CN105567672A - 包含高浓度的生物活性分子的组合物及其制备工艺 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及包含高浓度的生物活性分子的组合物及其制备工艺。公开了用于从细菌细胞制备具有感兴趣的生物活性分子的高纯度样品的大规模工艺。该方法包括以下步骤：通过使所述大量细胞的细胞悬浮液与溶胞溶液接触制备溶胞产物溶液；用中和溶液中和所述溶胞产物溶液以制备包含被中和的溶胞产物溶液和碎片的分散体；通过至少一个过滤器过滤所述分散体；对所述被中和的溶胞产物溶液进行离子交换分离以产生离子交换洗出液；和对所述离子交换洗出液进行疏水作用分离以产生疏水作用溶液。此外，提供了包含通过公开的大规模工艺制备的大量质粒DNA的组合物。

Description

包含高浓度的生物活性分子的组合物及其制备工艺
本申请是申请日为2008年5月23日的中国专利申请200880016945.5“包含高浓度的生物活性分子的组合物及其制备工艺”的分案申请。
相关申请的交叉引用
本申请要求于2007年5月23日提交的美国临时申请第60/939,792号的利益，其内容在此通过引用并入。
技术领域
本发明涉及包含高浓度的诸如质粒的生物活性分子的大批组合物(bulkcomposition)以及制备这样的组合物的工艺。
背景技术
在细胞中产生并从细胞分离的生物活性分子存在许多用途。通过引用在此并入的美国公布序列号20050014245公开了用于生物材料制备的设备和方法。生物活性分子包括蛋白和核酸分子。在活细胞中制备这样的分子提供了相对可选择的制备方法的许多优势，但当从细胞中提取生物活性分子时出现了分离和纯化问题。在细胞中存在多种组分，这阻碍实现感兴趣的生物活性分子的高产率，也表示可能的不希望的污染物进入最终产品。
由于非病毒性基因疗法和DNA疫苗领域的出现，质粒制备是感兴趣的领域。质粒是大的并且复杂的高分子，除非断裂，其保持超螺旋DNA结构。与其使用合成方法，在多种情况下，在生物系统中制备它们并随后从那些系统中分离并纯化它们是更具有成本效益的。质粒的生物制备通常采取使包含感兴趣的质粒的大肠杆菌(Escherichiacoli)(“E.coli”)发酵的方式。
细胞溶胞和随后的用于制备用于纯化的工艺流的处理步骤是在任何质粒工艺中最困难、复杂和重要的步骤。在该过程中，对于每次质粒制备的运行定义产率和质量。对最佳方法的探求已经成为获得商业能力可接受的工艺的障碍，所述最佳方法是连续的、可缩放的并且产生可以不管质粒尺寸以高浓度配制的高质量产品。
使用碱和洗涤剂溶解细菌以纯化质粒是常用的技术。令人遗憾地，该方法对于大规模制备(或放大生产)呈现出显著的挑战。首先，含有溶胞溶液的悬浮细胞的完全混合在小规模下通过简单地使包含该细胞的容器涡旋或颠倒而容易操控。然而，这在其中体积可以在几十升或几百升范围内的大规模下是不现实的。用于混合大体积液体的常用技术，例如叶轮混合，是有问题的，因为当某些细胞在最初的混合后开始溶解时，它们释放显著增加溶液粘度的基因组DNA。这种粘度上的增加显著妨碍了进一步混合。另一挑战在于，在加入碱性溶胞溶液后在高pH下过多的孵育可导致质粒的永久变性，使其不适于大部分随后的用途，特别是用于治疗目的的用途。此外，众所周知，在该步骤的混合应当是完全的但足够温和的(即，低剪切)以防止大量来自絮状沉淀的物质进入含质粒的溶液。大量的宿主基因组DNA和内毒素存在于絮状沉淀中并且如果它们与质粒混合，它们在随后的纯化期间可能难以从质粒中分离。因此，质粒的大规模制备以某种方式使大量细胞暴露于溶胞溶液、使其混合并中和溶胞产物以最优化质粒产率、最小化质粒降解和最大化除去其他细胞成分以便该物质可被进一步纯化而以相对大的体积制备高浓度、高质量、高纯度的最终产品。
存在多种纯化质粒的现有方法；然而，这些方法不适于大规模制备。实验室规模的纯化技术不能简单地放大用于涉及大规模质粒制备的体积。大规模制备需要产率和分子完整性的最优化而同时使污染物的去除和质粒浓度最大化。在制备大量高浓度的质粒DNA中，存在将质粒维持为超螺旋形式和开环松弛形式的问题。储存条件通常需要高盐，并且即使在盐存在下，随时间的分子降解仍然是个问题。许多现有的纯化方法依赖于使用潜在地危险的、毒性的、诱变的或污染的物质和/或昂贵的物质或设备，这又是对于大规模制备所不期望的。某些现有的纯化方法利用酶的使用以消化蛋白用于最终的消除，而这样的酶对于大规模生产是昂贵的并且可造成生物污染的危险。
存在对诸如质粒的感兴趣的生物活性分子的大规模制备方法的需求，其中最终产品可以具有成本效益的方式制备，所述具有成本效益的方式例如最少的设备和/或最少的工艺步骤、高产率、高浓度和最少降解并且不存在杂质、污染物和不希望的物质。存在对具有高浓度和最少降解及存在最少杂质、污染物和不希望的物质的大量质粒溶液的需求以及对这样的溶液的制备方法的需求。对大量质粒的需求大于对是低拷贝数质粒的那些质粒的需求，所述低拷贝数质粒需要非常大量的细胞以得到毫克(“mg”)范围和以上的质粒量。
发明内容
本发明的一方面包括用于从细菌细胞中制备至少一种感兴趣的生物活性分子的高纯度样品的大规模工艺。所述大规模工艺包括以下步骤：
a)通过使所述大量细胞的细胞悬浮液与溶胞溶液接触制备溶胞产物溶液；
b)用中和溶液中和所述溶胞产物溶液以制备包含被中和的溶胞产物溶液和碎片的分散体；
c)通过至少一个过滤器过滤所述分散体；
d)对所述被中和的溶胞产物溶液进行离子交换分离以产生离子交换洗出液；和
e)对所述离子交换洗出液进行疏水作用分离以产生疏水作用溶液。在该方面的某些实施方案中，大规模工艺还包括通过所述疏水作用溶液的超滤制备至少一种生物活性分子的溶液的步骤。
本发明进一步方面包括用于从细菌细胞制备至少一种感兴趣的生物活性分子的高纯度样品的大规模工艺，其包括以下步骤：使细菌细胞以细胞分散体与溶胞溶液接触以形成溶胞产物溶液；通过用泡罩塔混合器将中和溶液混入所述溶胞产物溶液而中和所述溶胞产物溶液以形成被中和的混合物；通过初级过滤器和二级过滤器过滤所述被中和的混合物以形成滤过的溶液；使所述滤过的溶液通过离子交换柱以形成离子交换溶液；使所述离子交换溶液通过疏水作用柱或疏水作用膜以形成疏水作用溶液；和超滤所述疏水作用溶液以形成至少一种感兴趣的生物活性分子的高纯度样品；其中在从接触步骤到使滤过的溶液通过的步骤的大规模工艺中的一个步骤向随后的步骤的每次过渡基本上连续发生。
在本发明的另一方面中，提供了组合物，其包含通过本文描述和公开的方法制备的至少一种感兴趣的生物活性分子，其中至少一种感兴趣的生物活性分子是DNA质粒。在某些实施方案中，所述组合物包含在溶液中的至少一种约10mg或更多的量的DNA质粒，其中高纯度的所述质粒是以大于约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％存在的质粒。
附图说明
通过参考附图，本领域技术人员可更好地理解本发明的多个目的和优势，其中：
图1显示用于以连续流工艺从细菌细胞中分离和纯化感兴趣的生物活性分子的一个实施方案的示意图。
图标含义如下：
101：细胞重悬罐
102：溶胞溶液罐
103：NP溶液罐
104：用于细胞重悬的泵
105：用于溶胞溶液的泵
106：用于NP溶液的泵
107：串联混合器
108：保持盘管
109：泡罩塔混合器
110：压缩气体罐
111：用于粗溶胞产物的容器
112：用于初级过滤的泵
113：初级过滤器
114：用于二级过滤的泵
115：二级过滤器
116：用于三级过滤器的泵(可选择的)
117：三级过滤器(可选择的)
118：用于净化的溶胞产物的泵
119：用于净化的溶胞产物的容器
120：水罐
121：混合器
122：用于稀释的溶胞产物的容器
123：用于MustangQ的泵
124：MustangQ柱
图2显示包含来自以下实施例1的样品的电泳凝胶的图。第1泳道表示超螺旋质粒标准梯带(supercoiledplasmidladder)(Invitrogen)；第2泳道含有质粒A的细胞溶胞产物；第3泳道：含有质粒A的Q阴离子交换后的产物；第4泳道：用疏水作用纯化后的质粒A的产物；和第5泳道：UF后混合的含有质粒A的最终产物。
图3显示包含来自实施例3的样品的电泳凝胶的图。第1泳道表示超螺旋质粒标准梯带(Invitrogen)；第2泳道表示在使用48μm褶裙式滤筒(pleatedcartridge)的初级过滤之后的溶胞产物；第3泳道表示在使用1μm褶裙式滤筒的二级过滤之后的滤液；第4泳道表示在使用COHCPod过滤器的三级过滤之后的滤液；第5泳道表示在经过MustangQ阴离子交换步骤之后的洗出液产物级分＃1；和第6泳道表示Q洗出液的第二级分。
具体实施方式
提供了从细胞中纯化感兴趣的生物活性分子的方法以便从该细胞中以高水平的纯度与浓度纯化感兴趣的生物活性分子。优选地，所述感兴趣的生物活性分子是质粒或DNA质粒。所述细胞可以是包含感兴趣的生物活性分子的任何细胞。在某些实施方案中，所述细胞是微生物细胞，例如诸如细菌细胞的原核细胞。在某些实施方案中，它们是大肠杆菌细胞。所述细胞可以通过诸如发酵的任何方式制备或产生。用于发酵细胞的方法是本领域技术人员众所周知的。可使用本发明从细胞中提取任何感兴趣的生物活性分子。在某些实施方案中，可使用本发明提取超过一种感兴趣的生物活性分子。所述感兴趣的生物活性分子可以是诸如核酸分子或蛋白的高分子。在某些实施方案中，所述感兴趣的生物活性分子可以是质粒。
可互换使用的术语“质粒”或“DNA质粒”是指环状DNA分子，其为能够独立于染色体DNA复制的、与染色体DNA分离的染色体外DNA分子。编码序列或转基因通常包含在DNA质粒内，并且在存在时，DNA质粒被提及为表达质粒或表达构建体。编码序列或“编码核酸序列”可包括可操作地与调节元件连接的起始和终止信号，所述调节元件包括能够指导在核酸分子所施用于的个体的细胞中表达的启动子和多腺苷酸化信号。
提及所描述的工艺时使用的术语“大规模”是指从细菌细胞或细菌细胞的悬浮液中产生约1克或更多量的至少一种生物活性分子(特别是DNA质粒)的纯化工艺和/或需要约1千克或更多量的细菌细胞糊(cellpaste)的溶胞的纯化工艺。
