammoniumsulfat und weitere Reinigung der Enzymaktivität aus der aktiven Fraktion durch Chromatographie an Phosphocellulose P-11, an DEAE-Cellulose DE-52 und an Heparin-Sepharose CL-6B, wobei jeweils mit einem NCl- Gradienten eluiert wird.

4. Verfahren zur Gewinnung der Restriktionsenzyme nach den Ansprüchen 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß man jeweils die im entsprechenden Anspruch angegebenen Maßnahmen in der dortigen Reihenfolge durchführt.