DE2733273A1

DE2733273A1 - Endonucleasen und verfahren zu ihrer herstellung

Info

Publication number: DE2733273A1
Application number: DE19772733273
Authority: DE
Inventors: Tadahiko Ando; Shukuko Ikawa; Tetsuo Kin; Takehiko Shibata; Saitama Wako
Original assignee: RIKEN Institute of Physical and Chemical Research
Current assignee: RIKEN Institute of Physical and Chemical Research
Priority date: 1976-07-23
Filing date: 1977-07-22
Publication date: 1978-01-26
Also published as: US4161424A; JPS5622512B2; DE2733273B2; DK145951B; DE2733273C3; DK333977A; JPS5315491A; DK145951C

Description

VOSSIUS- VOSSIUS HiLTi. PATENTANWÄLTE

07-3^973

SIEBERTSTRASSE 4 βΟΟΟ MÜNCHEN ββ ■ PHONE: (Οθθ) 47 4Ο 76 L I *J *J i- ' ** CABLE: EENZOLPATENT MÜNCHEN · TELEX 6-S9 4O3 VOPAT D

2 2. JULI 1977

u.Z.: M 289
Case: OP 77059-02
RIKAGAKU KENKYUSHO
Wako-shi, Saitama-ken, Japan

"Endonucleasen und Verfahren zu ihrer Herstellung"

Die Erfindung betrifft neue Enzyme, die Nucleinsäuren zersetzen und eine solche Substratspezifitat aufweisen, dass sie in der Lage sind, spezielle biologische Desoxyribonucleinsäuren zu erkennen und spezielle Bindungen davon zu spalten, so dass Desoxyribonucleinsäurebruchstücke bestimmter Grossen erhalten werden. Ferner betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung dieser Enzyme.

Desoxyribonucleinsäure (DNA) zersetzende Enzyme (DNasen) kommen in verschiedenen biologischen Materialien vor und sind an wichtigen Lebensvorgängen beteiligt, beispielsweise am Stoffwechsel, an der Zersetzung, Synthese und Substitution von DNA. In letzter Zeit wurde diesen Enzymen aufgrund ihrer chemischen Eigenschaften und biologischen Funktionen eine besondere Aufmerksamkeit geschenkt.

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Zur Untersuchung der Struktur und Funktion von DNA in Genen spielen derartige Enzyme mit einer spezifischen Wirkung eine wichtige Rolle als biochemische Reagenzien und beim molekularen KLonieren der Gene.

DNA-zersetzende Enzyme werden je nach ihrer Funktion grob in Exonucleasen und Endonucleasen eingeteilt. Enzyme der erstgenannten Art wirken auf das Ende der Polynucleotidkette des DNA-Moleküls ein und bewirken nach und nach eine Freisetzung und Zersetzung von Nucleotiden. Enzyme der letztgenannten Art bilden DNA-Bruchstücke oder Oligonucleotide, indem sie die Phosphodiesterbindung im DNA-Molekül spalten.

In letzter Zeit wurden bei der Untersuchung von Endonucleasen grosse Fortschritte erzielt. Es wurden Enzyme mit einer Spezifität für die DNA-Struktur, insbesondere für die Konfiguration von Nucleotiden oder für strukturelle Veränderungen, die in der Natur vorkommen oder die künstlich herbeigeführt werden, gefunden. Ferner kennt man Enzyme, die in der Lage sind, eine spezielle biologische DNA zu erkennen, sowie Enzyme, die biologisch wichtige Funktionen ausüben; vgl. Tadahiko Ando, Chemistry and Life, Bd. 13 (1975), S. 342.

Aufgrund umfangreicher Untersuchungen wurden Verfahren zur Herstellung von Enzymen aus Kulturen von Aspergilus oryzae ermittelt. Diese Enzyme wirken nicht auf doppelstrangige DNA, sondern zersetzen spezifisch einstrangige DNA; vgl. JA-PS 593 368.

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Aus der JA-PS 621 205 ist ein Verfahren zur Herstellung von Enzymen aus dem Pilz Aspergilus oryzae bekannt, die bevorzugt Purin-Purin-Bindungen zersetzen. Die JA-PS 764 919 beschreibt ein Verfahren zur Herstellung von Enzymen, die eine begrenzte Anzahl von einstrangigen Unterbrechungsstellen in doppelstrangige DHA einführen. Diese Enzyme werden aus mit Bakteriophagen infizierten Escherichia coli erhalten. Ferner ist ein Verfahren zur Herstellung eines Enzyms, das BNA zu Nucleosid-2,3-cyclophosphat hydrolysiert, aus Escherichia coli, das durch Bacteriophagen infiziert oder induziert ist, bekannt; vgl. japanische Patentanmeldung 78869/1972 und japanische Patentveröffentlichung 35577/1974. Aus der japanischen Patentanmeldung 114 131/1973 sowie der japanischen Patentveröffentlichung 64484/1975 ist ein Verfahren zur Herstellung von Enzymen bekannt, die bevorzugt Guanin-Guanin-Bindungen im DHA-Molekül spalten. Diese Enzyme werden aus Kulturflüssigkeiten von alkalophilen Bakterien gewonnen. Schliesslich ist ein Verfahren zur Herstellung von Enzymen bekannt, die spezifisch HKA-Reste von DNA-RNA-Hybriden zersetzen. Diese Enzyme werden aus Zellen von Bacillus subtilis gewonnen; vgl. japanische Patentanmeldung 127 276/1974. Schliesslich ist ein Verfahren zur Herstellung von Enzymen bekannt, die eine solche Substratspezifität aufweisen, dass sie spezifische biologische Desoxyribonucleinsäuren erkennen und spezielle Bindungen davon spalten. Diese Enzyme werden aus Bacillus subtilis und Mikroorganismen der Gattung Bacillus gewonnen; vgl. japanische Patentanmeldung 121 671/1975 und japanische Patentveröffentlichung 47980/1977.

