KR101497728B1 - 고농도의 생물학적 활성 분자 함유 조성물 및 그 제조 방법 - Google Patents

Abstract

박테리아 세포로부터 관심상의 생물학적 활성 분자의 고순도 샘플을 대규모로 제조하는 방법이 개시된다. 본 방법은 하기의 단계를 포함한다: 상기 복수 세포의 세포 현탁액을 용해 용액과 접촉시켜 용해물 용액을 제조하는 단계; 중화 용액으로 상기 용해물 용액을 중화하여, 중화된 용해물 용액과 잔여물을 포함하는 분산액을 제조하는 단계; 하나 이상의 필터로 분산액을 여과하는 단계; 상기 중화된 용해물 용액으로 이온 교환 분리를 실시하여 이온 교환 용출물을 제조하는 단계; 및 상기 이온 교환 용출물에 대해 소수성 상호작용 분리를 실시하여 소수성 상호작용 용액을 제조하는 단계. 또한, 개시된 대규모 방법에 의해 제조된 대규모 양의 플라스미드 DNA를 함유한 조성물이 제공된다.

벌크 조성물, 세포 용해, 이온 교환, 소수성 상호작용, 플라스미드

Description

고농도의 생물학적 활성 분자 함유 조성물 및 그 제조 방법{COMPOSITION COMPRISING HIGH CONCENTRATION OF BIOLOGICALLY ACTIVE MOLECULES AND PROCESSES FOR PREPARING THE SAME}

본 출원 관련 교차 문헌

본 출원은 2007.5.23에 출원된 미국 가출원 제 60/939,792호의 우선권을 주장하며, 그 내용은 본원에 참조로 편입된다.

본 발명은 플라스미드와 같은 생물학적 활성 분자를 고농도로 함유하는 벌크 조성물 및 이러한 조성물의 제조 방법에 관련된다.

세포로부터 단리되고 제조되는 생물학적 활성 분자는 그 용도가 다양하다. 본원에 참조로 편입되는 미국 공개 일련 번호 20050014245에는, 생물질 제조용 장치 및 방법이 기재되어 있다. 생물학적 활성 분자는 단백질 및 핵산 분자를 포함한다. 살아 있는 세포에서 이들 분자를 제조하는 것은 다른 제조 방법에 비해 다수의 장점을 제공하나, 세포로부터 생물학적 활성 분자를 추출시에 단리 및 정제 문제가 발생한다. 최종 생성물에 대해 존재할 수 있는 원치 않는 오염물을 나타낼뿐더러, 관심상의 생물학적 활성 분자의 고수율을 실현하는 것을 방해하는 각종 성 분이 세포 내에 존재한다.

비바이러스성 유전자 치료법 및 DNA 백신 분야의 출현 덕분에 플라스미드 제조는 관심 분야가 되었다. 플라스미드는 크고 복잡한 거대 분자로서, 방해 받지 않는 한 수퍼코일된 DNA 구조를 유지한다. 합성적 수단을 사용하는 것에 비해, 많은 경우에서는 생물학적 시스템 내에서 이들을 생산하고, 그러한 시스템으로부터 이들을 연이어 단리 및 정제하는 것이 비용면에서 더 효율적이다. 플라스미드의 생물학적 제조는, 관심상의 플라스미드를 함유하는 대장균 (Escherichia coli; "E. coli") 세포를 발효시키는 형태를 보통 취한다.

세포 용해(cel lysis) 및 정제를 위한 공정도를 준비하기 위해 사용되는 후속 처리 단계는 어떤 플라스미드 공정에 있어서도 가장 어렵고, 복잡하며 중요한 단계들이다. 각 플라스미드 제조 작업에 대한 수율 및 품질이 규정되는 것도 바로 이 공정이다. 연속적이며 스케일 조절 가능하고, 플라스미드 크기에 무관하게 고농도로 제형화할 수 있는 고품질 생성물을 생산하는 적절한 방법을 찾는 것은 상업적 규모로 허용되는 공정을 획득하는데 장애가 되어왔다.

알칼리 및 세제를 이용하여 플라스미드 정제를 위한 박테리아를 용해하는 것이 일반적인 기법이다. 불행하게도, 이 방법은 대규모 제조 (또는 보다 큰 스케일의 제조)에 있어서 큰 문제를 제공한다. 먼저, 용해 용액(lysis solution)과 현탁 세포를 완전히 혼합하는 것은 작은 스케일에서는 세포를 함유하는 용기를 간단히 소용돌이(vortex)로 돌리거나 뒤집음으로써 쉽게 실시할 수 있다. 그러나, 부피가 수십 또는 수백 리터 범위일 수 있는 보다 큰 스케일에서는 이 방법이 비현실 적이다. 임펠러 혼합과 같은 큰 부피의 액체를 혼합하기 위한 통상의 기법은 세포 일부가 초기 혼합 이후 용해하기 시작하여 용액의 점도를 현저하게 증가시키는 게놈 DNA를 방출하기 때문에 문제가 된다. 이러한 점성도의 증가는 추가의 혼합을 심각하게 방해한다. 다른 문제는 알칼리 용해 용액 첨가 이후 높은 pH에서의 과도한 보존(incubation)은 플라스미드의 영구 변성화를 초래하여 대부분의 후속 용도, 특히 치료 목적에 부적합하게 만든다는 점이다. 또한, 이 단계에서의 혼합은 완전하면서도 충분히 부드러워서 (즉, 낮은 전단력), 유모성(솜털같은; flocculent) 물질의 상당량이 플라스미드 함유 용액 내로 침전되는 것을 막을 수 있어야 함은 공지의 사실이다. 유모성 침전물 내에는 다량의 숙주 게놈 DNA 및 내독소(endotoxin)가 존재하며, 이들이 플라스미드와 혼합될 때 후속의 정제동안 플라스미드로부터 이들을 분리하기가 어려울 수 있다. 따라서, 플라스미드의 대규모 제조는 플라스미드 수율을 최적화하고, 플라스미드 분해를 최소화하고, 기타 세포 성분의 제거를 최대화하여 이에 따라 상대적으로 큰 부피 내에서 고농도, 고품질, 고순도의 최종 생성물을 제조하기 위하여 물질을 추가 정제할 수 있도록 하는 방식으로, 다량의 세포를 용해 용액에 노출하고, 이들을 혼합하고 용해물을 중화하는 것이다.

플라스미드 제조를 위한 다양한 기존의 방법이 존재한다; 그러나, 이들 방법은 대규모 제조에는 부적합하다. 실험실 수준 정제 기법을 대규모 플라스미드 제조에 맞는 규모로 단순히 규모 확대하는 것은 불가능하다. 대규모 제조에는 오염물의 제거 및 플라스미드의 농도를 최대화하면서도 분자의 완전 보전성 및 수율을 최적화하는 것이 요구된다. 고농도 플라스미드 DNA를 다량으로 제조시, 수퍼코일 및 개환 이완 형태 (open circle relaxed form)로 플라스미드를 유지하는데 있어서 문제가 존재한다. 고염(high salt)의 보존 조건이 보통 필요하며, 염이 존재하는 경우라도 시간에 따른 분자 분해가 여전히 문제시된다. 많은 기존의 정제 방법은 잠정적으로 위험하고 독성이며, 돌연변이 유발성 또는 오염된 물질 및/또는 고가의 물질 또는 기구의 사용에 의존하며, 이는 다시금 대규모 제조에 바람직하지 않다. 일부 기존의 정제 방법은 최종적 제거를 위한 단백질 소화를 위해서 효소를 사용하며, 이러한 효소는 대규모 제조에 있어 고가이고 또한 생물학적 오염의 위험을 야기할 수 있다.

최소의 기구 및/또는 최소의 공정단계와 같은 비용상 효율적인 방법으로 불순물, 오염물 및 원치 않는 물질의 존재 없이 고수율, 고농도 및 최소한의 분해로 최종 생성물을 제조할 수 있는, 플라스미드와 같은 관심상의 생물학적 활성 분자를 대규모로 제조하는 방법이 필요하였다. 불순물, 오염물 및 원치 않는 물질의 존재 없이 고농도 및 최소한의 분해를 가진 대량의 플라스미드 용액 및, 이러한 용액을 제조하는 방법이 필요하였다. 낮은 복제수 플라스미드인 플라스미드에 대해서는 다량의 플라스미드가 필요하며, 밀리그램 ("mg") 범위 이상의 플라스미드 분량을 생산하기 위해서는 훨씬 다량의 세포를 필요로 하게 한다.

발명의 개요

본 발명의 한 면은, 박테리아 세포로부터 관심상 생물학적 활성 분자 하나 이상의 고순도 샘플을 대규모로 제조하는 방법을 포함한다. 본 대규모 제조 방법 은 다음 단계들을 포함한다:

a) 상기 복수 세포의 세포 현탁액을 용해 용액과 접촉시켜 용해물 용액을 제조하는 단계;

b) 중화 용액으로 상기 용해물 용액을 중화하여, 중화된 용해물 용액과 잔여물을 포함하는 분산액을 제조하는 단계;

c) 하나 이상의 필터로 상기 분산액을 여과하는 단계;

d) 상기 중화된 용해물 용액으로 이온 교환 분리를 실시하여 이온 교환 용출물을 제조하는 단계; 및

e) 상기 이온 교환 용출물에 대해 소수성 상호작용 분리를 실시하여 소수성 상호작용 용액을 제조하는 단계. 상기 내용의 일부 구현에서, 대규모 방법은 상기 소수성 상호작용 용액의 한외여과에 의한 생물학적 활성 분자 하나 이상의 용액을 제조하는 단계를 추가로 포함한다.

본 발명의 또 다른 면은, 다음의 단계들을 포함하는 박테리아 세포로부터 관심상 하나 이상의 생물학적 활성 분자의 고순도 샘플을 제조하는 대규모 방법을 포함한다: 세포 분산액 중의 박테리아 세포를 용해 용액과 접촉시켜 용해물 용액을 형성하는 단계; 버블 컬럼 믹서로 중화용액을 용해물 용액내로 혼합하여 용해물 용액을 중화하여, 중화된 혼합물을 형성하는 단계; 제 1 필터 및 제 2 필터를 통해 중화된 혼합물을 여과하여 여과된 용액을 형성하는 단계; 이온 교환 컬럼을 통해 여과된 용액을 통과시켜 이온 교환 용액을 형성하는 단계; 소수성 상호작용 컬럼 또는 소수성 상호작용 막을 통해 이온 교환 용액을 통과시켜 소수성 상호작용 용액 을 형성하는 단계; 및 소수성 상호작용 용액을 한외여과하여 관심상의 하나 이상의 생물학적 활성 분자의 고순도 샘플을 형성하는 단계; 이때 접촉 단계에서 여과된 용액을 통과시키는 단계에 이르는 대규모 방법에서의 한 단계로부터 후속 단계로의 각 전이(또는 이행)는 실질적으로 연속으로 일어난다.

본 발명의 다른 면에서는, 본원에 개시되고 기재된 방법에 의해 제조된 관심상 생물학적 활성 분자 하나 이상을 포함하는 조성물이 제공되며 이때 관심상 생물학적 활성 분자 하나 이상은 DAN 플라스미드이다. 일부 구현에서, 조성물은 용액중 약 10 mg 이상 분량의 하나 이상의 DNA 플라스미드를 포함하며, 상기 플라스미드는 약 90％, 91％, 92％, 93％, 94％, 95％, 96％, 97％, 98％, 또는 99％ 초과의 고순도로 존재하는 플라스미드이다.

본 발명의 각종 목적 및 이점은 다음과 같이 수반된 도면을 참조하여 당업자에 의해 보다 잘 이해되어진다:

도 1은, 연속 흐름(또는 유동) 공정에서 박테리아 세포로부터 관심상 생물학적 활성 분자를 단리 및 정제하는데 이용되는 한 구현의 모식도를 나타낸다.

도 2는, 하기 실시예 1의 샘플을 포함하는 전기 영동 젤 사진을 나타낸다: 1레인은 수퍼코일된 플라스미드 래더 (Invitrogen); 2레인은 세포 용해물; 3레인은 Q 음이온 교환이후의 생성물; 4레인은 소수성 상호작용 정제 이후의 생성물; 및 5레인은 UF 이후 혼합된 최종 생성물을 나타낸다.

도 3은, 실시예 3의 샘플을 포함하는 전기 영동 젤 사진을 나타낸다: 1레인 은 수퍼코일된 플라스미드 래더 (Invitrogen)를 나타내고; 2레인은 48 ㎛ 주름진 카트리지를 사용한 1차 여과 이후의 용해물을 나타내고; 3레인은 1 ㎛ 주름진 카트리지를 사용한 2차 여과 이후의 여과물을 나타내고; 4레인은 C0HC Pod 필터를 사용한 3차 여과 이후 여과물을 나타내고; 5레인은 Mustang Q 음이온 교환 단계 실시 이후 용출 생성물 분획 #1을 나타내고; 그리고 6레인은 Q 용출물의 제 2 분획을 나타낸다.

관심상 생물학적 활성 분자를 세포로부터 정제하는 방법이 제공되며 이에 따라 세포로부터 고수준의 순도 및 농도로 관심상 생물학적 활성 분자를 정제할 수 있다. 바람직하게 관심상 생물학적 활성 분자는 플라스미드 또는 DNA 플라스미드이다. 세포는 관심상 생물학적 활성 분자를 포함한 임의의 세포일 수 있다. 일부 구현에서, 세포는 박테리아 세포와 같은 일례로 원핵세포인 미생물 세포이다. 일부 구현에서 세포는 대장균 세포이다. 세포는 일례로 발효와 같은 임의 수단으로 제조 또는 생성 가능하다. 세포 발효 방법은 당업자에게 공지이다. 본 발명은 세포로부터 임의의 관심상 생물학적 활성 분자를 추출하는데 사용 가능하다. 일부 구현에서 본 발명은 관심상 생물학적 활성 분자의 하나 이상의 타입을 추출하는데 사용 가능하다. 관심상 생물학적 활성 분자는 핵산 분자 또는 단백질과 같은 거대분자일 수 있다. 일부 구현에서 관심상 생물학적 활성 분자는 플라스미드일 수 있다.

상호 교환적으로 사용되는 "플라스미드" 또는 "DNA 플라스미드"라는 용어는, 독립적으로 염색체 DNA의 복제가 가능한, 염색체 DNA로부터 분리된 염색체 이외의 DNA 분자인 원형 DNA 분자를 가리킨다. 인코딩 서열 또는 트랜스유전자가 종종 DNA 플라스미드 내에 포함되며, 이들이 존재시에 DNA 플라스미드는 발현 플라스미드 또는 발현 구축물로 불린다. 코딩 서열 또는 "인코딩 핵산 서열"은 핵산 분자가 투여되는 개체의 세포 내에서 발현을 지시할 수 있는 폴리아데닐화 신호 및 프로모터를 포함한 조절 요소에 작동적으로 연결된 개시 및 종결 신호들을 포함할 수 있다.

