JP2010527617A - 高濃度の生物学的に活性な分子を含む組成物とその製造方法 - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、本明細書に参照により援用される2007年5月23日に出願された米国仮出願第60/939,792号の利益を主張する。
本発明は、高濃度のプラスミドのような生物学的に活性な分子を含むバルク組成物、及びそのような組成物を製造する方法に関する。
細胞中で作られ、細胞から分離される生物学的に活性な分子に関する多くの使用例がある。参照により本明細書に援用される米国出願公開第20050014245号は、生体材料製造の方法と装置を開示する。生物学的に活性な分子はタンパク質と核酸分子を含んでいる。生きている細胞のそのような分子の製造は、代替製造法に対して多くの優位性を提供するが、細胞から生物学的に活性な分子を抽出するとき、分離と精製の問題が発生する。細胞の中には多くの成分が存在し、対象とする生物学的に活性な分子の高い収量が現実化することを妨げ、また同時に最終産物への望ましくない夾雑物の存在を表している。
a)複数の該細胞の細胞懸濁液と溶解液(lysis solution)との接触によって溶菌液を製造し;
b)中和液による該溶菌液(lysate solution)を中和し、中和した溶菌液と残骸物を含む分散液を製造し;
c)少なくとも1つのフィルターを通過させて分散液をろ過し;
d)該中和した溶菌液に対してイオン交換分離を行い、イオン交換溶出液を製造し;及び
e)該イオン交換溶出液に対して疎水性相互作用分離を行い、疎水性相互作用液を製造する。この局面のいくつかの態様において、大規模工程はさらに、該疎水性相互作用液の限外ろ過による、少なくとも1つの生物学的に活性な分子の溶液の調製の工程を含むものである。
a)複数の該細胞による細胞懸濁液と溶解液とを接触させることによって溶菌液を製造し;
b)中和液による該溶菌液を中和して、中和した溶菌液と残渣を含む分散液を製造し;
c)少なくとも1つのフィルターを通過させて分散液をろ過し;
d)該中和した溶菌液に対してイオン交換分離を行って、イオン交換溶出液を製造し;そして
e)該イオン交換溶出液に対して疎水性相互作用分離を行って、疎水性相互作用液を製造する。
プラスミドAを含むエシェリキア・コリ(“E.coli”)細胞が、光学細胞密度(“OD600”)が72という高密度になるまで培養され遠心で集菌された。プラスミドAは6549bpのサイズである。プラスミドは約250コピー/細胞という低いコピー数で典型的に複製する。細胞湿重量(“WCW”)約3.1kgの細胞ペーストが最終容量を約21.5Lにした25mMトリス−塩酸(“Tris−HCl”、米国ニュージャージー州、フィルスバーグ、J.T.ベーカー)、10mMエデト酸二ナトリウム(“Na2EDTA”、米国ニュージャージー州、フェアローン、フィッシャーサイエンティフィック)、pH8からなる再懸濁溶液に懸濁された。この細胞懸濁液が、300mL/分で“Y”コネクタの一方の側にポンプで送り込まれた。同時に、0.2N水酸化ナトリウム(“NaOH”、米国ニュージャージー州、フィルスバーグ、J.T.ベーカー)、1%ドデシル硫酸ナトリウム(“SDS”、米国ニュージャージー州、フィルスバーグ、J.T.ベーカー)からなる溶菌液が300mL/分で“Y”コネクタの他方の側にポンプで送り込まれた。“Y”コネクタを出て行く合わされた流動体は、標準的なエマルサスクリーン(米国マサチューセッツ州、イーストロングメドウ、シバーソンマシーンズInc)とインラインアセンブリーを取り付けたシルバーソンモデルL4R回転子/固定子ミキサーにすぐに通された。ミキサーは800rpmのロータ速度で運転された。
プラスミドBを含むE.coli細胞3140グラム量が、pH8の25mM Tris−HCl(米国ニュージャージー州、フィルスバーグ、J.T.ベーカー)及び10mM Na2EDTAからなる再懸濁緩衝液に再懸濁され最終容量が18.8Lになった。プラスミドBは4.7kbのサイズである。懸濁された細胞は、800rpmのロータ速度で運転されるシルバーソンモデルL4R回転子/固定子ミキサーによる300mL/分の同じ流速で、0.2N NaOH(米国ニュージャージー州、フィルスバーグ、J.T.ベーカー)及び1%SDS(米国ニュージャージー州、フィルスバーグ、J.T.ベーカー)からなる溶解液と混ぜ合わされた。ミキサーからの溶菌液の流出物は、予め冷却された(4〜5℃)中和/沈殿(NP)溶液と混ぜ合わせるバブルカラムに入る前に、保持コイルでの5−分の保持時間が維持された。1M酢酸カリウム(米国ニュージャージー州、フィルスバーグ、J.T.ベーカー)及び3M酢酸アンモニウム(米国ニュージャージー州、ギブスタウン、EMDケミカルズInc)を含むNP溶液が、600mL/分でバブルカラムミキサーに供給され、同時に圧縮空気が流速3〜5slpmで底部のスパージャから導入された。
