CN102212466B - 制备质粒dna的碱裂解系统及组合系统 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种制备质粒DNA的碱裂解系统及组合系统，制备质粒DNA的碱裂解系统包括：细菌悬液储罐；碱裂解液储罐；中空超滤柱，包括由超滤膜分开的第一腔体和第二腔体，碱裂解液储罐与第一腔体相连通，细菌悬液储罐与第二腔体相连通。本发明提供的制备质粒DNA的碱裂解系统通过采用中空超滤柱将细菌悬液和碱裂解液混合均匀，避免了局部pH值过高问题和由于使用搅拌等常规混合方法而带来的剪切力过大的问题，提供了一种稳定性好、效率高和可重复性强的质粒DNA的碱裂解系统。同时，采用本发明所提供的制备质粒DNA的碱裂解系统制得的质粒DNA中超螺旋DNA的含量较高，能达到90％以上。

Description

制备质粒DNA的碱裂解系统及组合系统

技术领域

本发明涉及碱裂解的技术领域，具体而言，涉及一种制备质粒DNA的碱裂解系统及组合系统。

背景技术

基因治疗正处于研究阶段，其可能成为一些重大疾病如肿瘤、动脉粥样硬化、骨质疏松症、关节炎等的治疗手段，而基因治疗的关键是携带治疗基因的载体能否有效地进入靶细胞。目前，应用基因治疗的载体大致可以分为两大类，一类是病毒载体，另一类是非病毒载体。目前，临床上腺病毒载体占24％，反转录病毒载体占21.1％，质粒载体占18％。虽然病毒载体的转染率高，但存在一些安全隐患；而质粒DNA在靶细胞中的基因表达效率低、持续时间短，但它在靶细胞中安全性高。国内外研究机构都非常重视基因治疗的可能性，在国外采用质粒HGF治疗心血管疾病已进入III期临床试验。在国内采用质粒HGF治疗局部肢体动脉缺血疾病已进入I期临床试验。

为了保证基因治疗的研究，质粒DNA的大批量生产变得更为重要。碱裂解法是一种应用最为广泛的制备质粒DNA的方法，其原理是：基于染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异而达到分离目的。在pH值高达12.6的碱性条件下，染色体DNA的氢键断裂，双螺旋结构解开而变性。质粒DNA的大部分氢键也断裂，但超螺旋共价闭合环状的两条互补链不会完全分离，当以pH4.8的NaAc/KAc高盐缓冲液去调节其pH值至中性时，变性的质粒DNA又恢复原来的构型，保存在溶液中，而染色体DNA不能复性而形成缠连的网状结构，通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA、蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。碱裂解是整个质粒DNA分离纯化中的关键步骤，如果控制不好，会给后续分离纯化带来极大地困难。目前，碱裂解多数是在实验室中完成，其常常利用烧杯或不锈钢桶等容器来完成碱裂解过程。在碱裂解过程中多采用搅拌的方式使其混合均匀，然而由于搅拌带来的剪切力会将细菌chrDNA破坏成与质粒大小相同的DNA片段，而这些细菌chrDNA片段的化学和物理性质都与质粒DNA片段相似，在后续的分离纯化中很难将其去除。另外，现有的这种搅拌方式，一旦搅拌不均匀很容易造成局部过碱，而高pH值会造成质粒DNA的不可逆变性，从而降低质粒DNA的超螺旋比例，降低其回收率。在Levy等报道中指明质粒DNA大小超过20Kb对106S-1的剪切力非常敏感。然而现有的手动裂解工艺缺乏稳定性、高效性和可重复性，并且难以实现工业化生产。

发明内容

本发明旨在提供一种制备质粒DNA的碱裂解系统，以解决现有技术中碱裂解反应中搅拌带来的剪切力无法控制和搅拌不均带来的局部pH过高的问题，并进一步提供一种适于工业化连续生产的系统。

为了实现上述目的，根据本发明的一个方面，提供了一种制备质粒DNA碱裂解系统，包括：细菌悬液储罐；碱裂解液储罐；中空超滤柱，包括由超滤膜分开的第一腔体和第二腔体，碱裂解液储罐与第一腔体相连通，细菌悬液储罐与第二腔体相连通。

进一步地，上述中空超滤柱包括：外管，具有第一腔体，其上设有与碱裂解液储罐相连的第一进液口；内管，由超滤膜围成，具有第二腔体，并设置在第一腔体中，内管的两端分别具有穿透外管的管壁向外延伸的第二进液体口与出液口，第二进液口与细菌悬液储罐相连。