提及生物活性分子(特别是DNA质粒)的纯度水平时使用的术语“高纯度”是指以至少大于或等于约90％；并且优选地大于或等于约91％，大于或等于约92％，大于或等于约93％，大于或等于约94％，大于或等于约95％，大于或等于约96％，大于或等于约97％，大于或等于约98％或大于或等于约99％的水平纯化来自宿主细菌细胞的分子。
提及本文所述工艺时使用的术语“连续的”或“基本上连续的”是指物质(或溶液或悬浮液)在纯化工艺的每个步骤至每个随后的步骤之间的连续流动，所述步骤起始于纯化工艺的开始直到加载离子交换色谱柱的步骤。例如，随着分散体的细菌细胞与溶胞溶液在接触步骤中接触以形成溶胞产物溶液，这样的溶胞产物溶液将直接流入用中和溶液中和的下一步骤。这些在步骤之间的连续过渡消除了在纯化工艺步骤之间的保持步骤或孵育步骤。
术语“生物活性分子”是指包含在细菌内的、在其功能状态的分子或生物分子，并且在某些实施方案中，特别是指DNA质粒。这样的DNA质粒可被分离并用于转染感兴趣的细胞。本发明的组合物包含至少一种类型的生物活性分子。在某些实施方案中，本发明的组合物包含超过一种类型的生物活性分子。
质粒在它们的拷贝数上变化很大，取决于它们包含的复制起点，例如，pMB1或pSC101，所述复制起点决定它们是在松弛控制下还是在严紧控制下；并取决于质粒及其相关的插入序列的尺寸。诸如pUC系列及衍生质粒的某些质粒存在变异，这允许它们在细菌细胞内达到很高的拷贝数。基于pBR322的质粒通常保持在较低的拷贝数。很大的质粒通常保持在每个细胞很低的拷贝数。本发明的某些实施方案涉及质粒纯化工艺，该质粒纯化工艺允许以具有成本效益和最少步骤的制备工艺从细胞(优选细菌细胞)中大规模地纯化质粒以得到例如克量级的大量质粒(目的是保持较高产率)。在某些实施方案中，质粒是低拷贝数的质粒。对提供的工艺和由此制备的生物活性分子来说，低拷贝数质粒是获得小于或等于约300、小于或等于约100、小于或等于约50、小于或等于约20、小于或等于约10、或小于或等于约5的拷贝数的质粒。
本发明的一方面包括用于从细菌细胞中制备至少一种感兴趣的生物活性分子的高纯度样品的大规模工艺。所述大规模工艺包括以下步骤：
a)通过使所述大量细胞的细胞悬浮液与溶胞溶液接触制备溶胞产物溶液；
b)用中和溶液中和所述溶胞产物溶液以制备包含被中和的溶胞产物溶液和碎片的分散体；
c)通过至少一个过滤器过滤所述分散体；
d)对所述被中和的溶胞产物溶液进行离子交换分离以产生离子交换洗出液；和
e)对所述离子交换洗出液进行疏水作用分离以产生疏水作用溶液。
在一个实施方案中，所述大规模工艺包括制备溶胞产物溶液步骤，该步骤包括在高剪切串联混合器中将所述细胞悬浮液与溶胞溶液混合。
在某些实施方案中，制备步骤包括在混合器中使所述细胞悬浮液与所述溶胞溶液接触约1分钟至约20分钟，优选地从约4分钟至约8分钟，并且更优选地约5分钟的持续时间。在某些实施方案中，所述中和步骤包括在泡罩混合器(bubblemixer)中将所述溶胞产物溶液与所述中和溶液混合。在某些实施方案中，进行疏水作用分离的步骤包括使用疏水作用柱或疏水作用膜进行疏水作用分离以形成疏水作用溶液。疏水作用分离步骤可以是感兴趣的生物活性分子通过结合至疏水作用膜或柱的分离，这使杂质能够流过或被洗掉。在某些实施方案中，感兴趣的生物活性分子可流过疏水作用柱而杂质结合。在某些实施方案中，感兴趣的生物活性分子流过疏水作用膜(或HIC膜)(本文称为“方法I”)。在某些实施方案中，感兴趣的生物活性分子结合至HIC柱，例如丁基柱(butylcolumn)(本文称为“方法II”)。在某些实施方案中，可使用HIC膜和HIC柱(例如丁基柱)的组合(本文称为“方法III”)以得到大规模量的、具有高纯度的感兴趣的生物活性分子，例如克或更大量级的DNA质粒。在某些实施方案中，疏水作用分离包括至少使用丁基疏水作用色谱的分离，目的是产生疏水作用溶液，所述疏水作用溶液是丁基疏水作用色谱溶液洗出液。
在某些实施方案中，所描述的大规模工艺还可包括通过所述疏水作用溶液的超滤而制备含有至少一种生物活性分子的溶液的步骤。此外，可以进行通过所述生物活性分子的溶液的无菌过滤而制备生物活性分子的无菌溶液的步骤。
在某些实施方案中，所述大规模工艺包括保持步骤，所述保持步骤需要将分散体保持一段时间以使被中和的溶胞产物溶液与碎片分离并然后通过至少一个过滤器过滤被中和的溶胞产物溶液。
在某些实施方案中，所述进行离子交换分离步骤是使用阴离子交换膜而进行的。优选地，离子交换分离步骤包括离子交换柱的使用，并优选地使用Q柱。
在某些实施方案中，所述大规模工艺包括连续过程或被称为连续大规模工艺，其用于从细菌细胞制备高纯度生物活性分子。所述方法包括从大规模工艺的一个步骤向随后的步骤基本上连续地过渡，并且包括通过在容器中收集溶胞产物并使分散体通过初级过滤器而使分散体中的被中和的溶胞产物溶液与碎片分离以产生最初的粗的被中和的溶胞产物溶液。在某些实施方案中，所述工艺还包括使最初的粗的被中和的溶胞产物溶液通过二级过滤器以产生随后的粗的被中和的溶胞产物溶液。
在一个实施方案中，本发明包括用于从细菌细胞制备感兴趣的生物活性分子的高纯度样品的大规模工艺，其包括以下步骤：使细菌细胞以细胞分散体与溶胞溶液接触以形成溶胞产物溶液；通过用泡罩塔混合器将中和溶液混入所述溶胞产物溶液而中和所述溶胞产物溶液以形成被中和的混合物；通过初级过滤器和二级过滤器过滤所述被中和的混合物以形成滤过的溶液；使所述滤过的溶液通过离子交换柱以形成离子交换溶液；使所述离子交换溶液通过疏水作用柱或疏水作用膜以形成疏水作用溶液；和超滤所述疏水作用溶液以形成感兴趣的生物活性分子的高纯度样品；其中在从接触步骤到使滤过的溶液通过的步骤的大规模工艺中的一个步骤向随后的步骤的每次过渡基本上连续发生。
在本发明的另一方面中提供了包含由本文所述的大规模工艺制备的感兴趣的生物活性分子的组合物，其中所述感兴趣的生物活性分子是DNA质粒。在某些实施方案中，所述组合物包含在溶液中的约10mg或更多量的DNA质粒，其中高纯度的所述质粒是以大于约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％存在的质粒。权利要求18所述的组合物，其中所述质粒的浓度为约5、6、7、8、9、10、11、12或13mg/mL。某些组合物包含超螺旋质粒水平大于约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％或95％并且优选地大于80％的质粒。某些组合物包含小于或等于约10EU内毒素每mg质粒，并且某些实施方案，所述组合物包含小于或等于约1EU内毒素每mg质粒。某些实施方案小于或等于约0.1EU内毒素每mg质粒。在某些实施方案中，所述组合物包含含有小于或等于约1.0％RNA或小于或等于约0.4％RNA的溶液。在某些优选的实施方案中，所述组合物包含含有小于或等于约1.0％蛋白、优选小于或等于约0.20％蛋白的溶液。在某些实施方案中，所述组合物包含含有小于或等于约1％基因组DNA、优选地小于或等于约0.01％基因组DNA的溶液。
包括许多本文提供的工艺步骤的本发明实施方案的实例包括以下步骤：第一步，制备并收获感兴趣的细胞；第二步，溶解细胞以将其内容物(包括感兴趣的生物活性分子)释放至溶液；第三步，将固体细胞碎片和沉淀的细胞成分与含有至少一种感兴趣的生物活性分子的流体分离；第四步，使含有感兴趣的生物活性分子的溶液经过离子交换色谱；第五步，使由离子交换色谱产生的部分纯化的物质经过疏水作用色谱；第六步，使由疏水作用色谱产生的物质经过超滤和渗滤以浓缩至少一种类型的感兴趣的生物活性分子并从溶液中除去过量的盐；第七步，使浓缩并脱盐的产物可选择地经过无菌过滤以使其适于药用，包括，例如，肌肉内递送、静脉内递送、鼻内递送、心脏内递送、气溶胶递送、经皮递送、体内电穿孔促进的向肌肉的递送、体内电穿孔促进的向皮下组织或皮内组织的递送以及其他已知的药物施用的方法。
本发明的某些实施方案包括本文公开的工艺步骤，所述工艺步骤包括但不限于以导致不受工艺保持步骤限制的生产规模的连续方式操作步骤组合。这样的工艺使医药级生物分子能够大规模制备，例如制备约1克或更多的质粒。本发明的某些实施方案排除了可证明对大规模制备或药物产品是有害的任何物质或过程，包括，例如，酶的包含、热变性、机械分离(做这样的分离的机器)，诸如离心设备，或诸如异丙醇的有机溶剂或挥发性溶剂。
感兴趣的细胞可以通过例如常规的发酵和收集方式而制备或收获。制备足量的感兴趣的细胞完全是在本领域技术人员能力之内的。例如，细胞可以是含有高拷贝数的感兴趣的质粒的大肠杆菌，并且可以使用分批或补料分批技术将含质粒的细胞发酵至高密度。用于制备这样的含质粒的大肠杆菌细胞的方法和进行这样的分批或补料分批发酵的方法是本领域技术人员众所周知的。细胞可以通过诸如离心或过滤的常规方式收获以形成细胞糊。这样的收获方法对本领域技术人员是众所周知的。此外，本领域技术人员将认识到，收获的细胞或细胞糊可以立即处理，或者以冷冻状态或冷藏状态贮存用于以后处理。
可使用溶胞溶液将收获的细胞溶解以将其内容物(包括感兴趣的生物活性分子)释放至溶液。
通常，在溶解细胞前，细胞糊可用于制备含有感兴趣的生物活性分子的细胞悬浮液。细胞可悬浮于任何合适的溶液中。在悬浮溶液中含有细胞的悬浮液可保持在罐中或其他贮存容器中。可使用两个容器，其中第二容器可用于再悬浮额外量的细胞，而第一容器用于溶胞过程。在某些实施方案中，所述悬浮溶液可包含中等浓度的缓冲液、中等浓度的螯合剂或两者。在某些实施方案中，所述悬浮溶液可包含约25mMTris-盐酸盐(“Tris-HCl”)和约10mM乙二胺四乙酸二钠(“Na2EDTA”)，pH约为8。在某些实施方案中，所述细胞悬浮液可通过将已知重量的细胞糊悬浮于已知重量的悬浮缓冲液中而制备。例如，1份细胞糊可再悬浮于约4-10份缓冲液中，在某些实施方案中，使用约6-8份缓冲液。在某些实施方案中，所得细胞悬浮液的光密度可以是约50-80OD600单位。在某些实施方案中，其可以是约60-70OD600单位。