기재된 방법과 관련하여 사용된 "대규모"라는 용어는 박테리아 세포 현탁액 또는 박테리아 세포로부터 약 1 그램 이상의 하나 이상의 생물학적 활성 분자, 특히 DNA 플라스미드의 분량을 생성하는 정제 방법, 및/또는 약 1 kg 이상의 박테리아 세포 덩어리 분량의 용해를 필요로 하는 정제 방법을 가리킨다.

생물학적 활성 분자, 특히 DNA 플라스미드의 순도 수준과 관련해서 사용되는 "고순도"라는 용어는 적어도 약 90％ 이상; 및 바람직하게는 약 91％ 이상, 약 92％ 이상, 약 93％ 이상, 약 94％ 이상, 약 95％ 이상, 약 96％ 이상, 약 97％ 이상, 약 98％ 이상, 또는 약 99％ 이상의 수준으로 숙주 박테리아 세포로부터 분자를 정제하는 것을 가리킨다.

본원에 개시된 방법과 관련하여 사용된 "연속" 또는 "실질적으로 연속" 이라는 용어는 정제 과정의 시작부터 이온 교환 크로마토그래피 컬럼의 로딩에 이르는, 정제 방법의 각 단계로부터 각 후속 단계 간의 물질 (또는 용액 또는 분산액)의 연속적 흐름을 나타낸다. 일례로, 분산액의 박테리아 세포가 접촉 단계에서 용해 용액과 접촉함에 따라 용해물 용액을 형성하고, 그 용해물 용액은 중화 용액과 함께 다음의 중화 단계로 바로 흘러들어가게 된다. 단계들 간의 이러한 연속 전이는 정제 과정 단계 사이에서의 홀딩 또는 인큐베이션 단계를 제거하도록 한다.

"생물학적 활성 분자"라는 용어는 기능 상태에 있는 박테리아 내부에 포함된 분자 또는 생물분자를 가리키고, 일부 구현에서는 특히 DNA 플라스미드를 가리킨다. DNA 플라스미드는 분리되어 관심상 세포를 형질감염시키는데 사용 가능하다. 본 발명의 조성물은 생물학적 활성 분자의 적어도 하나 이상 타입을 포함한다. 일부 구현에서, 본 발명의 조성물은 생물학적 활성 분자 하나 초과의 타입을 포함한다.

플라스미드는 이들이 이완 또는 엄격한 조절하에 놓여있는지의 여부를 결정하는, 일례로 pMBl 또는 pSClOl을 포함하는 복제 근원(origin); 및 플라스미드 및 그에 수반된 삽입 서열의 크기에 따라 그 복제수가 크게 가변한다. pUC 시리즈 및 그 유도체와 같은 일부 플라스미드는 박테리아 세포 내에서 매우 높은 복제수를 달성할 수 있도록 하는 돌연변이를 가진다. pBR322 기재의 플라스미드는 보통 낮은 복제수로 유지된다. 매우 큰 플라스미드들은 보통 세포당 매우 낮은 복제수로 유지된다. 본 발명의 일부 구현은, 비용면에서 효과적이며 최소 단계의 제조 방법으로 (고 수율을 유지하기 위해) 그램 분량과 같은 대량의 플라스미드를 수득할 수 있는 세포, 바람직하게는 박테리아 세포로부터 대규모로 플라스미드 정제를 가능하게 하는 플라스미드 정제 방법에 관련된다. 일부 구현에서, 플라스미드는 낮은 복제수의 플라스미드이다. 제공된 방법 및 생성되는 얻어진 생물학적 활성 분자를 위해서, 낮은 복제수의 플라스미드는 약 300 이하, 약 100 이하, 약 50 이하, 약 20 이하, 약 10 이하 또는 약 5 이하의 복제수를 달성하는 플라스미드이다.

본 발명의 한 면은, 박테리아 세포로부터 관심상 생물학적 활성 분자 하나 이상의 고순도 샘플을 대규모로 제조하는 방법을 포함한다. 대규모 제조 방법은 다음의 단계들을 포함한다:

a) 상기 복수 세포의 세포 현탁액을 용해 용액과 접촉시켜 용해물 용액을 제조하는 단계;

b) 중화 용액으로 상기 용해물 용액을 중화하여, 중화된 용해물 용액과 잔여물을 포함하는 분산액을 제조하는 단계;

c) 하나 이상의 필터로 분산액을 여과하는 단계;

d) 상기 중화된 용해물 용액으로 이온 교환 분리를 실시하여 이온 교환 용출물을 제조하는 단계; 및

e) 상기 이온 교환 용출물에 대해 소수성 상호작용 분리를 실시하여 소수성 상호작용 용액을 제조하는 단계.

한 구현에서, 대규모 방법은 고전단력의 인라인 (in-line) 믹서 내에서 용해 용액과 상기 세포 현탁액을 혼합함을 포함하는, 용해물 용액을 생성하는 단계를 포함한다.

일부 구현에서, 생성 단계는 약 1분 내지 약 20분, 바람직하게는 약 4분 내지 약 8분, 더 바람직하게는 약 5 분 간의 기간 동안 믹서 내에서 세포 현탁액을 용해 용액과 접촉시킴을 포함한다. 일부 구현에서, 중화 단계는 버블 믹서 내에서 용해물 용액과 중화 용액을 혼합함을 포함한다. 일부 구현에서, 소수성 상호작용 분리단계의 실시는 소수성 상호작용 컬럼 또는 소수성 상호작용 막을 사용하여 소수성 상호작용 분리를 실시하여, 소수성 상호작용 용액을 형성함을 포함한다. 소수성 상호작용 분리단계는 소수성 상호작용 막 또는 컬럼에 결합시켜 관심상 생물학적 활성 분자를 분리하는 것일 수 있으며, 이에 따라 불순물이 흘러 통과하거나 세척제거되어질 수 있다. 일부 구현에서, 관심상 생물학적 활성 분자가 소수성 상호작용 컬럼을 통과하고 불순물이 결합할 수 있다. 일부 구현에서, 관심상 생물학적 활성 분자가 소수성 상호작용 막 (또는 HIC 막)을 통과한다 (본원에서는 "방법 I"로 불림). 일부 구현에서는, 관심상 생물학적 활성 분자가 부틸 컬럼과 같은 HIC 컬럼에 결합한다 (본원에서는 "방법 II"로 불림). 일부 구현에서는, HIC 막 및 부틸 컬럼과 같은 HIC 컬럼의 조합을 사용하여 (본원에서는 "방법 III"으로 불림) 그램 이상인 양의 DNA 플라스미드와 같이, 고순도로 관심상 생물학적 활성 분자를 대규모의 양으로 제조하는데 사용할 수 있다. 일부 구현에서, 소수성 상호작용 분리는 부틸 소수성 상호작용 크로마토그래피 용액 용출물인 소수성 상호작용 용액을 제조하기 위해 적어도 부틸 소수성 상호작용 크로마토그래피를 사용하는 분리를 포함한다.

일부 구현에서, 기재된 대규모 방법은 상기 소수성 상호작용 용액의 한외여과에 의해 생물학적 활성 분자 하나 이상의 용액을 제조하는 단계를 추가로 포함 가능하다. 또한, 생물학적 활성 분자의 상기 용액을 멸균 여과하는 단계에 의해 생물학적 활성 분자의 멸균 용액을 제조하는 단계를 실시할 수 있다.

일부 구현에서, 대규모 방법은 잔여물로부터 중화된 용해물 용액을 분리하기 위하여 일정 시간동안 분산액을 홀딩하는 홀딩 단계, 및 이어서 하나 이상의 필터를 통해 중화된 용해물 용액을 여과하는 것을 포함한다.

일부 구현에서, 이온 교환 분리 단계를 실시하는 것은 음이온 교환 막을 사용하여 실시한다. 바람직하게, 이온 교환 분리 단계는 Mustang^® Q 카트리지를 바람직하게 사용하는, 이온 교환 컬럼의 사용을 포함한다.

일부 구현에서, 대규모 방법은 연속 방법을 포함하거나, 박테리아 세포로부터 고순도 생물학적 활성 분자를 제조하는 연속 대규모 방법으로 일컫는다. 본 방법은, 실질적으로 연속인 대규모 방법의 한 단계로부터 후속 단계의 전이(또는 이행)를 포함하며 용기내의 용해물을 수합하고 제 1 필터를 통해 분산액을 통과시킴으로써 분산액내의 잔여물로부터 중화된 용해물 용액을 분리하여 초기 미정제 중화된 용해물 용액을 제공하는 것을 포함한다. 일부 구현에서, 본 방법은 제 2 필터를 통해 제 1 미정제 중화된 용해물 용액을 통과시켜 후속의 미정제 중화된 용해물 용액을 제조하는 것을 포함한다.

한 구현에서, 본 발명은 박테리아 세포로부터 관심상 생물학적 활성 분자의 고순도 샘플을 제조하는 대규모 방법을 포함하며, 이는 다음 단계들을 포함한다: 세포 분산액 내의 박테리아 세포를 용해 용액과 접촉시켜 용해물 용액을 제조하는 단계; 버블 컬럼 믹서로 용해물 용액 내로 중화 용액을 혼합함으로써 상기 용해물 용액을 중화하여, 중화된 혼합물을 제조하는 단계; 제 1 필터 및 제 2 필터를 통해 중화된 용액을 여과하여 여과된 용액을 형성하는 단계; 여과된 용액을 이온 교환 컬럼으로 통과시켜 이온 교환 용액을 형성하는 단계; 소수성 상호작용 컬럼 또는 소수성 상호작용 막으로 이온 교환 용액을 통과시켜 소수성 상호작용 용액을 형성하는 단계; 및 소수성 상호작용 용액을 한외여과하여 관심상 생물학적 활성 분자의 고순도 샘플을 형성하는 단계; 이때 접촉 단계부터 여과된 용액을 통과시키는 단계까지의 대규모 방법에서의 한 단계로부터 후속 단계로의 각 전이는 실질적으로 연속적으로 일어난다.

본 발명의 다른 면에서는, 본원에 개시된 대규모 방법으로 제조된 관심상 생물학적 활성 분자를 포함하는 조성물이 제공되며, 이때 관심상 생물학적 활성 분자는 DNA 플라스미드이다. 일부 구현에서, 조성물은 용액중 약 10 mg 이상의 양으로 DNA 플라스미드를 포함하며, 상기 플라스미드는 약 90％, 91％, 92％, 93％, 94％, 95％, 96％, 97％, 98％, 또는 99％ 초과의 고순도로 존재하는 플라스미드인 것이다. 청구범위 제 18 항의 조성물은 상기 플라스미드 농도가 약 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 또는 13 mg/mL이다. 일부 조성물은 약 50％, 55％, 60％, 65％, 70％, 75％, 80％, 81％, 82％, 83％, 84％, 85％, 86％, 87％, 88％, 89％, 90％, 91％, 92％, 93％, 94％ 또는 95％ 초과 수준의 수퍼코일된 플라스미드, 바람직하게는 80％ 초과의 수퍼코일된 플라스미드인 플라스미드를 포함한다. 일부 조성물은 플라스미드 1 mg 당 약 10 EU 이하의 내독소를 함유하며, 일부 구현에서 조성물은 플라스미드 1 mg 당 약 1 EU 이하의 내독소를 함유한다. 일부 구현에서는 플라스미드 1 mg 당 약 0.1 EU 이하의 내독소를 함유한다. 일부 구현에서, 조성물은 약 1.0％ 이하의 RNA, 또는 약 0.4％ 이하의 RNA를 함유하는 용액을 포함한다. 일부 바람직한 구현에서, 조성물은 약 1.0％ 이하의 단백질, 바람직하게는 약 0.20％ 이하의 단백질을 함유하는 용액을 포함한다. 일부 구현에서, 조성물은 약 1％ 이하의 게놈 DNA, 바람직하게는 약 0.01％ 이하의 게놈 DNA를 함유하는 용액을 포함한다.

본원에 제공된 많은 방법들을 포함하는 본 발명 구현의 한 예는 하기의 단계들을 포함한다: 제 1 단계, 관심상 세포를 생성하고 수확함; 제 2 단계, 세포를 용해하여 관심상 생물학적 활성 분자를 포함하는 내용물을 용액 중으로 방출시킴; 제 3 단계, 고체 세포 잔여물 및 침전 세포 성분을, 관심상 생물학적 활성 분자를 하나 이상 포함하는 유체로부터 분리함; 제 4 단계, 관심상 생물학적 활성 분자를 포함하는 용액을 이온 교환 크로마토그래피에 적용함; 제 5 단계, 이온 교환 크로마토그래피에서 수득한 부분 정제된 물질을 소수성 상호작용 크로마토그래피에 적용함; 제 6 단계, 소수성 상호작용 크로마토그래피로부터 수득한 물질을 한외여과 및 정용여과(diafiltration)에 적용하여 관심상 생물학적 활성 분자의 하나 이상의 타입을 농축하고, 용액으로부터 과량의 염을 제거함; 제 7 단계, 농축 및 탈염된 생성물을 임의로는 멸균 여과에 적용하여, 일례로 근육내 전달, 정맥내 전달, 비강내 전달, 심장내 전달, 에어로졸 전달, 경피 전달, 근육으로의 생체내 (in vivo) 전기천공 촉진된 전달, 피하 또는 내피 조직으로의 생체내 전기천공 촉진된 전달, 및 기타 약학 적용의 공지 방법을 포함하는 약학적 이용에 적합하도록 한다.

본 발명의 일부 구현은 본원에 개시된 방법 단계들을 포함하며, 이는 과정 홀딩 단계에 의해 제한되지 않는 제조의 규모를 도모하는 연속 방식의 단계들의 조합 조작을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 그러한 방법들은, 일례로 플라스미드 약 1 그램 이상의 제조와 같은 대규모로 약학 등급의 생물분자 제조를 가능하게 한다. 본 발명의 일부 구현은, 일례로 효소의 포함, 열 변성, 일례로 원심분리기와 같은 기계적 분리 (그러한 분리를 실시하는 기계), 또는 일례로 이소프로판올과 같은 유기 또는 휘발성 용매를 포함하는 약학 제품 또는 대규모 제조에 해가 될 수 있는 것으로 입증된 임의의 물질 또는 방법의 사용을 배척한다.

관심상 세포는 발효 및 수합과 같은 통상의 수단에 의해 생성 및 수확 가능하다. 관심상 세포를 충분량으로 제조하는 것은 당업자의 충분한 능력내이다. 일례로, 세포는 높은 복제수의 관심상 플라스미드를 함유한 대장균일 수 있고, 플라스미드 함유 세포는 배치 (batch) 또는 공급 배치식 기법을 이용하여 고밀도로 발효 가능하다. 그러한 플라스미드 함유 대장균 세포를 제조하고, 배치 또는 공급 배치식 발효를 실행하는 방법은 당업자에게 공지이다. 세포는 원심분리 또는 여과와 같은 통상의 수단으로 수확하여 세포 덩어리를 형성할 수 있다. 그러한 수확 방법은 당업자에게 공지이다. 또한, 당업자는 수확한 세포 또는 세포 덩어리를 바로 가공하거나 또는 후일 가공하기 위해 동결 또는 냉장 상태로 보관할 수 있음을 인지 가능하다.

