CN117050865A - 一种质粒生产全自动系统及制备方法 - Google Patents
一种质粒生产全自动系统及制备方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN117050865A CN117050865A CN202311042798.1A CN202311042798A CN117050865A CN 117050865 A CN117050865 A CN 117050865A CN 202311042798 A CN202311042798 A CN 202311042798A CN 117050865 A CN117050865 A CN 117050865A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- liquid
- input pipeline
- pipeline
- plasmid
- production system
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 title claims abstract description 57
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title claims abstract description 32
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims abstract description 14
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims abstract description 86
- 239000000725 suspension Substances 0.000 claims abstract description 44
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 claims abstract description 38
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 claims abstract description 35
- 238000007667 floating Methods 0.000 claims abstract description 31
- 230000003068 static effect Effects 0.000 claims abstract description 25
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims abstract description 23
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 claims abstract description 18
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims abstract description 11
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 33
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims description 29
- 239000006166 lysate Substances 0.000 claims description 26
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M Sodium bicarbonate Chemical group [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 22
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 17
- 230000002572 peristaltic effect Effects 0.000 claims description 17
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 11
- 235000017557 sodium bicarbonate Nutrition 0.000 claims description 11
- 229910000030 sodium bicarbonate Inorganic materials 0.000 claims description 11
- SCVFZCLFOSHCOH-UHFFFAOYSA-M potassium acetate Chemical compound [K+].CC([O-])=O SCVFZCLFOSHCOH-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 8
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical group [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 6
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 claims description 6
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 claims description 6
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims description 5
