CN115612684A - Gmp级质粒dna大规模简化生产方法 - Google Patents

Gmp级质粒dna大规模简化生产方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开一种GMP级质粒DNA大规模简化生产方法，其包括使用氯化钙处理含质粒DNA的裂解液产生沉淀和料液；分别使用第一过滤器和第二过滤器对所述料液澄清过滤得到上清液。其中所述第一过滤器为深层过滤器，孔径为1μm‑10μm，所述第二过滤器的孔径为0.8μm/0.45μm；使用膜包超滤对所述上清液进行浓缩，并使用缓冲液换液直至上清液pH值与缓冲液的pH值相当；使用阴离子交换层析使质粒DNA与杂质分离。本发明提供更为简单高效的质粒纯化方法，提升质粒产量的同时，降低制备成本。

Description

GMP级质粒DNA大规模简化生产方法
技术领域
本发明涉及质粒纯化领域，具体地涉及GMP级质粒DNA大规模简化生产方法。
背景技术
生物制药行业对GMP级质粒DNA大规模生产的需求日益强烈，包括开发基于mRNA的疫苗和治疗药物的热情空前高涨，而其需要质粒DNA作为mRNA体外转录过程的起始材料。另外，基因治疗和基于基因修饰的细胞治疗中，病毒载体是目前最有效的基因递送工具(如腺相关病毒和慢病毒载体)，而质粒DNA即为生产上述病毒的关键原材料。随着对GMP级质粒DNA质量和产量需求的提高，对制造商的挑战也在不断加大。因此，应对生产挑战、以满足大规模需求，对于实现提高效率和节约成本的解决方案至关重要。
质粒DNA的生产工艺流程包括：细菌发酵、碱性裂解、澄清过滤、质粒层析纯化。对于质粒层析纯化步骤，传统的纯化工艺为三步法层析，包括凝胶过滤层析、亲和层析和阴离子交换层析，用于去除样品中的杂质，如宿主RNA残留、开环DNA和内毒素等。传统层析方式因为包含三种层析方式，费时费力、层析填料成本高、最终质粒成品的回收率偏低，难以满足进一步扩大质粒DNA生产规模的需要。
因此，需要开发一种更为简单高效的质粒纯化方法，提升质粒产量的同时，降低制备成本。
背景技术中的信息仅仅在于说明本发明的总体背景，不应视为承认或以任何形式暗示这些信息构成本领域一般技术人员所公知的现有技术。
发明内容
为解决现有技术中的至少部分技术问题，本发明提供一种简化的GMP级质粒DNA大规模生产方法。具体地，本发明包括以下内容。
本发明提供一种GMP级质粒DNA大规模简化生产方法，其包括以下步骤：
(1)使用氯化钙处理含质粒DNA的裂解液产生沉淀和料液；
(2)分别使用第一过滤器和第二过滤器对所述料液澄清过滤得到上清液，其中，所述第一过滤器的孔径为1μm-10μm，所述第二过滤器为两级过滤，其孔径分别为0.8μm和0.45μm；
(3)使用膜包超滤对所述上清液进行浓缩，并使用缓冲液换液直至上清液pH值与缓冲液的pH值相当；和
(4)使用阴离子交换层析使质粒DNA与杂质分离。
在某些实施方案中，根据本发明所述的GMP级质粒DNA大规模简化生产方法，其中，步骤(1)中加入的氯化钙的量足以使其在料液中的浓度为0.8-1.2M。
在某些实施方案中，根据本发明所述的GMP级质粒DNA大规模简化生产方法，其中，步骤(2)中，所述第一过滤器为深层过滤器，所述第二过滤器为囊氏滤器。
在某些实施方案中，根据本发明所述的GMP级质粒DNA大规模简化生产方法，其中，步骤(3)中，膜包超滤的最大分子量孔径为100kD；所述缓冲液包含Tris-HCl、EDTA、氯化钠，其pH值为7.5±0.2。