수확한 세포는 관심상 생물학적 활성 분자를 포함하는 그 내용물을 방출하기 위해 용해 용액을 이용하여 용해물 용액으로 용해시킬 수 있다.

일반적으로, 세포 용해 이전에, 세포 덩어리를 관심상 생물학적 활성 분자를 함유하는 세포 현탁액 제조를 위해 사용 가능하다. 세포는 임의의 적절한 용액 내에 현탁 가능하다. 현탁 용액 내에 세포를 함유한 현탁액은 탱크 또는 기타 보관 용기에 보관할 수 있다. 제 2 용기를 추가량의 세포를 재현탁하기 위해 사용하고, 제 1 용기는 용해 과정에 사용하기 위해 2개의 용기를 사용 가능하다. 현탁 용액은, 일부 구현에서는 온화한 농도의 완충액, 온화한 농도의 킬레이트제 또는 이들 모두를 포함할 수 있다. 일부 구현에서, 현탁 용액은 약 25 mM의 트리스-염산염 ("Tris-HCl"), 및 약 10 mM 의 2소듐 에데테이트 ("Na₂EDTA")를 pH 약 8로 함유할 수 있다. 일부 구현에서 세포 현탁액은 알려진 중량의 현탁액 완충액으로, 알려진 중량의 세포 덩어리를 현탁하여 제조 가능하다. 일례로, 세포 덩어리 1부를 약 4-10부의 완충액에 재현탁할 수 있고, 일부 구현에서는 약 6-8부의 완충액에 재현탁할 수 있다. 일부 구현에서, 얻어진 세포 현탁액의 광학 밀도는 약 50-80 OD₆₀₀단위일 수 있다. 일부 구현에서 이는 약 60-70 OD₆₀₀ 단위일 수 있다.

용해 용액은 바람직하게는 알칼리, 산, 효소, 유기 용매, 세제 또는 이들의 혼합물과 같은 하나 이상의 용해제를 포함한다. 그러나, 동물 유래의 효소 또는 유기 용매는 약학 제품의 제조에 이들이 유해하기 때문에 그 사용이 바람직하지 않다. 일부 구현에서, 용해 용액은 알칼리, 세제 또는 그 혼합물을 포함한다. 적절하면서도 비제한적인 알칼리는 수산화나트륨 또는 수산화칼륨을 포함한다. 세제는 비이온성, 양이온성 또는 음이온성일 수 있다. 적절하면서도 비제한적인 세제는 소듐 도데실 설페이트 ("SDS"), Triton, Tween, 또는 플루론 타입 시약 (에틸렌 옥시드 및 프로필렌옥시드 기재 블록 공중합체)이다. 적절한 알칼리 또는 세제의 선택은 당업자의 기술범위 이내이다. 일부 구현에서, 용해 용액은 수산화나트륨 ("NaOH") 및 SDS를 함유할 수 있다. 일부 구현에서 NaOH의 농도는 약 0.1 내지 약 0.3 N 이고, 일부 구현에서는 약 0.2 N 이다. 일부 구현에서 SDS의 농도는 약 0.1％ 내지 약 5％ 이고, 일부 구현에서는 약 1％ 이다. 일부 구현에서 용해 용액은 탱크 또는 기타 보관 용기에 보관 가능하다.

세포 현탁액 및 용해 용액은 조합되어 세포를 용해하여 용해물 용액을 생성할 수 있다. 일부 구현에서, 이들은 조합 및 혼합되어 높은 수준의 세포 용해를 촉진하고 생물학적 물질의 배출에 충분한 시간동안 혼합물로 유지되며, 따라서 용해물 용액을 형성한다.

일부 구현에서, 세포 현탁액 및 용해 용액은 분리된 탱크 내에 보관되고 하나 이상의 펌프를 사용하여 탱크로부터 꺼내어진다. 세포 현탁액 및 용해 용액은 "Y" 커넥터를 사용하여 상호간 접촉시킬 수 있다. 일부 구현에서는 2중 헤드 펌프를 이용하여 동일한 유속으로 동일한 부피의 세포 현탁액 및 용해 용액을 펌핑할 수 있다. 그러나 당업자는, 필요시에는 개별 펌프를 이용하여 상이한 속도로 상이한 부피의 용해 용액 및 세포 현탁액을 펌핑할 수 있음을 인지할 것이다. 일부 구현에서, 세포 현탁액 및 용해 용액을 2중 헤드 펌프 frp를 통해 약 0.3 L/분 내지 약 2 L/분으로 펌핑하고, 접촉시킨 유체는 약 0.6 L/분 내지 약 4 L/분의 속도로 "Y" 커넥터를 빠져나가게 할 수 있다. 당업자는 이들 유속을 용이하게 증가 또는 감소시킬 수 있고 튜브 크기를 증가 또는 감소시켜 임의의 통과 요건을 만족시킬 수 있음을 인지할 것이다. "Y" 커넥터를 빠져 나온 이후, 접촉시킨 세포 현탁액 및 용해 용액을 고 전단력의 인라인 믹서로 통과시킬 수 있다. 믹서는 흐름(유동) 방식(flow-through mode) (배치 방식과 반대)으로 신속한 고전단력 혼합을 제공하는 임의의 장치일 수 있다. 일부 구현에서, 믹서는 회전자/고정자 믹서 또는 유화기이다. 당업자는 각종 고전단력의 인라인 믹서가 시판되고 있음을 인지할 것이다. 그러한 임의의 믹서의 사용은 본 발명 범위 이내이다. 일부 구현에서, 믹서는 표준 Emulsor 스크린 (Silverson Machines, Inc. East Longmeadow, MA) 및 인라인 어셈블리가 구비된 Silverson L4R 회전자/고정자 믹서이다. 회전자는 약 500 rpm 내지 약 900 rpm, 500-600 rpm, 약 500 rpm 내지 약 700 rpm, 약 500 rpm 내지 약 800 rpm, 약 600 rpm 내지 약 700 rpm, 약 600 rpm 내지 약 800 rpm, 약 600 rpm 내지 약 900 rpm, 약 700 rpm 내지 약 800 rpm 또는 약 700 rpm 내지 약 900 rpm의 속도로 작동 가능하다. 이러한 믹서는 약 0.3 L/분 내지 약 2 L/분으로 세포 현탁액을 처리하는데 적절하다. 그러나 당업자는 실질적으로 더 큰 부피의 세포 현탁액을 처리하기 위해서는 보다 큰 규모의 믹서로 대체될 것임을 인지할 수 있다. 그러한 대체는 통상의 실험에 의해 당업자가 용이하게 달성 가능하다. 고전단력의 인라인 믹서의 사용은 세포 현탁액 및 용해 용액의 완전하면서도 신속한 혼합을 촉진하여, 세포와 용해 시약 (들) 간의 밀접한 접촉을 도모하여 효율적인 용해를 달성하도록 한다. 또한, 믹서는 상이한 유체 유속을 쉽게 수용 가능하고 상이한 유속에 대한 조절 가능한 혼합 속도의 유연성을 제공한다. 고전단력의 인라인 믹서를 빠져 나오는 물질은 이후 홀딩 코일을 통과할 수 있다. 이 코일은 소정 시간동안 유체가 코일을 통과하도록 하는 충분한 길이의 튜브를 단순히 포함할 수 있다. 본 코일의 기능은 실질적으로 완전한 용해를 보장하기 위해 세포와 용해 시약 (들) 간의 충분한 접촉시간을 제공하는 것이다. 동시에, 코일은 부정적 결과를 가져올 만큼의 길지 않은 접촉시간을 보장한다. 일부 구현에서, 세포가 플라스미드 함유 세포이고 용해 용액이 알칼리를 포함하는 구현과 같은 경우, 단백질, 게놈 DNA, 및 기타 세포 성분의 실질적으로 완전한 변성 뿐 아니라, 실질적으로 완전한 세포 용해를 달성할 수 있기에 충분한 시간동안 알칼리에 노출을 지속하는 것이 바람직하다. 그러나, 영구적으로 변성된 상당량의 플라스미드를 초래할 만큼 알칼리 노출 시간을 연장하지 않는 것이 또한 바람직하다. 코일은, 하나의 완전한 튜브 또는 유체 유속의 유연성을 가능하게 하도록 2-10개 튜브로 분절화될 수 있다. 홀딩 코일은 이러한 접촉시간이 조절될 수 있도록 한다. 일부 구현에서, 이러한 접촉 시간은 약 2분 내지 약 10 분이다. 일부 구현에서, 이러한 접촉 시간은 약 2 분 내지 약 9 분, 약 2 분 내지 약 8 분, 약 2 분 내지 약 7 분, 약 2 분 내지 약 6 분, 약 3 분 내지 약 10 분, 약 3 분 내지 약 9 분, 약 3 분 내지 약 8 분, 약 3 분 내지 약 7 분, 약 3 분 내지 약 6 분, 약 4 분 내지 약 10 분, 약 4 분 내지 약 9 분, 약 4 분 내지 약 8 분, 약 4 분 내지 약 7 분, 약 4 분 내지 약 6 분, 약 5 분 내지 약 10 분, 약 5 분 내지 약 9 분, 약 5 분 내지 약 8 분, 약 5 분 내지 약 7 분, 또는 약 5 분 내지 약 6 분이다. 바람직하게, 접촉시간은 약 4 분 내지 약 8 분 또는 약 4 분 내지 약 6 분이다. 일부 구현에서, 접촉시간은 약 5 분이다. 일부 구현에서 홀딩 코일의 길이 및 직경은 원하는 속도로 원하는 용해된 세포가 흘러 통과할 때 원하는 노출 시간이 달성되도록 하는 것이다. 일부 구현에서, 홀딩 코일은 약 10 피트 길이 내지 약 150 피트 길이, 약 25 피트 길이 내지 약 100 피트 길이, 또는 약 40 피트 길이 내지 약 60 피트 길이이다. 일부 구현에서, 홀딩 코일은 약 50 피트 길이이고, 일부 구현에서 홀딩 코일은 약 100 피트 길이이다. 홀딩 코일의 내부 직경은 약 0.5 인치 내지 약 2 인치이고, 일부 구현에서는 0.625 인치일 수 있다. 또한 일부 구현에서, 용해된 세포는 고전단력 인라인 믹서를 빠져 나와 약 100 mL/분 내지 약 10 L/분, 약 200 mL/분 내지 약 8 L/분, 약 300 mL/분 내지 약 6 L/분, 약 400 mL/분 내지 약 4 L/분, 약 400 mL/분 내지 약 2 L/분, 또는 약 600 mL/분 내지 약 1.2 L/분의 속도로 홀딩 코일을 통과해 나간다. 바람직하게, 홀딩 코일 통과 속도는 약 0.6 L/분 내지 약 10 L/분이다. 일부 바람직한 구현에서 홀딩 코일 통과 속도는 약 600 mL/분이고, 일부 구현에서는 약 1200 mL/분이다. 생물학적 활성 분자 생산을 대규모로 함에 따라 더 큰 유속으로 수용 또는 조절하기 위해 당업자에 의해 코일 길이 및 직경 조절을 실시할 수 있다. 용해물 용액은 홀딩 코일로부터 수합된다.

용해물 용액은 중화 용액 (중화 침전 용액이라고도 또한 불림)과 조합함에 의해 중화되어, 중화된 용해물 용액 및 잔여물을 포함하는 분산액을 제조한다. 얻어진 분산액은 잔여물로부터 중화된 용해물 용액의 분리를 촉진하기 위해 이후 보관 가능하다.

일부 구현에서, 용해된 세포를 포함하는 용해물 용액은 중화 챔버 내에서 중화 용액과 혼합함에 의해 중화 가능하다. 이러한 용해물 용액의 중화는 중화 챔버 내에서의 혼합에 의해 촉진 가능하다. 일부 구현에서, 이러한 중화 이후 버블 컬럼 믹서 내에서 버블 혼합이 후속될 수 있다. 바람직하게, 중화는 버블 컬럼 믹서 내에서 버블 혼합이 수반되어 함께 진행된다. 일부 구현에서, 홀딩 코일을 빠져 나온 용해물 용액은 펌프가 다른 탱크로부터 중화/침전 용액을 버블 컬럼 믹서 내로 전달할 수 있음과 동시에, 버블 컬럼 믹서로 진입할 수 있다. 일부 실시예에서, 또한 동시에, 다른 탱크로부터의 압축 공기가 버블 컬럼 믹서의 기저부에 살포될 수 있다. 일부 구현에서, 용해물 용액은 한 편으로부터 컬럼 기저부로 진입 가능하고, 중화/침전 용액은 반대편으로부터 기저부로 진입 가능하다. 압축된 기체는 컬럼 단면을 거쳐 실질적으로 균일하게 기체 버블을 전달하기 위해 디자인된 소결된 살포기를 통해 살포 가능하다. 용해된 세포를 포함하는 용해물 용액 및 중화 용액은 컬럼 수직 상승방향으로 이동하여 거의 정상부에 위치한 배출구를 통해 배출된다. 액체의 수직 컬럼을 통한 기체 버블의 통과로 용해물 용액이 중화/침전 용액과 혼합되어진다. 상승하는 기체 버블에 의한 혼합은 완전하면서도 부드럽고 낮은 전단력을 가진다. 용해물 용액의 용해된 세포와 중화/침전 용액이 혼합됨에 따라, 용액으로부터 세포 성분이 침전한다. 과량의 기체를 방출하기 위해 버블 컬럼 믹서의 상부에 스노클을 제공할 수 있다.

일부 구현에서, 용해물 용액은 알칼리, 세제 또는 그 혼합물로 용해된 플라스미드 함유 세포를 포함하고, 중화/침전 용액은 알칼리를 중화시키고, 단백질, 막, 내독소 및 게놈 DNA와 같은 숙주 세포 성분을 침전시킨다. 일부 구현에서, 알칼리는 NaOH일 수 있고, 세제는 SDS일 수 있고, 중화/침전 용액은 칼륨 아세테이트, 암모늄 아세테이트 또는 이들의 혼합물을 포함할 수 있다. 일부 구현에서, 중화/침전 용액은 약 1 M 칼륨 아세테이트 및 약 3 M 내지 약 7 M의 암모늄 아세테이트를 포함하는 완충되지 않은 용액을 포함할 수 있다. 그러한 중화/침전 용액을 사용함에 따라 약 7 내지 약 8 pH의 현탁액이 생성되며, 이는 산성 pH에 비해 바람직한데 그 이유는 산성 조건은 DNA의 탈퓨린화를 초래할 수 있기 때문이다. 일부 구현에서, 중화/침전 용액은 약 2℃ 내지 약 8℃의 냉각된 형태로 제공 가능하다.