- 229960000583 acetic acid Drugs 0.000 claims description 5
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 claims description 5
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 claims description 5
- 238000004891 communication Methods 0.000 claims description 4
- 239000012362 glacial acetic acid Substances 0.000 claims description 4
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 claims description 4
- 235000011056 potassium acetate Nutrition 0.000 claims description 4
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 claims description 3
- 239000008103 glucose Substances 0.000 claims description 3
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 claims description 2
- 238000003860 storage Methods 0.000 claims description 2
- 238000000034 method Methods 0.000 abstract description 32
- 238000001914 filtration Methods 0.000 abstract description 9
- 239000012535 impurity Substances 0.000 abstract description 6
- 238000000926 separation method Methods 0.000 abstract description 3
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 abstract description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 10
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 9
- 238000005904 alkaline hydrolysis reaction Methods 0.000 description 8
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 8
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 6
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 6
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 6
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 6
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000008215 water for injection Substances 0.000 description 6
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 6
- 239000000463 material Substances 0.000 description 5
- 238000000197 pyrolysis Methods 0.000 description 4
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- UIIMBOGNXHQVGW-DEQYMQKBSA-M Sodium bicarbonate-14C Chemical compound [Na+].O[14C]([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-DEQYMQKBSA-M 0.000 description 3
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 3
- 229960002713 calcium chloride Drugs 0.000 description 3
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 3
- 238000005336 cracking Methods 0.000 description 3
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 3
- 238000012869 ethanol precipitation Methods 0.000 description 3
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 3
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 3