溶胞溶液优选地包含一种或多种溶胞剂(lysisagent)，例如碱、酸、酶、有机溶剂、洗涤剂或其混合物。然而，动物衍生酶或有机溶剂的使用不是优选的，因为它们对药物产品的制备是有害的。在某些实施方案中，溶胞溶液包含碱、洗涤剂或其混合物。合适的碱包括，但不限于，氢氧化钠或氢氧化钾。洗涤剂可以是非离子的、阳离子的或阴离子的。合适的洗涤剂包括，但不限于十二烷基硫酸钠(“SDS”)、三硝基甲苯(Triton)、吐温或聚氧丙烯型试剂(基于氧化乙烯和氧化丙烯的嵌段共聚物)。对合适的碱或洗涤剂的选择完全在本领域的普通技术范围内。在某些实施方案中，溶胞溶液可包含氢氧化钠(“NaOH”)和SDS。在某些实施方案中，NaOH的浓度可以是约0.1N至约0.3N，并且在某些实施方案中是约0.2N。在某些实施方案中，SDS的浓度可以是约0.1％至约5％，并且在某些实施方案中，是约1％。在某些实施方案中，溶胞溶液可以保持在罐中或其他贮存容器中。
可以合并细胞悬浮液和溶胞溶液以溶解细胞并产生溶胞产物溶液。在某些实施方案中，它们被合并、混合并保持为混合物，持续足以促进高水平的细胞溶解并释放生物物质的时间，从而形成溶胞产物溶液。
在某些实施方案中，细胞悬浮液和溶胞溶液被保持在分离的罐中并使用一个或多个泵从这样的罐中取出。可使用“Y”形连接器使细胞悬浮液和溶胞溶液互相接触。在某些实施方案中，等体积的细胞悬浮液和溶胞溶液可以使用双头泵以相等的流速被泵送。然而，本领域技术人员将认识到，如果需要，不同体积的细胞悬浮液和溶胞溶液可以使用单独的泵以不同的速率被泵送。在某些实施方案中，细胞悬浮液和溶胞溶液通过双头泵以约0.3L/min至约2L/min同时被泵送，并且接触过的流体以约0.6L/min至约4L/min的速率离开“Y”形连接器。本领域技术人员将认识到，这些流速可容易地增加或减少，并且管道尺寸可容易地增加或减少，以满足任何处理量需求。在离开“Y”形连接器以后，接触过的细胞悬浮液和溶胞溶液可通过高剪切的串联混合器。该混合器可以是以流通模式(与分批模式相对)提供快速、高剪切混合的任何设备。在某些实施方案中，该混合器是转子/定子混合器或乳化器。本领域技术人员将认识到，多种这样的高剪切串联混合器是商业可得的。任何这样的混合器的使用完全在本发明的范围内。在某些实施方案中，该混合器是配备标准乳化器筛网(standardEmulsorscreen)(SilversonMachines，Inc.EastLongmeadow，MA)和串联组件的SilversonL4R转子/定子混合器。转子可以诸如以下的速率运转：从约500rpm至约900rpm、500-600rpm、从约500rpm至约700rpm、从约500rpm至约800rpm、从约600rpm至约700rpm、从约600rpm至约800rpm、从约600rpm至约900rpm、从约700rpm至约800rpm或从约700rpm至约900rpm。这样的混合器适于处理从约0.3L/min至约2L/min的细胞悬浮液。然而，本领域技术人员将认识到，可以替换更大规模的混合器用于处理明显更大体积的细胞悬浮液。这样的替换将由本领域技术人员仅仅用普通试验而容易地实现。使用高剪切的串联混合器促进了细胞悬浮液和溶胞溶液的完全的且快速的混合，使细胞与溶胞剂紧密接触以获得有效的溶胞。此外，混合器能够容易地适应不同的流体流速并提供用于不同流速的变速混合的灵活性。离开高剪切的串联混合器的物质然后可通过保持盘管。该盘管可简单地包括长度足以提供流体以确定的时间通过该盘管的管道。该盘管的功能是提供细胞与溶胞剂之间足够的接触时间以保证基本上完全的溶胞。同时，该盘管保证接触时间不是太长以至于具有负面结果。在某些实施方案中，例如细胞是含质粒的细胞并且溶胞溶液包含碱的实施方案，期望保证在碱中的暴露持续得足够长以获得基本上完全的细胞溶胞以及蛋白、基因组DNA和其他细胞成分基本上完全的变性。然而，还期望在碱中的暴露不太长以至于导致大量永久变性的质粒。盘管可以是一个完整的管道或被分割为2-10个管道以允许流体流速的灵活性。保持盘管使该接触时间能够被控制。在某些实施方案中，该接触时间可以是从约2分钟至约10分钟。在某些实施方案中，该接触时间可以是从约2分钟至约9分钟、从约2分钟至约8分钟、从约2分钟至约7分钟、从约2分钟至约6分钟、从约3分钟至约10分钟、从约3分钟至约9分钟、从约3分钟至约8分钟、从约3分钟至约7分钟、从约3分钟至约6分钟、从约4分钟至约10分钟、从约4分钟至约9分钟、从约4分钟至约8分钟、从约4分钟至约7分钟、从约4分钟至约6分钟、从约5分钟至约10分钟、从约5分钟至约9分钟、从约5分钟至约8分钟、从约5分钟至约7分钟或从约5分钟至约6分钟。优选地，接触时间是从约4分钟至约8分钟或从约4分钟至约6分钟。在某些实施方案中，接触时间是约5分钟。在某些实施方案中，保持盘管的长度和直径是这样的：当溶解的细胞以所期望的速率流过时获得了所期望的暴露时间。在某些实施方案中，保持盘管可以具有从约10英尺的长度至约150英尺的长度、从约25英尺的长度至约100英尺的长度或从约40英尺的长度至约60英尺的长度。在某些实施方案中，保持盘管具有约50英尺的长度，并且在某些实施方案中，保持盘管具有约100英尺的长度。保持盘管可具有从约0.5英寸至约2英寸的内径，并且在某些实施方案中为0.625英寸。还在某些实施方案中，溶解的细胞可以以下的速率离开高剪切的串联混合器并通过保持盘管：从约100mL/min至约10L/min、从约200mL/min至约8L/min、从约300mL/min至约6L/min、从约400mL/min至约4L/min、从约400mL/min至约2L/min或从约600mL/min至约1.2L/min。优选地，经过保持盘管的速率是从约0.6L/min至约10L/min。在某些优选的实施方案中，通过保持盘管的速率是约600mL/min并且在某些实施方案中，其为约1200mL/min。当生物活性分子的制备被放大时，盘管长度和直径的调整可通过本领域技术人员实现以适应或适合较大流速。从保持盘管收集溶胞产物溶液。
溶胞产物溶液通过将其与中和溶液(还称为中和沉淀溶液)合并而被中和，以制备含有被中和的溶胞产物溶液和碎片的分散体。然后可保持所得分散体以促进被中和的溶胞产物溶液与碎片分离。
在某些实施方案中，包含溶解的细胞的溶胞产物溶液可通过将其与中和溶液在中和室中混合而被中和。溶胞产物溶液的这种中和可通过在中和室中混合而促进。在某些实施方案中，这种中和可在后面接着在泡罩塔混合器中泡罩混合(bubblemixing)。优选地，中和与泡罩混合在泡罩塔混合器中一起发生。在某些实施方案中，离开保持盘管的溶胞产物溶液可进入泡罩塔混合器中而同时，泵可将中和/沉淀溶液从另一个罐中递送至泡罩塔混合器中。在某些实例中，还同时地，来自另一个罐的压缩气体可鼓泡进入泡罩塔混合器的底部。在某些实施方案中，溶胞产物溶液可从一侧进入塔的底部，而中和/沉淀溶液可从相对侧进入底部。压缩气体可经过烧结的鼓泡器被鼓泡进入，所述烧结的鼓泡器设计为基本上均匀地沿塔的横截面递送气泡。包含溶解的细胞的溶胞产物溶液和中和溶液垂直向上流过塔并且经过顶部附近的一侧上的出料口离开。经过垂直的液体柱的气泡通道用于混合溶胞产物溶液和中和/沉淀溶液。由上升的气泡提供的混合是完全但温和和低剪切的。当中和/沉淀溶液与溶胞产物溶液的溶解的细胞混合时，细胞成分从溶液中沉淀。可在泡罩塔混合器的顶部提供通气管以排出过量的气体。
在某些实施方案中，溶胞产物溶液包含用碱、洗涤剂或其混合物溶解的含质粒的细胞，并且中和/沉淀溶液中和碱并沉淀诸如蛋白、膜、内毒素和基因组DNA的宿主细胞成分。在某些实施方案中，所述碱可以是NaOH，所述洗涤剂可以是SDS并且所述中和/沉淀溶液可包含乙酸钾、乙酸铵或其混合物。在某些实施方案中，所述中和/沉淀溶液可包含含有约1M乙酸钾和从约3M至约7M的乙酸铵的未缓冲的溶液。使用这样的中和/沉淀溶液制备出pH从约7至约8的悬浮液，所述悬浮液优选为酸性pH，因为酸性条件可导致DNA的脱嘌呤。在某些实施方案中，中和/沉淀溶液可以从约2℃至约8℃的冷冻的形式提供。
泡罩塔混合器提供低剪切形式的混合并因此避免了基因组DNA和内毒素向被中和的溶胞产物溶液中的过度释放。本领域技术人员将能够确定经过泡罩塔混合器的流动气体的合适的速率。可使用约2标准升每分钟至约20标准升每分钟(“slpm”)的气体流速。可使用任何合适的气体，包括但不限于，空气、氮气、氩气和二氧化碳。气体可以是过滤的压缩空气。
溶胞产物溶液和中和溶液的合并导致包含被中和的溶胞产物溶液和碎片的分散体的产生。被中和的溶胞产物溶液可收集在罐中或其他贮存容器中。在某些实施方案中，容器被冷冻至5℃-10℃。用于在容器中保持被中和的溶胞产物的时间不是强制性的，并且可以从小于1小时、从约1小时至约12小时、从约12小时至约15小时或大于15小时变化。在某些实施方案中，使用的时间为约12小时，而某些实例包括约15小时的时间，而在其他实例中，该时间为“过夜”(定义为大于约15小时)。在一个实施方案中，使用充分的保持期以获得细胞碎片与被中和的溶胞产物溶液的基本上完全的分离，结果获得有利于随后的净化过程的具有有限固体颗粒的粗溶胞产物。然而，该工艺规模受限于粗溶胞产物保持罐并且工艺时间被该保持期拉长。
为了获得低产率质粒产物的大规模纯化，被中和的溶胞产物的保持期可被减少至低于1小时。在某些实施方案中，被中和的溶胞产物溶液可在其产生的同时被处理，因此在容器中的保持时间是可以忽略的。在某些实施方案中，在将溶胞产物收集于容器中的从约5分钟至约60分钟时段后，溶胞产物溶液通过以下的过程同时被处理。溶胞产物保持时间的减少或消除还排除了容器的处理容量限制，因为溶胞产物在其产生时立即被处理。
被中和的溶胞产物溶液可用任何固液分离方法净化，例如袋过滤、筒过滤(cartridgefiltration)、分批离心、连续离心。完全除去溶液中的颗粒是所期望的以避免在以下的纯化过程中膜或柱的阻塞。同时，溶胞产物可不经过过多的剪切，所述过多的剪切将撕碎基因组DNA并造成基因组DNA、撕碎的基因组DNA、内毒素和其他污染物释放至含质粒的溶液中。分批过滤可用于处理小体积的溶胞产物，但在大规模中不实用。连续离心也是不适合的，因为沉淀可经过高剪切压力并释放高水平的污染物至溶液。在某些实施方案中，可使用采用不同级别过滤介质的一系列的过滤。初级过滤可用于除去大部分微米尺寸范围的大的细胞絮凝物，而连续的二级过滤保留了剩余的细颗粒。当随后过程需要严格的澄清度并且二级过滤不够时可进行可选择的三级过滤。