버블 컬럼 믹서는 낮은 전단력 방식의 혼합을 제공하고 이에 따라 중화된 용해물 용액으로의 게놈 DNA 및 내독소의 과다한 방출을 피할 수 있도록 한다. 당업자는, 버블 컬럼 믹서를 통하는 기체 흐름의 적절한 속도를 결정 가능하다. 기체 유속은 1 분 당 약 2 표준 리터 내지 1 분 당 약 20 표준 리터 ("slpm"; standard liters per minute)로 사용 가능하다. 비제한적으로, 공기, 질소, 아르곤, 이산화탄소를 포함하는 임의의 적절한 기체를 사용 가능하다. 기체는 여과된 압축공기일 수 있다.

용해물 용액 및 중화용액의 조합은 중화된 용해물 용액 및 잔여물을 포함하는 분산액의 생성을 도모한다. 중화된 용해물 용액은 탱크 또는 기타 보관 용기 내로 수합 가능하다. 일부 구현에서, 용기는 5-10℃로 냉각된다. 용기 내에 중화된 용해물을 홀딩하는 시간은 강제된 것이 아니고, 1 시간 미만, 약 1 시간 내지 약 12 시간, 약 12 시간 내지 약 15 시간, 또는 15 시간 초과로 가변이다. 일부 구현에서 사용되는 시간은 약 12 시간이고, 일부 실시예에서는 약 15 시간의 시간이 소요되며 다른 실시예에서는 시간은 "밤새도록" (약 15 시간 초과로 정의됨)이다. 한 구현에서, 충분한 홀딩 기간을 적용함으로써 중화된 용해물 용액으로부터 세포 잔여물의 실질적으로 완전한 분리를 도모하고, 그 결과 후속의 청정화 공정에 유리한 제한된 고체 입자의 미정제 용해물을 수득하였다. 그러나, 공정의 규모는 미정제 용해물 홀딩 탱크로 제한되며, 공정 시간은 본 홀딩 기간으로 인해 연장된다.

저수율의 플라스미드 생성물의 대규모 정제를 달성하기 위해, 중화된 용해물의 홀딩 시간은 1 시간 미만으로 감축 가능하다. 일부 구현에서, 중화된 용해물 용액은, 그 생성과 동시에 처리되어, 용기에서의 홀딩 시간은 무시할 만한 수준 될 수 있다. 일부 구현에서, 용해물 용액은 용기 내로 용해물을 수합한 약 5 분 내지 약 60 분 기간 이후 다음의 공정에 의해 동시에 처리된다. 용해물 홀딩 시간의 감소 또는 제거에 따라, 용해물이 생성되자마자 즉각적으로 처리되므로 용기에 의한 공정 용량 제한이 또한 사라진다.

중화된 용해물 용액은, 일례로 여과, 카트리지 여과, 배치 원심분리, 연속 원심분리와 같은 고체/액체 분리의 임의의 방법으로 청정화될 수 있다. 용액 중 입자의 완전한 분리는 다음의 정제 과정 동안 막 또는 컬럼 막힘을 피하기 위해 바람직하다. 동시에, 게놈 DNA를 절단하고, 게놈 DNA, 절단된 게놈 DNA, 내독소의 배출 및 기타 오염물이 플라스미드 함유 용액으로 배출되는 것을 야기하는 과도한 전단력에 용해물이 노출되지 않도록 할 것이다. 배치 여과는 작은 부피의 용해물 처리에는 사용 가능하나, 대규모에는 비현실적이다. 연속 원심분리 또한 부적절한데, 이는 침전물이 고전단력에 노출되어 높은 수준의 오염물을 용액 중으로 배출할 수 있기 때문이다. 일부 구현에서, 상이한 등급의 필터 매질을 사용하는 일련의 여과들을 사용 가능하다. 1차 여과는 마이크로 크기의 큰 세포 유모성 물질 대부분의 제거에 사용 가능하며, 이어지는 2차 여과는 잔류하는 미세 입자를 걸러낸다. 선택적인 3차 여과는 이어지는 과정에서 엄격한 청정도가 요구되고 2차 여과가 불충분한 경우 실시 가능하다.

일부 구현에서, 높은 더러움 보유 용량 및 용액에 대한 최소한의 교란성 덕분에 백 (bag) 및 카트리지 필터를 사용 가능하다. 필터 백 또는 카트리지는 임의의 크기, 형태, 공극 크기 등급, 배열 및 매질 타입일 수 있다. 여과 매질은 식품의약청 (FDA) 요건을 준수하거나 약품 등급의 물질로 만들어진 것이 바람직하다. 여과 물질은 또한, 전하가 없거나 생성물에 대해 제한적인 결합만을 가지는 것이 바람직하다. 여과 물질의 입자 크기 한계는 약 0.1 ㎛ 내지 약 수백 마이크론으로 가변이지만, 이는 목적 생성물의 크기보다 커서 생성물이 여과 매질에 의해 유보되지 않도록 하여야 한다. 백 필터 및 카트리지 필터 매질은 단일층, 다중층, 주름지거나 또는 다중 주름진 것일 수 있다.

일부 구현에서, 유사 공극 크기 등급을 가진 2 이상의 필터를 평행하게 사용하여 대규모의 공정을 수용할 수 있다. 세포벽 및 막 성분, 침전물, 게놈 DNA, 단백질, 지방, 지방다당류 및 기타 오염물 등을 포함하는 용해물 용액 중 고체 입자의 대부분은 여과에 의해 제거될 것이다. 그러나, 1차 여과에 의해 목적 청정도의 용액을 전달하기 불충분한 경우, 감소된 공극 크기 또는 보다 높은 유지 비율을 가진 2차 여과를 연이어 실시할 수 있다. 일부 구현에서, 2 이상의 2차 필터를 평행하게 사용하여 대규모의 공정을 수용할 수 있다. 대규모의 공정에서 다수의 필터를 사용할 필요가 있을 수 있고, 당업자는 이들의 입자 크기 제한뿐 아니라, 사용하는 필터의 개수와 같은 세부 사항들을 용이하게 변화시킬 수 있음을 인지할 것이다.

일부 구현에서, 분산액은 잔여물이 침전 또는 부유할 수 있도록 안정화 탱크내에 수합되어 유지될 수 있다. 따라서, 일부 구현에서 분산액은 버블 컬럼 믹서로부터의 침전된 숙주 세포 성분 및 미정제 세포 용해물의 슬러리로서 수합 가능하며, 안정화 탱크 내에 유지됨으로써 잔여물이 침전 또는 부유 가능하도록 할 수 있다. 안정화 탱크 내에 유지된 것과 같이, 잔여물을 구성하는 침전된 숙주 세포 성분의 중화된 용해물 용액으로부터의 실질적으로 완전한 분리를 달성하기에 충분한 시간동안 분산액을 유지할 수 있다. 침전된 성분은 버블 컬럼 믹서에 의해 도입된 트래핑된 기체 버블의 도움으로 분산액 표면으로 떠오를 수 있다. 일부 구현에서, 분산액을 안정화 탱크 내에서 약 6 내지 약 24 시간,일부 구현에서는 약 12 내지 약 18 시간 동안 유지할 수 있다. 일부 구현에서, 분산액은 홀딩 기간 동안 약 15℃ 미만으로, 일부 구현에서는 약 2℃ 내지 약 8℃로 냉각하여, RNA 또는 기타 불순물의 침전에 공조할 수 있다. 일부 구현에서, 분산액은 매우 낮은 rpm, 바람직하게는 15 rpm 내지 약 25 rpm에서 작동하는 임펠러 믹서에 의해 홀딩 기간 동안 부드럽게 혼합 가능하다.

일부 구현에서, 일례로 안정화 탱크와 같은 분산액을 홀딩하고 있는 용기에 진공을 가할 수 있다. 이에 따라 액체 표면으로 침전된 성분을 끌어당기는 것이 촉진된다. 또한, 이는 부유하는 유모성 침전물/잔여물을 압축하여, 그의 이어지는 제거를 도모하고, 또한 중화된 용해물 용액의 상당한 백분율이 다음의 단계들 동안 회수될 수 있도록 한다. 또한, 이는 다음의 크로마토그래피 단계를 방해할 수 있는 용액 중에 트래핑된 공기를 제거한다. 일부 구현에서, 적용되는 진공은 Hg 약 15 인치 내지 Hg 약 30 인치 (in·Hg)이고, 일부 구현에서는 Hg 약 20 인치 내지 Hg 약 30 인치이며, 일부 구현에서는 Hg 약 25 인치 내지 Hg 약 30 인치일 수 있다. 일부 구현에서, 진공은 이러한 홀딩 기간 전체에 걸쳐 유지될 수 있다. 진공은, 진공 펌프 또는 기타 진공 또는 사용 가능한 음압 장치를 사용하여 적용 가능하다. 일부 구현에서, 고체/액체 분리 시작 이전에, 탱크에 적용된 모든 진공을 조심스럽게 배출시킨다. 미정제 세포 용해물, 즉 중화된 용해물 용액을 이후 펌프를 이용하여 탱크로부터 수합하고, 심층 필터 및 최종 필터로 통과시키고, 이후 홀딩 탱크 내에 수합한다. 일부 구현에서, 안정화 탱크에는 조작하는 사람이 액체 수준의 위치 및 압축된 침전 숙주 세포 성분을 관찰할 수 있도록 하는 관측 유리가 구비된다. 탱크로부터의 물질 펌핑을 시각적으로 모니터링하며, 침전된 숙주 세포 성분이 라인에 진입하기 이전에 정지시킨다. 이에 따라 이어지는 필터들의 막힘이 방지된다. 백 여과 (또는 카트리지 여과) 또는 원심 분리는 필요하지 않다. 또한, 잔여물 교란은 게놈 DNA 또는 내독소와 같은 성분들의 중화된 용해물 용액으로의 방출을 따라서 최소화한다. 중화된 용해물 용액을 안정화 탱크로부터 펌핑한 이후, 이는 미세 입자를 제거하기 위해 하나 이상의 필터로 통과시킬 수 있다. 일부 구현에서, 약 1 내지 약 3개의 필터를 시리즈로 사용 가능하며, 제 1 필터는 큰 입자를 제거하고, 후속의 필터들은 차례로 작은 입자들을 제거한다. 일부 구현에서, 2개의 필터들을 시리즈로 사용 가능하다. 일부 구현에서, 제 1 필터는 약 5 ㎛ 내지 약 15 ㎛, 바람직하게는 약 7.5 ㎛ 내지 약 12 ㎛, 또는 더 바람직하게는 약 9 ㎛ 내지 약 11 ㎛의 입자 크기 제한을 가지는 예비 여과 심층 필터이다. 일부 구현에서, 예비 여과 심층 필터는 약 10 ㎛의 입자 크기 제한을 가진다. 제 2 필터는 바람직하게 약 0.01 ㎛ 내지 약 0.25 ㎛, 또는 바람직하게 약 0.05 ㎛ 내지 약 0.15 ㎛의 컷-오프 (cut-off)를 가지는 막 필터이다. 일부 구현에서 막 필터는 약 0.1 ㎛의 컷-오프를 가진다. 그러나, 당업자는 입자 크기 제한 뿐 아니라, 사용되는 필터들의 개수와 같은 세부 사항을 용이하게 변경할 수 있음을 인지할 수 있다.

상이한 공급자들로부터 다양한 선택의 필터들이 시판되고 있다. 한 특정 타입은 720 시리즈 주름진 카트리지 필터 (CPI 필터, Houston, TX)로서, 이는 더러움 홀딩 능력이 크고 처리 용량이 뛰어난 것으로 나타나 있다. 300 시리즈 및 500 시리즈 (Knight Corporation, Houston, TX)와 같은 고효율 다중층 필터 백은, 미세 입자를 매우 잘 보유하는 것으로 나타났다. 매질 12 층까지 점진적인 밀도 디자인을 가지는 PROGAF^TM 필터 백 (Eaton Filtration, Cleveland, OH)은 각종 크기의 입자 제거에 높은 효율을 나타낼 수 있다. 일부 구현에서, 다중층 또는 주름진 카트리지 여과가 이어지는 주름진 카트리지 여과의 조합은 중화된 용해물 용액에서의 입자의 청정화를 위한 최적의 수행을 도모할 수 있다.

카트리지 필터 또는 백 필터는 조작의 용이성 및 높은 처리 용량을 위해 필터 하우징 또는 필터 용기 내에 어셈블링되는 것이 바람직하다. 용기 재질은 타입 304 또는 316 스테인리스 스틸 또는 탄소 스틸일 수 있고, 초 순도 또는 부식성 적용을 위해서는 폴리비닐 클로라이드 (PVC), 염소화 폴리비닐 클로라이드 (CPVC), 폴리에스테르 플라스틱 (PPL) 또는 폴리비닐리덴 플루오라이드 (PVDF) 구조를 선택 가능한 전체가 플라스틱인 하우징이 유리할 수 있다. 여과 용기는 주문에 따라 디자인되거나 또는 다수의 제조자로부터 바로 입수 가능하다. 일례로, Eaton Filtration (Cleveland, OH)는 TOPLINE, SIDELINE, DUOLINE, MODULINE, POLYLINE, FLOWLINE, ECOLINE, MAXILINE 시리즈와 같은 임의의 필요한 적용을 만족하도록 디자인된 다양한 선택의 하우징/용기를 제공한다. 당업자는 공정상 요건을 수용하기 위한 필터 하우징의 사양 및 구성을 검증할 수 있다.

임의로, 제 2 필터 다음에 추가의 심층 필터 또는 막 필터를 설치할 수 있다. 필터는 중화된 용해물 용액 중의 미세 입자의 추가의 제거를 위해 약 0.1 ㎛ 내지 약 0.2 ㎛의 컷-오프를 가지는 것이 바람직하다. Vangard PP 및 Alpha PP (Meissner; Camarillo, CA), Clarigard (Millipore; Billerica, MA), HP 및 PreFlow (Pall; East Hills, NY)와 같은 카트리지 필터는 1회용 또는 하우징의 보조를 받는 것을 고려해볼 수 있다. 그러나, 이들 카트리지 필터의 대부분은, 특히 1회용 포맷에서 그 처리 용량면에서 제한적이다. 바람직한 것으로는, 대규모의 적용을 수용할 수 있는 규모 변경 가능한 포맷을 제공하는 1회용 구성요소의 사용이다. Millipore (Billerica, MA)는, 실험실 또는 공정 규모의 적용을 위한 고성능 1회용 심층 필터 시스템 Millistak + Pod 을 개발하였다. 포드 필터(pod filter)에서의 필터 매질은 선택 등급 셀룰로스 섬유 및 규조토로 이루어지며, 오염물 보유도가 크고 유지력이 우수한 것으로 나타나있다. 스테인리스 홀더가 보조된 포드 포맷의 적층 디스크 디자인은 좁은 공간에서의 큰 표면적 여과를 가능하게 하였다. 당업자는 특정 조작 필요를 만족시키기 위한 매질 등급 및 Pod 필터의 막 면적을 결정할 수 있다.