- VTYYLEPIZMXCLO-UHFFFAOYSA-L Calcium carbonate Chemical compound [Ca+2].[O-]C([O-])=O VTYYLEPIZMXCLO-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N Formamide Chemical compound NC=O ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 2
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000005856 abnormality Effects 0.000 description 2
- 230000006978 adaptation Effects 0.000 description 2
- 239000003513 alkali Substances 0.000 description 2
- LLSDKQJKOVVTOJ-UHFFFAOYSA-L calcium chloride dihydrate Chemical compound O.O.[Cl-].[Cl-].[Ca+2] LLSDKQJKOVVTOJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 229940052299 calcium chloride dihydrate Drugs 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 2
- 238000005188 flotation Methods 0.000 description 2
- 229920001903 high density polyethylene Polymers 0.000 description 2
- 239000004700 high-density polyethylene Substances 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 2
- 238000004062 sedimentation Methods 0.000 description 2
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 2
- 102000016911 Deoxyribonucleases Human genes 0.000 description 1
- 108010053770 Deoxyribonucleases Proteins 0.000 description 1
- ZGTMUACCHSMWAC-UHFFFAOYSA-L EDTA disodium salt (anhydrous) Chemical compound [Na+].[Na+].OC(=O)CN(CC([O-])=O)CCN(CC(O)=O)CC([O-])=O ZGTMUACCHSMWAC-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 108700001237 Nucleic Acid-Based Vaccines Proteins 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 229910000019 calcium carbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001569 carbon dioxide Substances 0.000 description 1
- 229910002092 carbon dioxide Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 239000013611 chromosomal DNA Substances 0.000 description 1
- 238000005352 clarification Methods 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000012527 feed solution Substances 0.000 description 1
- 238000005227 gel permeation chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000011031 large-scale manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 238000004848 nephelometry Methods 0.000 description 1
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 1
- 229940023146 nucleic acid vaccine Drugs 0.000 description 1
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 1
- 235000015497 potassium bicarbonate Nutrition 0.000 description 1
- 229910000028 potassium bicarbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011736 potassium bicarbonate Substances 0.000 description 1