进一步地，上述第一进液口设置在靠近出液口的一侧。

进一步地，上述制备质粒DNA碱裂解系统还包括第一液压泵和第二液压泵，细菌悬液储罐通过第一液压泵与第二进液口相连；碱裂解液储罐通过第二液压泵与第一进液口相连。

在本发明的另一个方面，还提供了一种制备质粒DNA的组合系统，包括顺序连接的上述的碱裂解系统、中和系统以及分离系统。

进一步地，上述中和系统包括：中和液储罐；三通连接管，具有相通的第一端口、第二端口和第三端口，第一端口与中空超滤柱的出液口相连，第二端口与中和液储罐，第三端口与分离系统相连。

进一步地，上述中和系统还包括第三液压泵，中和液储罐通过第三液压泵与第二端口相连。

进一步地，上述分离系统包括：过滤器，包括滤入口和滤出口，滤入口与第三端口相连；澄清溶液储罐，与过滤器滤出口相连。

进一步地，上述制备质粒DNA的组合系统还包括振荡器，振荡器设置在第三端口与过滤器之间。

进一步地，上述制备质粒DNA的组合系统还包括回旋管道，回旋管道设置在出液口与第一端口的连路上和/或第三端口与振荡器的连路上。

本发明的技术效果在于：本发明提供的制备质粒DNA的碱裂解系统通过采用中空超滤柱将细菌悬液和碱裂解液混合均匀，避免了由于使用搅拌等常规混合方法而带来的剪切力过大的问题和局部pH值过高问题，提供了一种稳定性好、效率高和可重复性强的质粒DNA的碱裂解系统。同时，采用本发明所提供的制备质粒DNA的碱裂解系统制得的质粒DNA中超螺旋DNA的较高，能达到90％以上。

附图说明

附图是构成本申请的一部分，说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：

图1示出了根据本发明实施例的连续制备质粒DNA的组合系统的结构示意图。

具体实施方式

需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将参考附图并结合实施例来详细说明本发明。

本发明中所称细菌悬液指含有待提纯质粒DNA的宿主细菌，经常规方法培养后，菌体在溶液中搅拌后制成的细菌悬液。所称裂解液为具有溶解细菌功能的碱溶液，如0.2N NaOH与1％SDS制成的混合液。所称中和液为能使得待调溶液的PH值调节为中性且不破坏提纯的质粒DNA的溶液，如3M醋酸钾和2M醋酸混合的溶液。

图1为本发明连续制备质粒DNA的组合系统的结构示意图，其中包括制备质粒DNA碱裂解系统。

如图1所示，在本发明的一种实施例中，提供了一种制备质粒DNA的碱裂解系统，在该系统中包括细菌悬液储罐11、碱裂解液储罐13、和中空超滤柱15，其中，中空超滤柱15包括由超滤膜分开的第一腔体和第二腔体，碱裂解液储罐13与第一腔体相连通，细菌悬液储罐11与第二腔体相连通。本发明提供的制备质粒DNA的碱裂解系统通过采用中空超滤柱，利用中空超滤柱内超滤膜的渗透能力，在压力作用下，碱裂解液透过超滤膜从第一腔体进入第二腔体与细胞悬液发生反应，将细菌悬液和碱裂解液混合均匀，避免了由于使用搅拌等常规混合方法而带来的剪切力过大的问题和局部pH值过高问题，同时，由于所生成的质粒DNA无法透过超滤膜，使得DNA具有定向的导出方向，这就形成了稳定的连续性生产系统，提高了反应效率，加强了可重复性。

在本发明上述中空超滤柱15中，由超滤膜分开的第一腔体和第二腔体可以是在同一个空腔内位于超滤膜两侧的两个腔体。

作为本发明的优选实施例，上述中空超滤柱15被超滤膜分为相互嵌套的外管151和内管153，外管151中具有第一腔体，内管153设置在外管151的第一腔体内，由超滤膜围成，其中具有第二腔体。外管151上设有与碱裂解液储罐13相连的第一进液口159。内管153的两端分别具有穿透外管的管壁向外延伸的第二进液体口155与出液口157，第二进液口155与细菌悬液储罐11相连。这种相互嵌套的结构能够增加第一腔体与第二腔体的接触面积，使得碱裂解液能够从多个角度透过超滤膜与细菌悬液混合，进而保证碱裂解液和细菌悬液混合的均匀性。更为优选地，上述中空超滤柱15中具有多个内管，设置多个内管能够进一步增加碱裂解液与细菌悬液的接触面积，进一步保证碱裂解液和细菌悬液混合的均匀性。

优选地，上述中空超滤柱15中设置在外管151上的第一进液口159靠近出液口157设置。此时，从靠近出液口157设置的第一进液口159流入的碱裂解液与从第二进液口155流入的细菌悬液具有一个相反的流动方向，在一定压力的作用下，能够使得两者混合的更均匀，裂解更充分。优选地，该中空超滤柱15中第二进液口155和出液口157位于中空超滤柱15轴向的两端，使得第二进液口155和出液口157具有较远的距离，使得混合反应提供充分的空间和时间。在本发明制备质粒DNA的碱裂解系统中也可以直接采用市售的中空超滤柱，市售的中空超滤柱多具有两个第一进液口159，一个靠近出液口157设置，一个靠近第二进液口设置。在采用市售的中空超滤柱时，可以将碱裂解液储罐13与其中一个第一进液口159相连，将另外一个堵住。也可以将碱裂解液储罐13同时与两个第一进液口159相连。

在本发明中超滤膜的孔径优选为20-1000

其截留分子量为3000～1000000道尔。如果膜的截留分子量过大则反应中溶解出的质粒DNA易外漏，而降低收率；如果膜的截留分子量过小则会影响碱裂解液中的碱性离子的渗透率，进而影响质粒DNA片段的产量。在本发明中可选的超滤膜包括但不限于聚丙烯基膜类的高分子膜。本领域技术人员能够根据设备的需要选择适当的超滤膜。

在本发明制备质粒DNA的碱裂解系统的使用过程中，可以将细菌悬液储罐11和碱裂解液储罐13置于高于中空超滤柱15的位置，使细菌悬液和碱裂解液通过重力作用直接流入到中空超滤柱15中。优选地，上述中空超滤柱15中还设有第一液压泵17和第二液压泵19，细菌悬液储罐11通过第一液压泵17与第二进液口155相连；碱裂解液储存罐13通过第二液压泵19与第一进液口159相连。在本发明所提供的制备质粒DNA碱裂解系统中安装液压泵，能够手动或者通过外部电信号自动地将位于细菌悬液储罐11中的细菌悬液和位于碱裂解液储罐13中的碱裂解液以一定的动力泵入到中空超滤柱15中，形成稳定的连续生产模式。同时，借助泵的动力，能够降低混合裂解反应对装置的要求，使得细菌悬浮液和碱裂解液能适应各种装置环境，并使得超滤膜内各个位置碱离子浓度均一，避免使用搅拌等混合方法时对反应液产生剪切力而导致细菌的chrDNA破坏成与质粒大小相同的DNA片段。在实际操作过程中，本领域技术人员能够根据该制备质粒DNA碱裂解系统的结构大小，所使用的泵的大小，适当选择液压泵的泵速，优选地，上述中空超滤柱15中细菌悬液和碱裂解液在混合裂解过程中的体积比为3∶1～1∶1，更优选为1∶1。细菌悬液和碱裂解液的体积比在该范围内能够使得混合裂解效果更好，有效的利用碱裂解液，提高质粒DNA的片段的产量。

在本发明中的实施例中还提供了一种制备质粒DNA的组合系统，该组合系统包括顺序连接的上述碱裂解系统、中和系统以及分离系统。本发明所提供的这种制备质粒DNA的组合系统能够连续的、大批量的生产质粒DNA，是一种适用于工业化生产质粒DNA的组合系统。

中和系统的作用是将中和液与经过碱裂解反应得到的混合溶液进行中和反应，中和混合溶液中过多的碱形成盐。使得混合溶液中呈中性以便裂解的质粒DNA复性溶解于溶液中，同时，加入中和液还能将细菌裂解后的蛋白质以沉淀的形式析出，减少蛋白质对提纯DNA超螺旋比例的影响，提高质粒DNA中超螺旋DNA的比例。

优选地，上述中和系统包括中和液储罐31和三通连接管33，这种三通连接管33具有相通的第一端口、第二端口和第三端口，第一端口与中空超滤柱15的出液口157相连，第二端口与中和液储罐31相连，第三端口与分离系统相连。该中和系统将碱裂解系统和分离系统简单的连接在一起，实现了碱裂解分离和后续分离的一体化。更优选地，三通连接管为T型连接管，在T型连接管中第二端口位于垂直于第一端口与第三端口连线的平面内。与中空超滤柱15的出液口相连的第一端口和与分离系统相连的第三端口位于同一轴线上，使得由中空超滤柱15的出液口流出的混合溶液的流动方向保持不变，在第二端口泵入中和液，能够使得中和液与混合溶液混合均匀，使中和反应更充分。优选地，上述中和系统还包括第三液压泵35，中和液储罐31通过第三液压泵35与第二端口相连。第三液压泵的设置能够为中和液的泵入提供一定的动力，增加本发明所提供的制备质粒DNA的组合系统操作的连续性。利于大规模生产。更优选地，在中和过程中使得碱裂解液和中和液的体积比为4∶1～1∶1，更优选为1∶1。碱裂解液和中和液的体积比在该范围内能够使得中和效果更好，有利于提高所制备的质粒DNA中超螺旋DNA的比例。

分离系统是将经过中和反应后的混合溶液中的沉淀和溶液分离，收集清液，所得清液为质粒DNA溶液。

优选地，上述分离系统包括过滤器53和澄清溶液储罐51，过滤器53为常规使用的过滤器，包括滤入口和滤出口，滤入口与三通连接管的第三端口相连，澄清溶液储罐51与过滤器滤出口相连。这种分离系统，结构简单且容易制作。

优选地，本发明制备质粒DNA的组合系统中还包括振荡器70，振荡器70设置在第三端口与过滤器53之间。震荡器70具有槽体，槽体外壁上设置有与槽体联通的进口、出口，槽体在驱动装置的驱动下能震荡位于槽体内经中和反应后的混合溶液。通过震荡使得经中和反应后的混合溶液中的蛋白质等杂质充分沉淀，进而提高收率。

优选地，在本发明制备质粒DNA的组合系统中还包括回旋管道9，该回旋管道包括设置在中空超滤柱15的出液口与第一端口之间的连路上的第一回旋管道91和/或设置在第三端口与振荡器70之间的连路上的第二回旋管道93。该回旋管道9具有波浪状结构。回旋管道9的设置能够缩小设备的面积，减少设备所占面积。同时能够为增加混合裂解反应和中和/或反应的时间，使得反应更充分、完全，提高产率。

为了证明本发明所提供的制备质粒DNA的组合系统的有益效果，以下将结合具体实施例予以进一步说明。

具体是实例中所采用的菌体、DNA含量测定方法、超螺旋比例测定方法如下：

菌体制备：以制备自行构建的携带人肝细胞生长因子基因的质粒DNA为例，其大小为6.5kbp。宿主菌为大肠杆菌，按常规方法进行发酵，离心后获得菌体，-20℃保存备用。(上述携带人肝细胞生长因子基因的质粒DNA以及构建方法已经在专利号为ZL00132196.X，授权公告日为2004年5月19日，专利名称为一种重组质粒及其在疾病防治中的应用的专利中公开。)

DNA含量测定方法：取分离结束后的澄清溶液1mL置于离心管中，12000rpm离心5mm，取上清600μL置于离心管中，加入-20℃无水乙醇1.2mL，将离心管倒置4-5次，静置5min。离心弃上清，沉淀用0.2mL重悬液溶解，再加入0.2N NaOH溶液0.2mL，最后加入中和液0.3mL。将裂解液加入小提质粒试剂盒吸附柱内，然后按照质粒提取试剂盒操作步骤进行。最后用50μL洗脱液将质粒洗脱下来。吸取4μL加196μL注射用水稀释50倍后，利用紫外分光光度计(Beckman DU640，USA)进行含量测定。

超螺旋比例测定方法：将分离结束后的澄清溶液利用Waters高效液相色谱仪(Waters，USA)进行检测：色谱柱：TskgelDNA-NPR(0.46id×7.5cm，TOSOH，日本)，检测波长：260nm，流速0.5ml/min，流动相A：20mmol/L Tris-HCl pH9.0；流动相B：20mmol/L Tris-HCl，1mol/L NaCl pH9.0，进样量：5μg，线性梯度洗脱条件：起始比例A∶B为50％∶50％，梯度洗脱30min，最终A∶B比例为20％∶80％，35min回到起始平衡色谱柱。

实施例1

装置：采用图1中本发明所提供的制备质粒DNA的组合系统，包括顺序连接的碱裂解系统、中和系统以及分离系统。碱裂解系统包括细菌悬液储罐11、碱裂解液储罐13、中空超滤柱15，细菌悬液储罐11通过第一液压泵17与中空超滤柱15的第二进液口155相连，碱裂解液储罐13通过第二液压泵19与中空超滤柱15的第一进液口159。中和系统包括中和液储罐31和T型连接管，中和液储罐31通过第三液压泵35与T型连接管的第二端口相连。分离系统包括过滤器53和澄清溶液储罐51，中和系统和分离系统之间连有振荡器70。其中，超滤膜截留分子量为4000。

原料：细菌悬液，400g菌体与4000mL溶液I混合，溶液1为50mmol/L Glucose，25mmol/L Tris-HCl以及10mmol/L EDTA的混合液，其pH为8.0。碱裂解液：200mmol/L NaOH和1％SDS的混合液，中和液：3mol/L KOAc和5mol/L HAc的混合液。

实施例2

装置：与实施例1中相同，其中，第一进液口159靠近出液口157设置。

原料：与实施例1相同。

对比例1

手动碱裂解法：将由400g菌体与4000mL溶液I混合的细菌悬液层析在冷柜中，磁力搅拌器充分重悬后在冰浴上加入4000mL碱裂解液，缓慢搅拌，形成粘稠物；随即加入4000mL中和液，形成白色絮凝物，冰浴，静置1h。用两层绸布过滤，获得澄清溶液。

原料：与实施例1相同

对比例2

装置：与实施例1相同，其中中空超滤柱15采用T型管代替。

原料：与实施例1相同。

将实施例1和2及对比例1和2所制得的澄清溶液经DNA含量测定方法和超螺旋比例测定方法进行测定。其中，在DNA含量测定方法中以对比例1所获取的DNA含量为基础，设定为100％，测算实施例1和2以及对比例2的所获得的DNA含量的相对产率。将检测的超螺旋比例和相对产率所得结果列于表1中。

表1质粒DNA产率和超螺旋比例结果

由表1可见，以本发明提供生产系统裂解得到的质粒DNA的相对产率都高于对比例1。其中，实施例1和2中超螺旋比例也高于对比例中超螺旋的比例，且其比例高于90％。由表1同样可知，实施例2的效果优于实施例1。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种制备质粒DNA的碱裂解系统，其特征在于，包括： 

细菌悬液储罐(11); 

碱裂解液储罐(13); 

中空超滤柱(15)，包括： 

外管(151)，具有第一腔体，其上设有与所述碱裂解液储罐(13)相连的第一进液口(159); 

内管(153)，由超滤膜围成，具有第二腔体，并设置在所述第一腔体中，所述内管(153)的两端分别具有穿透所述外管(151)的管壁向外延伸的第二进液口(155)与出液口(157)，所述第二进液口(155)与所述细菌悬液储罐(11)相连; 

所述碱裂解液储罐（13)与所述第一腔体相连通，所述细菌悬液储罐(11)与所述第二腔体相连通。 

2.根据权利要求1所述的碱裂解系统，其特征在于，所述第一进液口(159)设置在靠近所述出液口(157)的一侧。 

3.根据权利要求1所述的碱裂解系统，其特征在于，还包括第一液压泵(17)和第二液压泵(19)，所述细菌悬液储罐(11)通过所述第一液压泵(17)与所述第二进液口(155)相连;所述碱裂解液储罐(13)通过所述第二液压泵(19)与所述第一进液口(159)相连。 

4.一种制备质粒DNA的组合系统，其特征在于，包括顺序连接的上述权利要求1-3中任一项所述的碱裂解系统、中和系统以及分离系统;其中， 

所述中和系统包括： 

中和液储罐(31); 

三通连接管(33)，具有相通的第一端口、第二端口和第三端口，所述第一端口与所述中空超滤柱（15)的出液口(157)相连，所述第二端口与所述中和液储罐(31)相连，所述第三端口与所述分离系统相连; 

所述分离系统包括: 

过滤器(53)，包括滤入口和滤出口，所述滤入口与所述第三端口相连; 

澄清溶液储罐(51)，与所述过滤器(53)的滤出口相连。 

5.根据权利要求4所述的组合系统，其特征在于，所述中和系统还包括第三液压泵(35)，所述中和液储罐(31)通过所述第三液压泵(35)与所述第二端口相连。 

6.根据权利要求4所述的组合系统，其特征在于，还包括振荡器(70)，所述振荡器(70)设置在所述第三端口与所述过滤器(53)之间。 

7.根据权利要求6所述的组合系统，其特征在于，还包括回旋管道(9)，所述回旋管道(9)设置在所述出液口(157)与所述第一端口的连路上和/或所述第三端口与所述振荡器(70)的连路上。 

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