관심상의 생물학적 활성 분자를 함유하는 청정화된 중성화 용해물 용액은 이후, 컬럼 크로마토그래피 또는 막 기재를 포함하는 이온 교환 크로마토그래피에 적용 가능하다. 바람직하게, 음이온 교환 막 크로마토그래피와 같은 막 기재 접근법을 사용할 수 있다. 일례로, 중화된 용해물 용액을 이온 교환 막에 적용 가능하다. 일부 구현에 따르면, 관심상의 생물학적 활성 분자를 막과 접촉시켜 관심상의 생물학적 활성 분자를 막에 결합시키고, 한편 불순물은 막을 통과해 흐르거나 씻겨져 나감으로써 불순물로부터 관심상의 생물학적 활성 분자를 분리할 수 있다. 대안적으로는, 관심상의 생물학적 활성 분자를 막 통과시키고, 반면 불순물을 유지할 수 있다. 일부 구현에서, 관심상의 생물학적 활성 분자는 막에 결합되어 세척 이후 약하게 결합된 불순물이 제거되고, 관심상의 생물학적 활성 분자가 막으로부터 용출된다. 용출은 막을 통해 염 용액을 흘림으로써 실현 가능하다. 염 용액은 관심상의 생물학적 활성 분자가 막에 결합하는 것을 넘어서기에 충분한 강도, 농도 또는 전도도를 가진다. 따라서 관심상의 생물학적 활성 분자는 이온 교환 용출물에 회수된다.

임의의 이온 교환 막이 적합하지만, 일부 구현에서는 강한 음이온 교환 막으로서 4차 아민기를 함유하는 것과 같은 음이온 교환 막을 사용 가능하다. 비제한적인 그러한 막의 예는, Mustang Q (Pall Corporation, East Hills, NY), Sartobind Q (Sartorius, Edgewood, NY), 및 Intercept Q (Millipore Corporate, Billerica, MA)를 포함한다.

일부 구현에서, 플라스미드 함유 세포를 용해 및 중화하여 Pall Mustang Q 카트리지 (Pall Corporation, East Hills, NY)를 사용하는 정제를 포함하는 음이온 교환 막 정제에 의해 처리 가능한 중화된 용해물 용액을 형성한다. 일부 구현에서, 중화된 용해물 용액은 적절한 양의 정제수로 희석하여 약 95 mS/cm 미만 또는 약 85 mS/cm 미만의 전도도를 가지도록 조절된다. 일부 구현에서 전도도는 약 80 mS/cm 내지 약 85 mS/cm으로 조절된다. 목적하는 전도도를 얻기 위해, 용해물 부피와 동량 내지 약 1.5배의 정제수를 희석을 위해 사용 가능하다. 적절한 염 용액을 흘려보냄으로써 Mustang^® Q 카트리지를 컨디셔닝할 수 있다. 일부 구현에서, 용액은 약 0.5 M 염화나트륨 내지 약 1.0 M 염화나트륨 ("NaCl")을 함유하고, 다른 일부 구현에서는 0.67 M NaCl을 함유할 수 있다. 평형화 용액은 또한 완충제, 킬레이트제 또는 그 조합을 포함 가능하다. 일부 구현에서, 이러한 평형화/세척 용액은, 0.67 M NaCl에 추가하여 pH 8의 10 mM Tris-HCl, 1 mM Na₂EDTA를 포함 가능하다. 일부 구현에서, 평형화/세척 용액은 약 800 mL/분 내지 약 1500 mL/분으로 카트리지로 펌핑될 수 있다. 희석된 중화 용해물 용액을 카트리지로 펌핑할 수 있으며, 일부 구현에서는 약 4800 mL/분 미만, 일부 구현에서는 약 2000 mL/분 내지 약 20,000 mL/분으로 펌핑된다. 로딩된 카트리지는 바람직하게는 약 800 mL/분 내지 약 1500 mL/분의 유속으로 평형화/세척 완충액으로 세척될 수 있다. 일부 구현에서 세척은 용출물의 260 nm 흡광도 (A₂₆₀) 가 거의 기저선에 다다를 때까지 지속할 수 있다. 플라스미드는 pH 8로 1 M NaCl, 10 mM Tris-HCl, 1 mM Na₂EDTA를 포함하는 용액으로 용출된다. 일부 구현에서 용출은 약 500 mL/분 내지 약 9000 mL/분, 약 500 mL/분 내지 약 8000 mL/분, 약 500 mL/분 내지 약 7000 mL/분, 약 500 mL/분 내지 약 6000 mL/분, 약 500 mL/분 내지 약 5000 mL/분, 약 500 mL/분 내지 약 4000 mL/분, 약 500 mL/분 내지 약 3000 mL/분, 약 500 mL/분 내지 약 2000 mL/분, 약 600 mL/분 내지 약 5000 mL/분, 약 600 mL/분 내지 약 4000 mL/분, 약 600 mL/분 내지 약 3000 mL/분, 약 600 mL/분 내지 약 2000 mL/분, 또는 약 600 mL/분 내지 약 1500 mL/분의 유속으로 실시 가능하다. 일부 구현에서 용출은 용출물의 A₂₆₀가 거의 기저선에 다다를 때까지 지속할 수 있다. 당업자는 넓은 막 면적을 사용하여 유속을 쉽게 증가시키고 제시된 용액의 특정 염 농도를 변경하여 보통 이상의 실험 없이도 특정 생물분자의 수율 및 순도를 최대화할 수 있음을 인지할 것이다. 수합된 용출물은 이온 교환 용출물이며, 소수성 상호작용 단계에 의한 후속 정제에 사용된다.

이온 교환 막으로부터 회수한 이온 교환 용출물은 소수성 상호작용 크로마토그래피 (본원에서는 "HIC")에 의한 정제에 적용된다. 일부 구현에서, 관심상 생물학적 활성 분자는 HIC 막 또는 컬럼에 결합하는 반면, 불순물은 흘러 통과하거나 씻겨 나간다. 일부 구현에서, 관심상 생물학적 활성 분자는 흘러 통과하고 불순물이 결합한다. 일부 구현에서, 관심상 생물학적 활성 분자는 HIC 막을 흘러 통과한다 (본원에서 "방법 I"로 불림). 일부 구현에서, 관심상 생물학적 활성 분자는 부틸 컬럼과 같은 HIC 컬럼에 결합한다 (본원에서 "방법 II"로 불림). 일부 구현에서, 부틸 컬럼과 같은 HIC 컬럼 및 HIC 막의 조합을 사용하여 고순도의 관심상 생물학적 활성 분자를 대규모 양으로 얻을 수 있다 (본원에서 "방법 III"으로 불림).

이온 교환 용출물은 소수성 상호작용 막에 흘려넣기 전에 컨디셔닝 될 수 있다. 일반적으로, 컨디셔닝은 원하는 염을 원하는 양만큼 첨가하는 것으로 이루어진다. 일부 구현에서, 필요하다면, 생성물 또는 불순물을 결합시키기 위해 적당량으로 황산암모늄을 사용 가능하다. 보통, 방법 III에서는 부틸 컬럼에 로딩 이전에 HIC 여과물을 컨디셔닝할 필요가 없다.

일부 구현에서, 이온 교환 용출물은 Pall Mustang^® Q 카트리지를 사용하는 음이온 교환 크로마토그래피로 정제되고, 소수성 상호작용으로 추가로 정제된다. 일부 구현에서, Supor PES 필터를 가진 Pall Kleenpak^TM Nova 캡슐 (Pall Corporation, East Hills, NY)과 같은 HIC 막을 사용할 수 있다. 카트리지는 그 내부로 황산암모늄 농도를 포함하는 평형화/세척 용액을 흘려넣기 이전에 컨디셔닝 가능하다. 일부 구현에서, 평형화/세척 용액은 약 1 M 황산암모늄 내지 약 3 M 황산암모늄을 포함하고, 일부 구현에서는 약 2.4 M 황산암모늄 및 pH 약 8의 10 mM Tris-HCl을 포함한다. 일부 구현에서, 평형화/세척 용액은 약 240 mS/cm 내지 약 260 mS/cm 의 전도도를 가진다. 일부 구현에서, 평형화/세척 용액은 약 240 mS/cm 내지 약 300 mS/cm 의 전도도를 가진다. 일부 구현에서, 평형화/세척 용액은 약 250 mS/cm 내지 약 270 mS/cm 의 전도도를 가진다. 일부 구현에서, 평형화/세척 용액은 약 245 mS/cm 내지 약 255 mS/cm 의 전도도를 가진다. 일부 구현에서, 사용하는 HIC 컬럼은 Toyopearl 부틸 수지 650M (Tosoh Bioscience LLC, Montgomeryville, PA)로 패킹된 컬럼일 수 있다. 일부 구현에서, 컬럼은 약 1.5 M 황산암모늄 내지 약 3.0 M 황산암모늄을 포함하는 용액으로 평형화될 수 있다. 일부 구현에서, 컬럼은 2.5 M 황산암모늄 및 10 mM Tris-HCl을 포함하는 용액으로 평형화될 수 있다.

소수성 상호작용 막은 기본적으로 소수성 상호작용에 의해 관심상 생물학적 활성 분자 또는 불순물에 결합하는 임의의 막일 수 있다. 비제한적인 HIC 막의 예는, Pall 수포르 폴리에테르술폰 ("PES") 필터, PVDF 필터, GE PES 캡슐 필터 및 단백질에 대한 결합이 낮고 화학적 상용성이 넓은 유사 소수성 막을 포함한다. 비제한적인 통상의 HIC 수지는 부틸, 헥실, 페닐, 옥틸, 프로필, 네오펜틸, 히드록시프로필, 벤질, 메틸 및 이들의 유도체를 포함한다.

일부 구현에서, 이온 교환 용출물은 3 M 또는 4.1 M 황산암모늄으로 희석하여 약 240 mS/cm 내지 약 290 mS/cm, 일부 구현에서는 약 245 mS/cm 내지 약 255 mS/cm의 전도도를 가지도록 컨디셔닝될 수 있다. HIC 방법 I을 사용시, 희석된 이온 교환 용출물은 일부 구현에서는 약 100 mL/분 내지 약 200 mL/분의 유속으로 컨디셔닝된 HIC 카트리지를 흘러 통과시킬 수 있다. 후속의 한외여과/정용여과를 위해 흘려낸 액체를 수합할 수 있다. 임의로는, HIC 카트리지를 물로 세척하고 세척 용액을 회수하여 생성물로부터 제거된 오염물을 분석 가능하다. 방법 II를 사용시에, 희석된 이온 교환 용출물을 10-20 베드 부피/분 (BV/분)의 유속으로 컬럼에 로딩 가능하다. 관심상 생물학적 활성 분자는 약 1.0 M 황산암모늄 내지 약 2.5 M 황산암모늄으로 흡광도가 기저선에 이를 때까지 세척하고, 이후 일례로 0.5 내지 2.5 M 황산암모늄으로 용출한다. 불순물은 주사용 멸균수 (WFI)로 스트리핑하여, 반복사용을 위해 컬럼을 재생할 수 있다. 방법 III은 방법 I에 개시한 바와 같은 HIC 막을 사용하며, 방법 II에 개시한 바와 같은 HIC 컬럼이 이어진다. 방법 I, II, 또는 III의 선택은 생성물의 성질 및 품질 요건에 의존하며, 이는 당업자가 결정 가능한 것이다. 임의의 HIC 방법을 사용함에 의해 관심상 생물학적 활성 물질을 포함한 HIC 용출물이 생성된다. 당업자는 넓은 막 면적 또는 컬럼 직경을 사용하여 유속을 쉽게 증가시키고 제시된 용액의 특정 염 농도를 변경하여 보통 이상의 실험 없이도 특정 생물분자의 수율 및 순도를 최대화할 수 있음을 인지할 것이다.

임의로, HIC 용출물 내에 존재하는 관심상 생물학적 활성 물질을 추가로 정제 가능하다. 일부 구현에서, HIC 용출물은 관심상 생물학적 활성 물질을 농축하고, 과량의 염을 제거하고, 필요시에는 희석물의 조성을 변경하기 위해 한외여과/정용여과를 실시할 수 있다. 한외여과/정용여과 실시 방법은 당업자에게 공지이다. 일부 구현에서, 접선 흐름(tangential flow) 여과가 사용된다. 일부 구현에서는 배치 (batch) 방법이 사용된다.

한외여과/정용여과 막은 염과 같은 저분자량 물질이 여과물 내로 통과됨을 허용하면서도, 관심상 생물학적 활성 물질을 잔류물에 보유할 수 있도록 하는 명목상의 분자량 컷-오프 (nominal molecular weight cut-off; "NMWCO")에 따라 선택 가능하다. 당업자는 관심상 생성물의 크기 및 성질에 따라, 통상의 실험을 가지고 그러한 막을 선택할 수 있다. 일부 구현에서, 관심상 생물학적 활성 물질이 플라스미드인 일부 구현에서처럼, 한외여과/정용여과는 Pall Centramate 유닛 (Pall Corporation, East Hills, NY) 또는 Millipore Pellicon^® XL 유닛 (Millipore Corporate, Billerica, MA) 또는 유사한 특성을 가진 유닛으로 실시 가능하며, 사용하는 막은 Pall Omega^TM 서스펜디드 스크린 막 카세트 (Pall Corporation, East Hills, NY) 또는 Millipore 매질 스크린 막 카세트 (Millipore Corporate, Billerica, MA) 또는 100 kD 또는 50 kD 의 NMWCO 를 가지는 당업계 공지의 유사한 카세트이다. 일부 구현에서, 플라스미드는 약 2.5 mg/mL 이상, 일부 구현에서는 약 5.0 mg/mL 이상, 일부 구현에서는 약 10.0 mg/mL 이상으로 농축 가능하고, 다른 구현에서는 농도가 12.5 mg/mL 이상, 및 다른 구현에서는 농도가 15 mg/mL 이상이다. 일부 구현에서, 농축된 플라스미드 용액의 전도도는 약 50 mS/cm 미만이다.

한외여과/정용여과의 잔류물로부터 회수된 농축 및 탈염된 관심상 생물학적 활성 물질은 멸균 생성물이 필요한 경우 멸균 여과에 적용할 수 있다. 멸균 여과 방법은 당업자에게 공지이며, 임의의 그러한 방법을 선택 가능하다. 얻어진 물질은 실질적으로 순수한 생물학적 활성 생성물로 이루어진다. 생성물은 비제한적으로 약학, 수의 또는 농업 적용을 포함한 다양한 목적으로 사용 가능하다. 따라서, 본 발명은 실질적으로 정제된 생물학적 활성 분자의 벌크 제조를 제공한다. 이들 분자는 플라스미드일 수 있다. 일부 구현에서, 이는 게놈 DNA, RNA, 및 내독소가 실질적으로 없는 플라스미드일 수 있다.

생물학적 활성 분자가 플라스미드인 구현과 같은 일부 구현에서, 0.22 ㎛ 컷-오프를 가진 Pall AcroPak^TM 200 필터 (Pall Corporation, East Hills, NY)를 사용하여 멸균 여과를 실시 가능하다.

제공된 방법으로 제조되는 플라스미드 DNA는 고순도 및 매우 낮은 오염을 가지는 것으로 나타났다. 일부 구현에서, 플라스미드 DNA의 고순도는 90％ 이상, 91％ 이상, 92％ 이상, 93％ 이상, 94％ 이상, 95％ 이상, 96％ 이상, 97％ 이상, 98％ 이상, 또는 99％ 이상 수준으로 플라스미드 DNA가 존재하는 것이다. 순도는 낮은 수준의 RNA, 게놈 DNA, 내독소 및 단백질을 포함하는 오염물의 낮은 수준에 의해 특징지어질 수 있음은 바로 분명해질 것이다. 일부 구현에서, 플라스미드 DNA는 약 l0 mg 이상, 20 mg 이상, 30 mg 이상, 100 mg 이상, 200 mg 이상, 300 mg 이상, 500 mg 이상, 1 g 이상, 10 g 이상, 20 g 이상, 30 g 이상, 100 g 이상, 200 g 이상, 300 g 이상, 1 kg 이상, 또는 2 kg 이상의 양일 수 있다. 일부 구현에서, 플라스미드 DNA는 1 mg/mL 이상의 농도일 수 있다. 도 1은 제조 방법의 한 구현의 모식도를 나타낸다.

구현에는, 주어진 세포 샘플을 취하여 이를 용해 및 중화단계를 포함하는, 시작부터 분리 단계 (즉, 이온 교환 크로마토그래피의 시작)까지의 샘플의 연속적 흐름으로 정제 과정 단계를 밟는 것을 묘사하고 있다. 세포는 세포 현탁 탱크 101에 포함된 재현탁 용액 중에 재현탁된다. 용해 용액 탱크 102에는 용해 용액이 포함된다. 세포 현탁액 및 용해 용액은 각각 펌프 104 또는 105로 "Y" 커넥터의 2개의 주입구로 펌핑된다. "Y" 커넥터를 빠져 나온 용액은 고전단력의 인라인 믹서 107에 의해 혼합되었다. 믹서 107을 빠져 나온 용해물 용액은 4-6분의 홀딩 기간 동안 홀딩 코일 108을 통과해간다. 펌프 106이 다른 탱크인 NP 용액 탱크 103으로부터 중화/침전 (NP) 용액을 버블 컬럼 믹서 109에 동시에 전달하는 동안, 홀딩 코일을 빠져 나온 용해 용액/세포 혼합물은 버블 컬럼 믹서에 진입한다. 동시에, 압축 공기 탱크 110으로부터의 압축 공기를 버블 컬럼 믹서 109의 기저부에 위치한 살포기로 공급한다. 중화된 용해물 용액은 용기 111 내에 수합된다. 용해물 용액은 동시에 용기 111 내의 용해물을 1-60분 기간 수합한 이후 다음의 공정으로 처리된다. 1차 여과용 펌프 112는 미정제 용해물 용액을 제 1 필터 113으로 전달한다. 필터 113 이후의 1차 여과 용액은 동시에 펌프 114를 통해 제 2 필터 115 내로 펌핑된다. 115에서 얻어진 여과된 용액은 펌프 116을 통해 제 3 필터 117로 여과된다. 청정화된 용해물용 펌프 118은 청정화된 용해물용 용기 119로부터 물 탱크 120의 물과의 혼합을 실시하는 믹서 121로의 흐름을 추진한다. 혼합 및 희석된 용액은 희석된 용해물용 용기 122에 수합된다. 희석 및 중화된 용해물 용액은 펌프 123에 의해 예비 컨디셔닝된 Mustang^® Q 카트리지 124로 펌핑된다.

일부 구현에서, 본원에 제공된 방법의 생성물은 정제, 농축, 탈염, 멸균 여과된 플라스미드이고, 이는 단백질, 게놈 DNA, RNA 및 내독소와 같은 불순물이 실질적으로 없는 것일 수 있다. 이들 불순물 및 오염물은 낮은 수준으로, 바람직하게는 실질적으로 존재하지 않는 양으로, 본원에서 가장 바람직한 수준으로는 측정 불가능한 양으로 제공된다. 일부 구현에서, 제공된 제조 방법에 의해 생산되는 생물학적 활성 분자, 바람직하게는 플라스미드 용액 중의, BCA (비신코닌산) 단백질 어세이 (Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL)로 측정되는 잔여 단백질은 약 1％ (중량 기준) 이하, 0.9％ 이하, 0.8％ 이하, 0.7％ 이하, 0.6％ 이하, 0.5％ 이하, 0.4％ 이하, 0.3％ 이하, 0.2％ 이하, 또는 약 0.1％ 이하일 수 있다. 일부 구현에서, 잔여 단백질은 0.2％ 이하, 더 바람직하게는 0.1％ 이하이다. 일부 구현에서 본 제조 방법에 의해 생산된 생물학적 활성 분자, 바람직하게는 플라스미드 용액 중 잔여 내독소는 플라스미드 1 밀리그램당 약 100 내독소 단위 미만 (EU/mg), 약 20 EU/mg 이하, 약 10 EU/mg 이하, 약 1.0 EU/mg 이하, 약 0.9 EU/mg 이하, 약 0.8 EU/mg 이하, 0.7 EU/mg 이하, 0.6 EU/mg 이하, 0.5 EU/mg 이하, 약 0.4 EU/mg 이하, 약 0.3 EU/mg 이하, 약 0.2 EU/mg 이하, 또는 약 0.1 EU/mg 이하이다. 바람직하게 일부 구현에서 내독소 수준은 약 0.2 EU/mg 이하, 보다 바람직하게는 0.1 EU/mg 이하이다. 일부 구현에서, 본원에 제공된 제조 방법에 의해 생성되는 바람직하게는 플라스미드인 생물학적 활성 분자 용액 중의, 소수성 상호작용 HPLC로 측정되는 잔여 RNA는 약 5％ (중량 기준) 이하, 1％ 이하, 0.9 이하, 0.8％ 이하, 0.7％ 이하, 0.6％ 이하, 0.5％ 이하, 0.4％ 이하, 0.3％ 이하, 0.2％ 또는 약 0.1％ 이하이다. 바람직하게, 일부 구현에서 RNA의 양은 약 0.5％ 이하, 및 더 바람직하게는 약 0.4％ 이하이다. 일부 구현에서, 본원에 제공된 제조 방법에 의해 생성되는 바람직하게는 플라스미드인 생물학적 활성 분자 용액 중의, qPCR로 측정되는 잔여 게놈 DNA는 약 5％ (중량 기준) 이하, 약 1％ 이하, 0.9％ 이하, 0.8％ 이하, 0.7％ 이하, 0.6％ 이하, 0.5％ 이하, 0.4％ 이하, 0.3％ 이하, 0.2％ 이하, 약 0.1％ 이하, 약 0.01％ 이하, 약 0.001％ 이하, 약 0.0001％ 이하, 약 0.00001％ 이하, 또는 약 0.000001％ 이하이다. 바람직하게, 일부 구현에서 게놈 DNA의 양은 약 0.1％ 이하, 더 바람직하게는 약 0.001％ 이하, 및 가장 바람직하게는 약 0.000001％ 이하이다.

고수율이면서 고농도의 플라스미드 DNA를 본원에 제공한 방법으로 다량 생산할 수 있다. 본원에 제공된 방법으로 제조되는 플라스미드 DNA는 고순도 플라스미드 DNA의 용액을 포함한다. 일부 구현에서 고순도 플라스미드 DNA는 약 90％ 이상, 약 91％ 이상, 약 92％ 이상 또는 약 93％ 이상, 약 94％ 이상, 약 95％ 이상, 5 mg/mL 이상, 6 mg/mL 이상, 7 mg/mL 이상, 8 mg/mL 이상, 9 mg/mL 이상, 10 mg/mL 이상, 11 mg/mL 이상, 12 mg/mL 이상, 13 mg/mL 이상, 14 mg/mL 이상, 15 mg/mL 이상이다. 일부 구현에서, 플라스미드 DNA는 약 5 mg/mL 내지 약 15 mg/mL, 약 5 mg/mL 내지 약 14 mg/mL, 약 5 mg/mL 내지 약 13 mg/mL, 약 5 mg/mL 내지 약 12 mg/mL, 약 5 mg/mL 내지 약 11 mg/mL, 약 5 mg/mL 내지 약 10 mg/mL, 약 5 mg/mL 내지 약 9 mg/mL, 약 5 mg/mL 내지 약 8 mg/mL의 농도, 약 6 mg/mL 내지 약 15 mg/mL, 약 6 mg/mL 내지 약 14 mg/mL, 약 6 mg/mL 내지 약 13 mg/mL, 약 6 mg/mL 내지 약 12 mg/mL, 약 6 mg/mL 내지 약 11 mg/mL, 약 6 mg/mL 내지 약 10 mg/mL, 약 6 mg/mL 내지 약 9 mg/mL, 약 6 mg/mL 내지 약 8 mg/mL의 농도, 약 7 mg/mL 내지 약 15 mg/mL, 약 7 mg/mL 내지 약 14 mg/mL, 약 7 mg/mL 내지 약 13 mg/mL, 약 7 mg/mL 내지 약 12 mg/mL, 약 7 mg/mL 내지 약 11 mg/mL, 약 7 mg/mL 내지 약 10 mg/mL, 약 7 mg/mL 내지 약 9 mg/mL, 약 8 mg/mL 내지 약 15 mg/mL, 약 8 mg/mL 내지 약 14 mg/mL, 약 8 mg/mL내지 약 13 mg/mL, 약 8 mg/mL내지 약 12 mg/mL, 약 8 mg/mL 내지 약 11 mg/mL, 약 8 mg/mL 내지 약 10 mg/mL, 약 9 mg/mL 내지 약 15 mg/mL, 약 9 mg/mL 내지 약 14 mg/mL, 약 9 mg/mL 내지 약 13 mg/mL, 약 9 mg/mL 내지 약 12 mg/mL, 약 9 mg/mL 내지 약 11 mg/mL, 약 10 mg/mL 내지 약 15 mg/mL, 약 10 mg/mL 내지 약 14 mg/mL, 약 10 mg/mL 내지 약 13 mg/mL, 약 10 mg/mL 내지 약 12 mg/mL, 약 11 mg/mL 내지 약 15 mg/mL, 약 11 mg/mL 내지 약 14 mg/mL, 약 11 mg/mL 내지 약 13 mg/mL, 약 12 mg/mL 내지 약 15 mg/mL, 약 12 mg/mL 내지 약 14 mg/mL, 또는 약 13 mg/mL 내지 약 15 mg/mL의 농도일 수 있다. 일부 구현에서, 플라스미드 DNA는 수퍼코일 백분율이 약 50％, 55％, 60％, 65％, 70％, 75％, 80％, 81％, 82％, 83％, 84％, 85％, 86％, 87％, 88％, 89％, 90％, 91％, 92％, 93％, 94％ 또는 95％ 초과의 수퍼코일 플라스미드, 바람직하게는 80％ 초과의 수퍼코일된 플라스미드가 되도록 하는 그러한 농도로 제조될 수 있다. 일부 구현에서, 플라스미드 DNA는 수퍼코일 백분율이 50-90％, 50-80％, 50-75％, 50-70％, 50-65％, 50-60％, 60-90％, 60-80％, 60-75％, 60-70％, 65-90％, 65-80％, 65-75％, 65-70％, 70-90％, 70-80％, 70-75％, 80-90％, 85-90％, 90- 95％ 또는 그 초과가 되도록 하는 그러한 농도로 제조될 수 있다. 일부 구현에서, 플라스미드 DNA는 수퍼코일 및 이완된 (개환이며 분해되지 않음) 백분율이 90％ 이상, 95％ 이상 또는 98％ 이상이 되도록 하는 그러한 농도일 수 있다. 일부 구현에서, 플라스미드 DNA는 2 년 이상의 저장 이후 수퍼코일 백분율이 50％ 이상이고 나머지는 본질적으로 이완된 (개환이며 분해되지 않음) 플라스미드이고, 2 년 이상의 저장 이후 수퍼코일 백분율이 60％ 이상이고 나머지는 본질적으로 이완된 (개환이며 분해되지 않음) 플라스미드이고, 2 년 이상의 저장 이후 수퍼코일 백분율이 65％ 이상이고 나머지는 본질적으로 이완된 (개환이며 분해되지 않음) 플라스미드이고, 2 년 이상의 저장 이후 수퍼코일 백분율이 85％ 이상이고 나머지는 본질적으로 이완된 (개환이며 분해되지 않음) 플라스미드가 되도록 하는 그러한 농도일 수 있으며, 이때 보관은 물의 동결점 미만이다. 일부 구현에서, 플라스미드 DNA는 2년 이상 저장 이후 수퍼코일 및 이완된 (개환이며 분해되지 않음) 백분율이 90％ 이상, 95％ 이상 또는 98％ 이상이 되도록 하는 그러한 농도일 수 있고, 이때 보관은 물의 동결점 미만이다. 본원에 개시된 그러한 플라스미드 제제는 본원 기재의 방법에 의해 생성물로 제조 가능하다.

본 발명은 하기의 실시예로서 추가로 예시되며, 실시예에서 달리 언급되지 않는 한 부 및 백분율은 중량 기준이고, 도 (°)는 섭씨이다. 본 발명의 바람직한 구현을 나타내는 이들 실시예가 예시를 위해서만 주어진 것임을 이해하여야 한다. 상기의 논의 및 실시예로부터 당업자는 본 발명의 필수 특성을 확인할 수 있고, 그 사상 및 범위를 벗어나지 않고서도 각종 용도 및 조건으로 본 발명을 다양하게 변경 및 변형할 수 있다. 따라서, 본원에 개시 및 기재된 것 이외의 본 발명의 다양한 변형은 앞서의 기재로부터 당업자에게 명백할 것이다. 그러한 변형은 또한 부가된 청구항의 범위 이내이다.

실시예 1

플라스미드 A를 함유하는 대장균 ("E. coli") 세포를 원심분리로 수확시 광학 세포 밀도 ("OD₆₀₀")가 72인 고밀도로 발효시켰다. 플라스미드 A의 크기는 6549 bp이다. 해당 플라스미드는 ~250 복제/세포의 낮은 복제수로 보통 복제한다. 약 3.1 kg의 세포 덩어리 습윤 세포 중량 ("WCW")을 pH 8의 25 mM Tris-염산염 ("Tris-HCl", J.T. Baker, Phillipsburg, NJ), 10 mM 디소듐 에데테이트 ("Na₂EDTA", Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ)로 이루어진 재현탁 완충액에 최종 부피 약 21.5 L로 현탁하였다. 그 세포 현탁액을 "Y" 커넥터의 한 쪽으로 300 mL/분으로 펌핑하였다. 동시에, 0.2 N 수산화나트륨 ("NaOH", J.T. Baker, Phillipsburg, NJ), 1％ 소듐 도데실 설페이트 ("SDS", J.T. Baker, Phillipsburg, NJ)로 이루어진 용해 용액을 "Y" 커넥터의 다른 한 쪽으로 300 mL/분으로 펌핑하였다. "Y" 커넥터를 빠져 나온 조합된 유체를 곧바로 표준 Emulsor Screen (Silverson Machines, Inc. East Longmeadow, MA) 및 인라인 어셈블리가 장착된 Silverson Model L4R 회전자/고정자 믹서로 통과시켰다. 믹서를 회전자 속도 800 rpm 으로 작동시켰다.

회전자/고정자 믹서를 빠져 나온 유체를 50-피트, 0.625인치 (내부 직경)의 홀딩 코일로 통과시켰다. 약 600 mL/분의 총 유속과 홀딩 코일 통과 시간 약 5분으로 완전한 세포 용해를 도모하였다.

홀딩 코일을 빠져 나온 세포 용해물 (용해물 용액)을 버블 컬럼 믹서로 통과시켰다. 동시에 1 M 칼륨 아세테이트 (J.T. Baker, Phillipsburg, NJ), 7 M 암모늄 아세테이트 (EMD Chemicals, Inc., Bibbstown, NJ)로 이루어진 차가운 (약 4℃) 중화/침전 용액을 600 mL/분으로 버블 컬럼 믹서 내로 독립적으로 펌핑하였다. 용해물 용액 및 중화/침전 용액을 혼합 컬럼의 수직 상승 방향이면서 정상부 근방의 배출구로 흐르도록 하였다. 용액들이 혼합 컬럼을 통과하는 동안, 혼합 직경 전반에 걸쳐 미세한 버블의 일정한 스트림을 제공하기 위해 고안된 소결된 살포기를 통해 약 3.0 slpm의 속도로 컬럼의 기저부로 압축 공기를 도입하였다. 과량의 공기는 컬럼 정상부를 통해 방출시켰다. 용해물 용액 및 중화/침전 용액이 컬럼을 통과하는 동안, 이들은 상승하는 버블의 부드러운 요동에 의해 연속적으로 혼합된다. 이는, 칼륨 SDS, 변성된 세포 단백질, 결합 지방 및 세포벽 성분 및 관련된 게놈 DNA로 이루어진 백색의 유모성(솜털같은) 침전물 (잔여물 성분)의 형성에 의해 입증되었다.

버블 컬럼 믹서를 빠져 나온 중화 및 침전된 용해물 (중화된 용해물 용액 및 잔여물의 분산액)을 안정화 용기 내에 수합한다. 본 과정은 세포 덩어리의 전체 현탁액이 용해, 중화 및 침전되어 안정화 탱크 내에 수합될 때까지 연속 모드로 실시하였다. 전체 용액 부피는 21.5 L 세포 현탁액과, 재현탁 완충액을 포함한 5 L 재현탁 탱크 세척물, 26.5 L 용해 용액 및 53 L 중화 용액으로, 총 부피 약 106 L에 이른다.

수합 이후 안정화 탱크 내의 물질을 관측 유리를 통해 관측하였다. 고체 내에 트래핑된 분명히 보이는 공기 버블을 따라 액체 표면으로 상승하는 유모성 침전물이 관측될 수 있다. 약 28 in·Hg의 진공을 안정화 탱크에 가하여, 부유성 침전물의 뚜렷하면서도 가시적인 압축을 도모하였다.

약 16 시간 동안 실온 및 진공하의 안정화 탱크 내에서 물질을 유지하였다. 이후 압축된 침전물의 파쇄를 피하도록 서서히 진공을 제거하였다. 플라스미드 함유 액체 (중화된 용해물 용액)를 기저부에 장착된 무균 부품을 통해 탱크로부터 조심스럽게 펌핑해 내었다. 탱크 내의 액체 및 침전물 수준을 연속적으로 모니터링하고, 침전물이 탱크를 빠져 나오지 않도록 제시간 내에 펌핑을 중단하였다. 이를 10 ㎛ 심층 여과, 이후 0.1 ㎛ 최종 여과에 적용하였다. 필터 막힘 때문에 중화된 용해물 용액 일부는 여과 동안 손실되었다. 그 결과, 69 L의 청정화된 중화 용해물 용액을 수득하였다. 중화된 용해물 용액을 이후 약 93 L의 정제수로 희석하여, 음이온 교환에 의한 추가의 처리를 위한 제제 내에서 총부피 162 L 및 대략적 전도도 97 mS/cm를 달성하였다. 여과된 중화 용해물 용액 중 플라스미드 농도는 약 17 μg/mL인 것으로서, 이는 총 플라스미드 약 1170 mg에 해당한다.

청정화되고 희석 및 중화된 용해물 용액을 음이온 교환에 의해 추가로 정제하였다. 260 mL 베드 부피의 Pall Mustang Q 카트리지를 pH 8의 10 mM Tris-HCl (J.T. Baker, Phillipsburg, NJ) 및 1 mM EDTA (Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ)로 이루어진 1 x Tris-EDTA ("TE") 완충액 중의 0.67 M 염화나트륨 ("NaCl", J.T. Baker, Phillipsburg, NJ) 4 L로 평형화하였다. 160 L 부피의 희석된 중화 용해물 용액을 1.2 L/분의 유속으로 Q 카트리지로 펌핑하였다. 260 nm에서의 카트리지 용출물의 자외선 ("UV") 흡광도를 스트립 챠트 기록기를 사용하여 모니터링 및 기록하였다. 로딩 이후, 용출물의 A₂₆₀이 기저선으로 돌아올 때까지 1.2 L/분으로 카트리지를 평형화 완충액으로 세척하였다. 플라스미드를 이후 1.2 L/분으로 펌핑하는 1 M NaCl (J.T. Baker, Phillipsburg, NJ) 함유 1 x TE 완충액으로 카트리지로부터 용출시켰다. A₂₆₀이 기저선으로 돌아올 때 용출을 종결하였다. 용출액의 총 부피는 약 4.8 L 이고, A₂₆₀ 기준으로 총 약 915 mg의 DNA를 함유하였다. Q 음이온 교환의 수율은 약 78％ 였다. 이 단계에서, 단백질, 대부분의 RNA, 게놈 DNA 및 내독소를 포함하는 오염물은 흐름 통과물 및 세척 액체 내로 제거된다.

Q 용출물은 부틸 컬럼으로 방법 II에 따라 소수성 상호작용으로 추가 정제된다. K5/15 Amersham (Piscataway, NJ) 컬럼을 290 mL 베드 부피 ("BV")의 Toyopearl 부틸 수지 650M (Tosoh Bioscience LLC, Montgomeryville, PA)로 패킹하였다. 24 L 부피의 3 M 황산 암모늄 (EMD Chemicals, Inc., Gibbstown, NJ)을 로딩 이전에 4.8 L의 Q 용출물과 혼합하였다. 컬럼을 43 mL/분으로 펌핑하는 2 L의 2.5 M 황산 암모늄 (EMD Chemicals, Inc., Gibbstown, NJ)으로 평형화하였다. 컨디셔닝된 Q 용출물을 43 mL/분으로 부틸 컬럼에 로딩하고, 43 mL/분으로 5 L의 2.5 M 황산 암모늄 (EMD Chemicals, Inc., Gibbstown, NJ)으로 세척하고, 생성물을 43 mL/분으로 1.5 L 의 1.8 M 황산 암모늄 (EMD Chemicals, Inc., Gibbstown, NJ)으로 용출하였다. RNA 및 내독소를 포함하는 결합된 오염물을 제거하기 위해 주사용 멸균수 ("WFI", Baxter Healthcare, Deerfield, IL)로 컬럼을 스트리핑하고, 반복 사용을 위해 재생하였다. 용출물은 95％ 수율로 약 870 mg의 플라스미드를 포함하며, 플라스미드의 수퍼코일 백분율은 Q 이후 66％로부터 부틸 컬럼 단계 이후 80％ 초과까지 증가하였다.

부틸 HIC로부터의 용출물을 1 제곱 피트의 면적 및 50 kDa 의 명목상 분자량 컷-오프인, Pall Omega 서스펜디드 스크린 막 카세트 (Pall Corporation, East Hills, NY) 하나가 구비된 Pall Centramate^TM 카세트 홀더를 이용하여 한외여과/정용여과에 의해 농축하고 탈염하였다. 41.2 mL 부피의 벌크 유지물이 회수되었고, 이때 DNA 농도는 9.026 mg/mL (A₂₆₀ 기준)였다. UF/DF 조작을 위한 WFI의 제 1 세척은 농도 1.6 mg/mL로 46.9 mL를 제공하였다. WFI의 제 2 세척은 농도 0.268 mg/mL로 65.8 mL를 제공하였다. UF 이후의 결합된 DNA 회수는 약 47 6 mg 이며 수율은 55％였다. 플라스미드의 최종 수퍼코일 백분율은 UF 이후 87％ 초과를 달성하였다.

실시예 1의 샘플을 아가로스 젤 전기영동 분석에 적용하였고, 이는 도 2에 개시되어 있다. 3개의 주요 밴드는 모두 샘플 레인 (2-5 레인)에 존재하며, 가장 낮은 밴드는 목적 플라스미드 A 의 수퍼코일 포맷이다 (6.5 kb). 1레인은 수퍼코일된 플라스미드 래더 (Invitrogen)를 나타낸다. 2레인은 6.5 kb 플라스미드 생성 물을 함유한 세포 용해물이고, 다량의 RNA가 또한 샘플 내에 존재한다. 3레인은 Q 음이온 교환 이후의 생성물을 나타내며, 플라스미드가 보다 적은 RNA를 함유하면서 농축되었음을 나타낸다. 4레인은 소수성 상호작용 정제 이후의 생성물을 나타내고, 5레인은 UF 이후 혼합된 최종 생성물을 나타낸다. 용해물 중의 오염성 RNA가 제거되고, 목적하는 수퍼코일된 플라스미드의 순도가 60％ 에서 >85％로 실질적으로 증가하였다.

실시예 2

플라스미드 B를 함유하는 3140 그램의 대장균 세포를 pH 8의 25 mM Tris-HCl (J.T. Baker, Phillipsburg, NJ) 및 10 mM Na₂EDTA로 이루어진 재현탁 완충액에 최종 부피 18.8 L로 재현탁하였다. 플라스미드 B는 4.7 kb 크기이다. 재현탁된 세포를, 0.2 N NaOH (J.T. Baker, Phillipsburg, NJ) 및 1％ SDS (J.T. Baker, Phillipsburg, NJ)로 이루어진 용해 용액으로, 회전자 속도 800 rpm으로 작동하는 Silverson Model L4R 회전자/고정자 믹서에 의해 300 mL/분의 동일 유속으로 혼합하였다. 미리 냉각된 (약 4-5℃) 중화/침전 (NP) 용액과 혼합하기 위해 버블 컬럼에 도입하기 이전에, 믹서로부터의 용해 용출물을 홀딩 코일 내에서 5분간의 홀딩 시간으로 유지하였다. 1 M 칼륨 아세테이트 (J.T. Baker, Phillipsburg, NJ) 및 3 M 암모늄 아세테이트 (EMD Chemicals, Inc., Bibbstown, NJ)를 함유한 NP 용액을 600 mL/분으로 버블 컬럼 믹서에 공급하고, 동시에, 압축 공기를 3-5 slpm의 유속으로 기저부의 살포기를 통해 도입하였다.

중화된 세포 용해물을 버블 컬럼 배출구 아래에 걸려있는 200-400 ㎛의 편직 그물백에 의해 먼저 수합하였다. 큰 세포 유모물질이 백에 담겨진 반면에, 플라스미드 DNA 및 분쇄된 세포 잔여물을 포함하는 미정제 용해물 용액은 미리 냉각된 (5℃) 안정화 탱크 내에 수합되었다. 동시에, 생성된 미정제 용해물은 2 L/분의 유속으로 ECOLINE 필터 용기 (Eaton Filtration, Iselin, New Jersey)에 구비된 48 ㎛ 주름진 카트리지 필터 (CPI filters, Houston, TX)로 펌핑하였다. 1차 필터된 용해물을 총 회수 부피 75 L로 용기 내에 수합하였다. 이후 2차 여과를 실시하였다. 1차 여과된 용해물을 2 L/분의 유속으로 ECOLINE 필터 용기 (Eaton Filtration, Iselin, New Jersey)에 구비된 523 다중층 백 필터 (Knight Corporation, Barrington, IL)로 펌핑하였다. 회수한 용액을 총 회수 부피 65 L로 용기 내에 수합하였다. 최종적으로, Millistak Pod 1회용 심층 필터 시스템 (Millipore, Bellerica, MA)을 이용하여 심층 여과를 실시하였다. 여과 매질은 0.2 - 2.5 ㎛의 공극 크기 분포를 가졌다. 0.11 제곱미터의 막 면적을 가지는 Pod 필터를 사용하여 0.5 L/분의 유속으로 2차 여과된 용해물을 청정화하였다. 최종 60L 부피의 청정화된 용해물을 수득하고, 이는 2 미만 NTU 값의 높은 청정도를 나타내는 것이다. 여과 각 단계에서 용해물 샘플 내에서의 플라스미드 순도 및 형태에는 차이가 없었다.

실시예 3

플라스미드 C (3.5 kb 플라스미드 크기)를 함유하는 대장균 세포를 높은 세포 밀도로 발효시키고 원심분리로 수확하였다. 24.4 kg의 습윤 중량 세포를 400L 의 발효 작업 용액으로부터 회수하였다. 세포를 pH 8의 25 mM Tris-HCl (J.T. Baker, Phillipsburg, NJ) 및 10 mM Na₂EDTA (Mallinckrodt Baker, Phillipsburg, NJ)로 이루어진 171 L 재현탁 완충액에 3시간 동안 재현탁하였다. 재현탁된 세포를 600 ml/분의 동일 유속으로 Silverson 고전단력 믹서에 의해 새로운 용해 용액과 혼합하고, 홀딩 루프로 약 5분간 홀딩하였다. 1 M 칼륨 아세테이트 (J.T. Baker, Phillipsburg, NJ) 및 3 M 암모늄 아세테이트 (EMD Chemicals, Inc., Bibbstown, NJ)를 함유한 중화/침전 용액을 1.2 L/분의 유속으로 버블 믹서로 펌핑하여 용해된 세포와 혼합하였다. 5-6 slpm 기체 유속으로 공급된 압축 공기는 혼합하는 힘으로 작용하고 중화된 용해물의 수합 탱크로 전달되도록 작용하였다. 용해 과정을 위해 약 5시간의 기간이 소요되었다. 버블 혼합 장치를 빠져 나온 중화된 세포를 수합 탱크로 우회하여, 다음의 여과에 연속적으로 적용하였다.

중화된 미정제 용해물을 그 생성에 따라 3번의 연속 여과로 처리하고, 이들 청정화 과정은 용해 과정과 동시에 실시하였다. 초기 여과는, 2.4 L/분의 유속으로 48 ㎛ 주름진 카트리지 필터 (CPI filters, Houston, TX)를 구비한 TOPLINE 필터 용기 (Eaton Filtration, Iselin, New Jersey)로 세포 유모물질을 함유한 미정제 용해물을 펌핑하여 실시하였다. 세포 유모물질과 같은 큰 입자 대부분을 제거하기 위해 1차 여과를 실시하였고, 주름진 막은 더 큰 여과 면적을 제공하며 따라서 단일층 또는 다중층 구조보다 빠른 유속 및 더 큰 공정 용량을 제공한다. 4개의 주름진 카트리지를 사용하여 세포 유모물질을 함유한 680 L 부피의 중화된 미정 제 용해물을 처리하고, 회수된 1차 여과 용해물은 600 L였다. 48 ㎛ 주름진 카트리지 필터를 빠져 나온 용액을 2.4 L/분의 유속으로 1 ㎛ 다중층 카트리지 필터 (CPI filters, Houston, TX)를 구비한 제 2의 ECOLINE 필터 용기 (Eaton Filtration, Iselin, New Jersey)로 직접 펌핑하였다. 본 단계에 의해 2차 여과된 용해물 중의 1 ㎛ 내지 50 ㎛ 범위의 작은 입자 대부분을 제거한다. 후속의 Mustang Q는 0.2 ㎛에 해당하는 공극을 가지므로, 0.2 ㎛ 이하의 절대 공극 크기에 기초한 필터를 이용한 3차 심층 여과를 실시하였다. 심층 필터 Millitak + Pod 시스템은 큰 공정 용량 및 미세 입자에 대한 높은 유보 모두를 달성할 수 있다. 스테인리스 스틸 Pod 홀더에 구비된 Millistak C0HC 필터 (Millipore, Bellerica, MA)를 사용하여, 2 Nephelometric Turbidity Unit (NTU)으로 용해물의 탁도를 감소시켰다. 1.1 제곱미터 막 면적의 C0HC 필터는 400L 부피의 2차 여과 용해물을 처리하였다.

Millistak 필터를 빠져 나온 여과된 용해물을 용기에 수합하였다. 그 용기 용액의 일부를 2.2 L/분의 유속으로 "Y" 커넥터로 펌핑하여 0.7 L/분의 유속으로 동일한 "Y" 커넥터로 펌핑된 물과 혼합하였다. 혼합물을 Kenics 인라인 믹서로 흘려넣어 다른 홀딩 탱크에 이르게 하였다. 홀딩 탱크 내의 이러한 희석 용해물의 전도도는 90-95 mS/cm 범위였다. 400 L 부피의 희석 용해물을 베드 부피 260 ml의 10 인치 Mustang Q (Pall, East Hills, NY)에 로딩하였다. 200 L의 Q 로딩 이전에 Q 캡슐을 포화시켰다. 약 3 g 의 플라스미드 DNA를 Q 용출물 내에 회수하였다. Q 생성물의 수퍼코일된 백분율은 80％ 내지 90％ 였고, Q 용출물 중 RNA 함량은 젤 분석에서 나타나지 않았다.

실시예 3의 샘플을 아가로스 젤 전기영동 분석에 적용하였고, 이는 도 3에 개시되어 있다. 각 레인에서 가장 강한 강도의 밴드는 플라스미드의 수퍼코일 (SC)된 형태를 나타내고, 이는 80-90％의 백분율 범위로 존재한다. 1레인은 수퍼코일된 플라스미드 래더 (Invitrogen)를 나타낸다. 2레인은 48 ㎛ 주름진 카트리지를 사용한 1차 여과 이후 여과물로써, 높은 RNA 함량을 나타낸다. 3레인은 1 ㎛ 주름진 카트리지를 사용한 2차 여과 이후 여과물로써, 역시 높은 RNA 함량을 나타낸다. 4레인은 C0HC Pod 필터를 이용한 3차 여과 이후 여과물을 나타내고, 감소된 RNA 비율을 보여준다. 5레인은 Mustang Q 음이온 교환 단계를 거친 이후 용출 생성물 분획 #1을 나타내며, 이는 제한된 RNA와 함께 고순도를 나타낸다. 6레인은 Q 용출물의 제 2 분획을 나타내며 그 순도가 용출물 #1과 유사하다.

실시예 4

플라스미드 C를 함유하는 25 kg 습윤 세포 중량의 대장균 세포를 pH 8의 25 mM Tris-HCl (J.T. Baker, Phillipsburg, NJ) 및 10 mM Na₂EDTA로 이루어진 105 L 재현탁 완충액에 총 3시간 동안 재현탁하였다. 플라스미드 C는 3.5 kb 크기이다. 0.2 N NaOH (J.T. Baker, Phillipsburg, NJ) 및 1％ SDS (J.T. Baker, Phillipsburg, NJ)를 함유하는 용해 용액을 1500 ml/분의 유속으로 Silverson Model L4R 회전자/고정자 믹서에 공급함과 동시에, 1500 ml/분의 유속으로 재현탁된 세포를 동일 믹서 내로 펌핑하였다. 1인치 내부직경 (ID) 및 100 피트 길이의 홀딩 코일을 통해 용해된 세포를 함유하는 혼합물을 통과시켰다. 믹서로 진입부터 홀딩 코일을 빠져 나올 때까지의 용해물의 대략적 유지 시간은 5 분이었다. 이어서, 용해된 세포를 미리 냉각된 (약 4-5℃) 중화/침전 (NP) 용액과 접촉시키기 위해 버블 컬럼에 도입하였다. 1 M 칼륨 아세테이트 (J.T. Baker, Phillipsburg, NJ) 및 3 M 암모늄 아세테이트 (EMD Chemicals, Inc., Bibbstown, NJ)를 함유한 NP 용액을 3000 mL/분으로 버블 컬럼 믹서에 공급하였다. 동시에, 압축 공기를 6-10 slpm의 유속으로 기저부의 살포기를 통해 도입하여, 혼합하는 힘으로 작용시키고 중화된 용액을 미정제 용해물 탱크를 향한 우회 파이프로 진입하도록 촉진시켰다.

20 분의 기간 동안 미정제 용해물을 수합한 이후, 용액을 미정제 용해물 탱크의 기저부로부터 48 ㎛ 주름진 카트리지 필터 (CPI filters, Houston, TX)가 구비된 TOPRLINE 필터 용기 (Eaton Filtration, Iselin, New Jersey)로 6 L/분의 유속으로 펌핑해내었다. 동시에, 제1 필터 용기로부터의 여과물을 1 ㎛ 주름진 카트리지 필터 (CPI filters, Houston, TX)가 구비된 제 2 TOPRLINE 필터 용기 (Eaton Filtration, Iselin, New Jersey)로 6 L/분의 유속으로 펌핑하였다. 1차 여과는 48 ㎛ 초과 입자의 99％를 제거하였고, 5개의 10 인치 카트리지 필터는 총 부피 700 L의 미정제 용해물을 청정화하였다. 10 인치 1 ㎛ 카트리지 필터 3개를 사용함으로써 2차 여과의 종결에 따라 1 ㎛ 초과 입자의 99％를 제거하였다. 제 2 용기로부터의 여과물을 5-6 L/분의 유속 펌프를 이용하여 청정화된 용해물 탱크에 수합하였다. 스테인리스 스틸 시험용 규모의 Pod 홀더에 구비된 Millistak + C0HC 필터 (Millipore, Bellerica, MA)의 제 3 필터 시스템을 사용하여, 후속 Mustang Q 정제를 위한 높은 청정도를 달성하였다. 청정화된 용해물 탱크로부터의 용액은 6 L/분의 유속으로 pod 필터에 펌핑하였다. 2.2 제곱미터 막 면적의 C0HC 필터는 주입 압력이 10 psi에 도달하기 이전에 2차 여과된 용해물 650 L 부피를 처리하였다. 제 3 Pod 필터에 의한 여과물을 여과된 용해물 용기에 수합하였다.

여과된 용해물을 "Y" 커넥터로 전달하여, Mustang Q로의 로딩 이전에 0.3-0.4 V 물/V 용해물의 속도로 Kenics 인라인 믹서를 통하여 물과 혼합하였다. 용해물을 5 L/분의 유속으로 펌핑하고, 물은 1.75-2 L/분의 유속으로 공급하였다. 혼합물은 희석된 용해물 탱크내에 수합하였다. 홀딩 탱크 중 이러한 희석된 용해물의 전도도는 90-95 mS/cm 범위였다. 약 800L 부피의 희석된 용해물을 베드 부피 5000 ml의 Mustang Q XT5000 (Pall, East Hills, NY)에 로딩하였다. Q 용출물 내에 약 25 g의 플라스미드 DNA를 회수하였다. 회수한 Q 용출물은 높은 백분율의 수퍼코일 형태와 제한된 수준의 오염물을 나타내었다.

실시예 5

하기의 표 I은 낮은 복제수 플라스미드인 플라스미드 A를 이용한 방법 II에 따라 제조한 14개의 플라스미드 제제 및 그에 대해 측정된 일부 순도 파라미터들을 나타낸다. 제조 프로토콜은 상기 실시예 3에 개시한 바와 같다.

플라스미드 샘플의 분석

플라스미드 C의 크기는 3.5 kb이다 (실시예 3 및 실시예 4의 경우와 같음). 플라스미드 D1-D3는 4.4 - 4.7 kb이며, 발현 유전자를 제외하고는 유사한 구성을 가진다. 플라스미드 E1-E2 크기는 3.8 kb이며, 발현 유전자를 제외하고는 유사한 구성을 가진다. 플라스미드 E의 크기는 2.5 kb이다

Claims (31)

1. 다음 단계들을 포함하는, 박테리아 세포로부터 복제수 300 이하의 저 복제수(low copy number) 플라스미드의 90 중량% 이상 순도의 샘플을 대규모로 제조하는 방법:

   a) 복수의 박테리아 세포의 세포 현탁액을 용해 용액(lysis solution)과 접촉시켜 용해물 용액(lysate solution)을 제조하는 단계;

   b) 상기 용해물 용액을 중화 용액으로 중화하여, 중화된 용해물 용액과 잔여물(debris)을 포함하는 분산액을 제조하는 단계;

   c) 하나 이상의 필터로 상기 분산액을 여과하는 단계;

   d) 상기 중화된 용해물 용액으로 이온 교환 분리를 실시하여 이온 교환 용출물을 제조하는 단계; 및

   e) 상기 이온 교환 용출물에 대해 소수성 상호작용 분리를 실시하여 소수성 상호작용 용액을 제조하는 단계;

   이때 단계 a)는 고전단력의 인라인 (in-line) 믹서 중에서 상기 세포 현탁액을 용해 용액과 혼합함을 포함하고,

   단계 b)는 버블 믹서 중에서 상기 중화 용액과 상기 용해물 용액을 혼합함을 포함하며,

   단계 e)는 소수성 상호작용 컬럼 또는 소수성 상호작용 막을 사용하여 소수성 상호작용 분리를 실시하여 소수성 상호작용 용액을 제조함을 포함한다.
2. 제1항에 있어서, 하기의 단계를 추가로 포함하는 방법:

   f) 상기 소수성 상호작용 용액의 한외여과에 의해 저 복제수 플라스미드의 용액을 제조하는 단계.
3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 하기의 단계를 추가로 포함하는 방법:

   g) 상기 저 복제수 플라스미드 용액의 멸균 여과에 의해 저 복제수 플라스미드의 멸균 용액을 제조하는 단계.
4. 제1항 또는 제2항에 있어서, 잔여물로부터 중화된 용해물 용액을 분리하기 위한 시간 동안 분산액을 홀딩하고, 하나 이상의 필터로 중화된 용해물 용액을 여과함을 추가로 포함하는 방법.
5. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 제조 단계가, 1 분 내지 20 분의 기간, 또는 4 분 내지 8 분의 기간, 또는 5 분에 걸쳐 믹서 내에서 상기 용해 용액과 세포 현탁액을 접촉시킴을 포함하는 것인 방법.
6. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 이온 교환이 음이온 교환 막인 방법.
7. 제1항 또는 제2항에 있어서, 단계 e)가, 부틸 소수성 상호작용 크로마토그래피 용액 용출물인 소수성 상호작용 용액을 생성하기 위해 부틸 소수성 상호작용 크로마토그래피를 포함하는 소수성 상호작용 분리를 실시하는 것을 포함하는 방법.
8. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 방법이 한 단계로부터 후속 단계로 연속으로 전이(또는 이행)시킴을 포함하고, 용기 내에 용해물을 수합함에 의해 분산액 중 중화된 용해물 용액을 잔여물로부터 분리하고, 분산액을 제 1 필터를 통해 통과시켜 초기의 미정제 중화된 용해물 용액을 생성함을 포함하는 방법.
9. 제8항에 있어서, 1차의 상기 미정제 중화된 용해물 용액을 제 2 필터를 통해 통과시켜 후속의 미정제 중화된 용해물 용액을 생성함을 포함하는 방법.
10. 다음 단계들을 포함하는, 박테리아 세포로부터 복제수 300 이하의 저 복제수(low copy number) 플라스미드의 90 중량% 이상 순도의 샘플을 대규모로 제조하는 방법:

    세포 분산액 중의 박테리아 세포를 용해 용액과 접촉시켜 용해물 용액을 형성하는 단계;

    버블 컬럼 믹서로 중화 용액을 상기 용해물 용액 내로 혼합하여 상기 용해물 용액을 중화하여, 중화된 혼합물을 형성하는 단계;

    제 1 필터 및 제 2 필터를 통해 상기 중화된 혼합물을 여과하여 여과된 용액을 형성하는 단계;

    이온 교환 컬럼을 통해 상기 여과된 용액을 통과시켜 이온 교환 용액을 형성하는 단계;

    소수성 상호작용 컬럼 또는 소수성 상호작용 막을 통해 상기 이온 교환 용액을 통과시켜 소수성 상호작용 용액을 형성하는 단계; 및

    상기 소수성 상호작용 용액을 한외여과하여 90 중량% 이상 순도의 저 복제수 플라스미드 샘플을 형성하는 단계;

    이때 접촉 단계로부터 여과된 용액을 통과시키는 단계까지 이르는 대규모 방법에서의 한 단계로부터 후속 단계로의 각 전이는 연속으로 일어난다.
11. 제1항 또는 제2항의 대규모 제조 방법에 의해 생산된, 복제수 300 이하의 저 복제수(low copy number) DNA 플라스미드를 포함하는 조성물로서,

    상기 DNA 플라스미드의 양은 조성물 중 10 g 이상이고,

    상기 DNA 플라스미드의 순도는 99 중량％ 초과이며,

    상기 DNA 플라스미드의 농도는 전체 조성물 중 5 mg/mL 이상이고,

    상기 DNA 플라스미드는 80 중량％ 초과의 수퍼코일된 플라스미드를 포함하며,

    상기 조성물은 DNA 플라스미드 1 mg 당 10 EU 이하의 내독소(endotoxin)를 포함하고,

    상기 조성물은 1.0 중량％ 이하의 RNA를 포함하며,

    상기 조성물은 1.0 중량％ 이하의 단백질을 포함하고,

    상기 조성물은 1.0 중량％ 이하의 게놈 DNA를 포함하는 것인 조성물.
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