在某些实施方案中，可以使用袋过滤器和筒过滤器，因为它们的高纳污能力和对溶液最小的干扰。过滤器的袋或筒可以是任何尺寸、形状、孔径率(poresizerating)、构型和介质类型。过滤介质优选由医药级或符合食品与药品管理局(FDA)要求的材料制成。过滤器材料还优选不带电或对产物具有有限的结合。过滤器材料的粒径限值可以从约0.1μm至约几百微米变化，条件是其大于目标产物的尺寸以便产物不被过滤介质保留。袋过滤器和筒过滤介质可以是单层的、多层的、褶裙式的或多褶裙式的。
在某些实施方案中，可并联使用具有近似孔径率的两个或多个过滤器以适应大规模工艺。在溶胞产物溶液中的大部分固体颗粒，包括细胞壁和细胞膜成分、沉淀、基因组DNA、蛋白、脂质、脂多糖及其他污染物，将通过过滤除去。然而，当初级过滤不足以提供所期望的澄清度时，可随后设置具有减少的孔径或较高的保留率的二级过滤。在某些实施方案中，可并联设置两个或多个二级过滤器以适应大规模工艺。多个过滤器的使用在大规模工艺中可能是需要的，并且本领域技术人员将认识到，可容易地改变诸如使用的过滤器数以及它们的粒径限值的细节。
在某些实施方案中，可在沉降罐中收集和保持分散体以使碎片沉淀或漂浮。因此，在某些实施方案中，分散体可作为粗的细胞溶胞产物与来自泡罩塔混合器的沉淀的宿主细胞成分的浆料而收集，并且可被保持在沉降罐中以使碎片沉淀或漂浮。分散体可以被保持(例如在沉降罐中保持)足以获得组成碎片的沉淀的宿主细胞成分与被中和的溶胞产物溶液基本上完全分离的时间。沉淀的组分可在泡罩塔混合器引入的夹入气泡的帮助下上升至分散体的表面。在某些实施方案中，分散体可保持在沉降罐中约6小时至约24小时，在某些实施方案中，从约12小时至约18小时。在某些实施方案中，分散体可在保持期间被冷冻至小于约15℃，在某些实施方案中为从约2℃至约8℃，以帮助RNA或其他杂质的沉淀。在某些实施方案中，分散体可在保持期间温和地混合，例如通过以很低的rpm、优选地从约15rpm至约25rpm运转的叶轮式混合器。
在某些实施方案中，可将真空施加于保持分散体的诸如沉降罐的容器。这有助于将沉淀的成分带到液体表面。此外，这压紧了漂浮的絮状沉淀/碎片，有助于其随后的去除并且还允许更大百分比的被中和的溶胞产物溶液在以后的步骤中被回收。此外，这除去了溶液中夹杂的空气，所述空气可能污染以后的色谱法步骤。在某些实施方案中，施加的真空可以从约15英寸HG至约30英寸Hg(in·Hg)，在某些实施方案中，从约20英寸Hg至约30英寸Hg，并且在某些实施方案中，从约25英寸Hg至约30英寸Hg。在某些实施方案中，真空可在整个该保持期间保持。可使用真空泵或任何其他可用的真空设备或可用的负压设备而施加真空。在某些实施方案中，在开始固液分离前，施加于罐的任何真空被小心地释放。然后使用泵从罐中收集粗的细胞溶胞产物，即被中和的溶胞产物溶液，并使其通过深层过滤器和最后的过滤器，然后在保持罐中收集。在某些实施方案中，沉降罐安装了观察窗，允许操作者观察液面位置和压紧的沉淀的宿主细胞成分。从罐中泵送物质被视觉监测，并且在沉淀的宿主细胞成分进入管线之前停止。这防止了后面的过滤器的阻塞。不需要袋过滤(或筒过滤)或离心。此外，碎片的干扰由此最小化诸如基因组DNA或内毒素成分向被中和的溶胞产物溶液中的释放。在被中和的溶胞产物溶液从沉降罐被泵送后，其通过一个或多个过滤器以除去细颗粒。在某些实施方案中，可串联使用约1个至约3个过滤器，第一过滤器除去较大的颗粒，并且随后的过滤器连续除去较小的颗粒。在某些实施方案中，可串联使用2个过滤器。在某些实施方案中，第一过滤器是预过滤深层过滤器，其粒径限值为从约5μm至约15μm、优选地从约7.5μm至约12μm或更优选地从约9μm至约11μm。在某些实施方案中，预过滤深层过滤器具有约10μm的粒径限值。第二过滤器优选地是膜过滤器，其截留为从约0.01μm至约0.25μm或优选地从约0.05μm至约0.15μm。在某些实施方案中，膜过滤器具有约0.1μm的截留。然而，本领域技术人员将认识到，可以容易地改变诸如使用的过滤器数以及它们的粒径限值的细节。
大量的过滤器是可从不同供应商商业获得的。一种具体的类型是720系列褶裙式筒过滤器(CPIfilters，Houston，TX)，其表现出大的纳污能力和优良的处理容量。高效率的多层过滤袋，例如300系列和500系列(KnightCorporation，Houston，TX)，已显示出对细颗粒的相当大的保留。具有达12层介质的渐进密度设计的PROGAFTM过滤袋(EatonFiltration，Cleveland，OH)在具有多种尺寸的颗粒的去除中可提供高效率。在某些实施方案中，褶裙式筒过滤接着是多层或褶裙式筒过滤的组合可对在被中和的溶胞产物溶液中的颗粒的净化提供最佳性能。
筒过滤器或袋过滤器优选装配在过滤器壳或过滤器容器中，以简化操作和较高的处理容量。容器材料可以是304或316型不锈钢或碳钢，而具有聚氯乙烯(PVC)、氯化的聚氯乙烯(CPVC)、聚酯塑料(PPL)或聚偏氟乙烯(PVDF)结构的选择的全塑料壳对于超高纯或腐蚀性的应用是有利的。过滤器容器可以是定制的或从若干生产商容易地可得的。例如，EatonFiltration(Cleveland，OH)提供了对设计为满足任何要求的应用的壳/容器的宽泛的选择，例如TOPLINE、SIDELINE、DUOLINE、MODULINE、POLYLINE、FLOWLINE、ECOLINE、MAXILINE系列。本领域技术人员将能够确定过滤器壳的结构和特征以适应处理要求。
可选择地，在二级过滤后可提供另外的深层过滤器或膜过滤器。过滤器优选具体从约0.1μm至约0.2μm的截留以进一步除去被中和的溶胞产物溶液中的细颗粒。筒过滤器，例如来自Meissner(Camarillo，CA)的VangardPP和AlphaPP、来自Millipore(Billerica，MA)的Clarigard、来自Pall(EastHills，NY)的HP和PreFlow，可预期为一次性的或具有壳辅助的。然而，大部分的这些筒过滤器受其处理容量限制，尤其是在一次性形式中。优选的是使用可提供可升级形式以适应大规模应用的一次性组件。Millipore(Billerica，MA)已开发出高效一次性深层过滤器系统，Millistak+Pod，用于在实验室或生产规模中的应用。在pod过滤器(podfilter)中的过滤介质主要由精选级别的(selectgrade)纤维素纤维和硅藻土组成，并且被证明具有大的纳污能力和优良的保留能力。辅有不锈的支持物的pod形式的叠片式设计实现了在小空间中的大面积过滤。本领域技术人员可确定pod过滤器的介质级别和膜面积以满足特定操作需要。
因此，包含感兴趣的生物活性分子的、净化的被中和的溶胞产物溶液能够经过离子交换色谱，包括基于柱色谱的或基于膜的。优选的，可使用基于膜的方法，例如阴离子交换膜色谱。例如，被中和的溶胞产物溶液可应用于离子交换膜。根据某些实施方案，感兴趣的生物活性分子可与膜接触，由此，感兴趣的生物活性分子可与膜结合而杂质从膜流过或从膜被洗掉，从而将杂质与感兴趣的生物活性分子分离。可选择地，感兴趣的生物活性分子可流过膜，而杂质被保留。在某些实施方案中，感兴趣的生物活性分子与膜结合，并且在洗涤除去弱结合的杂质后，从膜洗脱感兴趣的生物活性分子。可通过使盐溶液流过膜而实现洗脱。盐溶液具有足以克服感兴趣的生物活性分子与膜的结合的强度、浓度或电导率。因此，感兴趣的生物活性分子在离子交换洗出液中被回收。
虽然任何离子交换膜可以是合适的，但在某些实施方案中，可使用包含季胺基团的阴离子交换膜、诸如强阴离子交换膜。这样的膜的实例包括，但不限于MustangQ(PallCorporation，EastHills，NY)、SartobindQ(Sartorius，Edgewood，NY)和InterceptQ(MilliporeCorporate，Billerica，MA)。
在某些实施方案中，含质粒的细胞被溶解和中和以产生可通过阴离子交换膜纯化而处理的被中和的溶胞产物溶液，所述阴离子交换膜纯化包括使用PallMustangQ柱(PallCorporation，EastHills，NY)的纯化。在某些实施方案中，通过用适量净化水的稀释可将被中和的溶胞产物溶液的电导率调整为约小于95mS/cm或约85mS/cm。电导率在某些实施方案中可调整为从约80mS/cm至约85mS/cm。可将等于溶胞产物体积的约1.5倍的净化水用于稀释以获得所需电导率。可通过将合适的盐溶液流过Q柱而对其进行调整。在某些实施方案中，所述溶液可包含从约0.5M氯化钠至约1.0M氯化钠(“NaCl”)并且在某些其他实施方案中为0.67MNaCl。平衡溶液还可包含缓冲剂、螯合剂或其组合。在某些实施方案中，除了0.67MNaCl以外，该平衡溶液/洗液可包含10mMTris-HCl、1mMNa2EDTA，pH为8。在某些实施方案中，平衡溶液/洗液可经所述柱以约800mL/min至约1500mL/min被泵送。稀释的被中和的溶胞产物溶液可在某些实施方案中以小于约4800mL/min、在某些实施方案中以从约2000mL/min至约20,000mL/min被泵送至所述柱上。装载的柱可采用优选为从约800mL/min至约1500mL/min的流速的平衡溶液/洗液洗涤。在某些实施方案中，洗涤可持续到流出液在260nm(A260)的吸光度回到大约基线处。质粒可采用包含1MNaCl、10mMTris-HCl、1mMNa2EDTA且pH为8的溶液洗脱。在某些实施方案中，洗脱是以以下流速进行的：从约500mL/min至约9000mL/min、从约500mL/min至约8000mL/min、从约500mL/min至约7000mL/min、从约500mL/min至约6000mL/min、从约500mL/min至约5000mL/min、从约500mL/min至约4000mL/min、从约500mL/min至约3000mL/min、从约500mL/min至约2000mL/min、从约600mL/min至约5000mL/min、从约600mL/min至约4000mL/min、从约600mL/min至约3000mL/min、从约600mL/min至约2000mL/min或从约600mL/min至约1500mL/min。在某些实施方案中，洗脱持续到洗出液的A260回到大约基线处。本领域技术人员将认识到，通过使用大的膜面积可容易地增加流速并且可仅仅使用普通试验而改变列出的特定盐溶液的浓度以使特定生物分子的产率和纯度最大化。收集的洗出液是离子交换洗出液并且用于随后的通过疏水作用步骤的纯化。
从离子交换膜回收的离子交换洗出液经过由疏水作用色谱(本文中，“HIC”)的纯化。在某些实施方案中，感兴趣的生物活性分子可结合至HIC膜或柱，而杂质流过或被洗掉。在某些实施方案中，感兴趣的生物活性分子可流过而杂质结合。在某些实施方案中，感兴趣的生物活性分子流过HIC膜(本文称为“方法I”)。在某些实施方案中，感兴趣的生物活性分子结合至HIC柱，例如丁基柱(本文称为“方法II”)。在某些实施方案中，可使用HIC膜和HIC柱(例如丁基柱)的组合(本文称为“方法III”)以得到大规模量的、具有高纯度的感兴趣的生物活性分子。
离子交换洗出液可在流至疏水作用膜之前被调整。通常，所述调整由添加所期望量的所期望的盐组成。在某些实施方案中，可按需要以适于提供产物或杂质的结合的量使用硫酸铵。通常，在方法III中，在装载至丁基柱之前，对于HIC滤液可不必调整。
在某些实施方案中，离子交换洗出液通过使用Q柱的阴离子交换色谱产生并通过疏水作用进一步纯化。在某些实施方案中，可使用诸如具有SuporPES过滤器的PallKleenpakTMNova囊(PallCorporation，EastHills，NY)。所述柱可通过将含有浓缩硫酸铵的平衡溶液/洗液流过该柱而被调整。在某些实施方案中，所述平衡溶液/洗液包含从约1M硫酸铵至约3M硫酸铵并且在某些实施方案中包含2.4M硫酸铵和10mMTris-HCl，pH为8。在某些实施方案中，所述平衡溶液/洗液的电导率为从约240mS/cm至约260mS/cm。在某些实施方案中，所述平衡溶液/洗液的电导率为从约240mS/cm至约300mS/cm，在某些实施方案中，所述平衡溶液/洗液为从约250mS/cm至约270mS/cm，并且在某些实施方案中，所述平衡溶液/洗液为从约245mS/cm至约255mS/cm。在某些实施方案中，使用的HIC柱可以是用树脂Toyopearl丁基树脂650M(TosohBioscienceLLC，Montgomeryville，PA)填充的柱。在某些实施方案中，所述柱可用含有约1.5M硫酸铵至约3.0M硫酸铵的溶液平衡。在某些实施方案中，所述柱可与含有2.5M硫酸铵和10mMTris-HCl的溶液平衡。
疏水作用膜可以是任何这样的膜，其主要基于疏水作用结合感兴趣的生物活性分子或杂质。HIC膜的实例包括，但是限于Pallsupor聚醚砜(“PES”)过滤器、PVDF过滤器、GEPES囊式过滤器和具有低蛋白结合和宽化学相容性的类似的亲水膜。典型的HIC树脂包括，但不限于丁基、己基、苯基、辛基、丙基、新戊基、羟基丙基、苄基、甲基及其衍生物。
在某些实施方案中，所述离子交换洗出液可通过用3M或4.1M硫酸铵将其稀释而被调整以得到从约240mS/cm至约290mS/cm并且在某些实施方案中为从约245mS/cm至约255mS/cm的电导率。当使用HIC方法I时，稀释的离子交换洗出液可以在某些实施方案中为从约100mL/min至约200mL/min的流速流过调整的HIC柱。流过物(flow-through)可被收集用于随后的超滤/渗滤。可选择地，HIC柱可用水洗涤，并且回收洗液以分析从产物中除去的污染物。当使用方法II时，稀释的离子交换洗出液可以10-20床体积/分钟(BV/min)的流速被装载至柱。感兴趣的生物活性分子可被洗涤，例如用1.0M硫酸铵至约2.5M硫酸铵，直至吸光度回到基线处，然后用例如0.5M至2.0M硫酸铵洗脱。杂质可用无菌的注射用水(WFI)剥离以便柱可被再生而重复使用。方法III使用如方法I描述的HIC膜，然后是如方法II描述的HIC柱。对于方法I、方法II或方法III的选择取决于产物性质和质量要求，这可由本领域技术人员确定。使用任何HIC方法，均产生包含感兴趣的生物活性物质的HIC洗出液。本领域技术人员将认识到，通过使用大的膜面积或柱直径可容易地增加流速，并且可仅仅使用普通试验而改变列出的特定盐溶液的浓度以使特定生物分子的产率和纯度最大化。
可选择地，存在于HIC洗出液中的感兴趣的生物活性物质可进一步纯化。在某些实施方案中，HIC洗出液可经过超滤/渗滤以浓缩感兴趣的生物活性物质、除去过量的盐，并且如果需要，改变稀释液的组成。用于进行超滤/渗滤的方法是本领域技术人员公知的。在某些实施方案中，使用切向流过滤。在某些实施方案中，使用分批方法。
超滤膜/渗滤膜可基于名义截留分子量(“NMWCO”)而选择以便将感兴趣的生物活性物质保留在截留物中，而允许诸如盐的低分子量物质通过进入滤过液。本领域技术人员能够基于感兴趣的产物的尺寸和特性结合仅普通的试验而选择这样的膜。在某些实施方案中，例如当感兴趣的生物活性物质是质粒时的某些实施方案，可使用PallCentramate装置(PallCorporation，EastHills，NY)或装置(MilliporeCorporate，Billerica，MA)或具有类似特征的装置进行超滤/渗滤，并且使用的膜可以是PallOmegaTM悬挂筛膜盒(suspendedscreenmembranecassette)(PallCorporation，EastHills，NY)或Millipore中等筛膜盒(mediumscreenmembranecassette)(MilliporeCorporate，Billerica，MA)或本领域中公知的NMWCO为100kD或50kD的类似的盒。在某些实施方案中，质粒可浓缩为至少约2.5mg/mL，在某些实施方案中为至少约5.0mg/mL，在某些实施方案中为至少约10.0mg/mL，而在其他实施方案中，浓度为至少12.5mg/mL，并且在其他实施方案中，浓度为至少约15mg/mL或更多。在某些实施方案中，浓缩的质粒溶液的电导率为小于约50mS/cm。
如果需要无菌的产物，在来自超滤/渗滤的截留物中回收的、浓缩的、脱盐的感兴趣的生物活性物质可经过无菌过滤。用于无菌过滤的方法是本领域技术人员公知的，并且可选择任何这样的方法。所得物质由基本上纯化的生物活性产物组成。该产物可用于多种用途，包括，但不限于，药学应用、兽医应用或农业应用。因此，该方法提供了基本上纯化的生物活性分子的大批制备。这些分子可以是质粒。在某些实施方案中，它们可以是基本上不含基因组DNA、RNA、蛋白和内毒素的质粒。
在某些实施方案中，例如生物活性分子是质粒的实施方案，优选地，无菌过滤可使用具有0.22μm截留的PallAcroPakTM200过滤器(PallCorporation，EastHills，NY)而进行。
由提供的工艺产生的质粒DNA已显示出高纯度和极低的污染。在某些实施方案中，质粒DNA的高纯度是以以下的水平存在的质粒DNA：大于或等于90％、大于或等于91％、大于或等于92％、大于或等于93％、大于或等于94％、大于或等于95％、大于或等于96％、大于或等于97％、大于或等于98％或大于或等于99％。很显然地，纯度可由低水平的污染物而表征，包括低水平的RNA、基因组DNA、内毒素和蛋白。在某些实施方案中，质粒DNA可以是以下的量：约10mg或更多、20mg或更多、30mg或更多、100mg或更多、200mg或更多、300mg或更多、500g或更多、1g或更多、10g或更多、20g或更多、30g或更多、100g或更多、200g或更多、300g或更多、1kg或更多或2kg或更多。在某些实施方案中，质粒DNA的浓度可以是1mg/mL或更多。图1显示制备工艺的一个实施方案的示意图。
实施方案显示一种连续过程，所述连续过程用于采集给定的细胞样品并经历相同的纯化工艺步骤，所述纯化工艺步骤起始于开始(包括溶胞和中和步骤)直至样品的连续流中的分离步骤(即，离子交换色谱的开始)。细胞在包含于细胞悬浮罐101的重悬液中重悬。溶胞溶液包含在溶胞溶液罐102中。分别用泵104或泵105将细胞悬浮液和溶胞溶液泵送至“Y”形连接器的两个入口。离开“Y”形连接器的溶液通过高剪切的串联混合器107混合。离开混合器107的溶胞产物溶液通过保持盘管108，保持期为4-6分钟。离开保持盘管的溶胞溶液/细胞混合物进入泡罩塔混合器109而同时泵106将中和/沉淀(NP)溶液从另一个罐(NP溶液罐103)递送至泡罩塔混合器。同时，将来自压缩气体罐110的压缩气体进料至位于泡罩塔混合器109的底部的鼓泡器。在容器111中收集被中和的溶胞产物溶液。在容器111中收集溶胞产物1-60分钟的时段后，通过后面的工艺同时处理溶胞产物溶液。用于初级过滤的泵112将粗溶胞产物溶液递送经过初级过滤器113。初级滤过的溶液在过滤器113之后经泵114被同时泵送至二级过滤器115。经过泵116，由115产生的滤过的溶液经第三过滤器117而被过滤。用于净化的溶胞产物的泵118将流从用于溶胞产物的容器119驱动至混合器121，所述流与来自水罐120的水混合。混合并且稀释的溶液在用于稀释的溶胞产物的容器122中收集。稀释的被中和的溶胞产物溶液被泵送至预调整的Q柱124，这由泵123完成。