- TYJJADVDDVDEDZ-UHFFFAOYSA-M potassium hydrogencarbonate Chemical compound [K+].OC([O-])=O TYJJADVDDVDEDZ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- ONQDVAFWWYYXHM-UHFFFAOYSA-M potassium lauryl sulfate Chemical compound [K+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O ONQDVAFWWYYXHM-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 238000005086 pumping Methods 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 239000010802 sludge Substances 0.000 description 1
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 1
- 238000002798 spectrophotometry method Methods 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 230000001360 synchronised effect Effects 0.000 description 1
- 238000010998 test method Methods 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910021642 ultra pure water Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000012498 ultrapure water Substances 0.000 description 1
- 238000000870 ultraviolet spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
- C12N15/1003—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
Abstract
本发明公开了一种质粒生产全自动系统及制备方法,通过静态混悬器对菌悬液、碱裂解液和中和液流式混合,对菌体进行不断的分割、混合,提高碱裂解和中和的效率,进而提高质粒收率。对质粒DNA收集时采用沉淀和上浮相组合的策略,特别适用于规模化、自动化质粒生产。该方法可提高DNA沉淀的效率,使中间澄清液层与上层悬浮杂质更好地分层,显著降低中间层澄清液的浊度,有利于后续的分离和过滤。无论在过滤前还是过滤后,均获得了比传统方法更高的DNA收率。
Description
技术领域
本申请涉及生物制药领域,特别是一种质粒生产全自动系统及制备方法。
背景技术
随着基因治疗和核酸疫苗/药物的兴起,对GMP级别的质粒的需求显著增加。目前质粒的纯化工艺方法主要是碱裂解法提取质粒,其基本原理是利用碱液裂解细胞释放出质粒和其它胞内物质,通过十二烷基磺酸钾盐沉淀来吸附去除蛋白质,并基于染色体DNA与质粒DNA的大小差异来分离基因组DNA。利用碱裂解法小规模制备质粒时,一般通过手动加入并颠倒混合的方法,而当制备大量质粒时,虽然已有相关自动化体系的设备报道,以期解决大规模碱裂解操作困难、碱裂解不充分、收率低的问题,但是在碱裂解时间的控制、碱裂解效果的评估以及操作过程中如何防止差错方面还是无法满足需求。
现有技术对质粒DNA的提取方法多采用苯酚/氯仿法、乙醇沉淀法、核酸吸附柱法等方式。苯酚/氯仿法虽具有抑制DNase降解的优势,但试剂毒性较大,长时间操作对人员健康有较大影响,且核酸回收率低,损失量大,由于操作体系大,不同人员操作重复性差,很难进行大规模标准化生产。乙醇沉淀法使体系总体积增加,利用乙醇多次沉淀造成工艺流程长、生产效率低;且DNA在溶液中有一定程度的溶解,会影响收率。核酸吸附柱法利用核酸与磁珠或固相柱材料之间的亲和性质,将杂质从样品中去除,从而使纯化后的核酸更加纯净。该方法对样本和耗材的要求高,需反复离心,不便于自动化大规模生产操作。
中国专利申请CN114561273A(公开日2022年5月31日)公开了一种制备质粒的连续碱裂解系统及其质粒的制备方法,在裂解前利用雾化装置处理来解决长时间搅拌混合剪切力引起的DNA污染,提高质粒收率,该装置在加入中和液后经过连续流离心装置,收集澄清液。该装置的螺旋裂解装置和螺旋混合装置均为螺旋盘管结构,导致混合效果无法评价;螺旋裂解装置仅增加了料液之间的接触时间,没有进一步混合的功能,特别对于生产中出现的pH变化、气泡产生等问题,无法有效识别并控制生产。
发明内容
发明目的:本发明的目的是提供一种基于碱裂解法、可实时监测异常、对中和后的料液高效沉淀和分层的质粒生产全自动系统,本发明还有一个目的是提供一种利用碱裂解法自动化、规模化生产质粒的方法。
技术方案:为了实现上述发明目的,本发明提供的一种质粒生产全自动系统包括:一级汇流部,其输入端分别与菌悬液输入管路和裂解液输入管路连通,并输至二级汇流部;二级汇流部,其输入端分别与所述一级汇流输出管路和中和液输入管路连通,并输至收集装置;收集装置,包括与所述二级汇流输出管路连通的第一接口、与沉淀液输入管路连通的第二接口、以及与上浮液输入管路连通的第三接口;PLC控制器,用于获取每个所述输入管路和/或输出管路的运行参数,并发出控制指令;其中,每个汇流部的出口端各自设有一个静态混旋器。
本发明提供的全自动系统主要包括菌悬液输入管路、裂解液输入管路、中和液输入管路、一级汇流输出管路、二级汇流输出管路、沉淀液输入管路、上浮液输入管路等,以供不同介质从中流过。具体地说,所述PLC控制器获取的运行参数包括但不限于:菌悬液输入管路、裂解液输入管路、中和液输入管路的流量参数、气泡参数,一级汇流输出管路、二级汇流输出管路的pH参数,沉淀液输入管路、上浮液输入管路的流量参数等。PLC控制器发出的所述控制指令包括但不限于分别对每个管路蠕动泵发送的启动信号、停止信号、变速信号、反转信号等。