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Bisher konzentrierten sich die Untersuchungen auf die Erscheinung, dass der Wirtsbereich von Riagen durch den Wirt kontrolliert wird, sowie' auf wirtskontrollierte Modifikationen und Restriktionen. Es wurde festgestellt, dass ein Mechanismus existiert, nach dem Escherichia coli \ -Fhagen-DNA modifiziert und unmodifizierte, fremde DNA kontrolliert.

Aufgabe der Erfindung ist es, Endonucleasen mit einer spezifischen biologischen Aktivität zur Verfügung zu stellen.

Im Verlauf der Untersuchungen, die zur vorliegenden Erfindung führten, wurden eine Reihe von durch Mikroorganismen gebildeten neuen Enzymen untersucht. Es wurden dabei Enzyme ermittelt, die DNA zersetzen und spezifisch das DNA-Molekül in bestimmten Stellungen angreifen und spalten, wobei sie die DNA eines speziellen Mikroorganismus erkennen. Diese Enzyme werden aus 62, aeroben, Sporen aufweisenden Stämmen der Gattung Bacillus gewonnen. Diese Enzyme sind in der Lage, DNA-Fragmente von bestimmter Grosse zu bilden.

Der Gegenstand der Erfindung ist in den Patentansprüchen definiert.

Pig. 1 zeigt eine Photographic mit den Ergebnissen einer Agarose-Gelelektrophorese von DNA, die mit den erfindungsgemässen Enzymen behandelt worden ist.

Die einzelnen Symbole in der Figur haben folgende Bedeutungen:

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.168

SPPl.168
01O4C.N
SPPl. R

λΗ
DNA

01O5C168DNA
R.EcoRI

Bacillus-Phage 01O5C gezüchtet auf

Bacillus subtilis ATCC 6O5I

Bacillus-Phage SPPl gezüchtet auf

Bacillus subtilis ATCC 6O5I

Bacillus-Phage 01O5C gezüchtet auf

Bacillus amyloliquefaciens IAM 1522

Bacillus-Phage SPPl gezüchtet auf

Bacillus subtilis R

DNA von E. coli-Phage \_ gezüchtet auf

Escherichia coli B

DNA modifiziert durch Bacillus amyloliquefaciens H

unbehandelte X-DNA gezüchtet auf

Escherichia coli B

unbehandelte 01O5C.168DNA

DNA von E. coli-Phage ) behandelt mit EcoRI-Enzym

von Escherichia coli

Es ist charakteristisch für die erfindungsgemässen Enzyme, dass sie in der Lage sind, spezielle Nucleinsäuren zu erkennen und selektiv die Phosphodiesterbindung in den Nucleinsäuren unter Bildung von Nucleinsaurebruchstucken mit diskretem Molekulargewicht zu spalten. Die Enzyme werden aus zellfreien Extrakten von Mikroorganismen der Gattung Bacillus gewonnen.

Im erfindungsgemässen Verfahren können alle Stämme der Gattung Bacillus verwendet werden, die in der Lage sind, die erfindungsgemässen Enzyme zu bilden. Beispiele für derartige Mikroorganismen-

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stamme sind die unter den Hinterlegungsnummern IAM 1076, 1114, 1145, 1192, 1193, 1231, 1247, 1259 und 1253 beim Institute of Applied Microbiology, University of Tokyo (1-1, Yayoi, Bunkyoku, Tokyo, Japan) ohne Einschränkungen hinterlegten Stämme von Bacillus subtilis. Weitere Beispiele sind die ebenfalls ohne Einschränkungen hinterlegten Stämme Bacillus cereus IAM 1229, Bacillus megaterium IAM IO3O und Bacillus sphaericus IAM 1286. ELn weiteres Beispiel ist der bei der landwirtschaftlichen Fakultät der Universität Hokkaido (Nishi-9-chome, Kita-9-Jo, Sapporo City, Hokkaido, Japan) unter der Hinterlegungsnummer AHU 1387 (vgl. JPCC-Catalogue of Culture (1966)) ohne Einschränkungen hinterlegte Stamm von Bacillus pumillus. Diese Mikroorganismenstämme sind Dritten jederzeit frei zugänglich.

Weitere Beispiele sind die bei der American Type Culture Collection (ATCC) (12301 Parklawn Drive Rockville, Maryland 20852) unter den Hinterlegungsnummern ATCC 6O5I und 6633 hinterlegten Stämme von Bacillus subtilis, ferner der Stamm Bacillus amyloliquefaciens ATCC 23350, der Stamm Bacillus cereus ATCC 14579, der Stamm Bacillus cereus Rf sm st ATCC 31293, der Stamm Bacillus sp Nr. 170 ATCC 31292 und der Stamm Bacillus megaterium B 205-3 ATCC 31294. Auch diese Stämme sind Dritten frei zugänglich. Die Stämme ATCC 6O5I, 6633, 23350 und 14579 sind seit dem 9. Juni 1977 der Öffentlichkeit zugänglich. Die Stämme ATCC 31292, 31293 und 31294 sind seit dem 10. Juni 1977 zugänglich.

Die Anmelderin wird die Hinterlegung der genannten Mikroorganismen-

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Stämme während der gesamten Laufdauer eines eventuell erteilten Patents und eine angemessene Zeit daruberhinaus aufrechterhalten. Die genannten Stämme werden während dieser Zeit der Öffentlichkeit zugänglich sein.

Die Hinterlegungsdaten der einzelnen Mikroorganismen sind in Tabelle I zusammengestellt.

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Mikroorgani smus
Bacillus subtilis

Tabelle I Hinterlegungsstelle

The American Type Culture Collection (ATCC)

The Institute of Applied Microbiology, University of Tokyo (IAM)

Bacillus amylo-

liquefaciens ATCC

¹¹ (auch als
"Bacillus subtilis" bezeichnet IAM

Bacillus cereus ATCC Bacillus cereus Rf sm st ATCC

Bacillus	cereus	IAM
Bacillus	sp. Nr. 170	ATCC
Bacillus	megaterium	IAM
Bacillus B 205-3	megaterium	ATCC

Bacillus pumillus

Bacillus sphaericus

Faculty of Agriculture , Hokkaido University (AHU)

IAM Hinterlegungs-Nr. ATCC 6O5I

ATCC 6633 IAM 1076

IAM 1114 IAM 1145 IAM 1192 IAM 1193 IAM 1231 IAM 1247 IAM 1259

ATCC 2335O

IAM 1523 ATCC 14579 ATCC 31293 IAM 1229 ATCC 31292 IAM IO3O

ATCC 31294 AHU 1387

IAM 1286

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Nachstehend sind die mikrobiologischen Eigenschaften der Stämme Bacillus sp. Nr. I70 ATCC 51292, Bacillus cereus Rf sm st ATCC 31293 und Bacillus megaterium B 205-3 ATCC 31294 beschrieben.

Die einzelnen Untersuchungen wurden gemäss R.E. Gordon, W.C. Haymes und C. H-N. Pang, "The Genus Bacillus", U.S. Dpet. Agr., 1973 und "Bergey's Manual of Determinative Bacteriology", 1974·, durchgeführt.

(1) Mikrobiologische Eigenschaften von Bacillus sp. Nr. (A) Morphologie;

Der Stamm weist eine stabartige Monokokken- oder Streptokokkengestalt der Abmessungen (1,0 bis 1,2) χ (3,0 bis 5,0) mu auf. Er hat ein peritriches Flagellum und ist bev/eglich. Der Stamm weist eine positive Gram-Färbung auf und ist beim Säurefestigkeitstest negativ. Der Stamm weist keinen Pleomorphismus auf und bildet ovale Sporen. Zur Beobachtung der morphologischen Eigenschaften wird folgendes Nährmedium verwendet:

Pepton 10 g/Liter

Fleischextrakt 10 g/Liter

NaCl 5 g/Liter

Agar 15 g/Liter

pH-Wert 7,2

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(B) Wachstum auf verschiedenen Medien:

1) Bouillon-Agar-Plattenkultur:

Die Kolonie ist kreisförmig und bildet eine flache Kammlinie. Die Randkante ist wellenförmig. Die Oberfläche der Kolonien ist glatt und weiss. Im Nährmedium bildet sich kein Pigment.

2) Bouillon-Agar-Ausstrichkultur:

Das Wachstum verläuft mittelmässig unter Streuung. Die Oberfläche ist glatt und weiss. Im Nährmedium bildet sich kein Pigment.

3) Flüssiges Bouillon-Medium:

Die Oberfläche des Nährmediums ist membranartig. Es bildet sich ein Niederschlag.

4) Bouillon-Gelatine-Stichkultur: Gelatine wird verflüssigt.

5) Lackmus-Milch:

Die Lackmus-Farbe verschwindet und es tritt Peptonisierung ein.

(C) Biologische Eigenschaften:

1) Nitratreduktion: positiv

2) Denitrifikation: negativ

3) MR-Test: positiv

4) VP-Test: positiv

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5) Indolbildung: negativ

6) Schwefelwasserstoffbildung: negativ

7) Stärkehydrolyse: positiv

8) Verwertung von Citronensäure:

Der Stamm wächst auf Christensen-Medium, zeigt aber auf Koser-Medium kein Wachstum.

9) Verwertung von anorganischem Stickstoff:

Der Stamm wächst unter Verwertung von Ammoniumsalzen.

10) Pigmentbildung: negativ

11) Urease: negativ

12) Qxidase: positiv

13) Katalase: positiv

14) Wachstumsbedingungen:
pH-Optimum: 7 bis 10
Temperaturoptimum: 30 bis 37⁰C

15) Verhalten gegenüber Sauerstoff: aerob

16) 0-F-Test:

Der Stamm bildet entweder aerob oder anaerob Säure.

17) Verwertung von Kohlenstoffquellen:

Der Stamm bildet entweder aerob oder anaerob aus D-Glucose, D-Mannose, D-Fructose, Maltose, Saccharose, Trehalose, Glycerin und Stärke Säuren. Eine Gasbildung wird bei keinem dieser Saccharide beobachtet. Eine Bildung von Säure oder Gas tritt bei L-Arabinose, D-Xylose, D-Galactose, Lactose, Raffinose, D-Sorbit, D-Mannit und Inosit nicht auf.

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18) Salzbeständigkeit:

Der Stamm wächst in Gegenwart von NaCl bis zu einer Konzentration von 7»5 Prozent.

19) Caseinhydrolyse: positiv

20) Phenylalanin-Desaminase: negativ

Aufgrund der vorstehend geschilderten mikrobiologischen Eigenschaften lässt sich der Stamm Bacillus sp. Nr. I70 (nachstehend kurz als Stamm Nr. I70 bezeichnet) unter Berücksichtigung der vorstehenden Literaturstellen in die Gattung Bacillus einordnen. Ein Vergleich von Stamm Nr. I70 mit anderen Stämmen der Gattung Bacillus ergibt, dass er Ähnlichkeiten mit Bacillus cereus aufweist, sich aber insoweit deutlich von Bacillus cereus unterscheidet, dass er unter alkalischen Bedingungen ein gutes Wachstum zeigt, während der bekannte Stamm einen Wachstums-pH-Bereich von 5 bis 8 aufweist.

Wie nachstehend erläutert, weist der Stamm Nr. I70 in alkalischen Nährmedien eine maximale Penicillinase-Bildung auf, worin er sich offensichtlich von Bacillus cereus unterscheidet, da dieser Penicillinase in neutralen Nährmedien bildet.

Demzufolge lässt sich der Stamm Nr. I70 keinem der bekannten Stämme zuordnen und ist somit als neuer Stamm der Gattung Bacillus anzusehen.

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(2) Mikrobiologische Eigenschaften von Bacillus cereus RC sm st;

(A) Morphologie:

Der Stamm ist ein aerober Bacillus und bildet Endosporen. Er erweist sich beim Gram-Färbungstest als negativ. Die Sporen haben ovale oder zylindrische Gestalt. Der GC-Gehalt in der DNA beträgt 32 bis 37 Prozent.

(B) Biologische Eigenschaften:

1) Eidotter -Test: positiv

2) Wachstunisbedingungen:

Die höchsten Wachstumstemperaturen liegen bei 35 bis 45°C und die niedrigsten Temperaturen bei 0 bis 20°C.

3) Nitratreduktion: positiv

(C) Wachstum auf verschiedenen Nährmedien:

Der Stamm wächst unter anaeroben Bedingungen auf einem Agar-Medium. Er wächst auf einem Medium mit einem Gehalt an 0,001 Prozent Lysozym.

Durch Vergleich mit den vorgenannten Literaturstellen ergibt sich, dass dieser Stamm im wesentlichen mit bekannten Stämmen von Bacillus cereus übereinstimmt. Der Si;amm wird somit als Bacillus cereus eingestuft.

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(3) Mikrobiologische Eigenschaften von Bacillus megaterium B 205-3

(A) Morphologie:

Der Stamm ist ein relativ grosser aerober Bacillus, bildet Endosporen und erweist sich beim Gram-Färbungstest als positiv. Die Sporen haben eine ovale oder zylindrische Gestalt. Der GC-Gehalt in der DNA beträgt 3β bis 38 Prozent.

(B) Biologische Eigenschaften;

1) Eidotter -Test: negativ

2) Wachstumsbedingungen:

Die höchsten Wachstumstemperaturen liegen bei 35 t>is 45°C und die niedrigsten Wachstumstemperaturen bei 3 bis 20⁰C.

(C) Wachstum auf verschiedenen Nährmedien:

Der Stamm wächst nicht unter anaeroben Bedingungen auf einen: Agar-Medium. Auf einem Medium mit einem Gehalt an 0,001 Prozent Lysozym zeigt er kein Wachstum.

Bei einem Vergleich mit den vorgenannten Literaturstellen ergibt sich, dass dieser Stamm im wesentlichen mit Bacillus megaterium übereinstimmt. Er wird deshalb als Bacillus megaterium bezeichnet.

Die genannten Mikroorganismen lassen sich nach folgenden allgemeinen Züchtungsverfahren züchten, beispielsweise durch Überimpfen der Mikroorganismen auf ein Nährmedium, das Aminosäuren,

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te

Caseinhydrolysat, Glucose, Phosphat, Sulfat und dergl. enthält, und Züchten unter Belüften und Rühren bei etwa 30 bis 37⁰C.

Ein typisches Nährmedium weist folgende Zusammensetzung auf: (1) CI-Medium in 10 Liter

KH₂PO₄

Na-citrat.2H₂0

60	ε
140	g
10	g
20	S
2	g
2	g
50	g
2	g
0,25	g

Arginin Casaminsäure Glucose MgSO₄

Tryptophan

(2) Bacto-Penassay-Brühe (Difco)

Das Wachstum der Mikroorganismen wird gemessen, indem man die Gärbrühe in eine Küvette bringt und die Lichtdurchlässigkeit bei 660 nyj. misst.

Nach der Züchtung werden die Zellen während eines Zeitraums von der exponensiellen Phase bis zum Anfangsstadium der stationären Phase gesammelt. Die Zellen werden mit Ultraschall behandelt und direkt oder nach vorheriger Behandlung mit Lysozym zur Herstellung eines Protoplasten zentrifugiert. Der auf diese Weise erhaltene zellfreie Extrakt wird mit Streptomycinsulfat behandelt, der Ammoniumsulfatfraktionierung unterworfen, anschliessend wird

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er der Gelfiltration unter Verwendung von Ultrogel ACA 44 oder Sephadex G-100 und/oder der Ionenaustauschchromatographie unter Verwendung von DEAE-CeIIuIοse oder Phosphocellulose unterworfen. Auf diese Weise erhält man aus den Zellen neue DNA-zersetzende Enzyme vom Endonucleasetyp.

Demgemäss lassen sich die erfindungsgemässen Enzyme herstellen, indem man einen nach Züchtung der Mikroorganismen während eines Zeitraums von der exponentiellen Phase bis zum Anfangsstadium der stationären Phase erhaltenen zellfreien Extrakt einer Be handlung zur Entfernung von Nucleinsäuren, der fraktionierten Fällung mit Ammoniumsulfat, der Ionenaustauschchromatographie oder Gelfiltration bzw. zwei oder mehr dieser Behandlungen unter wirft. Auf diese Weise erhält man Enzyme mit den nachstehend angegebenen physikochemisehen Eigenschaften.

Physikochemisehe Eigenschaften der Enzyme

(1) Aktivität und Substratspezifität

DNA von folgenden Phagen wird hergestellt und als Substrat- DNA für enzymatische Reaktionen verwendet: Bacillus-Phage 0 105C (0 105 CN) und Bacillus-Phage SPP 1 (SPP 1.N) vermehrt mit Bacillus amyloliqucfaciens IAM 1522; Bacillus-Phage 0 105c (0 105c.168) und Bacillus-Phage SPP 1 (SPP 1.168),ver mehrt mit Bacillus subtilis ATCC 6O5I; und Coli-Phage λ. , vermehrt mit Escherichia coli B.

Nach der enzymatischen Reaktion wird die Grosse der durch die erfindungsgemäßen Enzyme gespaltenen Substrat-DNA-Bruchstücke und die Anzahl der Spaltungsstellen elektrophoretisch untersucht. Die

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Anzahl der bei einer Behandlung mit den erfindungsgemässen Enzymen gebildeten Schnittstellen ergibt sich aus dem mit Agarosegel erhaltenen Elektropherogramm der Fig.1.

Aus Fig. 1 ergibt sich, dass das Substrat-DNA-Molekül durch die erfindungsgemässen Enzyme in Bruchstücke bestimmter Grosse gespalten wird.

Folgende Substrate werden verwendet:

(1) DNA von unbehandelter Bacillus-Phage 0 105C

(2) DNA von unbehandelter E.coli-Phage X ·

(3) DNA von E. coli-PhageΛ » behandelt mit Eco E I Enzym von Escherichia coli (Kontrolle zum Vergleich mit (1) und (2)).

Die erfindungsgemässen Enzyme werden folgendermassen bezeichnet: R. Bsu M, R. Bsu 6633, R. Bsu 1193, R. Bsu 1231, R. Bsu 1192, R. Bsu 1145, R. Bsu 1076, R. Bsu 1114, R. Bam F, R. Bam K, R. Bsu 1259, R. Bee 14-579, R. Bee R, R. Bee 170, R. Bsu 1247, R. Bee 1229, R. Bme 205, R- Bpu 1387, R. Bme 899 und R. Bsp 1286.

Die Nomenklatur der Enzyme richtet sich nach dem allgemeinen System von H.O. Smith und D. Nathans, J. Mol. Biol., Bd. 81 0973), S. 419.

Die Bezeichnungen "Bsu", "Bam", "Bee", "Bme", "Bpu" und "Bsp" sind folgendermassen abgeleitet:

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0.4

Name	Gattung	Spezies Stamm	•I - K	Nr.
1) Bsu M	Bacillus	^subtilis M	subtilis
2) Bsu 6633	Il	•ι	cercus	6633
3) Bsu 1193	•I	Il		1193
4) Bsu 1231	Il	η ■	ti	1231 /
5) Bsu II92	•I	Il	subtilis	1192
6) Bsu 1145	•1	ti	cereus	1145
7) Bsu_1076	•I	ti	megaterium	IO76
8) Bsu. 1114	•I	Il	puiaillus	1114
9.) Bam F	¹¹ amyloliquefaciene JF	megaterium
10) Bam K	Il	sphaericus
11) Bsu I259	Il	1259
12) Bee 1^579	•1	14579
*13) Bee R**	Il
14) Bee 170	Il	170/
15) Bsu 1247	Il	1247
16) Bee 1229	•1	1229
17) Brae 205	•I	205
18) Bpu 1387	η	1387
19) Bme 899	Il	899
20) Bsp 1286	•1	1286

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Die vorgenannten Abkürzungen werden durch Kombination der unterstrichenen Anfangsbuchstaben gebildet.

Das Symbol "R." ist eine Abkürzung für"Endonuclease R",während das Symbol "R" eine Abkürzung für "Restriktion" ist. Ferner leitet sich der Ausdruck "EcoR 1" folgendermassen ab:

Genus Spezies Stamm Nr.

Escherichia coli R I

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.23

Tabelle II Verwendeter Mikroorganismus

1) Bacillus subtilis ATCC 605I

2) Bacillus subtilis ATCC 6633

3) Bacillus subtilis IAM 1193 k) Bacillus subtilis IAM 1231

5) Bacillus subtilis IAM 1192

6) Bacillus subtilis IAM 11**5

7) Bacillus subtilis IAM IO76

8) Bacillus subtilis IAM

9) Bacillus atnyloliguofacicns ATCC

2335O

10) -Bacillus amyloliquefncjens IAM.

11) Bacillus subtilis IAM 1259

12) Bacillus cereus ATCC 1^579

13) Bacillus ccrcus Rf em st ATCC

31293 Ik) Bacillus sp. I70 ATCC 31292

15) Bacillus subtilis IAM 12^7

16) Bacillus cereus IAM 1229

17) Bacillus mcgaterium B2O5-3

ATCC 31294

18) Bacillus pumillus AIIU I387

19) Bacillus megaterium IAM IO3O

20) Bacillus sphacricus IAM 1286

Name des Enzyms

R. BsuM

R. Bsu6633

R. BSUII93

R. BSUI23I

R. BSUII92

R. Bsull45

R. BSUIO76

R. Bsulll4

R. BamF

R. Bn-JiK

R. BSUI259

R. Bcel4579

R. Been

R. Bcel70

R; Bsul2^7

R. Bcel229

R. Dme205 .

R. BPUI387

R. Bme899

R. Bspl286

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Aus dem Elektrophoresediagramm von Pig. 1 ergibt sich, dass das Enzym von Bacillus subtilis ATCC 6O5I in charakteristischer Weise DNA der Bacillus-Phage 0 IO5C 168 und DNA der Bacillus-

zersetzt
Phage 0 IO5C N/.Die Enzyme von Bacillus subtilis IAM 1076 und Bacillus subtilis IAM 1114 weisen die gleiche Substratspezifität auf und haben keine Wirkung auf DNA der Bacillus-Phage SPPl R.

Die Enzyme von Bacillus subtilis ATCC 66331 Bacillus subtilis IAM 1193, Bacillus subtilis IAM 1231 und Bacillus subtilis IAM 1192 fragmentieren die einzelnen DNA in relativ kleine Bruchstücke. Sie wirken auch spezifisch auf DNA des SPPL-Phagen, modifiziert mit dem Stamm R von Bacillus subtilis. Es lässt sich auch feststellen, dass das Enzym von Bacillus subtilis IAM 1247 in ähnlicher Weise wie das Enzym von Bacillus sp. Nr. I70 ATCC 31292 wirkt.

Die Substratspezifität der Enzyme von Bacillus amyloliquefaciens ATTC 23350, Bacillus amyloliquefaciens IAM I523 und Bacillus subtilis IAM 1259 ist so beschaffen, dass sie keine Wirkung

mit dem Enzym Bam NI
zeigen auf (I)/behandelte \-Phagen-DNA, (II) DNA des Phagen 105c 168 oder(III)\-Phagen-DNA, modifiziert mit dem Stamm H von Bacillus anyloliquefaciens.

Das erfindungsgemässe Enzym aus Bacillus pumillus AHU 1387

(Bpu 1387) wird zu Vergleichszwecken mit den Enzymen Bam NI, Bam NII und Bam NIII aus Bacillus amyloliquefaciens N (IAM 1522) (vgl. japanische Patentanmeldung 121 671/75 und japanische

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verglichen

Patentveröffentlichung 47980/1977)/·Die Ergebnisse eines entsprechenden Vergleichs der Substratspezifität in bezug auf verschiedene DNS-Substrate sind in Tabelle III zusammengestellt.

Aus Tabelle III geht hervor, dass das Enzym Bpu 1387 sich von den Enzymen Bam NI und Bam NII + Bam NIII nicht nur in bezug auf DNA der Bacillus-Phagen 0 105, SP?¹ und der Coli-Phagen λ, sondern auch in bezug auf DNA von Plasmid (intrazellulärer Paktor)Xdv 1 von Escherichia coli, DNA von CoIEL und DNA von Simian-Virus 40 unterscheidet.

Tabelle III

Anzahl der Schnittstellen

Substrat-DNA	Bam NI	Bam Nil + Bam	NIII Bpu 1387
Bacillus-Phage 0 105C	O	~9 + /-^7	5
Bacillus-Phage 0 29	O	O	nicht unter sucht
Bacillus-Phage M2	O	O	nicht unter sucht
Bacillus-Phage SPPl	O	3	O
Coli-Phage Λ	5	~15	6-7
AdV 1*	1	2 oder 3	1
T7	O	>14	nicht unter sucht
CoIEl*	O	3	O
SV 40**	1	>4	2 bis 3

* dv 1, CoIEl: Plasmid (intrazellulärer Faktor) von

Escherichia coli
♦* SV 40: Simian-Virus 40

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(2) pH-Optimum:

Das pH-Optimum der erfindungsgemässen Enzyme liegt jeweils im Bereich von 7,2 bis 8,3·

(3) Temperaturoptimum:

Das Temperaturoptimum der erfindungsgemässen Enzyme liegt jeweils im Bereich von 35 bis 37⁰C.

Verfahren zur Messung der Enzymaktivität: Die enzymatische Aktivität wird gemessen, indem man die Enzymprobe zu einem Gemisch aus folgenden Bestandteilen in den angegebenen Konzentrationen gibt: 50 millimolar Tris-Salzsäure-Puffer vom pH-Wert 7»5i 5 millimolar MgCIp, 0,2 millimolar EDTA, 5 millimolar ß-Mercaptoäthanol und 0,1 mg DNA. Das Gemisch wird 50 Minuten bei 37°C inkubiert. Da die Bildung von säurelöslichen Nucleotiden nach der Umsetzung in der Flüssigkeit nicht beobachtet wird, wird das Reaktionsprodukt der Elektrophorese unter Verwendung von Agarosegel oder der Zentrifugation mit einem neutralen Saccharosegradienten unterworfen, um die Bruchstückbildung der Substrat-DNA zu untersuchen.

(5) Hemmung, Aktivierung und Stabilisierung:

Die erfindungsgemässen Enzyme werden durch 1 bis 20 millimolar Mg aktiviert, wobei ATP oder S-Adenosylmethionin als Cofaktor nicht erforderlich ist. Durch mehr als 20 millimolar

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Mg ⁺ oder mehr als 0,2 m NaCl wird die Enzymaktivität gehemmt. Das Enzym (Bpu 1387) von Bacillus pumillus AHU 1387 wird durch 0,1 bis 0,2 m NaCl aktiviert.

(6) Reinigungsverfahren:

Die Reinigung der Enzyme von R. Bam F und R. Bpu 1387 wird nach folgendem Schema vorgenommen:

Zellen

Behandlung mit Lysozym

Ultraschallbehandlung

Zentrifugation (90 Minuten bei 2°C mit 80 000 g) (Überstand) (Fraktion I)

Zugabe von 1/4 Volumteile einer 5prozentigen Lösung von Streptomycinsulfat in Puffer A

(Überstand) (Fraktion II)

Fällung des Materials mit Ammoniumsulfat bei 40 bis 60prozentiger Sättigung

Lösung in Puffer A
(Ammoniumsulfatfraktion)

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Streptomycinsulfat-Fraktion von Bacillus amyloliquefaciens ATCC 2335O

Ammoniumsulfat-Fraktion von Bacillus pumillus AHU 1387

Gelfiltration an AcA34 (in Gegenwart von 0,3m

NaCl)

(aktive Fraktion)

Säulenchromatographie an DEAE-Cellulose (0,05 bis 0,16 m NaCl-Fraktion)

R. Bam F

Säulenchromatographie an Phosphocellulose (0,4 bis 0.55 m NaCl-Fraktionen)

R. Bpul 1387

Die Enzyme Bsu 1145 und Bee 14579 werden direkt aus der vorgenannten Fraktion I gewonnen. Die Enzyme Bsu M, Bsu 6633, Bsu 1193, Bsu 1231, Bsu 1192, Bsu 1076, Bsu 1114, Bam K, Bsu 1259, Bee R, Bee I70, Bsu 1247, Bee 1229, Bme 205, Bme 877 und Bsp 1286 werden direkt aus der vorgenannten Fraktion II gewonnen.

Aus den vorstehenden Ausführungen ergibt sich, dass es sich bei den erfindungsgemässen Enzymen um neue, Nucleinsäure spaltende Enzyme von hoher Substratspezifität handelt, die in der Lage sind, spezielle Nucleotidsequenzen

von DNA zu erkennen, diese DNA

an bestimmten Stellen zu spalten und DNA-Bruchstücke von

bestimmter Grosse zu bilden.

Die Beispiele erläutern die Erfindung.

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Beispiel 1

Hirn-Bacillus pumillus AHU 1387 wird in 500 ml/Herz-Infusionsmediuin 13 bis I5 Stunden bei 30⁰C unter Schütteln vorgezüchtet. Das Vorzuchtmedium wird in 10 Liter CI-KuItürmedium der folgenden Zusammensetzung suspendiert: 120 g KpHPO₄, 4 g Arginin-hydrochlorid, 280 g KH₂PO₄, 100 g Glucose, 20 g Natriumcitrat, 4 g MgSO₄, 40 g Ammoniumsulfat, 0,5 S Tryptophan und 4 g Casaminsäure (ohne Vitamine).

Die Züchtung wird unter Schütteln 6 Stunden bei 37°C bis zum Anfangsstadium der stationären Phase durchgeführt. Die auf diese Weise erhaltene Gärflüssigkeit wird in einer kontinuierlich arbeitenden Kühlzentrifuge zentrifugiert. Man erhält 13 g Zellen. Diese Zellen werden in 20 ml Puffer A (20 millimolarer Tris-HCl-Puffer vom pH-Wert 7^2, 0,1 millimolar EDTA, 2 millimolar HgCIo und 2 millimolar ß-Mercaptoäthanol) suspendiert. Die Suspension wird mit 13 m Hühnereiweiss-Lysozym versetzt. Die erhaltene Suspension wird 35 Minuten bei 37°C stehengelassen und anschliessend der Ultraschallbehandlung unterworfen (20 kHz, 15 see, 4 mal). Anschliessend wird 60 Minuten bei 75 000 g in einer Kühlzentrifuge zentrifugiert. Sodann wird der Überstand unter Rühren mit 10 ml einer 5prozentigen Losung von Streptomycinsulfat versetzt. Die Flüssigkeit wird 20 Minuten gerührt und anschliessend in der Kühlzentrifuge behandelt. Der Überstand wird gewonnen.

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3σ

Anschliessend wird der Überstand innerhalb von 30 Minuten unter Rühren bis zu einer 35prozentigen Sättigung mit Ammoniumsulfat versetzt. Das Gemisch wird 20 Minuten gerührt. Der erhaltene Niederschlag wird in der Kühlzentrifuge abgetrennt. Der. Überstand wird innerhalb von 30 Minuten bis zu einer 65prozentigen Sättigung mit Ammoniumsulfat versetzt. Das Gemisch wird 30 Minuten gerührt. Der Niederschlag wird in der Kühlzentrifuge abgetrennt und im vorstehenden Puffer A gelöst. Diese Fraktion wird über Nacht gegen den Puffer dialysiert.

Die dialysierte Fraktion wird auf eine mit Ultrogel AcA 3^ beschickte Säule, . die mit dem Puffer A unter Zusatz von0,3mNaCl und 10 Prozent Glycerin äquilibriert worden ist, aufgesetzt. Das mit dem gleichen Puffer erhaltene Eluat wird gegen den Puffer A, ergänzt mit 10 Prozent Glycerin, dialysiert.

Die dialysierte Fraktion wird an Phosphocellulose (p 11, 1 χ 12 cm), die mit dem Puffer A äquilibriert worden ist, adsorbiert und anschliessend mit dem Puffer A gewaschen. Sodann wird die Elution mit dem Puffer A mit einem linearen NaCl-Gradienten von 0 bis 0,7a vorgenommen. Das erfindungsgemasse Enzym (Bpu 1387) wird bei 0,4 bis 0,55 m NaCl eluiert.

Beispiel 2

Bacillus amyloliquefaciens ATCC 23350 wird in 1000 ml des in Beispiel 1 angegebenen CI-Nährmediums gezüchtet. Die Zellen (etwa 3 g) vom Anfangsstadium der stationären Phase werden auf

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die vorstehend beschriebene Weise mit Hühnereiweiss-Lysozym, Ultraschall und Streptomycinsulfat behandelt. Der nach dem Abtrennen der Streptomycinsulfat-Fraktion erhaltene flüssige überstand wird an einer mit DEAE-Cellulose beschickten Säule (DE52: 1 χ 10 cm), die mit dem Puffer A äquilibriert worden ist, adsorbiert. Nach dem Waschen mit dem gleichen Puffer wird die ELution mit dem Puffer A mit einem linearen NaCl-Gradienten von 0 bis 1,0 m durchgeführt.

Las erfindungsgemässe Enzym (Bam F) wird mit dem Puffer A bei 0,05 bis 0,16 m NaCl eluiert.

Beispiel 3

Anstelle der in den Beispielen 1 und 2 angegebenen Mikroorganismen werden die in Tabelle II aufgeführten Stämme unter den Bedingungen von Beispiel 1 gezüchtet.

Aus der Fraktion I werden die erfindungsgemässen Enzyme Bsu und Bee 14579 erhalten.

Die erfindungsgemässen Enzyme Bsu M, Bsu 6633, Bsu 1193, Bsu 1231, Bsu 1192, Bsu 1076, Bsu 1114, Bam K, Bsu 1259, Bee R, Bee I70, Bsu 1247, Bee 1229, Bme 205, Bme 899 und Bsp 1286 werden jeweils aus der Fraktion II erhalten.

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-32-L e e r s e i t e

Claims

VOSSIUSVOSSIUS HILTL. Patentanwälte:

SIEBERTSTRASSE 4 ■ 800O MÜNCHEN 80 · PHONE: (ΟΘΟ) 47 4O78 27 3327

CABUE: BENZOLPATENT MÜNCHEN · TELEX 8-994S3 VOPAT D

2 2. JULI 1977

u.Z.: M 289
Case: OP 77059-02
RIKAGAKU KENKYUSHO
Wako-shi, Saitama-ken, Japan

"Endonucleasen und Verfahren zu ihrer Herstellung"

Priorität: 23. Juli 1976, Japan, Nr. 87883/1976

Patentansprüche

1. Endonucleasen, die selektiv spezifische Nucleinsäuren erkennen und die Phosphodiesterbindung von Nucleinsäuren unter Bildung von Bruchstücken mit diskretein Molekulargewicht abspalten, dadurch gekennzeichnet, dass sie aus zellfreien Extrakten der zur Gattung Bacillus gehörenden Mikroorganismen ATCC 6O5I, ATCC 6633, IAM 1193, IAM 1231, IAM II92, IAM 114-5, IAM IO7S, IAM 1114-, ATCC 23350, IAM 1523, IAM 1259, ATCC 14579, ATCC 31293, ATCC 31292, IAM 1247, IAM 1229, ATCC 31294, AHU 1387, IAM IO3O und IAM 1286 erhalten worden sind.

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ORIGINAL INSPECTED

2. Endonuclease R Bsu M.

3. Endonuclease B Bsu 6633.

4. Endonuclease R Bsu 1193.

5. Endonuclease R Bsu 1231.

6. Endonuclease R Bsu 1192.

7. Endonuclease R Bsu 1145.

8. Endonuclease R Bsu 1076. *

9. Endonuclease R Bsu 1114.

10. Endonuclease R Bam P.

11. Endonuclease R Bam K.

12. Endonuclease R Bsu 1259.

13. Endonuclease R Bee 14579.

14. Endonuclease R Bee R.

15. Endonuclease R Bee I70.

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16. Endonuclease R Bsu 1247.

17. Endonuclease R Bee 1229.

18. Endonuclease R Bme 205.

19. Endonuclease R Bpu 1387.

20. Endonuclease R Bme 899.

21. Endonuclease R Bsp 1286.

22. Verfahren zur Herstellung von Endonucleasen nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man eine der zur Gattung Bacillus gehörenden Spezies ATCC 6O5I, ATCC 6633, IAM II93, IAM 1231, IAM 1192, IAM 1145, IAM 1076, IAM 1114, ATCC 2335O, IAM 1523, IAM 1259, ATCC 14579, ATCC 31293, ATCC 31292, IAM 1247, IAM 1229, ATCC 31294, AHU 1387, IAM 1030 und IAM 1286 in einem Nährmedium züchtet, die Zellen gewinnt, daraus einen zellfreien Extrakt herstellt, diesen Extrakt fraktioniert und den fraktionierten Extrakt reinigt.

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