在某些实施方案中，本文提供的工艺的产物是纯化的、浓缩的、脱盐的、无菌滤过的质粒，能够基本上不含诸如蛋白、基因组DNA、RNA和内毒素的杂质。本文提供了低水平的这些杂质或污染物，优选基本上没有的量，最优选的水平为无法检测量的这样的杂质或污染物。在某些实施方案中，在由提供的制备方法制备的生物活性分子(优选质粒)的溶液中，由BCA(二辛可宁酸)蛋白测定法(PierceBiotechnology，Inc.，Rockford，IL)测定的残留蛋白可以小于或等于约1％(按重量计)、小于或等于0.9％、小于或等于0.8％、小于或等于0.7％、小于或等于0.6％、小于或等于0.5％、小于或等于0.4％、小于或等于0.3％、小于或等于0.2％或小于或等于约0.1％。在某些实施方案中，残留蛋白为小于或等于0.2％并且更优选地，小于或等于0.1％。在某些实施方案中，在由提供的制备方法制备的生物活性分子(优选质粒)的溶液中，残留内毒素可以小于约100内毒素单位每毫克质粒(EU/mg)、小于约或等于约20EU/mg、小于约或等于约10EU/mg、小于或等于约1.0EU/mg、小于或等于约0.9EU/mg、小于或等于约0.8EU/mg、小于或等于约0.7EU/mg、小于或等于约0.6EU/mg、小于或等于约0.5EU/mg、小于或等于约0.4EU/mg、小于或等于约0.3EU/mg、小于或等于约0.2EU/mg、或小于或等于约0.1EU/mg。优选地，在某些实施方案中，内毒素水平为小于或等于约0.2EU/mg，并且更优选地，小于或等于约0.1EU/mg。在某些实施方案中，在由提供的制备方法制备的生物活性分子(优选质粒)的溶液中，由疏水作用HPLC测定的残留RNA可以小于或等于约5％(按重量计)、小于或等于约1％、小于或等于0.9％、小于或等于0.8％、小于或等于0.7％、小于或等于0.6％、小于或等于0.5％、小于或等于0.4％、小于或等于0.3％、小于或等于0.2％或小于或等于约0.1％。优选地，在某些实施方案中，RNA的量为小于或等于约0.5％，并且更优选地，小于或等于0.4％。在某些实施方案中，在由提供的制备方法制备的生物活性分子(优选质粒)的溶液中，由qPCR测定的残留基因组DNA可以小于或等于约5％(按重量计)、小于或等于约1％、小于或等于0.9％、小于或等于0.8％、小于或等于0.7％、小于或等于0.6％、小于或等于0.5％、小于或等于0.4％、小于或等于0.3％、小于或等于0.2％、小于或等于约0.1％、小于或等于约0.01％、小于或等于约0.001％、小于或等于约0.0001％、小于或等于约0.00001％或小于或等于约0.000001％。优选地，在某些实施方案中，基因组DNA的量为小于或等于约0.1％，并且更优选地小于约0.001％，并且最优选地小于或等于约0.000001％。
通过本文提供的方法可制备出大量高收率且高浓度的质粒DNA。通过提供的工艺制备的质粒DNA包括高纯度的质粒DNA溶液。在某些实施方案中，质粒DNA的高纯度为大于或等于约90％、大于或等于约91％、大于或等于约92％、大于或等于约93％、大于或等于约94％、大于或等于约95％、5mg/mL或更高、6mg/mL或更高、7mg/mL或更高、8mg/mL或更高、9mg/mL或更高、10mg/mL或更高、11mg/mL或更高、12mg/mL或更高、13mg/mL或更高、14mg/mL或更高、15mg/mL或更高。在某些实施方案中，质粒DNA的浓度可以是从约5mg/mL至约15mg/mL、从约5mg/mL至约14mg/mL、从约5mg/mL至约13mg/mL、从约5mg/mL至约12mg/mL、从约5mg/mL至约11mg/mL、从约5mg/mL至约10mg/mL、从约5mg/mL至约9mg/mL、从约5mg/mL至约8mg/mL，浓度可以是从约6mg/mL至约15mg/mL、从约6mg/mL至约14mg/mL、从约6mg/mL至约13mg/mL、从约6mg/mL至约12mg/mL、从约6mg/mL至约11mg/mL、从约6mg/mL至约10mg/mL、从约6mg/mL至约9mg/mL、从约6mg/mL至约8mg/mL，浓度可以是从约7mg/mL至约15mg/mL、从约7mg/mL至约14mg/mL、从约7mg/mL至约13mg/mL、从约7mg/mL至约12mg/mL、从约7mg/mL至约11mg/mL、从约7mg/mL至约10mg/mL、从约7mg/mL至约9mg/mL、从约8mg/mL至约15mg/mL、从约8mg/mL至约14mg/mL、从约8mg/mL至约13mg/mL、从约8mg/mL至约12mg/mL、从约8mg/mL至约11mg/mL、从约8mg/mL至约10mg/mL、从约9mg/mL至约15mg/mL、从约9mg/mL至约14mg/mL、从约9mg/mL至约13mg/mL、从约9mg/mL至约12mg/mL、从约9mg/mL至约11mg/mL、从约10mg/mL至约15mg/mL、从约10mg/mL至约14mg/mL、从约10mg/mL至约13mg/mL、从约10mg/mL至约12mg/mL、从约11mg/mL至约15mg/mL、从约11mg/mL至约14mg/mL、从约11mg/mL至约13mg/mL、从约12mg/mL至约15mg/mL、从约12mg/mL至约14mg/mL或从约13mg/mL至约15mg/mL。在某些实施方案中，质粒DNA可以是如大于约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％或95％的超螺旋质粒并且优选地大于80％超螺旋质粒的超螺旋百分比所提出的这样的浓度。在某些实施方案中，质粒DNA可以是如50-90％、50-80％、50-75％、50-70％、50-65％、50-60％、60-90％、60-80％、60-75％、60-70％、65-90％、65-80％、65-75％、65-70％、70-90％、70-80％、70-75％、80-90％、85-90％、90-95％或更高的超螺旋百分比所提出的这样的浓度。在某些实施方案中，质粒DNA可以是如90％或更高、95％或更高、或98％或更高的超螺旋与松弛(开环非降解的)百分比所提出的这样的浓度。在某些实施方案中，质粒DNA可以是如以下所提出的这样的浓度：在储存2年或更长后剩余物基本上为松弛的(开环非降解的)质粒的50％或更高的超螺旋百分比、在储存2年或更长后剩余物基本上为松弛的(开环非降解的)质粒的60％或更高的超螺旋百分比、在储存2年或更长后剩余物基本上为松弛的(开环非降解的)质粒的65％或更高的超螺旋百分比、在储存2年或更长后剩余物基本上为松弛的(开环非降解的)质粒的85％或更高的超螺旋百分比，其中所述储存是在水的凝固点以下。在某些实施方案中，质粒DNA可以是如以下所提出的这样的浓度：在储存2年或更长后90％或更高、95％或更高、98％或更高的超螺旋与松弛的(开环非降解的)百分比，其中所述储存是在水的凝固点以下。如此处描述的这样的质粒制备可以制成本文描述的工艺的产物。
实施例
在以下实施例中进一步说明本发明，其中份和百分比是按重量计并且度是摄氏度，除非另外说明。应当理解，这些实施例虽然指示了本发明的优选实施方案，但其仅作为示例而给出。从以上的讨论和这些实施例中，本领域技术人员能够确定本发明的基本特征，并且在不背离其精神和范围的情况下，能够对本发明做出多种改变和更改以使其适应多种用途和条件。因此，除了本文呈现和描述的那些更改以外，从先前的描述中，本发明的多种更改将对本领域技术人员是明显的。这样的更改还意图落在所附权利要求的范围内。
实施例1
将含有质粒A的大肠杆菌(“E.coli”)的细胞发酵为高密度，在通过离心分离收获时的细胞光密度(“OD600”)为72。质粒A具有6549bp的尺寸。质粒通常以～250拷贝/细胞的低拷贝数复制。将细胞湿重(“WCW”)为约3.1kg的细胞糊悬浮于由25mMTris-盐酸盐(“Tris-HCl”，J.T.Baker，Phillipsburg，NJ)、10mM依地酸二钠(“Na2EDTA”，FisherScientific，FairLawn，NJ)组成的、pH8的重悬缓冲液至约21.5L的最终体积。将该细胞悬浮液以300mL/min泵送至“Y”形连接器的一侧。同时，将由0.2N氢氧化钠(“NaOH”，J.T.Baker，Phillipsburg，NJ)、1％十二烷基硫酸钠(“SDS”，J.T.Baker，Phillipsburg，NJ)组成的溶胞溶液以300mL/min泵送至“Y”形连接器的另一侧。离开“Y”形连接器的合并的流体立即通过配备标准乳化器筛网(SilversonMachines，Inc.EastLongmeadow，MA)和串联组件的SilversonModelL4R转子/定子混合器。该混合器以800rpm的转子转速运转。
离开转子/定子混合器的流体通过50-英尺、0.625英寸(内径)的保持盘管。以约600mL/min的总流速，经过保持盘管的通过时间为约5分钟以允许完全的细胞溶胞。
将离开保持盘管的细胞溶胞产物(溶胞产物溶液)通入泡罩塔混合器。同时，将由1M乙酸钾(J.T.Baker，Phillipsburg，NJ)、7M乙酸铵(EMDChemicals，Inc.，Bibbstown，NJ)组成的冷的(约4℃)中和/沉淀溶液以600mL/min独立地泵送至泡罩塔混合器。溶胞产物溶液和中和/沉淀溶液垂直流上混合柱并流过靠近顶部的出口。当该溶液通过混合柱时，将压缩空气以约3.0slpm的速率经过烧结的鼓泡器引入该柱的底部，所述烧结的鼓泡器设计为提供贯穿该混合的横断面的持续的小气泡流。过量的空气经该柱的顶部排出。当溶胞产物溶液和中和/沉淀溶液通过该柱时，它们通过上升气泡的温和湍流而不断地混合。这可以通过由SDS钾、变性的细胞蛋白、结合的脂质和细胞壁成分以及相关的基因组DNA组成的白色絮状沉淀(碎片组分)形成来证明。
在沉降容器中收集离开泡罩塔混合器的被中和的沉淀的溶胞产物(被中和的溶胞产物溶液和碎片的悬浮液)。以连续方式运行该工艺直到全部的细胞糊悬浮液被溶解、被中和及被沉淀并且在沉降罐中收集。全部的溶液体积为21.5L细胞悬浮液加5L洗涤重悬罐的重悬缓冲液、26.5L溶胞溶液和53L中和溶液，总体积为约106L。
在收集后，通过观察窗观察沉降罐中的物质。可以看到絮状沉淀在被夹入固体中的清晰可见的气泡的帮助下上升至液体表面。将约28英寸Hg的真空施加于沉降罐，导致对漂浮的沉淀的显著并且可见的压紧。
在室温下，将该物质在沉降罐中真空保持约16小时。然后缓慢地对真空放气以避免破坏压紧的沉淀。将含质粒的液体(被中和的溶胞产物溶液)从罐中经底部的清洁设备(sanitaryfitting)而小心泵送。持续监测罐中液体和沉淀的水平，并且及时停止泵送以确保沉淀不离开罐。经过10μm深层过滤，接着是0.1μm最终过滤。由于过滤器的阻塞，一部分被中和的溶胞产物溶液在过滤期间损失了。结果，获得了约69L澄清的被中和的溶胞产物溶液。然后用约93L净化水稀释被中和的溶胞产物溶液，获得162L的总体积和约97mS/cm的电导率，为用阴离子交换进一步处理做准备。估计在滤过的被中和的溶胞产物溶液中的质粒浓度为约17μg/mL，相当于约1170mg全部质粒。
通过阴离子交换进一步纯化澄清的、稀释的被中和的溶胞产物溶液。用4L在pH8的1×Tris-EDTA(“TE”)缓冲液中的0.67M氯化钠(“NaCl”，J.T.Baker，Phillipsburg，NJ)来平衡260mL床体积的PallMustangQ柱，所述1×Tris-EDTA缓冲液主要由10mMTris-HCl(J.T.Baker，Phillipsburg，NJ)和1mMEDTA(FisherScientific，FairLawn，NJ)组成。以1.2L/min的流速将体积为162L的稀释的被中和的溶胞产物溶液泵送至Q柱上。监测并使用长条纸记录仪记录柱流出液在260nm处的紫外(“UV”)吸收。在装载后，用1.2L/min的平衡缓冲液洗涤柱直至流出液的A260接近基线。然后用以1.2L/min泵送的、含有1MNaCl(J.T.Baker，Phillipsburg，NJ)的1×TE缓冲液将质粒从柱中洗脱。A260回到基线时洗脱终止。全部洗出液的体积为约4.8L并且包含共约915mg基于A260的DNA。Q阴离子交换的产率为约78％。在该步骤中的流过和洗涤中将包含蛋白、大部分RNA、基因组DNA和内毒素的污染物除去。
经过丁基柱的方法II，通过疏水作用进一步纯化Q流出液。用290mL床体积(“BV”)的Toyopearl丁基树脂650M(TosohBioscienceLLC，Montgomeryville，PA)填充K5/15Amersham(Piscataway，NJ)柱。将24L体积的3M硫酸铵(EMDChemicals，Inc.，Gibbstown，NJ)在装载前与4.8LQ流出物混合。用2L以43mL/min泵送的2.5M硫酸铵(EMDChemicals，Inc.，Gibbstown，NJ)平衡该柱。将调整的Q流出液以43mL/min装载至丁基柱，随后用5L2.5M硫酸铵(EMDChemicals，Inc.，Gibbstown，NJ)以43mL/min洗涤，并且产物用1.5L1.8M硫酸铵(EMDChemicals，Inc.，Gibbstown，NJ)以43mL/min洗脱。该柱用无菌的注射用水(“WFI”，BaxterHealthcare，Deerfield，IL)剥离以除去包含RNA和内毒素的结合的污染物，并且被再生而重复使用。流出液获得约870mg质粒，产率为95％，而质粒的超螺旋百分比从Q之后的66％富集至丁基柱步骤后的大于80％。
使用PallCentramateTM盒支持物，通过超滤/渗滤(“UF/DF”)将来自丁基HIC的流出液浓缩并脱盐，所述PallCentramateTM盒支持物配备了面积为1平方英尺且名义截留分子量为50kDa的一个PallOmega悬挂筛膜盒(PallCorporation，EastHills，NY)。回收了体积为41.2mL的大批截留物，其含有的DNA浓度为9.026mg/mL(基于A260)。用于UF/DF设备(UF/DFrig)的WFI的第一次洗涤得到46.9mL，浓度为1.6mg/mL。WFI的第二次洗涤得到65.8mL，浓度为0.268mg/mL。在UF后合并的回收DNA为约476mg，收率为55％。获得的质粒的最终超螺旋百分比在UF后为大于87％。
来自实施例1的样品通过在图2中显示的琼脂糖凝胶电泳进行分析。在所有样品泳道中(第2-5泳道)均存在三个主要的带，而最低的带是超螺旋形式的目标质粒A(6.5kb)。第1泳道表示超螺旋质粒标准梯带(Invitrogen)。第2泳道表示含有6.5kb质粒产物的细胞溶胞产物，而大量RNA也存在于该样品中。第3泳道表示Q阴离子交换后的产物，其显示质粒被浓缩，具有较少的RNA。第4泳道显示用疏水作用纯化后的产物，并且第5泳道表示UF后混合的最终产物。在溶胞产物中的污染物RNA被除去并且所期望的超螺旋质粒的纯度基本上从60％增加至＞85％。
实施例2
将包含质粒B的3140克量的大肠杆菌细胞重悬于重悬缓冲液至最终体积18.8L，该重悬缓冲液是由pH为8的25mMTris-HCl(J.T.Baker，Phillipsburg，NJ)和10mMNa2EDTA组成的。质粒B具有4.7kb的尺寸。重悬的细胞通过SilversonModelL4R转子/定子混合器、以300mL/min的相等流速与由0.2NNaOH(J.T.Baker，Phillipsburg，NJ)和1％SDS(J.T.Baker，Phillipsburg，NJ)组成的溶胞溶液混合，所述SilversonModelL4R转子/定子混合器以800rpm的转子速度运行。在进入泡罩塔以与预冷却的(4℃-5℃)中和/沉淀(NP)溶液混合之前，来自混合器的溶胞产物流出液在保持盘管中维持5分钟的保持时间。将含有1M乙酸钾(J.T.Baker，Phillipsburg，NJ)和3M乙酸铵(EMDChemicals，Inc.，Bibbstown，NJ)的NP溶液以600mL/min进料至泡罩塔混合器，同时，以3-5slpm的流速从鼓泡器底部将压缩空气引入。
被中和的细胞溶胞产物首先通过悬挂在泡罩塔出口下面的200-400μm的编织网袋接收。大的细胞絮状物保留在袋中，而含有质粒DNA和减少的细胞碎片的粗溶胞产物溶液在预冷却的(5℃)沉降罐中收集。同时，以2L/min的流速将产生的粗溶胞产物泵送至装配在ECOLINE过滤器容器(EatonFiltration，Iselin，NewJersey)中的48μm褶裙式筒过滤器(CPIfilters，Houston，TX)。初级滤过的溶胞产物在容器中收集，回收的总体积为75L。然后进行二级过滤。以2L/min的流速将初级滤过的溶胞产物泵送至装配在ECOLINE过滤器容器(EatonFiltration，Iselin，NewJersey)中的523多层的袋过滤器(KnightCorporation，Barrington，IL)。回收的溶液在容器中收集，回收的总体积为65L。最后，使用MillistakPod一次性的深层过滤器系统(Millipore，Bellerica，MA)进行深层过滤。过滤介质具有0.2-2.5μm的孔径分布。膜面积为0.11m2的Pod过滤器用于以0.5L/min的流速净化二级滤过的溶胞产物。获得60L体积的最终净化的溶胞产物，其呈现出NTU值低于2的高澄清度。在过滤的每个阶段中，溶胞产物样品中的质粒纯度和形式是难区分的。
实施例3
将含有质粒C的大肠杆菌细胞发酵为高细胞密度，并通过离心收获。从400L发酵的工作体积中回收细胞湿重为24.4kg的细胞。将细胞用由pH为8的25mMTris-HCl(J.T.Baker，Phillipsburg，NJ)和10mMNa2EDTA(MallinckrodtBaker，Phillipsburg，NJ)组成的171L重悬缓冲液重悬3小时的时段。通过Silverson高剪切混合器以600ml/min的相同流速将重悬的细胞与新鲜的溶胞溶液混合，并且保持约5min，由保持环路(holdingloop)完成。将由1M乙酸钾(J.T.Baker，Phillipsburg，NJ)和3M乙酸铵(EMDChemicals，Inc.，Bibbstown，NJ)组成的中和/沉淀溶液以1.2L/min的流速泵送至泡罩混合器以与溶解的细胞混合。以5-6slpm的气体流速进料的压缩空气作为混合力(mixingforce)和将被中和的溶胞产物运输至收集罐。约5小时的时段用于溶胞过程。离开泡罩混合设备的被中和的细胞被转移至收集罐并经过以下的连续过滤。
被中和的粗溶胞产物在其形成时用三个连续的过滤来处理并且这些净化过程与溶胞过程同时进行。最初的过滤是通过将含有细胞絮状物的粗溶胞产物以2.4L/min的流速泵送至配备48μm褶裙式筒过滤器(CPIfilters，Houston，TX)的TOPLINE过滤器容器(EatonFiltration，Iselin，NewJersey)中而进行。使用初级过滤以除去大部分的诸如细胞絮状物的大颗粒，并且褶裙式的膜提供更大的过滤面积，从而提供了比单层或多层结构更高的流速和更大的处理容量。使用4个褶裙式筒以处理体积为680L的含有细胞絮状物的被中和的粗溶胞产物，而回收的初级滤过的溶胞产物估计为600L。将离开48μm褶裙式筒过滤器的溶液以2.4L/min的流速直接泵送至配备1μm多层筒过滤器(CPIfilters，Houston，TX)的二级ECOLINE过滤器容器(EatonFiltration，Iselin，NewJersey)。该步骤除去在二级滤过的溶胞产物中的范围在1μm与50μm之间的小颗粒的大部分。随后的MustangQ具有等于0.2μm的孔径，并因此通过具有0.2μm或更小的绝对孔径的过滤器进行三级深层过滤。深层过滤器Millitak+Pod过滤器系统能够获得大的处理体积和对细颗粒的高保留。装配在不锈钢Pod支持物中的MillistakC0HC过滤器(Millipore，Bellerica，MA)用于将溶胞产物的浊度降低至2比浊法浊度单位(NTU)。膜面积为1.1m2的C0HC过滤器处理400L体积的二级滤过的溶胞产物。
在容器中收集离开Millistak过滤器的滤过的溶胞产物。将来自该容器的一部分溶液以2.2L/min的流速泵送至“Y”形连接器以与水混合，所述水以0.7L/min的流速被泵送至相同的“Y”形连接器。该混合物流入导入另一保持罐的Kenics串联混合器。在保持罐中如此稀释的溶胞产物的电导率为90-95mS/cm的范围。将体积为400L的稀释的溶胞产物装载至10英寸的MustangQ(Pall，EastHills，NY)中，所述MustangQ具有260ml的床体积。在200L的Q负载之前使Q囊饱和。在Q流出液中回收约3g的质粒DNA。Q产物的超螺旋百分比在80％-90％之间，并且Q洗出液中的RNA含量不能被凝胶分析所检测到。
来自实施例3的样品通过在图3中显示的琼脂糖凝胶电泳进行分析。在每一泳道中的最高强度的带表示超螺旋(SC)形式的质粒，其以80-90％的百分比存在。第1泳道表示超螺旋质粒标准梯带。第2泳道表示在使用48μm褶裙式筒的初级过滤后的溶胞产物，并显示高的RNA含量。第3泳道表示在使用1μm褶裙式筒的二级过滤后的滤液，并且也显示高的RNA含量。第4泳道表示在使用C0HCPod过滤器的三级过滤后的滤液，并且显示减少的RNA比例。第5泳道表示在经过MustangQ阴离子交换步骤后的流出液产物级分＃1，其呈现出有限的RNA的高纯度。第6泳道表示Q流出液的二级级分，与流出液#1具有类似的纯度。
实施例4
将细胞湿重为25kg的含有质粒C的大肠杆菌细胞在由pH为8的25mMTris-HCl(J.T.Baker，Phillipsburg，NJ)和10mMNa2EDTA组成的105L重悬缓冲液中重悬3小时的总时间。质粒C具有3.5kb的尺寸。将重悬的细胞以1500ml/min的流速泵送至SilversonModelL4R转子/定子混合器，同时，将由0.2NNaOH(J.T.Baker，Phillipsburg，NJ)和1％SDS(J.T.Baker，Phillipsburg，NJ)组成的溶胞溶液以1500ml/min的流速递送至相同的混合器。使含有溶解的细胞的混合物通过内径(ID)为1英寸且长度为100英尺的保持盘管。对于溶胞产物从进入混合器直至离开保持盘管的大约的保留时间为5分钟。然后溶解的细胞进入泡罩塔与预冷却的(4℃-5℃)中和/沉淀(NP)溶液接触。将含有1M乙酸钾(J.T.Baker，Phillipsburg，NJ)和3M乙酸铵(EMDChemicals，Inc.，Bibbstown，NJ)的NP溶液以3000mL/min进料至泡罩塔混合器。同时，从鼓泡器底部以6-10slpm的流速将压缩空气引入以作为混合力并促进被中和的溶液进入导入粗溶胞产物罐的转移管。
在收集粗溶胞产物20分钟时段后，将溶液从粗溶胞产物罐的底部以6L/min的流速泵送至配备48μm褶裙式筒过滤器(CPIfilters，Houston，TX)的TOPLINE过滤器容器(EatonFiltration，Iselin，NewJersey)。同时，将来自初级过滤器容器的滤液以6L/min的流速泵送至配备1μm褶裙式筒过滤器(CPIfilters，Houston，TX)的二级TOPLINE过滤器容器(EatonFiltration，Iselin，NewJersey)。初级过滤除去了99％的大于48μm的颗粒，并且五个10英寸的筒过滤器净化了总体积为700L的粗溶胞产物。使用三个10英寸的1μm筒过滤器使完成二级过滤能够除去99％大于1μm的颗粒。借助于泵，以5-6L/min的流速将来自二级容器的滤液收集在净化的溶胞产物罐中。使用配备不锈钢中试规模的Pod支持物的Millitak+C0HCPod过滤器(Millipore，Bellerica，MA)的三级过滤器系统以获得高澄清度用于随后的MustangQ纯化。将来自净化的溶胞产物罐的溶液以6L/min的流速泵送至pod过滤器。在入口压力达到10psi之前，膜面积为2.2m2的C0HC过滤器处理了650L体积的二级滤过的溶胞产物。在滤过的溶胞产物容器中收集经过三级Pod过滤器的滤液。
将滤过的溶胞产物在装载至MustangeQ之前递送至“Y”形连接器并经Kenics串联混合器以0.3-0.4V水/V溶胞产物的比例与水混合。以5L/min的流速泵送溶胞产物，而水以1.75-2L/min的流速进料。在稀释的溶胞产物罐中收集该混合物。在保持罐中如此稀释的溶胞产物的电导率为90-95mS/cm的范围。将体积约为800L的稀释的溶胞产物装载至具有5000ml床体积的MustangQXT5000(Pall，EastHills，NY)。在Q流出液中回收约25g的质粒DNA。回收的Q流出液显示高百分比的超螺旋形式和有限水平的污染。
实施例5
下表I表示使用采用质粒A(一种低拷贝质粒)的方法II制备的14个质粒制剂以及其中检测的某些纯度参数。用于制备的方案是以上实施例3中讨论的方案。
质粒样品的分析
质粒C具有3.5kb的尺寸(如实施例3和实施例4)。质粒D1-D3范围从4.4-4.7kb，除了表达基因外具有类似的结构。质粒E1-E2具有3.8kb的尺寸，除了表达基因外具有类似的结构。质粒F具有2.5kb的尺寸。
表I

Claims (31)

1.一种从细菌细胞制备至少一种感兴趣的生物活性分子的高纯度样品的大规模工艺，其包括以下步骤：
a)通过使所述大量细胞的细胞悬浮液与溶胞溶液接触而制备溶胞产物溶液；
b)用中和溶液中和所述溶胞产物溶液以制备包含被中和的溶胞产物溶液和碎片的分散体；
c)通过至少一个过滤器过滤所述分散体；
d)对所述被中和的溶胞产物溶液进行离子交换分离以产生离子交换洗出液；和
e)对所述离子交换洗出液进行疏水作用分离以产生疏水作用溶液。
2.根据权利要求1所述的方法，其中步骤a)包括在高剪切的串联混合器中使所述细胞悬浮液与溶胞溶液混合。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中步骤b)包括在泡罩混合器中将所述溶胞产物溶液与所述中和溶液混合。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中步骤e)包括使用疏水作用柱或疏水作用膜进行疏水作用分离以形成疏水作用溶液。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其还包括以下步骤；
f)通过所述疏水作用溶液的超滤来制备生物活性分子的溶液。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其还包括以下步骤：
g)通过所述生物活性分子的溶液的无菌过滤来制备至少一种生物活性分子的无菌溶液。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的方法，其还包括将所述分散体保持一段时间以使所述被中和的溶胞产物溶液与所述碎片分离并且通过至少一个过滤器过滤所述被中和的溶胞产物溶液。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的方法，其中制备步骤包括在混合器中使所述细胞悬浮液与所述溶胞溶液接触约1分钟至约20分钟的持续时间。
9.根据权利要求8所述的方法，其中所述持续时间为从约4分钟至约8分钟。
10.根据权利要求8所述的方法，其中所述持续时间为约5分钟。
11.根据权利要求1-8中任一项所述的方法，其中所述生物活性分子是质粒。
12.根据权利要求1-8中任一项所述的方法，其中所述离子交换是阴离子交换膜。
13.根据权利要求1-8、11或12中任一项所述的方法，其中步骤e)包括进行疏水作用分离，包括丁基疏水作用色谱，以制备疏水作用溶液，即丁基疏水作用色谱溶液流出液。
14.根据权利要求1-8、或11-13中任一项所述的方法，其中所述方法包括从一个步骤基本上连续地过渡到随后的步骤，并且包括通过将所述溶胞产物收集在容器中并将所述分散体通过初级过滤器而使所述分散体中的所述被中和的溶胞产物溶液与所述碎片分离以制备最初的粗的被中和的溶胞产物溶液。
15.根据权利要求14所述的方法，其还包括使所述最初的粗的被中和的溶胞产物溶液通过二级过滤器以产生随后的粗的被中和的溶胞产物溶液。
16.一种从细菌细胞制备至少一种感兴趣的生物活性分子的高纯度样品的大规模工艺，其包括以下步骤：
使所述细菌细胞以细胞分散体与溶胞溶液接触以形成溶胞产物溶液；
通过用泡罩塔混合器将中和溶液混入所述溶胞产物溶液而中和所述溶胞产物溶液以形成被中和的混合物；
通过初级过滤器和二级过滤器过滤所述被中和的混合物以形成滤过的溶液；
使所述滤过的溶液通过离子交换柱以形成离子交换溶液；
使所述离子交换溶液通过疏水作用柱或疏水作用膜以形成疏水作用溶液；和
超滤所述疏水作用溶液以形成至少一种感兴趣的生物活性分子的高纯度样品；
其中在从接触步骤到使滤过的溶液通过的步骤的大规模工艺中的一个步骤向随后步骤的每次过渡基本上连续发生。
17.一种组合物，其包含由权利要求1所述的方法制备的至少一种感兴趣的生物活性分子，其中至少一种感兴趣的生物活性分子是DNA质粒。
18.根据权利要求17所述的组合物，其中所述组合物包含在溶液中的约10mg或更多量的DNA质粒，其中高纯度的所述质粒是以大于约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％存在的质粒。
19.根据权利要求18所述的组合物，其中所述质粒的纯度为大于约99％。
20.根据权利要求18或19所述的组合物，其中所述溶液中的质粒浓度为约5、6、7、8、9、10、11、12或13mg/mL。
21.根据权利要求18-21中任一项所述的组合物，其中所述质粒包含大于约50％的超螺旋质粒。
22.根据权利要求18-21中任一项所述的组合物，其中所述质粒包含大于约80％的超螺旋质粒。
23.根据权利要求18-22中任一项所述的组合物，其中所述溶液包含小于或等于约10EU内毒素每mg质粒。
24.根据权利要求18-22中任一项所述的组合物，其中所述溶液包含小于或等于约1EU内毒素每mg质粒。
25.根据权利要求18-22中任一项所述的组合物，其中所述溶液包含小于或等于约0.1EU内毒素每mg质粒。
26.根据权利要求18-25中任一项所述的组合物，其中所述溶液包含小于或等于约1.0％RNA。
27.根据权利要求18-25中任一项所述的组合物，其中所述溶液包含小于或等于约0.4％RNA。
28.根据权利要求18-25中任一项所述的组合物，其中所述溶液包含小于或等于约1.0％蛋白。
29.根据权利要求18-27中任一项所述的组合物，其中所述溶液包含小于或等于约0.20％蛋白。
30.根据权利要求18-29中任一项所述的组合物，其中所述溶液包含小于或等于约1％基因组DNA。
31.根据权利要求18-29中任一项所述的组合物，其中所述溶液包含小于或等于约0.01％基因组DNA。
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