作为本发明的优选方案,所述菌悬液输入管路、裂解液输入管路、中和液输入管路上分别设有一个蠕动泵以及至少一个流量计。每个蠕动泵的输入端还设有气泡检测器,与所述PLC控制器通信连接。所述PLC控制器设有预警模块,当所述预警模块收到气泡检测器发出的监测到气泡的信号后,向蠕动泵发出停止信号。
作为本发明的进一步优化,所述静态混悬器的输出端设有一个与所述PLC控制器通信连接的pH传感器。当所述预警模块收到pH传感器发出的超出阈值信号后,向蠕动泵发出停止信号。
作为本发明的进一步优化,所述静态混旋器包括壳管和设于壳管内的若干单螺旋板,相邻螺旋板的扭转方向相反。更具体地说,所述静态混旋器为SK型静态混悬器,为本发明相应物料提供20秒至2分钟的停留混合时间。
进一步地,本发明所述的沉淀液指可以与核酸形成可复性沉淀的试剂,优选包括但不限于氯化钙、乙醇、异丙醇、酚/氯仿、甲酰胺、醋酸等试剂。所述的上浮液是具有与所述沉淀液反应生成气泡的特性,包括但不限于碳酸氢钠、碳酸氢钾。作为本发明的优选方案,所述沉淀液为氯化钙溶液,所述上浮液为碳酸氢钠溶液。
现有技术并未就质粒碱提取的中和料液如何进行沉淀和澄清提供全自动、规模化生产的方案。本发明首次提出利用沉淀液和上浮液的相互配合的自动化生产法方案,两者相互反应生成的气泡(主要是二氧化碳)可有效驱使收集装置中的沉淀向上漂浮,静置后中间的澄清液层为含有质粒的溶液,底层为少量的没有被完全上浮的沉淀液。无需使用耗材或进行离心,也不需要向体系中引入复杂的试剂成分,通过自动化控制即可实现沉淀和澄清,并保证质粒提取的收率和质量。
为了进一步提高沉淀效果和上浮效果,所述第二接口位于所述收集装置距离底部约90%的液位高度处,所述第三接口位于所述收集装置距离底部约10%的液位高度处。
进一步地,所述菌悬液输入管路的输入端与菌悬液容器连通,所述裂解液输入管路的输入端与裂解液容器连通,所述中和液输入管路的输入端与中和液容器连通;可选地,所述菌悬液容器与所述中和液容器具有将内部温度恒定在2-8℃的温控装置。
进一步地,所述一级汇流部和二级汇流部为具有一个出口和至少两个进口的接头。作为本发明的优选方案,所述一级汇流部和二级汇流部为三通接头。
进一步地,所述输入管路、输出管路的两端均设有快接接头。本发明所述的快速接头是指通过卡止配合、螺纹配合、键槽配合、销轴配合等任意一种或多种组合的方式实现输入管路、输出管路和相应容器之间的快速组装。所述快捷接头优选为一次性耗材,例如MPC快接接头、MPX快接接头、MPU快接接头、SIP接头、鲁尔接头、CPC接头、无菌接头等。
本发明提供的一种质粒碱裂解自动化制备方法,包括将悬浮液与菌泥混合后,先与裂解液流式混合,再与中和液流式混合;流式混合结束后,加入沉淀液获得沉淀料液;向所述沉淀料液底部加入上浮液,所述上浮液具有与所述沉淀液反应生成气泡的特性;再在2-8℃静置4-24小时,获取中间澄清液层,进行后续纯化。后续的所述纯化步骤包括浓缩洗滤、凝胶层析、亲和层析、离子交换层析、浓缩换液等。
本发明所述的流式混合是指在料液流动过程中通过混悬器进行混合,更具体地说,是通过静态混旋器,尤其是SK型静态混旋器进行混合。只需要保持一定的流速和流量,静态混合器时可通过内部结构和流体流动状态的设计,将不同流体充分分散和扭曲,使其混合均匀。流体流经SK型静态混旋器时,被其内部的单螺旋板不断切割,同时由于单螺旋板旋转扭曲,迫使流体的流动方向不断变化,产生对流和涡旋运动,被分割的流体在两个单元之间合流,之后再次被分割,流体不断进行分散、对流、涡旋、合流,达到混合均匀的效果。这种混合方式,对菌悬液和裂解液、中和液的接触较为温和,且避免了局部浓度过高或混合不均匀的情况,最大限度地避免DNA双螺旋结构被破坏。本发明在所述静态混旋器的混合时长为20秒至2分钟。
本发明提供的方法在依次加入沉淀液、上浮液之后,通过静置即可高效澄清中和料液,所述中间澄清液层具有不超过15NTU的平均浊度。
作为本发明的进一步优化,所述沉淀液为氯化钙,加入后的终浓度为0.5-1.5M;所述上浮液为碳酸氢钠,所述碳酸氢钠加入后的终浓度为1-10g/L。
进一步地,所述悬浮液为包含Tris-HCl、EDTA和葡萄糖的水溶液,pH为7.5±0.2,2-8℃存放;所述裂解液为包含氢氧化钠、SDS的水溶液,可常温保存;所述中和液为醋酸钾、冰醋酸水溶液,2-8℃存放。
本发明提供的一种质粒生产全自动系统通过静态混悬器对菌悬液、碱裂解液和中和液流式混合,对菌体进行不断的破裂、混合,提高碱裂解和中和的效率,进而提高质粒收率。通过参数设定以及多台泵的同步启动,可以控制各种物料的添加量,同时还有过程中的pH监测,使得生产过程更稳定,最大限度降低人为操作导致的批次间差异。对质粒DNA收集时采用沉淀和上浮相组合的策略,解决了沉淀过程絮凝物将部分DNA一起共沉淀使得收率偏低的困扰,特别适用于规模化、自动化质粒生产。该方法可提高DNA沉淀的效率,使中间澄清液层与上层悬浮杂质更好地分层,显著降低中间层澄清液的浊度,有利于后续的分离和过滤。无论在过滤前还是过滤后,均获得了比传统方法更高的DNA收率。
附图说明
图1是本发明实施例1的系统结构示意图;
图2是本发明实施例1的系统原理示意图;
图3是本发明实施例1制备方法的流程图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明进行进一步说明。
实施例1
如图1、图2所示,本实施例提供了一种质粒生产全自动系统,包括菌悬液容器1、裂解液容器2、中和液容器3、收集装置4、沉淀液容器5、上浮液容器6、PLC控制器7。