在某些实施方案中，根据本发明所述的GMP级质粒DNA大规模简化生产方法，其中，步骤(4)中，所述阴离子交换层析柱材料优选为聚合物微球，直径为40-90微米，优选40-60微米。所述聚合物包括骨架和连接到所述骨架的分支结构。在示例性实施方案中，分支结构具有官能团，优选阴离子官能团，且分支结构通过共价键结合到所述聚甲基丙烯酸酯骨架。分支结构的实例包括R-COOH。R为亚烷基，如(CH2)n基团，其中，n为0-10，优选0-5的整数。n越大，分离效果趋向于变差。分支结构的数量不限定，优选地，每分子聚合物包含5-30个，如5-20个，10-15个等。该范围内的分支结构的聚合物作为交换层析材料能够有效地将蛋白、内毒素以及细菌DNA等与质粒DNA进行区分，获得高的回收率和纯度。如果分支结构数量越大，则分离效果趋向于变差。
在某些实施方案中，根据本发明所述的GMP级质粒DNA大规模简化生产方法，其中，阴离子交接层析包括色谱柱清洗、平衡、上样、再平衡、冲洗、洗脱。清洗、平衡、上样、再平衡、冲洗、洗脱使用特定组成或性质的溶液，从而确保质粒DNA与细菌DNA等质杂有效分离。如果各步骤中使用的溶液性质如pH值或组成变化，则会影响到阴离子交接层析材料的性质，进而影响分离效果，甚至完全不能分离。
在某些实施方案中，根据本发明所述的GMP级质粒DNA大规模简化生产方法，其中，所述清洗使用纯化水，所述平衡或再平衡时的平衡缓冲液包含100±5mM Tris-HCl、10±2mM EDTA、0.3±0.1M NaCl，所述冲洗时的冲洗缓冲液包含100±5mM Tris-HCl、10±2mMEDTA、0.65±0.1M NaCl，所述洗脱时的洗脱缓冲液包含100±5mM Tris-HCl、10m±2MEDTA、1.0±0.1MNaCl。
在某些实施方案中，根据本发明所述的GMP级质粒DNA大规模简化生产方法，其中，步骤(3)中当UV260大于40mAU时开始收集且UV260小于100mAU后停止收集。
在某些实施方案中，根据本发明所述的GMP级质粒DNA大规模简化生产方法，收集后的样品采用膜包超滤的方式进一步进行换液，膜包超滤的最大分子量孔径为100kD；所述缓冲液包含Tris-HCl、EDTA、氯化钠，其pH值为7.5±0.2。
在某些实施方案中，根据本发明所述的GMP级质粒DNA大规模简化生产方法，其中，所述裂解液的制备包括将湿菌加入细胞重悬液，充分混匀后，缓慢加入与细胞重悬液等体积的裂解液，混匀，然后加入中和液，混匀，形成白色沉淀物，得到裂解液。
对于质粒DNA的生产，本发明使用一步层析(阴离子交换层析)代替传统的三步层析(凝胶过滤层析、亲和层析和阴离子交换层析)对质粒DNA进行纯化。以一批次质粒生产为例，在保证最终质粒产品符合《中国药典》和FDA法规规定的质控指标外，大大缩短了纯化工艺所需的时间，对应的人员成本及试剂耗材成本是传统三步法纯化工艺的三分之一。另外，质粒产量可以大于0.6mg质粒/g湿菌，大大提升了企业的效益产出，满足了质粒规模扩大生产的需求。
附图说明
图1传统质粒制备流程图。
图2本发明示例性质粒DNA制备流程图。
图3本发明示例性阴离子交换层析典型色谱图。
图4本发明阴离子交换一步层析纯化过程中各色谱峰对应的胶图。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为具体公开了该范围的上限和下限以及它们之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。除非另有说明，否则“％”为基于重量的百分数。
实施例
本实施例为示例性质粒DNA制备方法，其制备工艺流程图如图2所示，包括以下步骤：
(1)对高密度发酵后的大肠杆菌湿菌进行碱裂解，获得裂解液；
(2)对裂解液进行氯化钙沉淀；
(3)对氯化钙沉淀后的裂解液进行澄清过滤；
(4)用膜包对澄清过滤后液体进行超滤浓缩及换液；
(5)对换液后样品进行阴离子交换层析纯化，获得纯化质粒。
具体操作步骤为：
一、碱裂解步骤：
高密度发酵后离心收获的湿菌，按每克湿菌加入20ml细胞重悬液(25mMTris--HCl，10mM EDTA，pH8.0)的比例加入，充分混匀后，缓慢加入与细胞重悬液等体积的裂解液(0.2M NaOH，1％SDS)，混匀，室温下静置5min，整个溶液变得粘稠且均匀。加入中和液(3M乙酸钾一乙酸)，混匀，形成白色沉淀物，得到裂解液。
二、氯化钙沉淀步骤：
向裂解液中缓慢加入5M氯化钙溶液至终浓度为1M，搅拌均匀后，静置1h；氯化钙加入的目的是沉淀宿主菌长链RNA、宿主菌基因组DNA及宿主蛋白等杂质。
三、澄清过滤步骤：
用深层过滤器(1μm-10μm)对料液进行澄清过滤，除去菌体碎片，获得上清液。后经0.8μm/0.45μm两级囊氏滤器进行澄清过滤，便于后续的膜包浓缩换液。
四、膜包超滤浓缩及换液步骤：
用截留分子量为100KD的超滤膜包，对澄清过滤后上清液进行浓缩。将超滤膜包连接到超滤系统，对样品进行10倍体积浓缩(ΔP为0.1-1.2bar，TMP为0.1-1.2bar)；使用换液缓冲液(10mM Tris-HCl、1mM EDTA和0.3M NaCl，pH7.5±0.1)进行20倍体积换液，直至裂解液pH换液缓冲液接近(pH7.5-8.0)。
五、阴离子交换层析步骤：
进行阴离子交换层析(合成聚甲基丙烯酸酯，在线性聚合物链上分布有-CH2COOH)的目的是利用质粒与宿主DNA、宿主蛋白、内毒素带电情况不同，进而与层析介质的结合强度不同，最终将质粒DNA与宿主DNA、宿主蛋白、内毒素等杂质分子分离开。
阴离子交换层析-清洗色谱柱：用不少于4.0CV的纯化水冲洗色谱柱。
阴离子交换层析-平衡色谱柱：层析柱清洗完成后，用不少于4.0CV的平衡缓冲液(100mM Tris-HCl、10mM EDTA、0.3M NaCl)冲洗色谱柱。
阴离子交换层析-上样：当所有基线都平稳后，将膜包换液后的样品进行上样。
阴离子交换层析-再平衡色谱柱：上样结束后，用不少于2.0CV的平衡缓冲液冲(100mM Tris-HCl、10mM EDTA、0.3M NaCl)洗色谱柱。
阴离子交换层析-冲洗：再平衡完成后用4.0CV以上的冲洗缓冲液(100mM Tris-HCl、10mM EDTA、0.65M NaCl)洗涤色谱柱，收集冲洗峰。
阴离子交换层析-洗脱：冲洗结束后，用洗脱缓冲液(100mM Tris-HCl、10mM EDTA、01.0M NaCl)洗脱质粒，从UV260大于40mAU后开始收集。UV260小于100mAU后停止收集，将收集后的样品进行换液，用TE缓冲液调整浓度至1.0±0.1mg/ml，并除菌过滤、分装，即得到质粒终产品。
阴离子交换层析的典型色谱图如图3所示，其主要包括三个主要峰，分别为流穿峰、RNA杂质峰和质粒峰。其中：
流穿峰：样品上样过程中对应的色谱峰；
RNA杂质峰：冲洗缓冲液(100mM Tris-HCl、10mM EDTA、0.65M NaCl)洗涤色谱柱时，出现的杂质峰，主要成分为宿主RNA；
质粒峰：洗脱缓冲液(100mM Tris-HCl、10mM EDTA、01.0M NaCl)洗脱层析柱，对应的目的峰。
图4阴离子交换一步层析纯化过程中各色谱峰对应的胶图。图4中，从左到右依次为M、Marker；1膜包浓缩换液后样品；2阴离子交换层析上样时收集的流穿峰；3阴离子交换层析冲洗缓冲液冲洗对应的RNA杂质峰；4阴离子交换层析洗脱缓冲液洗脱对应的质粒峰。
下表1中列出了质粒作为生物制品重要的原材料，相关法规对其质控指标的具体要求。根据以上要求，发明人采用本发明的阴离子交换一步层析工艺，进行了三批次的质粒生产，验证质控指标是否符合法规要求，具体结果见表2。
表1、GMP级质粒质量标准即来源依据
Figure BDA0003920170510000071
Figure BDA0003920170510000081
表2阴离子交换一步层析纯化得到的三批次质粒质控指标结果
Figure BDA0003920170510000082
从表2可以看出，采用本发明阴离子交换一步法层析，最终质粒终产品的质控指标，均符合法规要求，证明阴离子交换一步法层析纯化得到的质粒，完全可以用于GMP级质粒的生产。
表3传统三步法三批次质粒质控指标结果
Figure BDA0003920170510000091
尽管本发明已经参考示例性实施方案进行了描述，但应理解本发明不限于公开的示例性实施方案。在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的示例性实施方案做多种调整或变化。权利要求的范围应基于最宽的解释以涵盖所有修改和等同结构与功能。

Claims (10)

1.一种GMP级质粒DNA大规模简化生产方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)使用氯化钙处理含质粒DNA的裂解液产生沉淀和料液；
(2)分别使用第一过滤器和第二过滤器对所述料液澄清过滤得到上清液，其中，所述第一过滤器的孔径为1μm-10μm，所述第二过滤器为两级过滤器，其孔径分别为0.8μm和0.45μm；
(3)使用膜包超滤对所述上清液进行浓缩，并使用缓冲液换液直至上清液pH值与缓冲液的pH值相当；和
(4)使用阴离子交换层析使质粒DNA与杂质分离。
2.根据权利要求1所述的GMP级质粒DNA大规模简化生产方法，其特征在于，步骤(1)中加入的氯化钙的量足以使其在料液中的浓度为0.8-1.2M。
3.根据权利要求1所述的简化的GMP级质粒DNA大规模生产方法，其特征在于，步骤(2)中，所述第一过滤器为深层过滤器，所述第二过滤器为囊氏滤器。
4.根据权利要求1所述的GMP级质粒DNA大规模简化生产方法，其特征在于，步骤(3)中，膜包超滤的最大分子量孔径为100kD；所述缓冲液包含Tris-HCl、EDTA、氯化钠，其pH值为7.5±0.2。
5.根据权利要求1所述的GMP级质粒DNA大规模简化生产方法，其特征在于，步骤(4)中，所述阴离子交换层析柱材料包括骨架和连接到所述骨架的分支结构，其中，所述分支结构具有官能团，优选阴离子官能团，所述骨架为聚甲基丙烯酸酯骨架。
6.根据权利要求5所述的GMP级质粒DNA大规模简化生产方法，其特征在于，阴离子交接层析包括色谱柱清洗、平衡、上样、再平衡、冲洗、洗脱。
7.根据权利要求6所述的GMP级质粒DNA大规模简化生产方法，其特征在于，所述清洗使用纯化水，所述平衡或再平衡时的平衡缓冲液包含100±5mM Tris-HCl、10±2mM EDTA、0.3±0.1M NaCl，所述冲洗时的冲洗缓冲液包含100±5mM Tris-HCl、10±2mM EDTA、0.65±0.1M NaCl，所述洗脱时的洗脱缓冲液包含100±5mM Tris-HCl、10m±2M EDTA、1.0±0.1MNaCl。
8.根据权利要求1所述的GMP级质粒DNA大规模简化生产方法，其特征在于，步骤(3)中当UV260大于40mAU时开始收集且UV260小于100mAU后停止收集。
9.根据权利要求8所述的GMP级质粒DNA大规模简化生产方法，其特征在于，收集后的样品采用膜包超滤的方式进一步进行换液，膜包超滤的最大分子量孔径为100kD；所述缓冲液包含Tris-HCl、EDTA、氯化钠，其pH值为7.5±0.2。
10.根据权利要求1所述的GMP级质粒DNA大规模简化生产方法，其特征在于，所述裂解液的制备包括将湿菌加入细胞重悬液，充分混匀后，缓慢加入与细胞重悬液等体积的裂解液，混匀，然后加入中和液，混匀，形成白色沉淀物，得到裂解液。
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