プラスミドC(3.5kbのプラスミドサイズ)を含むE.coli細胞が、高密度になるまで培養され遠心で集菌された。細胞湿重量24.4kgが400−Lの可動培養容積から回収された。細胞が、pH8の25mM Tris−HCl(米国ニュージャージー州、フィルスバーグ、J.T.ベーカー)及び10mM Na2EDTA(米国ニュージャージー州、フィルスバーグ、マリンクロット・ベーカー)からなる171Lの再懸濁緩衝液で3時間再懸濁された。再懸濁された細胞が、シルバーソンの高せん断ミキサーで、600ml/分という同じ流速で、新鮮な溶解液と混ぜられ、約5分間保持ループ内で保持された。1M酢酸カリウム(米国ニュージャージー州、フィルスバーグ、J.T.ベーカー)及び3M酢酸アンモニウム(米国ニュージャージー州、ギブスタウン、EMDケミカルズInc)からなる中和/沈殿溶液がバブルミキサーへ、1.2L/分の流速でポンプによって送り込まれ、溶解された細胞と混ぜ合わされた。ガス流速5〜6slpmで供給された圧縮空気は、攪拌力として働きまた中和された溶菌液を収集タンクに運んだ。溶解工程には約5時間が使われた。バブルミキシング装置を出て行く中和された細胞は収集タンクに向けられ、次のろ過に連続的に供された。
細胞湿重量25kgのプラスミドCを含むE.coli細胞が、pH8の25mM Tris−HCl(米国ニュージャージー州、フィルスバーグ、J.T.ベーカー)及び10mM Na2EDTAからなる105Lの再懸濁液で、全3時間に渡って再懸濁された。プラスミドCのサイズは3.5kbである。再懸濁された細胞は、シルバーソンモデルL4R回転子/固定子ミキサーに流速1500ml/分でポンプにより送り込まれ、同時に、0.2N NaOH(米国ニュージャージー州、フィルスバーグ、J.T.ベーカー)及び1%SDS(米国ニュージャージー州、フィルスバーグ、J.T.ベーカー)からなる溶解液が同じミキサーによって1500ml/分の流速で送られた。溶解された細胞を含む混合液が、内径(ID)1インチで100フィートの長さの保持コイルを通る。懸濁液がミキサーに入ってから保持コイルを出るまでのおおよその保持時間は5分である。溶解された細胞は、次にバブルカラムに入り、予め冷却された(4〜5℃)中和/沈殿溶液(NP)に接触した。1M酢酸カリウム(米国ニュージャージー州、フィルスバーグ、J.T.ベーカー)及び3M酢酸アンモニウム(米国ニュージャージー州、ギブスタウン、EMDケミカルズInc)を含むNP溶液が、3000mL/分の流速でバブルカラムミキサーに供給された。同時に、底部のスパージャから6〜10slpmの流速で圧縮空気が導入され攪拌力として働き、中和した溶液が、粗製溶菌液タンクへと導くディバーティングパイプへ入ることを容易にした。
以下の表Iは、コピー数の少ないプラスミドAに関する、方法IIを用いて製造された十四個のプラスミド標品を示す。そしてそこでは、検出されたいくつかの純度パラメータも付してある。生成のプロトコールは、上記の実施例3で議論されたものである。
プラスミドCは3.5kbのサイズを有す(実施例3と実施例4にあるように)。プラスミドD1〜D3は4.4〜4.7kbの範囲にあり、発現遺伝子である以外は類似したコンストラクトを有している。プラスミドE1〜E2は3.8kbのサイズを有し、発現遺伝子である以外は類似したコンストラクトを有している。プラスミドFは2.5kbのサイズを有す。
Claims (31)
- バクテリア細胞からの少なくとも1つの対象とする生物学的に活性な分子の高純度試料を製造するための大規模方法であって、以下の工程:
a)複数の細胞の細胞懸濁液を溶解液(lysis solution)と接触することによる溶菌液(lysate solution)を製造し;
b)中和液を用いて該溶菌液を中和して、中和した溶菌液と残骸物を含む分散液を製造し;
c)少なくとも1つのフィルターを通過させて分散液をろ過し;
d)該中和した溶菌液に対してオン交換分離を行って、イオン交換溶出液を製造し;
e)該イオン交換溶出液に対して疎水性相互作用分離を行い、疎水性相互作用液を製造する
を含む前記方法。 - 工程a)が、強いせん断力がかかるインラインミキサー中で前記細胞懸濁液と溶解液とを混合することを含む、請求項1に記載の方法。
- 工程b)が、バブルミキサー中で前記溶菌液と前記中和溶液とを混合することを含む、請求項1又は2に記載の方法。
- 工程e)が、疎水性相互作用カラム又は疎水性相互作用膜を使用して、疎水性相互作用分離を行い、疎水性相互作用液を形成することを含む、請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
- さらに、下記の工程:
f)前記疎水性相互作用液の限外ろ過によって、生物学的に活性な分子の溶液を調製する
ことを含む、請求項1〜4のいずれか1項に記載の方法。 - さらに、下記の工程:
g)生物学的に活性な分子の該溶液の滅菌ろ過によって、少なくとも1つの生物学的に活性な分子の滅菌溶液を調製する
ことを含む、請求項1〜5のいずれか1項に記載の方法。 - さらに、一定時間、分散液を保持して、中和した溶菌液を残骸物から分離し、少なくとも1つのフィルターを通過させて中和した溶菌液をろ過することを含む、請求項1〜6のいずれか1項に記載の方法。
- 前記製造工程が、約1分〜約20分の時間、ミキサー中で前記細胞懸濁液と溶解液とを接触を含む、請求項1〜7のいずれか1項に記載の方法。
- 前記時間が約4分〜約8分である、請求項8に記載の方法。
- 前記時間が約5分である、請求項8に記載の方法。
- 前記生物学的に活性な分子がプラスミドである、請求項1〜8のいずれか1項に記載の方法。
- 前記イオン交換がアニオン交換膜である、請求項1〜8のいずか1項に記載の方法。
- ブチル疎水性相互作用クロマトグラフィー溶出液である疎水性相互作用溶液を生産するために、工程e)が、疎水性相互作用分離の実行がブチル疎水性相互作用クロマトグラフィーを含む、請求項1〜8、11、及び12のいずれか1項に記載の方法。
- 実質的に連続的に1つの工程から次の工程へ移行することを含み、容器中で溶菌物を回収し、分散液を第1のフィルターに通過させて、最初の粗製な中和した溶菌液を製造することによって、分散液中の残骸物から中和した溶菌液を分離することを含む、請求項1〜8、及び11〜13のいずれか1項に記載の方法。
- さらに最初の粗製な中和した溶菌液を第2のフィルターに通過させて、次の粗製な中和した溶菌液を製造することを含む、請求項14に記載の方法。
- バクテリア細胞由来の少なくとも1つの対象とする生物学的に活性な分子の高純度の試料を製造するための大規模方法であって、以下の工程:
細胞の分散液中のバクテリア細胞と溶解液とを接触させ、溶菌液を形成し;
バブルカラムミキサーで溶菌液の中和溶液を溶菌液に混合して、中和した混合液を形成させ;
中和した混合液を第1のフィルター及び第2のフィルターに通過させて、ろ過溶液を形成させ;
ろ過溶液をイオン交換カラムに通過させて、イオン交換液を形成させ;
イオン交換液を疎水性相互作用カラム又は疎水性相互作用膜に通過させて、疎水性相互作用液を形成させ;
疎水性相互作用液を限外ろ過して、少なくとも1つの対象とする生物学的に活性な分子の高純度の試料を形成させる
ことを含み、ここで、接触工程からろ過溶液を通過させる工程の、1工程から次の工程へのそれぞれの移行は、実質的に連続的に起こる前記方法。 - 請求項1に記載の方法によって調製された少なくとも1つの対象とする生物学的に活性な分子を含む組成物であって、ここで、少なくとも1つの対象とする生物学的に活性な分子はDNAプラスミドである前記組成物。
- 前記組成物が溶液中に約10mg以上の量でDNAプラスミドを含む、ここで該プラスミドの高純度は、該プラスミドが約90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、又は99%を超えて存在する、請求項17に記載の組成物。
- 前記プラスミドの純度が約99%より大きい、請求項18に記載の組成物。
- 溶液中のプラスミドの濃度が約5、6、7、8、9、10、11、12、又は13mg/mLである、請求項18又は19に記載の組成物。
- 前記プラスミドが約50%を超えるスーパーコイル状のプラスミドを含む、請求項18〜21のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記プラスミドが約80%を超えるスーパーコイル状のプラスミドを含む、請求項18〜21のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記溶液がプラスミド1mg当たり約10EU以下のエンドトキシンを含む、請求項18〜22のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記溶液がプラスミド1mg当たり約1EU以下のエンドトキシンを含む、請求項18〜22のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記溶液がプラスミド1mg当たり約0.1EU以下のエンドトキシンを含む、請求項18〜22のいずれか1項に記載の組成物。
- 該溶液が約1.0%以下のRNAを含む、請求項18〜25のいずれか1項に記載の組成物。
- 該溶液が約0.4%以下のRNAを含む、請求項18〜25のいずれか1項に記載の組成物。
- 該溶液が約1.0%以下のタンパク質を含む、請求項18〜25のいずれか1項に記載の組成物。
- 該溶液が約0.20%以下のタンパク質を含む、請求項18〜27のいずれか1項に記載の組成物。
- 該溶液が約1%以下のゲノムDNAを含む、請求項18〜29のいずれか1項に記載の組成物。
- 該溶液が約0.01%以下のゲノムDNAを含む、請求項18〜29のいずれか1項に記載の組成物。
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