菌悬液容器1的出液口通过菌悬液输入管路8与第一三通10连接,裂解液容器2的出液口通过裂解液输入管路9与第一三通10连接。第一三通10的出口处设有第一静态混悬器11,并通过一级汇流输出管路12与第二三通14连接,中和液容器3的出液口通过中和液输入管路13与第二三通14连接。第二三通14的出口处设有第二静态混旋器15,并通过二级汇流输出管路16与收集装置4的第一接口连接。收集装置4的第二接口通过沉淀液输入管路17连接至沉淀液容器5,收集装置4的第二接口通过上浮液输入管路18连接至上浮液容器6。为了进一步提高沉淀效果和上浮效果,第二接口位于收集装置距离底部约90%的液位高度处,第三接口位于收集装置距离底部约10%的液位高度处。
第一静态混悬器11和第二静态混悬器15均为SK型静态混悬器,具有壳管和设于壳管内的若干单螺旋板,相邻螺旋板的扭转方向相反,为物料提供20秒至2分钟的停留混合时长。
所有管路都是一次性高密度聚乙烯管(HDPE),管路管径和长度的匹配,可以根据生产规模进行重新选择匹配。本实施例选用的管路长度90~110cm、规格为直径7.6mm,管路两端设有CPC无菌快接接头,防止料液被污染。
从图1可以看出,PLC控制器分别与各个管路的所有蠕动泵、流量计、气泡检测器、pH传感器通信连接,以获取每个输入管路和/或输出管路的运行参数,并发出控制指令。蠕动泵泵速为30-45ml/min。菌悬液输入管路8、裂解液输入管路9、中和液输入管路13、沉淀液输入管路17和上浮液输入管路18上均设有蠕动泵和流量计,除此之外,菌悬液输入管路8、裂解液输入管路9、中和液输入管路13还设有气泡检测器。一级汇流输出管路12和二级汇流输出管路16上设有pH传感器。PLC控制器设有预警模块,当预警模块收到气泡检测器发出的监测到气泡的信号后,向蠕动泵发出停止信号。当预警模块收到pH传感器发出的超出阈值信号后,向蠕动泵发出停止信号。
图1中,菌悬液容器1、中和液容器3和收集装置4均设于独立的温控装置内,以保持料液维持在2-8℃。作为替代方案,也可将这三个容器置于同一个温控装置中。
实施例2
本实施例提供了一种质粒碱裂解自动化制备方法,该方法基于实施例1提供的全自动系统进行生产,以大肠杆菌DH5α感受态细胞生产的pMDLg-pRRE质粒作为试验对象。
1.溶液配制
配制菌悬液,将30g菌泥(发酵液湿重16.6%,质粒浓度749ng/ul)与悬浮液混合。悬浮液包含3.0g Tris、2.66g EDTA和9.91g葡萄糖,定容至1.0kg(1L),用盐酸调节pH至7.5±0.2,2-8℃存放。
配制裂解液,按比例称取氢氧化钠8.0g、SDS10.0g,定容至1.0kg(1L),常温保存。
配制中和液,按比例称取醋酸钾294.5g、冰醋酸120g,定容至1.1kg(1L),2-8℃存放。
配制沉淀液,按比例称取二水氯化钙744.5g,定容至1.4kg(1L),常温保存。
配制上浮液,按比例称取碳酸氢钠80g,定容至1.05kg(1L),常温保存。
2.自动化生产
请参考图3,其中,P1、P2、P3、P4和P5分别为菌悬液容器1、裂解液容器2、中和液容器3、沉淀液容器5和上浮液容器6的蠕动泵。本实施例中,PLC控制器向蠕动泵发出的控制指令为启动和停止信号。
S110:PLC控制器向P1、P2发出启动指令,将菌悬液与裂解液流式混合;
S120:基于P1、P2的启动时刻,PLC控制器设置P3启动的延时参数(20秒至2分钟,根据不同料液特性和管路参数而异)。待一级汇流输出管路12中的料液到达第二三通14时,向P3发出启动指令,进一步与中和液流式混合。
S130:当P1、P2、P3完成料液加入时,启动检查异常,如果收到来自气泡检测器发出的监测到气泡的信号,PLC控制器向P1、P2和P3发出停止指令,否则继续执行S140。
S140:流式混合结束后,PLC控制器向P4发出启动指令,加入沉淀液以获得沉淀料液。
S150:当P4完成料液加入时,PLC控制器向P5发出启动指令,向沉淀料液底部加入上浮液直至完成。上浮液中的碳酸氢钠与沉淀液中的氯化钙发生反应,生成大量气泡,驱使碳酸钙和絮状沉淀的混合物向上漂浮,质粒DNA位于中间澄清液层,而下层主要是少量的没有被完全上浮的沉淀液。
3.静置与后处理
料液收容于收集装置内,并维持2-8℃恒温静置4-24小时。
获取中间澄清液层,用深层过滤模块或0.22um过滤器过滤后,经过浓缩洗滤,再开展后续纯化。
4.pH检测
本实施例中,pH传感器分别设于第一静态混悬器11和第二静态混悬器15的出口端,PLC控制器预先对两个pH传感器的pH阈值进行设定。在S110和S120所述的流式混合过程中,如监测到pH传感器的检测值超出阈值,向P1、P2和P3三个蠕动泵发出停止信号,人工排除问题后再进行生产。
实施例3
为了验证本发明生产工艺的优势,本实施例提供一套基于现有技术的碱裂解工艺作为对照:悬浮液按配比称取Tris-HCl 7.9g,EDTA二钠盐3.7g,加入800mL超纯水充分溶解,用注射用水定容至1L,加入1M NaOH,调节pH至7.5±0.5。裂解液按配比称取氢氧化钠8g,SDS10g,加入800ml注射用水充分溶解,定容至1L。中和液按配比称取醋酸钾294g,加入600ml注射用水充分溶解,量取冰醋酸100mL加入上述溶液中混匀,用注射用水定容至1L。沉淀液按配比称取二水氯化钙735g,加入800ml注射用水充分溶解,用注射用水定容至1L。试验组采用实施例2记载的方法。
试验方法:试验组和对照组分别取80%样品量和20%样品量(沉淀料液),分别就加入上浮液和不加上浮液进行两次试验。所有样品在静置4h、24h、过滤后的中间澄清液层进行检测。DNA浓度是按照紫外分光光度法进行测定。DNA纯度利用分光光度计测定并计算A260/A280,A260/A230的吸光度比值。浊度平均值按照浊度计法进行统计计算,单位为NTU。质粒收率按照紫外分光光度法进行DNA浓度测定并对碱裂解前质粒浓度与碱裂解后过滤的料液质粒浓度比值进行计算。所有试验的结果请参见表1:
表1质粒碱裂解工艺差异和上浮液的影响
试验结论
关于杂质上浮现象:不管是试验组还是对照组,添加碳酸氢钠后的上浮杂质与不加碳酸氢钠的裂解液上浮杂质相比更紧密,取出容器过程中晃动不会引起杂质与溶液的混合,更利于中间澄清溶液的分离与后续的过滤。
关于浊度:不管是试验组还是对照组,添加碳酸氢钠后的中间澄清溶液与不加碳酸氢钠的中间澄清溶液相比,浊度显著更低。
关于DNA浓度:总体而言,不管是过滤前还是过滤后,本发明提供的碱裂解工艺比现有技术获得的DNA浓度更高。
关于碱裂解收率:本发明提供的碱裂解工艺使得质粒收率显著高于现有技术,且无论试验组还是对照组,添加上浮液(碳酸氢钠)后的收率均高于未添加碳酸氢钠的收率。
本发明通过自动化精确控制裂解液、中和液与料液的添加比例,控制碱裂解的接触时间,以及使用静态混悬器优化料液混合效果等一系列手段以保证质粒浓度和收率;并进一步通过pH传感器在线监测料液pH值,避免裂解液加入量过多或局部过量引起的质粒质量问题。通过沉淀和上浮相组合的策略显著提高了沉淀液中回收质粒的收率,更有利于规模化、自动化生产。
以上所述仅是本发明的优选实施方式,应当指出:对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明原理的前提下,还可以做出若干改进和润饰,这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (16)
1.一种质粒生产全自动系统,其特征在于包括:一级汇流部,其输入端分别与菌悬液输入管路和裂解液输入管路连通,并输至二级汇流部;二级汇流部,其输入端分别与所述一级汇流输出管路和中和液输入管路连通,并输至收集装置;收集装置,包括与所述二级汇流输出管路连通的第一接口、与沉淀液输入管路连通的第二接口、以及与上浮液输入管路连通的第三接口;PLC控制器,用于获取每个所述输入管路和/或输出管路的运行参数,并发出控制指令;其中,每个汇流部的出口端各自设有一个静态混旋器。
2.根据权利要求1所述的一种质粒生产全自动系统,其特征在于:所述菌悬液输入管路、裂解液输入管路、中和液输入管路上分别设有一个蠕动泵以及至少一个流量计。
3.根据权利要求1或2所述的一种质粒生产全自动系统,其特征在于:每个蠕动泵的输入端还设有气泡检测器,与所述PLC控制器通信连接。
4.根据权利要求3所述的一种质粒生产全自动系统,其特征在于:所述PLC控制器设有预警模块,当所述预警模块收到气泡检测器发出的监测到气泡的信号后,向蠕动泵发出停止信号。
5.根据权利要求4所述的一种质粒生产全自动系统,其特征在于:每个所述静态混悬器的输出端设有一个与所述PLC控制器通信连接的pH传感器。
6.根据权利要求5所述的一种质粒生产全自动系统,其特征在于:当所述预警模块收到pH传感器发出的超出阈值信号后,向蠕动泵发出停止信号。
7.根据权利要求1所述的一种质粒生产全自动系统,其特征在于:所述静态混旋器包括壳管和设于壳管内的若干单螺旋板,相邻螺旋板的扭转方向相反。
8.根据权利要求1-2,4-7任意一项所述的一种质粒生产全自动系统,其特征在于:所述菌悬液输入管路的输入端与菌悬液容器连通,所述裂解液输入管路的输入端与裂解液容器连通,所述中和液输入管路的输入端与中和液容器连通;所述菌悬液容器与所述中和液容器具有将内部温度恒定在2-8℃的温控装置。
9.根据权利要求8所述的一种质粒生产全自动系统,其特征在于:所述一级汇流部和二级汇流部为具有一个出口和至少两个进口的接头。
10.根据权利要求9所述的一种质粒生产全自动系统,其特征在于:所述输入管路、输出管路的两端均设有快接接头。
11.一种质粒碱裂解自动化制备方法,其特征在于:将悬浮液与菌泥混合后,先与裂解液流式混合,再与中和液流式混合;流式混合结束后,加入沉淀液获得沉淀料液;向所述沉淀料液底部加入上浮液,所述上浮液具有与所述沉淀液反应生成气泡的特性;再在2-8℃静置4-24小时,获取中间澄清液层,进行后续纯化。
12.根据权利要求11所述的一种质粒碱裂解自动化制备方法,其特征在于:所述中间澄清液层具有不超过15NTU的平均浊度。
13.根据权利要求12所述的一种质粒碱裂解自动化制备方法,其特征在于:所述流式混合是在静态混旋器中进行混合,混合时间为20秒至2分钟。
14.根据权利要求12或13所述的一种质粒碱裂解自动化制备方法,其特征在于:所述沉淀液为氯化钙,所述上浮液为碳酸氢钠。
15.根据权利要求14所述的一种质粒碱裂解自动化制备方法,其特征在于:所述氯化钙加入后的终浓度为0.5-1.5M,所述碳酸氢钠加入后的终浓度为1-10g/L。
16.根据权利要求15所述的一种质粒碱裂解自动化制备方法,其特征在于:所述悬浮液为包含Tris-HCl、EDTA和葡萄糖的水溶液,pH为7.5±0.2,2-8℃存放;所述裂解液为包含氢氧化钠、SDS的水溶液;所述中和液为醋酸钾、冰醋酸水溶液,2-8℃存放。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202311042798.1A CN117050865A (zh) | 2023-08-16 | 2023-08-16 | 一种质粒生产全自动系统及制备方法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202311042798.1A CN117050865A (zh) | 2023-08-16 | 2023-08-16 | 一种质粒生产全自动系统及制备方法 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN117050865A true CN117050865A (zh) | 2023-11-14 |
Family
ID=88662266
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN202311042798.1A Pending CN117050865A (zh) | 2023-08-16 | 2023-08-16 | 一种质粒生产全自动系统及制备方法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN117050865A (zh) |
Citations (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN101998991A (zh) * | 2008-02-08 | 2011-03-30 | 贝林格尔.英格海姆Rcv两合公司 | 用于生产生物分子的方法和设备 |
CN111601889A (zh) * | 2018-07-12 | 2020-08-28 | 卡尼卡欧洲遗传有限责任公司 | 纯化染色体外核酸序列的方法和设备 |
CN114561273A (zh) * | 2022-04-02 | 2022-05-31 | 北京沃森创新生物技术有限公司 | 一种制备质粒的连续碱裂解系统以及质粒的制备方法 |
CN114933960A (zh) * | 2022-07-03 | 2022-08-23 | 苏州谱博分析技术有限公司 | 一种连续流细菌破碎与澄清装置 |
CN218710455U (zh) * | 2022-07-11 | 2023-03-24 | 上海莱馥医疗科技有限公司 | 一种适用于工业化质粒纯化的大肠杆菌裂解的装置 |
-
2023
- 2023-08-16 CN CN202311042798.1A patent/CN117050865A/zh active Pending
Patent Citations (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN101998991A (zh) * | 2008-02-08 | 2011-03-30 | 贝林格尔.英格海姆Rcv两合公司 | 用于生产生物分子的方法和设备 |
CN111601889A (zh) * | 2018-07-12 | 2020-08-28 | 卡尼卡欧洲遗传有限责任公司 | 纯化染色体外核酸序列的方法和设备 |
CN114561273A (zh) * | 2022-04-02 | 2022-05-31 | 北京沃森创新生物技术有限公司 | 一种制备质粒的连续碱裂解系统以及质粒的制备方法 |
CN114933960A (zh) * | 2022-07-03 | 2022-08-23 | 苏州谱博分析技术有限公司 | 一种连续流细菌破碎与澄清装置 |
CN218710455U (zh) * | 2022-07-11 | 2023-03-24 | 上海莱馥医疗科技有限公司 | 一种适用于工业化质粒纯化的大肠杆菌裂解的装置 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US7771945B2 (en) | Apparatus and method for preparative scale purification of nucleic acids | |
US5947689A (en) | Automated, quantitative, system for filtration of liquids having a pump controller | |
EP2540676A1 (en) | Continuous flow reactor and method for treating wastewater having high-concentration nitrogen and phosphorus | |
EA025403B1 (ru) | Системы и способы осмотического разделения | |
JP2002521029A5 (zh) | ||
US8822672B2 (en) | Method and device for producing and/or purifying polynucleotides and products obtainable thereof | |
CN114933960A (zh) | 一种连续流细菌破碎与澄清装置 | |
CN109851138A (zh) | 一种高盐废水软化及浓缩装置及方法 | |
CN113321283A (zh) | 一种人工智能加药混凝沉淀成套设备及其加药系统 | |
ES2316451T3 (es) | Un metodo y equipo para supervisar relaciones ssintroficas en un fluido de proceso biologico. | |
CN117050865A (zh) | 一种质粒生产全自动系统及制备方法 | |
CN208829433U (zh) | 一种高氨氮废水处理装置 | |
CN105645692B (zh) | 一种去除电镀废水中有机磷酸盐的处理方法 | |
CN208346157U (zh) | 一种用于对微生物发酵产物进行分离纯化的系统 | |
CN115159739A (zh) | 一种反渗透海水淡化系统 | |
CN214270482U (zh) | 一种用于碱性高钙废水去除钙离子的处理系统 | |
CN215975309U (zh) | 高效型矿井水处理用自动调节pH值的装置 | |
CN210186491U (zh) | 一种植物/中药提取液及水处理连续自动化絮凝设备 | |
CN217838557U (zh) | 一种电厂冷却循环水处理装置 | |
CN105565551B (zh) | 一种去除电镀废水中有机磷酸盐的处理系统 | |
CN111601889A (zh) | 纯化染色体外核酸序列的方法和设备 | |
CN215756857U (zh) | 一种纯化水机组的多介质过滤器 | |
CN211847497U (zh) | 一种含氟废水处理系统 | |
CN215712409U (zh) | 自调式超纯水处理系统 | |
CN216039028U (zh) | 基于太阳能供电的净水器 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination |