CN111601889A - 纯化染色体外核酸序列的方法和设备 - Google Patents
纯化染色体外核酸序列的方法和设备 Download PDFInfo
- Publication number
- CN111601889A CN111601889A CN201980008445.5A CN201980008445A CN111601889A CN 111601889 A CN111601889 A CN 111601889A CN 201980008445 A CN201980008445 A CN 201980008445A CN 111601889 A CN111601889 A CN 111601889A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- unit
- tank
- aqueous medium
- liquid aqueous
- cell lysate
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 86
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 title claims abstract description 54
- 238000000926 separation method Methods 0.000 claims description 100
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 94
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 claims description 79
- 239000012736 aqueous medium Substances 0.000 claims description 78
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 73
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims description 71
- 238000002347 injection Methods 0.000 claims description 67
- 239000007924 injection Substances 0.000 claims description 67
- 230000003068 static effect Effects 0.000 claims description 60
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 46
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 claims description 43
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 claims description 38
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims description 34
- 230000006037 cell lysis Effects 0.000 claims description 25
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 21
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 21
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 claims description 21
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 claims description 19
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 claims description 19
- 239000012530 fluid Substances 0.000 claims description 14
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 13
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 claims description 12
- 239000003599 detergent Substances 0.000 claims description 12
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 claims description 12
- 230000005587 bubbling Effects 0.000 claims description 9
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 claims description 8
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M Acetate Chemical compound CC([O-])=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 7
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 7
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 6
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 claims description 5
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 4
- FGUUSXIOTUKUDN-IBGZPJMESA-N C1(=CC=CC=C1)N1C2=C(NC([C@H](C1)NC=1OC(=NN=1)C1=CC=CC=C1)=O)C=CC=C2 Chemical compound C1(=CC=CC=C1)N1C2=C(NC([C@H](C1)NC=1OC(=NN=1)C1=CC=CC=C1)=O)C=CC=C2 FGUUSXIOTUKUDN-IBGZPJMESA-N 0.000 claims description 3
- PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L Sodium Sulfate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]S([O-])(=O)=O PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 3
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 claims description 3
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 claims description 3
- -1 ion salts Chemical class 0.000 claims description 3
- KWGKDLIKAYFUFQ-UHFFFAOYSA-M lithium chloride Inorganic materials [Li+].[Cl-] KWGKDLIKAYFUFQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 3
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 claims description 3
- USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N Ammonium acetate Chemical compound N.CC(O)=O USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 239000005695 Ammonium acetate Substances 0.000 claims description 2
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 2
- 229940043376 ammonium acetate Drugs 0.000 claims description 2
- 235000019257 ammonium acetate Nutrition 0.000 claims description 2
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 claims description 2
- 229910001626 barium chloride Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 2
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 235000019341 magnesium sulphate Nutrition 0.000 claims description 2
- 230000001376 precipitating effect Effects 0.000 claims description 2
- 229910052938 sodium sulfate Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 235000011152 sodium sulphate Nutrition 0.000 claims description 2
- 229910001631 strontium chloride Inorganic materials 0.000 claims description 2
- AHBGXTDRMVNFER-UHFFFAOYSA-L strontium dichloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Sr+2] AHBGXTDRMVNFER-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 2
- 239000011592 zinc chloride Substances 0.000 claims description 2
- JIAARYAFYJHUJI-UHFFFAOYSA-L zinc dichloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Zn+2] JIAARYAFYJHUJI-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 2
- 230000002934 lysing effect Effects 0.000 claims 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 abstract description 21
- 238000011084 recovery Methods 0.000 abstract description 14
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 68
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 46
- 238000010908 decantation Methods 0.000 description 27
- 238000005352 clarification Methods 0.000 description 26
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 23
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 23
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 17
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 17
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 15
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 14
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 13
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 9
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 9
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 8
- 230000033001 locomotion Effects 0.000 description 8
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 8
- 238000007667 floating Methods 0.000 description 7
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 7
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 7
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 7
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000012266 salt solution Substances 0.000 description 6
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000005188 flotation Methods 0.000 description 5
- 239000012465 retentate Substances 0.000 description 5
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 4
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 4
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 4
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 description 4
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 4
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 4
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 4
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 4
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- 238000005336 cracking Methods 0.000 description 3
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 3
- 230000005484 gravity Effects 0.000 description 3
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 3
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 3
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 3
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 3
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 3
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 3
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 3
- GNFTZDOKVXKIBK-UHFFFAOYSA-N 3-(2-methoxyethoxy)benzohydrazide Chemical compound COCCOC1=CC=CC(C(=O)NN)=C1 GNFTZDOKVXKIBK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 2
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 2
- CBENFWSGALASAD-UHFFFAOYSA-N Ozone Chemical compound [O-][O+]=O CBENFWSGALASAD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000012670 alkaline solution Substances 0.000 description 2
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000010923 batch production Methods 0.000 description 2
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 2
- 238000011210 chromatographic step Methods 0.000 description 2
- 238000010924 continuous production Methods 0.000 description 2
- 239000012527 feed solution Substances 0.000 description 2
- 238000002513 implantation Methods 0.000 description 2
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 2
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 2
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 2
- HEGSGKPQLMEBJL-RKQHYHRCSA-N octyl beta-D-glucopyranoside Chemical compound CCCCCCCCO[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O HEGSGKPQLMEBJL-RKQHYHRCSA-N 0.000 description 2
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 2
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 2
- 238000005086 pumping Methods 0.000 description 2
- 238000004062 sedimentation Methods 0.000 description 2
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 2
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 2
- WMFHUUKYIUOHRA-UHFFFAOYSA-N (3-phenoxyphenyl)methanamine;hydrochloride Chemical compound Cl.NCC1=CC=CC(OC=2C=CC=CC=2)=C1 WMFHUUKYIUOHRA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UMCMPZBLKLEWAF-BCTGSCMUSA-N 3-[(3-cholamidopropyl)dimethylammonio]propane-1-sulfonate Chemical compound C([C@H]1C[C@H]2O)[C@H](O)CC[C@]1(C)[C@@H]1[C@@H]2[C@@H]2CC[C@H]([C@@H](CCC(=O)NCCC[N+](C)(C)CCCS([O-])(=O)=O)C)[C@@]2(C)[C@@H](O)C1 UMCMPZBLKLEWAF-BCTGSCMUSA-N 0.000 description 1
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 description 1
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M Chloride anion Chemical compound [Cl-] VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 108091005461 Nucleic proteins Proteins 0.000 description 1
- 239000000159 acid neutralizing agent Substances 0.000 description 1
- 238000013019 agitation Methods 0.000 description 1
- 239000001166 ammonium sulphate Substances 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M caesium chloride Chemical compound [Cl-].[Cs+] AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 1
- 239000008004 cell lysis buffer Substances 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 238000012864 cross contamination Methods 0.000 description 1
- 238000007872 degassing Methods 0.000 description 1
- 230000000593 degrading effect Effects 0.000 description 1
- 239000003398 denaturant Substances 0.000 description 1
- 229960003964 deoxycholic acid Drugs 0.000 description 1
- 230000003544 deproteinization Effects 0.000 description 1
- 238000011026 diafiltration Methods 0.000 description 1
- 239000006185 dispersion Substances 0.000 description 1
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 1
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N ethidium bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960005542 ethidium bromide Drugs 0.000 description 1
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 238000000265 homogenisation Methods 0.000 description 1
- 239000012633 leachable Substances 0.000 description 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 239000011859 microparticle Substances 0.000 description 1
- 239000012229 microporous material Substances 0.000 description 1
- 230000006911 nucleation Effects 0.000 description 1
- 238000010899 nucleation Methods 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 150000002989 phenols Chemical class 0.000 description 1
- 238000009428 plumbing Methods 0.000 description 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 1
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- ROSDSFDQCJNGOL-UHFFFAOYSA-N protonated dimethyl amine Natural products CNC ROSDSFDQCJNGOL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000011535 reaction buffer Substances 0.000 description 1
- 238000010008 shearing Methods 0.000 description 1
- FHHPUSMSKHSNKW-SMOYURAASA-M sodium deoxycholate Chemical compound [Na+].C([C@H]1CC2)[C@H](O)CC[C@]1(C)[C@@H]1[C@@H]2[C@@H]2CC[C@H]([C@@H](CCC([O-])=O)C)[C@@]2(C)[C@@H](O)C1 FHHPUSMSKHSNKW-SMOYURAASA-M 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000011179 visual inspection Methods 0.000 description 1
- 239000002699 waste material Substances 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
- C12N15/1003—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01F—MIXING, e.g. DISSOLVING, EMULSIFYING OR DISPERSING
- B01F33/00—Other mixers; Mixing plants; Combinations of mixers
- B01F33/40—Mixers using gas or liquid agitation, e.g. with air supply tubes
- B01F33/403—Mixers using gas or liquid agitation, e.g. with air supply tubes for mixing liquids
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B03—SEPARATION OF SOLID MATERIALS USING LIQUIDS OR USING PNEUMATIC TABLES OR JIGS; MAGNETIC OR ELECTROSTATIC SEPARATION OF SOLID MATERIALS FROM SOLID MATERIALS OR FLUIDS; SEPARATION BY HIGH-VOLTAGE ELECTRIC FIELDS
- B03D—FLOTATION; DIFFERENTIAL SEDIMENTATION
- B03D1/00—Flotation
- B03D1/14—Flotation machines
- B03D1/1431—Dissolved air flotation machines
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B03—SEPARATION OF SOLID MATERIALS USING LIQUIDS OR USING PNEUMATIC TABLES OR JIGS; MAGNETIC OR ELECTROSTATIC SEPARATION OF SOLID MATERIALS FROM SOLID MATERIALS OR FLUIDS; SEPARATION BY HIGH-VOLTAGE ELECTRIC FIELDS
- B03D—FLOTATION; DIFFERENTIAL SEDIMENTATION
- B03D1/00—Flotation
- B03D1/14—Flotation machines
- B03D1/24—Pneumatic
- B03D1/242—Nozzles for injecting gas into the flotation tank
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
- C12M45/00—Means for pre-treatment of biological substances
- C12M45/06—Means for pre-treatment of biological substances by chemical means or hydrolysis
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
- C12M47/00—Means for after-treatment of the produced biomass or of the fermentation or metabolic products, e.g. storage of biomass
- C12M47/06—Hydrolysis; Cell lysis; Extraction of intracellular or cell wall material
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/06—Lysis of microorganisms
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B03—SEPARATION OF SOLID MATERIALS USING LIQUIDS OR USING PNEUMATIC TABLES OR JIGS; MAGNETIC OR ELECTROSTATIC SEPARATION OF SOLID MATERIALS FROM SOLID MATERIALS OR FLUIDS; SEPARATION BY HIGH-VOLTAGE ELECTRIC FIELDS
- B03D—FLOTATION; DIFFERENTIAL SEDIMENTATION
- B03D2203/00—Specified materials treated by the flotation agents; Specified applications
- B03D2203/003—Biotechnological applications, e.g. separation or purification of enzymes, hormones, vitamins, viruses
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
- Sustainable Development (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Virology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本发明涉及用于纯化和回收一种或多种染色体外核酸序列的新设备和新方法。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及从污染物和杂质中纯化多核苷酸序列的方法和设备，所述多核苷酸序列优选是选自由以下组成的组的一种或多种染色体外核酸序列：DNA质粒、粘粒、BAC、YAC、MAC、微型质粒和微型环。
背景技术和技术现状
多核苷酸的纯化一般从能够产生大量这些多核苷酸的宿主细胞中获得(这可能是在基因工程之后)。
已知，通过连续的纯化步骤(包括但不限于选择性沉淀、沉降、过滤和在色谱柱上的特异性保留)，可裂解革兰氏阴性细菌(例如大肠杆菌)的生物量，并将其目的核苷酸序列，特别是染色体外核酸序列与批量基因组核酸和蛋白质分离。
然而，根据所遵循的方案，这些目的核酸序列与污染物(或杂质)(如内毒素、酚、氯化铯、溴化乙锭、
结合的蛋白或其他核酸)组合。
由于高纯度的核苷酸序列，特别是染色体外的核酸序列，在实验室中或用于临床目的的特殊用途是需要的，因此提出了若干种减少污染物量的尝试。
通常，用于分离它们的方法涉及细胞裂解步骤，其中添加碱、表面活性剂或酶，然后与中和溶液混合，并且最终与沉淀溶液混合，以从溶液中回收与沉淀的污染细胞组分(基因组DNA、蛋白质和蛋白质-核复合物)分离的一种或多种染色体外序列。
然而，使用碱性溶液、表面活性剂、加热步骤和/或一个或多个长程序将降解这些核苷酸序列。此外，包括这些一种或多种染色体外核酸序列的DNA分子对机械应力敏感。此外，高粘性溶液可能导致局部异质性或需要大量混合，两者都具有降解这些核苷酸序列的潜力。当使用二价金属的浓氯化物(如CaCl2)溶液时尤其如此。
已知分批方法存在污染和/或异质性的风险，特别是在大规模的情况下。
文献WO 2010/0136503描述了一种用于有效纯化DNA质粒的方法和设备，其中DNA质粒污染物的沉淀是通过在通道中将崩解的细胞与含有一种或多种盐(如CaCl2)的溶液混合，并通过随后通过重力倾析从溶液中分离沉淀物而获得的。
在该方法和设备中，通过在管件元件中诱导文丘里效应的手段的集成，获得崩解的细胞和盐的有效混合以及随后的沉淀。这种文丘里效应是通过管件元件中的内径减小约40％而获得的。术语“诱导文丘里效应”是指从使用的系统获得的流动中的紊流，其中层流中的流体被迫以这样的程度进入缩小的管件中，所述程度使得流体具有增加的速度，并且在缩小的直径之后刚好引起凹陷。
在管件元件中产生的文丘里效应导致在不降解DNA质粒和不在液体中产生高剪切力的情况下获得的有效混合。因此，已知在重搅拌力或重剪切力下没有发生DNA分子的降解，鉴于在所述方法中观察到5M CaCl2溶液的高粘度，这是必要的。然而，这种需要整合用于诱导文丘里效应的手段的方法和设备专用于生产数克质粒，并且不足以将生产提高到更大量的染色体外核酸序列，即数千克至数吨。
专利申请EP 811055-B1、WO 99/37750和WO 00/05358描述了细胞裂解的方法和设备，其中将细胞与裂解溶液混合到具有足够直径长度并且优选圆形轮廓的小管件或静态混合器中以获得这种裂解。
此外，在科学文献中描述了各种手段和步骤，以提高从细胞中提取的核酸的纯化步骤的收率和效率。例如，专利US 5,096,818-B2披露了一种用于从细胞培养基中分离和纯化核酸序列的方法，所述方法通过在不混合的情况下将裂解/变性剂和脱蛋白和/或中和剂添加到重悬浮的细胞中，然后进行第一离心，使细胞碎片部分地沉淀，然后混合溶液以最终完成裂解，然后进行第二离心，使细胞碎片完全沉淀。由于设备的限制，这种离心方法不适合大规模工艺，导致生产收率不足。
欧洲专利EP 1 593 741-B1披露了生产含有一种或多种染色体外核酸序列的微生物澄清裂解物的方法，所述方法通过将含有这些核酸序列的微生物悬浮液与反应缓冲液混合，使混合物反应足够的时间以破坏微生物，将获得的混合物转移到包含中和缓冲液的容器中以与待去除的污染物形成沉淀，并通过使气体通过容器底部分散而产生气泡以使沉淀与裂解物(未沉淀的液体级分)分离。由于中和缓冲液不是连续添加的而是从裂解开始所需要的总量就存在于悬浮液中，其在悬浮液中的浓度(因此悬浮液中可用的中和能力)随工艺时间而变化，这导致工艺的可变性。另一个限制是，由于系统设计和批处理，不能容易地处理非常大量的细胞。
专利US 8,158,348-B2；US 7,771,945-B2和US 7,314,746-B2披露了用于纯化DNA质粒的方法和设备，其包括在细胞裂解步骤期间添加带有裂解介质的气体微泡，以提高目的DNA质粒的回收。如这些美国专利的图5所示，鉴于分离后得到的最终液相体积，在裂解期间不同量的注入气体的相对效果不是很有效，并且表明在处理的非常长的延迟(约16小时)之后，回收的液体可溶级分的量仅为60％或更低。
发明目的
本发明涉及一种方法和设备，其没有呈现并解决了现有技术的方法和设备的缺点。
本发明的一个优选目的是获得廉价、稳健和简化的方法和设备，用于特别是通过改善的分离(倾析或澄清)步骤，有效和快速地从其杂质(或污染物)纯化一种或多种目的染色体外核酸序列，特别是纯化大量的一种或多种目的染色体外核酸序列，特别是以大于现有技术的方法和设备所获得的一个或多个量的量。
本发明的另一个目的是获得一种新的方法和设备，其允许完全或几乎完全回收含有一种或多种目的染色体外核酸序列的液体澄清细胞裂解物，并且其中所获得的液体澄清细胞裂解物包含较少或不被从沉淀物层获得的杂质(或污染物)污染的一种或多种染色体外核酸序列。
发明内容
在根据本发明的方法和设备中，通过术语“大约”或“大约”，其优选地是指高于或低于所述值的加或减20％或10％的值(例如，约5分钟是指从4分钟30秒到5分钟30秒的每一个值)。
本发明通过连续的生产和/或纯化步骤获得一种或多种目的染色体外核酸序列，优选DNA质粒(优选具有小于30,000个碱基(或碱基对)的大小)的方法包括以下步骤或由以下步骤组成：
a)任选地培养产生(参与合成)一种或多种目的序列的宿主细胞(优选重组宿主细胞)，并收获这些含有目的序列的细胞，优选含有该目的DNA质粒的细胞；
b)在细胞裂解单元中崩解这些细胞，优选通过将细胞连续引入通道中，该连续引入是在流动装置中连续供给细胞，其中优选通过将(碱性)裂解介质添加到细胞裂解单元中的细胞来获得该崩解；
c)在中和单元中借助中和溶液中和所述裂解的细胞(包括一种或多种目的染色体外核酸序列)，该中和溶液优选地被添加有并且优选地由乙酸/乙酸盐组合物构成，以产生包含可溶性级分(包含一种或多种目的染色体外核酸序列，特别是目的DNA质粒)和沉淀物的细胞裂解物混合物，该沉淀物包含一种或多种目的序列的污染物和/或杂质；
d)任选地(进一步)通过混合所述细胞裂解物混合物(由步骤c)获得)沉淀一种或多种目的染色体外核酸序列的这些污染物和/或杂质，特别是目的DNA质粒的这些污染物和/或杂质，以有利地纯化该混合物。该(进一步)沉淀通过包括在浓度为(约)2M和(约)6M之间的溶液中以连续方式向优选地崩解的细胞裂解物混合物中添加一种或多种优选水合的盐来进行，其中所述一种或多种盐选自由以下组成的组(包括)：(优选水合的)CaCl2，(优选水合的)MgCl2，(优选水合的)ZnCl2，(优选水合的)SrCl2，(优选水合的)BaCl2或(较不优选的)其他的一种或多种(优选水合的)盐，例如LiCl、乙酸铵、硫酸铵、硫酸钠或硫酸镁，其中优选的盐是(优选水合的)CaCl2和/或(优选水合的)MgCl2；
e)在分离(倾析或澄清)罐中收集由步骤c)或由步骤d)获得的所述细胞裂解物混合物；
f)使包含在所述细胞裂解物混合物中的所述可溶性级分(包含一种或多种目的染色体外核酸序列，特别是目的DNA质粒)与所述沉淀(包含污染物或杂质)分离(使所述可溶性级分倾析或澄清)；该分离步骤优选具有包括在(约)5分钟和数小时之间的持续时间；更优选包括在(约)15分钟和(约)2小时之间。该分离步骤有利地在称为分离(倾析或澄清)罐的罐或储器中进行；
g)优选通过泵出从所述分离罐回收所述分离的可溶性级分，所述可溶性级分包括在来自该分离罐的该细胞裂解物混合物中存在的一种或多种目的染色体外核酸序列，特别是目的DNA质粒；
h)任选地在一个或多个具有包括在(约)0.2μm和(约)20μm之间的孔径的过滤器上对所获得的可溶性级分进行一个或多个进一步的分离步骤、倾析步骤和/或过滤步骤，优选随后在(约)30kDa膜至(约)500kDa膜上，优选在(约)50和(约)250kDa之间，更优选在(约)50和(约)100kDa之间的超滤步骤，以获得包含所述一种或多种目的染色体外核酸序列，优选目的DNA质粒的第一膜滞留物；
i)任选地对来自步骤g)的可溶性级分或来自步骤h)的第一膜滞留物进行(精制步骤)色谱，所述可溶性级分或一膜滞留物包含回收的一种或多种染色体外核酸序列，优选目的DNA质粒，该色谱步骤任选地包括洗涤子步骤以获得色谱洗脱液；
j)任选地在(约)3kDa至(约)100kDa膜上对来自步骤i)的色谱洗脱液进行超滤，并收集获得的第二滞留物；以及任选地在(约)0.2μm膜上对所述第二滞留物进行(甚至进一步)过滤，以在滤液中回收和收集从其杂质(或污染物)纯化的所述一种或多种目的染色体外核酸序列，优选所述目的DNA质粒。
术语“可溶性级分”(例如细胞裂解物的可溶性级分)是指通过本发明的方法和设备回收的细胞裂解物混合物的液体和可溶性级分，其中该可溶性级分可以从沉淀物层分离、倾析或澄清，所述沉淀物层可以包括漂浮在液体裂解物混合物中和上方的絮体，并且其中该沉淀物层可以包括或含有待回收和纯化的一种或多种目的染色体外核酸序列的杂质(或污染物)。在下文中，这种分离、倾析和/或澄清后得到的可溶性级分也称为“澄清相”。分离步骤、即倾析步骤和/或澄清步骤，优选基于经典的连续工艺步骤，但也可以根据分批工艺进行，而不是添加连续供给的进料。
术语“一种或多种染色体外核酸序列”，其是指超过50个碱基(碱基对)的任何核苷酸序列。更优选地，所述染色体外核酸序列选自包含以下的组(由以下组成的组)：DNA质粒、粘粒、BACS、YAC、MAC、微型质粒和微型环，优选(DNA)质粒，例如大小小于30000碱基对的(DNA)质粒。
根据本发明，分离步骤f)包括至少一次将包含溶解气体的液体水性介质注入到包含在分离(倾析或澄清)罐中的细胞裂解物混合物中。该注入在细胞裂解期间或裂解的细胞的中和期间都不进行。所述液体水性介质可以通过在升高的压力下将气体溶解在液体水性介质中来获得。出人意料地发现，将包含足够量的溶解气体的液体水性介质注入到细胞裂解物混合物中改善了包含目的染色体外核酸序列的可溶性级分和沉淀物之间的分离(倾析或澄清)步骤的收率，该分离步骤是在上述分离罐中进行的。所述改善的分离收率显著改善了回收的可溶性级分的量，特别是回收的一种或多种目的核酸序列的量。在不存在所述注入的情况下，沉淀物层保持浸没在可溶性级分中，截留了显著体积的该可溶性级分，其在回收步骤g)期间损失。由于沉淀物颗粒之间的空间充满气体而不是(液体)可溶性级分，因此所述注入实现了沉淀物层在可溶性级分之上的漂浮。
有利地，通过将气体(优选选自由空气、CO2、氧、臭氧、氮或其混合物组成的组的气体)溶解到液体水性介质(例如水)中来获得包含足够量的溶解气体的液体水性介质。优选地，通过鼓泡手段将该气体溶解在液体水性介质中。有利地，该溶解在高于大气压的压力下进行，例如至少1表压(barg)，优选在(约)2表压和(约)50表压之间，优选在(约)3表压和(约)25表压之间，优选在(约)4表压和(约)15表压之间的压力。通过这样做，可以获得液体水性介质中较高浓度的溶解气体(亨利定律(Henry’s law))。液体水性介质中的溶解气体的浓度有利地接近饱和浓度，例如液体水性介质中的溶解气体的浓度达到指示压力下饱和浓度的至少50％，有利地达到饱和浓度的至少60％、至少70％、至少80％、至少90％。有利地，液体水性介质被溶解气体饱和。液体水性介质优选在高于(约)2表压的压力(优选包括在(约)2表压和(约)50表压之间，更优选在(约)3表压和(约)25表压之间)下在气体方面饱和。有利地，注入细胞裂解物混合物中的包含溶解气体的液体水性介质的体积量与被处理的细胞裂解物混合物的体积(例如，罐中细胞裂解物混合物的总体积)相比，包括在(约)0.2％v/v和(约)25％v/v之间，优选在(约)0.5％v/v和(约)15％之间，更优选在(约)1％v/v和(约)10％之间，注入一次或多次。
优选地，在将包含溶解气体的液体水性介质注入到细胞裂解物混合物中之前，将包含溶解气体的液体水性介质制备到储器或罐中。
有利地，包含溶解气体的液体水性介质在高于大气压的压力下注入到细胞裂解物混合物中，所述细胞裂解物混合物有利地在大约大气压附的压力下注入。有利地，这种液体水性介质在与气体溶解的压力基本相同的压力下注入。优选的注入压力为至少(约)2表压，优选在(约)3表压和(约)50表压之间，优选在(约)4表压和(约)15表压之间。有利地将液体水性介质间歇地注入到细胞裂解物混合物中。这意味着两个连续注入周期之间的静态休止周期有利地至少具有持续时间，所述持续时间等于在该静态休止周期之前和之后的注入周期的持续时间。例如，进行注入的时间周期(注入周期)在(约)5秒和(约)10分钟之间，更优选为在(约)5秒和(约)5分钟之间。两个连续注入周期之间的静态休止周期有利地在(约)5秒和(约)10分钟之间，有利地至少等于注入周期的持续时间。
根据本发明，在存在于分离(倾析或澄清)罐中的细胞裂解物混合物中注入包含溶解气体的液体水性介质可以是单次注入或间歇注入的一系列一次或多次连续注入。包含溶解气体的液体水性介质的间歇注入，随后是静态休止期，这样允许在静态休止时间期间沉淀物上升和可溶性级分澄清。同时，气泡取代了截留在沉淀物层的絮体内的可溶性级分，导致沉淀物层漂浮在可溶性级分之上，而不是沉淀物浸没在可溶性级分中。结果，可回收更大体积的可溶性级分。
用于本发明的方法和整合在设备中的宿主细胞是原核细胞，例如细菌，特别是大肠杆菌细胞。
优选地，在根据本发明的方法中，步骤b)包括将细胞与添加的(碱性)裂解介质混合。优选地，混合在静态混合器中进行，该静态混合器优选包括至少6个混合元件，优选在12个混合元件和24个混合元件之间，更优选18个混合元件。优选地，混合线速度等于或高于150cm/min；优选地包括在(约)150cm/min和(约)2000cm/min之间，更优选地包括在(约)500cm/min和(约)1500cm/min之间。
优选地，在根据本发明的方法中，步骤c)包括将细胞裂解物混合物与中和溶液混合。优选地，混合在静态混合器中进行，该静态混合器优选包括至少4个混合元件，优选在6个混合元件和16个混合元件之间，更优选10个混合元件。优选地，混合线速度等于或高于100cm/min，优选地包括在(约)100cm/min和(约)2000cm/min之间，更优选地包括在(约)340cm/min和(约)1025cm/min之间。
优选地，在根据本发明的方法中，步骤d)包括将由步骤c)获得的细胞裂解物混合物与一种或多种盐混合。优选地，混合在静态混合器中进行，该静态混合器优选包括至少2个混合元件，优选在2个混合元件和18个混合元件之间，更优选4个混合元件。优选地，混合线速度等于或高于100cm/min，优选地包括在(约)100cm/min和(约)1500cm/min之间，更优选地在(约)400cm/min和(约)1200cm/min之间。
在本发明的方法和设备中，细胞优选保持在悬浮液中，并通过添加(碱性)裂解介质而崩解。
根据本发明，用于崩解细胞的裂解介质可以是pH值包括在(约)11和(约)12.5之间，优选pH值包括在(约)12和(约)12.5之间的碱性溶液。裂解介质可包含足够量的一种或多种洗涤剂。
在根据本发明的方法和设备中，(碱性)裂解介质可以通过将至少足够量的NaOH与足够量的至少一种洗涤剂混合来获得。在根据本发明的方法和设备中，本领域技术人员根据需要裂解的细胞的一个或多个量来选择足够量的NaOH和洗涤剂。更优选地，混合可以通过将足够量的每种反应性产物溶液(NaOH和至少一种洗涤剂)引入静态混合器中并在将该(碱性)裂解介质添加到细胞中之前混合所述组分以形成(碱性)裂解介质来进行。所述静态混合器优选包括至少至少6个混合元件，优选在12个混合元件和24个混合元件之间，更优选18个混合元件。优选地，混合线速度等于或高于100cm/min。
所述(碱性)裂解介质可包含(约)0.01％和(约)5％之间，优选(约)0.1％和(约)3％之间，更优选(约)0.5％和(约)3％(w∶v)之间的一种或多种洗涤剂。优选地，洗涤剂选自由以下组成的组：十二烷基硫酸钠(SDS)、脱氧胆酸钠、
X-100、
X-114、
P-40、辛基-葡萄糖苷、
35、
56、
20、CHAPS(3-[(3-胆酰胺丙基)二甲基铵基]-1-丙磺酸)或其混合物。
有利地，在该工艺的崩解步骤(步骤b))中，使细胞与(碱性)裂解介质混悬。优选地，细胞和(碱性)裂解介质之间的最佳接触时间包括在(约)15秒和(约)15分钟之间，优选在(约)0.5分钟和(约)5分钟之间，更优选(约)2分钟。
优选地，中和溶液是pH值包括在(约)5.0和(约)6.0之间，优选为(约)5.5的乙酸/乙酸盐溶液。优选地，中和溶液具有约3M(mol/L)乙酸盐和约15％(v∶v)乙酸的浓度。
优选地，将中和溶液，特别是上述乙酸/乙酸盐溶液从室温冷却到包括在(约)2℃和(约)8℃之间的温度，优选为(约)4℃。该步骤通过本领域技术人员公知的方法获得，优选通过将缓冲液储存在冷室中足够长的时间，或者通过使用连接到围绕携带中和溶液的管件元件的热交换器的足够的低温恒温器。
有利地，包含目的染色体外核酸序列的裂解的细胞与中和溶液的最佳接触时间包括在(约)15秒和(约)5之间，优选(约)30秒和(约)2分钟之间，更优选(约)1分钟。
有利地，中和的裂解物和沉淀溶液的最佳接触时间多于1分钟，该时间段适合于获得所需的沉淀。
有利地，根据本发明的方法的步骤f)的分离(倾析或澄清)的最佳时间包括在(约)5分钟和数小时之间，优选在(约)15分钟和(约)2小时之间。
本发明的方法可任选地包括步骤a)和步骤b)之间的预备步骤，所述预备步骤包括以下(或由以下组成)：向包含一种或多种目的染色体外核酸序列的(整个)细胞悬浮液中添加足够量的RNA酶。所添加的RNA酶的量由本领域技术人员根据待纯化的一种或多种目的序列的类型和量来定义，并且该RNA酶处理对于具有小于3000个碱基(碱基对)的大小的质粒DNA的纯化特别有用。
根据本发明的方法的优选添加的水合盐是CaCl2.5H2O，其以包括在(约)2M和(约)6M之间的浓度添加，优选以约5M的浓度添加。
在本发明的方法或设备中，通过入口/出口、泵或阀的打开和关闭来执行连续工艺或连续添加步骤，并且这些泵的输出有利地通过称量本发明的进料溶液的罐、储器、小瓶或接收器或通过将流量计集成到连接这些罐的一个或多个管件来控制。
在本发明的方法和设备中，过滤步骤是在深度过滤器或表面过滤器上完成。
任选存在于本发明方法中的色谱步骤(步骤i))包括以下(或由以下组成)：一个或多个本领域技术人员公知的经典纯化步骤。
任选地，在该洗涤子步骤之后和在洗脱子步骤之前，可以用补充有一种或多种中性洗涤剂的相同溶液进行另一洗涤子步骤。优选地，该中性洗涤剂选自由以下组成的组：
X-100、
X-114、
20、
P-40、辛基葡萄糖苷、
35、
56或其混合物。优选地，所述中性洗涤剂以(约)0.1％至(约)1％存在于溶液中。在该任选的第二洗涤子步骤之后可以接着进一步的洗涤子步骤，并且该进一步的子步骤优选地在不存在任何中性洗涤剂的情况下进行。
本发明的方法和设备允许生产和纯化大量的一种或多种目的染色体外核酸序列，从少于一克到数百克、数千克、直至数吨。然而，在根据本发明的工艺中，任选的沉淀步骤(步骤d))可以在步骤h)至j)之前或之后被其他纯化步骤取代，以获得所需纯度的一种或多种目的染色体外核酸序列。
本发明还涉及用于执行根据本发明的方法的设备。本发明的设备包括以下(或由以下组成)：用于获得连续流的手段，例如圆管或管件元件，其可能连接到合适的罐、一个或多个储器、小瓶或一个或多个接收器并且具有入口或开口手段和出口或离口手段。
有利地，设备的一个或多个管件符合用于人类医学的要求，特别是符合药品质量的要求，并且优选地是不可浸出的并且通过“Y型连接”连接。
本发明的设备包括或优选地由以下组成：
-制备单元，其包括一个或多个包含(碱性)裂解介质化合物的罐，所述一个或多个罐包括一个或多个出口，所述一个或多个罐优选地经由一个或多个管件流体地连接到细胞裂解单元的入口，该入口优选不同于用于将细胞从细胞悬浮液罐引入到细胞裂解单元的入口，
-细胞裂解单元，所述细胞裂解单元包括细胞悬浮液罐，所述细胞悬浮液罐包含具有一种或多种目的染色体外核酸序列的细胞，所述细胞裂解单元包括至少一个入口，所述至少一个入口优选地经由一个或多个管件流体地连接到所述细胞悬浮液罐和所述制备单元的一个或多个出口，所述细胞裂解单元还包括至少一个出口，所述至少一个出口优选地经由一个或多个管件流体地连接到中和单元的一个或多个入口，
-中和单元，所述中和单元包括中和介质罐、至少一个入口和至少一个出口或离口，所述入口优选地经由一个或多个管件流体地连接到所述中和介质罐并连接到所述细胞裂解单元的一个或多个出口或一个或多个离口，并且所述一个或多个出口流体地连接到分离(倾析或澄清)单元的一个或多个入口或连接到任选的沉淀单元.
-任选地，沉淀单元，所述沉淀单元包括至少一个入口、至少一个出口或离口和包含盐溶液的罐，所述一个或多个入口优选地经由一个或多个管件流体地连接到包含盐溶液的罐并连接到所述中和单元的一个或多个出口或一个或多个离口，并且所述出口优选地经由一个或多个管件流体地连接到分离单元的入口，
-分离(倾析或澄清)单元，所述分离(倾析或澄清)单元包括用于细胞裂解物混合物的分离(倾析或澄清)罐，所述分离(倾析或澄清)罐具有至少一个入口和至少一个出口，所述一个或多个入口流体地连接到所述中和单元的出口，或视情况而定连接到所述沉淀单元的出口，所述分离罐优选包括用于从所述细胞裂解物混合物中回收包含一种或多种目的染色体外核酸序列的可溶性级分的手段，以及
-注入单元，特别是漂浮单元，其包括用于在高于大气压的压力下将气体溶解在液体水性介质中的手段和用于将包含溶解气体的液体水性介质注入所述分离罐中的手段。
优选地，液体水性介质是水，并且该液体水性介质有利地被溶解气体饱和，该气体优选地是空气、CO2、N2、O2、臭氧或其混合物。更优选地，用于将包含溶解气体的液体水性介质注入分离罐中的手段包括至少一个具有离口的注入管道，优选朝向分离(倾析或澄清)罐的底表面定向的离口喷嘴。优选地，离口，优选地是离口喷嘴设置在分离罐中从罐底表面测量的高度处，所述高度包括在罐总高度的(约)1/6和(约)5/6之间，更优选地包括在罐总高度的(约)1/4和(约)2/4之间。这种位置有利地避免了已经被分离的沉淀污染物和杂质的再悬浮。
优选地，用于将气体溶解在液体水性介质中的手段包括液体水性介质罐，优选水罐和鼓泡装置。该鼓泡装置优选地包括连接到气体容器的管件(tubing)，例如管道(pipe)，并且优选地，流量计也连接到管件，并且泵流体地连接在管件和该气体容器之间。所述鼓泡装置提供来自所述气体容器的气体到所述液体水性介质中的受控鼓泡，以获得包含溶解气体的液体水性介质。优选地，该鼓泡装置构造成在高于或等于1表压，优选在2表压和50表压之间，优选在3表压和25表压之间的压力下并且有利地以与待处理的细胞裂解物混合物的体积相比包括在(约)5％和(约)20％v/v之间的体积将气体注入液体水性介质罐中。
在根据本发明的设备中，液体水性介质注入管道内径与其离口喷嘴直径之间的比率可以是(约)1或接近1的值，但优选地高于(约)3，更优选地高于(约)5，但优选地低于50。这种特定的注入管道和喷嘴组合确保在注入包含溶解气体的液体水性介质期间，注入管道内部的压力不会下降到初始值的90％以下。这防止了注入管道内而不是细胞裂解物混合物内的早期脱气，并改善了纯化的质量和数量。在将包含溶解气体的液体水性介质注入到保持在大气压下的分离罐中之后，液体水性介质失去其溶解气体，这在细胞裂解物混合物中产生平均直径小于或等于1.5mm，优选小于或等于1mm或甚至小于或等于0.5mm的(雾状)(微)气泡。
在根据本发明的设备中，注入单元的注入管道与入口分离，所述入口通向分离单元或罐与中和单元或沉淀单元的一个或多个出口之间的管件。因此，包含溶解气体的含水液体介质经由与细胞裂解物混合物的入口相比单独的入口或管件被注入分离罐中。
根据本发明的设备还可以包括公知的混合元件，例如产生文丘里效应的手段(即，如在本文中通过引用描述的国际专利申请WO 2010/0136503中所述)，任选地与用于有效地混合流体的一个或多个静态混合器组合。
在根据本发明的设备中，所述制备单元包括包含裂解介质的单个罐或包含其不同组分的两个或更多个分离罐，所述一个或多个罐通过第一(组)管件，经由一个(或若干个)泵、优选包括至少6个混合元件的第一静态混合器连接到细胞裂解单元，该第一静态混合器具有入口和出口或离口，其中该入口连接到来自(碱性)裂解介质或其分离组分的一个或多个泵的一个或多个管件，并且其中所述出口或离口经由第二管件或更多个管件连接到细胞裂解单元。选择第一静态混合器的尺寸(即，引入的混合元件的数量，以及该第一静态混合器的直径和长度以及一个或多个泵的一个或多个输出，以允许引入第一静态混合器的元件的优选高于100cm/min的混合线速度。
根据本发明的设备还可以包括由第二静态混合器(优选为包括12和24个之间的混合元件，优选18个混合元件的第二静态混合器)制成的细胞裂解单元，该第二静态混合器具有入口和出口或离口，所述入口通过一个或多个第二管件连接到制备单元的出口，并且经由第三管件或更多个管件和泵连接到包含细胞悬浮液的细胞悬浮液槽的出口，并且所述第二静态混合器的出口或离口连接到第四管件或更多个管件。选择第二静态混合器和泵输出的尺寸以允许引入第二静态混合器的溶液的包括在(约)1000cm/min和(约)1500cm/min之间的混合线速度。
根据本发明的设备还可以包括第三静态混合器，优选为包括6个混合元件和16个混合元件之间，优选10个混合元件的第三静态混合器，该第三静态混合器具有入口和出口或离口，所述入口连接到来自细胞裂解单元的出口的第四管件，并且经由第五管件和泵连接到中和介质罐，所述第三静态混合器的出口或离口连接到第六管件或更多个管件。选择第三静态混合器和泵输出的尺寸以允许引入第三静态混合器的溶液的优选包括在(约)340cm/min和(约)1025cm/min之间的混合线速度。
根据本发明的设备还可以包括第四静态混合器，优选为包括4和18个之间的混合元件的第四静态混合器，该第四静态混合器具有入口和出口或离口，所述入口连接到来自中和单元的第六管件并经由第七管件和泵连接到包含(二价)盐溶液的罐，并且其中所述出口或离口经由第八管件连接到分离(或倾析)罐。选择第四静态混合器和泵输出的尺寸以允许引入第四静态混合器的溶液的优选包括在(约)400cm/min和(约)1200cm/min之间的混合线速度。
如图中所示的泵的位置也改善了处理效率，因为如图中所示的泵的相应位置可以有利地允许流体在一个或多个管件中的推动(流动)，而不是在这一个或多个管件中存在的流体的拉动，这意味着处理的产物不会受到发生在泵头部中的剪切力的冲击，所述剪切力会损坏产物并降低产物的质量。
优选地，本发明的设备还包括称重存在于不同罐、储器、袋或接收器中的所谓进料溶液(即中和溶液，裂解溶液......)的手段和/或包括一个或多个流量计，用于控制不同介质或细胞或细胞级分在一个或多个管件中的引入。这意味着本发明的方法可以包括连续执行的步骤和以一批接一批的顺序执行的步骤。优选地，中和步骤以一批接一批的顺序进行。
本发明的方法或设备的替代方案涉及所述的方法和设备，其包括所述的分离步骤和分离单元，而不注入包含溶解气体的液态水性介质并且没有用来注入包含溶解气体的液态水性介质的注入单元，但是其将与上述技术特征一起包括一个或多个上述静态混合器和一个或多个或所有混合步骤，所述混合步骤包括使用一个或多个静态混合器。
在作为非限制性优选实施例呈现的以下详细描述中，参考附图描述了根据本发明的方法和设备。
附图简要说明
图1示意性地表示本发明的设备。
图2和图3表示根据本发明的设备的分离单元的不同构造。
图4表示连接到根据本发明的设备的分离单元的注入单元。
图5表示连接到根据本发明的设备的分离单元的过滤单元。
图6表示用现有技术的方法和设备获得的分离结果。
图7表示用根据本发明的方法和设备获得的分离结果。
具体实施方式
图1示出了允许实施本发明方法的步骤的设备，所述设备是若干米长的管道或管，由具有圆形截面并且流体地连接(或联接)在一起的若干个管或管件元件制成，并且连接到静态混合器和罐或储器。
优选地，根据本发明的设备和方法专用于从细胞中回收和纯化一种或多种染色体外核酸序列，例如将从细胞杂质(或污染物)，特别是从大肠杆菌或污染物(如宿主细胞蛋白质、RNA序列、基因组DNA序列、内毒素......)中纯化的一种或多种DNA质粒。
用于根据本发明的方法的设备包括以下或由以下组成：流体地连接的若干个单元，所述若干个单元包括制备单元1、细胞裂解单元20、中和单元30、任选的沉淀单元40、分离(倾析或澄清)单元50、注入单元70和过滤单元。
此外，细胞裂解单元20可流体地连接到生产单元(包括图中未示出的反应罐)，但用于包含待回收的一种或多种目的染色体外核酸序列的细胞的生长和增殖。
在根据本发明的设备的通道中，流速跟踪通过计时计、重量监测和/或通过添加到不同的一个或多个管件的流量计获得，并且一个或多个管件之间的连接为“Y型”。
根据本发明的设备的第一部分是准备单元1，其可以呈现两种不同的形式。根据图中未示出的第一实施例，根据本发明的设备包含具有(碱性)裂解介质的裂解介质罐或储器，其通过第一管件和泵以及可能的流量计连接到裂解单元20，以将细胞与添加的(碱性)裂解介质混合。
根据本发明的另一个实施例并且如附图所示，制备单元1有利地由至少两个单独的罐(2和3)制成，均保持在室温下，第一罐2包含NaOH(RM2-A)，并且第二罐3包含一种或多种洗涤剂(RM2-B)，优选十二烷基硫酸钠(SDS)。
两个罐2和3优选地经由第一泵6和第二泵7分别与第一组管件元件4和5流体地连接，其中这些泵(6和7)控制每种反应产物(NaOH、洗涤剂和可能的一种或多种其他分子)的足够添加量，混合并供给到第一静态混合器9以形成裂解溶液。
存在于第一组管件(4和5)的管件中的反应性化合物在“Y型”连接中相遇，并经由入口或开口8被推入用于有效均匀混合所有引入的化合物的第一静态混合器9中，以形成裂解缓冲液(RM2缓冲介质)。这种混合确保了(碱性)裂解介质的稳定性和恒定的组成质量。均匀混合指根据肉眼观察是均匀的混合。
制备单元1的第一静态混合器9的出口或离口10经由第二管件11流体地连接到作为细胞裂解单元20的一部分的第二静态混合器22的入口或开口21。优选地，细胞裂解单元20的第二静态混合器22包括在12和24个之间的混合元件，优选18个混合元件。
细胞裂解单元20是上述通道，并且优选地包括第二静态混合器22，所述第二静态混合器22通过在其入口21处的“Y型”连接与制备单元1的第二管件11和细胞悬浮液罐25(经由第三管件23和泵24)处于流体连接，所述细胞悬浮液罐25在合适的温度下，优选地在包括在约2℃和约8℃之间的温度下包含具有有待回收的一种或多种染色体外核酸序列的悬浮的细胞。
通过将来自第一静态混合器9的细胞裂解缓冲液(优选为NaOH+SDS的混合物)和来自细胞悬浮液罐25的悬浮细胞添加到第二静态混合器22来进行裂解或细胞崩解。虽然崩解细胞产生的溶液是粘性的，但在不降解质粒的情况下获得了有效的匀化。
发明人已经优化了管件直径和长度以及泵输出，以便评估细胞和裂解缓冲液的最佳平均接触时间。他们开发的设备允许出人意料地短的平均接触时间，例如少于5分钟，优选在(约)1分钟和(约)5分钟之间，更优选(约)2分钟，这有利地防止一种或多种目的染色体外核酸序列(优选DNA质粒)的降解。
该第二静态混合器22的出口或离口26经由第四管件27(其具有足够的长度和直径，允许获得用于回收细胞裂解物的最佳接触时间)与中和单元30的特征流体地连接。
中和单元30包括含有中和介质(RM3)的中和罐31，所述中和介质优选由乙酸和乙酸盐的溶液制成，优选维持在包括在约5.0和约6.0之间，优选约5.5的pH，并且由3M乙酸盐和15％(v∶v)乙酸组成，优选在包括在2℃和8℃之间，优选约4℃的温度下使用。
该中和罐31经由第五管件32和泵33流体地连接到第三静态混合器35的入口或开口34。中和介质可以在使用之前通过将中和罐31存储在冷室内足够长的时间来冷却，或者通过低温恒温器36和围绕第五管件32的一部分的热交换器39以连续的方式从室温(包括在20℃和25℃之间)冷却到包括在2℃和8℃之间，优选约4℃的较低温度。
该第三静态混合器35的入口或开口34也与提供细胞裂解物的第四管件27流体地连接。优选地，该第三静态混合器35包括在6和16个之间的混合元件，优选地包括10个混合元件。
该第三静态混合器35的入口34优选地通过“Y型”连接与两个管件元件32和27流体地连接，使得两个流体流被送到静态混合器35以获得细胞裂解物的快速和有效的中和，从而停止裂解反应并形成中和的细胞裂解物。
发明人还优化了管件直径和长度以及泵输出，以便评估在中和下的裂解的细胞的最佳平均接触时间。所开发的设备允许较短的平均接触时间，例如少于3分钟，优选(约)0.5分钟至(约)3分钟，更优选(约)1分钟，这有利地导致在添加沉淀剂之前有效地中和裂解的细胞。
该第三静态混合器35的出口或离口37与收集所获得的中和的裂解物混合物的第六管件38处于流体连接。第六管件38可以定向并且流体连接到形成沉淀单元40的一部分的第四静态混合器41的入口或开口45。
第四静态混合器41的入口或开口45还经由泵43流体连接到第七管件42，连接到一种或多种二价盐溶液罐44(其包含一种或多种二价离子盐(优选水合氯化钙)的溶液(RM4))。
再次，优选在两个管件38和42之间使用“Y型”连接，使得两个流体流被送到第四静态混合器41以获得快速和有效的混合。从罐44经由第七管件42泵送到第四静态混合器41的入口45的一种或多种二价盐的溶液连续地添加到从第六管件38添加到第四静态混合器41中的中和的细胞裂解物中，以获得细胞裂解物混合物。该第四静态混合器41确保了致密和粘性溶液的充分混合，并改善了沉淀反应。然而，除了该静态混合器之外的其他手段，包括用于产生文丘里效应的手段，可用于有效地混合流体，包括从罐44获得的致密且粘性的一种或多种二价盐溶液。
该第四静态混合器41包括4个混合元件和18个混合元件之间，优选仅包括4个混合元件。可选择最佳数量的10个混合元件以有效地混合盐和中和的裂解的细胞以获得细胞裂解物混合物。然而，由于较高数量的混合元件将产生较小的颗粒和沉淀物，这些颗粒和沉淀在分离(倾析或澄清)期间不易从可溶性级分中消除，并且将降低生产和纯化收率并增加纯化时间。
第四静态混合器41的出口或离口46经由第八管件47流体连接到分离单元50的分离罐51。细胞裂解物混合物52从第四静态混合器41供给到分离罐51。将方便地注意到第四静态混合器41是任选的，并且管件38可以直接供应到分离(或倾析或澄清)单元50的分离罐51。
在根据本发明的设备中，分离单元50用于将细胞裂解物混合物52的一种或多种目的序列从杂质(或污染物)分离、倾析或澄清，并且改善了收率，特别是分离、倾析或澄清的延迟和效率，并改善了一种或多种目的染色体外核酸序列从该细胞裂解物混合物52中的回收。
图2和图3所示的分离单元50连接到图4所示的注入(漂浮)单元70，并且允许将液体水性介质更优选水注入分离罐51内部，所述液体水性介质包括大量的溶解气体，优选空气、氮气、CO2、氧或臭氧，更优选空气注入分离罐51。该液体水性介质与气体，优选空气一起保持在室温下，并在合适的压力(优选至少2表压的压力)下引入。
通过将该液体水性介质(优选包含饱和或接近饱和水平的溶解气体(优选选自由空气、CO2或氮气、或其混合物组成的组)的水)经由一个或多个具有离口54的注入管道53(可能包含喷嘴)注入到存在于分离罐51中的细胞裂解物混合物52中，可以有效地改善分离、倾析或澄清。该注入管道53的离口54设置在与存在于分离罐51中的细胞裂解物混合物52的表面55相对的方向上，并朝向分离罐51的底表面58或朝分离罐51的底表面58的方向。
如图3所示，倾析单元50的构造可包括分离罐51，其中引入多于一个的注入管道53，优选地是两个、三个或四个注入管道53，可能布置在分离罐51中的对角相对位置处，优选地，每个注入管道53的离口54布置在与由分离罐51的底部形成的平面平行的同一平面中并且有利地彼此之间以及与倾析罐的侧面和底部之间具有相等的距离。在图3中四个注入管道53被表示在直径或对角线相对位置处。
如图3所示，每个注入管道53的离口54设置成背对分离罐51中存在的细胞裂解物混合物52的顶表面55，并且该离口54面对罐底表面58，但是定向成沿该底表面58的方向垂直向下注入液体水性介质。这种构造避免了在细胞裂解物中形成重大的对流运动，并避免了沉淀物或絮体从顶部沉淀物层的分散。
在根据本发明的设备的分离单元50中，细胞裂解物混合物52由沿着分离罐51的侧壁设置的第八管件47引入，并且部分地填充分离罐51。在该分离罐51中应保持足够的自由容积，以处理在压力下用气体饱和的液体水性介质的添加。
一个或多个注入管道53的离口54有利地位于距分离罐51底部的高度57处，该高度57在该分离罐51的高度56的1/6和5/6之间，更有利地位于距分离罐51底部的在1/4和3/4之间的高度57处。
注入管道53可以具有喷嘴离口54(其具有窄的离口)。有利地，注入管道53呈现其内径与其喷嘴离口54的直径之间的比率，所述比率高于或等于(约)2，更优选地高于或等于(约)3，并且可以低于或等于50。这种构造和内径管道尺寸与其喷嘴离口之间的比率确保液体水性介质的降压仅在喷嘴本身处开始，而不是在注入管件53内。通过这样做，具有溶解气体的液体水性介质保持在合适的升高压力直到离口喷嘴，使得压力仅在喷嘴离口处下降。然而，在本发明的设备的特定构造中(其允许产生更低量的一种或多种目的染色体外核酸序列)，该比率为(约)1或接近1的值，其中注入管道53既不包括喷嘴，也不减小离口54的直径。结果，可以获得细胞裂解物混合物52与分散在分离罐51中的其污染物或杂质的快速和有效的分离、澄清或倾析。污染物或杂质将漂浮在细胞裂解物混合物52的顶表面55处。优选地，该分离持续时间包括在(约)5分钟和(约)3小时之间，但可应用多达1或2天的更长时间。
如图4所示，添加的含有溶解气体的液体水性介质从注入管道53(其优选地通过阀71连接到注入或漂浮单元70)获得。
注入(或漂浮)单元70包括含有液体水性介质，优选水的罐72。该液体水性介质罐72包括有利地设置在罐72的下部的入口，所述入口优选地经由阀73连接到鼓泡装置的管件元件74，在液体水性介质罐72中供给气体，优选地供给空气。用于气体(空气)引入和排出的附加管件元件(75和76)和阀(77和78)可以连接到含水介质罐72。
液体水性介质罐72有利地是密闭容器，布置成在适当的升高压力下保持液体。分离(或倾析)罐51有利地构造成在基本大气压下保持细胞裂解物混合物52。
通过将从鼓泡装置获得的加压气体鼓泡到液体水性介质中，液体水性介质在压力下富含溶解气体并有利地被溶解气体饱和。通过这样做，该液体水性介质富含溶解气体(亨利定律)。有利地，鼓泡被执行足够的时间量以达到完全饱和。液体水性介质罐72中的压力在鼓泡期间有利地保持恒定，在2表压或更高的值，优选在2表压和50表压之间，更优选在3表压和25表压之间。
将富含溶解气体的液体水性介质有利地在包括在数秒和数分钟之间，优选在5秒和5分钟之间的时间段内注入到分离罐51中。优选地，在根据本发明的方法和设备中，与(倾析的)细胞裂解物混合物的体积相比，注入的液体水性介质的体积％包括在0.2％和25％(v/v)之间，优选包括在0.5％和15％之间，更优选包括在1％和10％之间。
再次参考图2和图3，分离罐51还包括收集管件61，用于从存在于分离罐51中的细胞裂解物混合物52中回收含有一种或多种目的染色体外核酸序列的可溶性级分或澄清相。
收集管件61的入口有利地设置在分离罐51的底部，以获得有效的可溶性级分或澄清相的泵送，同时最小化分离罐51中的液体运动，以避免污染物或杂质沉淀物的再悬浮。管件61有利地从分离罐51的底部57(其位于注入管道53的离口54的水平之下)中移除可溶性级分。管件61可以连接到过滤单元。
还可以使用已知的手段(例如过滤器、色谱柱和收集罐)和本领域技术人员公知的方法步骤进行进一步的纯化。
如图5所示，有利地通过阀62和泵63的打开获得分离罐51外部的细胞裂解物混合物的可溶性级分或澄清相的流动，所述阀62和泵63连接到管件元件64的另一部分，允许细胞裂解物混合物的可溶性级分或澄清相流向另一过滤单元60，以便用本领域技术人员公知的方法步骤进一步纯化。该过滤单元可包括一个或多个过滤器65和66和/或一个或多个具有合适洗脱材料的色谱柱。此外，在过滤、超滤和/或渗滤期间，一个或多个管件区段，特别是管件元件64的一个或多个区段可以被连接到低温恒温器68的热交换装置67围绕，用于将过滤和澄清的裂解物冷却到尽可能接近4℃的温度(在2℃至8℃的范围内)，优选在合适的(并且可能是冷藏的)罐69中能够保持足够时间(过夜)的温度。
在根据本发明的设备和方法中，管件元件可包括流量计或其他装置，用于控制裂解系统、罐或储器所需的适当体积(每单位时间)的不同流体的引入。该设备还可包括重量监测元件，例如不同罐或储器的重量天平，以测量在根据本发明的方法的每个步骤引入的溶液或活性化合物(裂解溶液、中和溶液、悬浮液中的细胞、在压力下气体饱和的液体水性介质)的量。通过本发明的设备和方法获得的纯化的条件和效率总结在下表1中，其给出了可能的工艺条件的概述。
表1：
本发明的新工艺和设备带来的优点是很多的。它是一种简单且稳健、高效、可重复性和可自动化的工艺和设备(或厂房)，可以被使用。
根据本发明的方法和设备的目标是保持非常低的分离持续时间，优选保持在最大两小时。达到甚至超过了这一目标，仅在约1小时甚至更短的时间后就获得了完全分离。
另一个目标是获得稳健的分离(倾析或澄清)，其中，对于每次运行，几乎没有颗粒留在分离罐(51)的底部或分散在细胞裂解物混合物中，因为它们很快堵塞澄清深度过滤器并且不应该被泵送。由于在漂浮之后几乎所有颗粒都漂浮在分离(倾析或澄清)罐51的顶部上，因此达到了该目标，甚至由于裂解物的澄清级分比经典的重力法分离步骤更澄清(降低的浊度)而超过了该目标。因此，分离需要较少的深度过滤器表面，这意味着较低的成本、较少的废物、较少的区域中所需空间、较少的处理等。
另外的目标是提高(总)可溶性级分或澄清相的回收，并且也随着以下而实现：沉淀物层中损失的可溶性级分或澄清相现在被气体(例如空气)替代，该沉淀物层漂浮在该可溶性级分或澄清相之上，而不是浸入其中。因此，回收的可溶性级分或澄清相的体积增加了10％～15％。
本发明的新工艺和设备的另一个目标是处理大量细胞沉淀，优选通过增加流速，同时对于每个规模保持至少相同的工艺持续时间(少于约4小时)，并获得大量(kg)的纯化的一种或多种目的染色体外核酸序列的回收。
发明人还测试了将气泡而不是将包含溶解气体的液体水性介质直接注入到包含在分离罐51中的细胞裂解物混合物中。然而，气泡的注入由于气泡上升到顶部而产生从下到上的运动，并因此产生可溶性级分与沉淀物层的混合，所述沉淀物层包含要从细胞裂解物混合物中回收的一种或多种染色体外核酸序列的杂质和污染物。絮体和其他固体颗粒(包括在可溶性级分或澄清相中回收的一种或多种染色体外核酸序列的污染物)的混合和引入将降低该可溶性级分回收的效率，也降低一种或多种染色体外核酸序列纯化的效率。
另一方面，在根据本发明的方法和设备中，将包含溶解气体的液体水性介质注入细胞裂解物混合物中，有利地允许完全或几乎完全回收不被或几乎不被由漂浮在细胞裂解物混合物的可溶性级分上方的絮体构成的沉淀物层污染的可溶性级分或澄清相。
此外，根据本发明的方法和设备不包含减小气泡尺寸所必需的气体注入玻璃料或其他微孔材料，这种装置非常容易被沉淀颗粒堵塞，并且由于其较差的可清洁性，也是批次间交叉污染的重要来源。根据本发明的方法和设备的设计允许在细胞裂解物的可溶性级分(或澄清相)回收之后，快速和有效地随后洗涤分离(倾析或澄清)手段，尤其是分离罐51以供其进一步使用，所述洗涤可能通过将一种或多种洗涤液从注入管道53或从其他管件元件注入该分离罐51中。
裂解后，沉淀物具有类似于细胞裂解物的液相(可溶性级分或澄清相)的密度。然而，由于一些微气泡(其来自于溶解在起始试剂中的少量气体)粘在它们上，它们通常会非常缓慢地上升到分离罐的顶部。如在现有技术出版物中提出的那样，在裂解过程中连续地添加气泡是增加气泡量以帮助这种漂浮效果的一种方式。另一方面，在现有技术的方法中，气泡与沉淀物的结合强度很低，因此混合运动或搅动容易使气泡从沉淀物中脱开，破坏漂浮效果并使其再次下沉。
在连续裂解系统的离口处，裂解物必须被送至分离罐，在那里由絮体101或颗粒100(由待回收的一种或多种目的序列的杂质构成)构成的沉淀物与可溶性级分分离。如果将细胞裂解物送到底部(离口浸入细胞裂解物中)，并且如果在裂解期间连续添加气泡，如现有技术中所建议的那样，这些气泡将迅速上升到离口的正上方(像水族箱中的气泵)，并将在细胞裂解物内产生向上的流，导致混合运动，阻止沉淀物正确地沉降在分离罐的顶部。如果细胞裂解物被送到分离罐的顶部，它还将在已经开始漂浮的颗粒100的顶层内产生混合运动，并将它们推回到溶液中，破坏部分漂浮效果。这些混合运动是在裂解过程中需要连续添加气泡的现有技术的缺点之一。另一个缺点来自于处理的连续性。将具有沉淀物和气泡的新细胞裂解物连续添加到已经包含先前生成并且已经开始沉淀的细胞裂解物的分离罐中。这就导致了分离罐中的处理不均匀性。
本发明提出了一种解决方案，当裂解结束并且填充分离罐51时，通过以“静态方式”执行漂浮来避免这些混合运动和处理不均匀性。在压力下注入具有溶解气体的液体水性介质允许同时处理整个细胞裂解物体积。由于注入的是液体而不是气体，它很快混合到整个体积进行处理。在注入之后，由于分离罐处于大气压，在压力下溶解在液体介质中(即处于液相中)的气体重新变成气相，主要与起成核中心作用的颗粒接触。因此，微泡粘附在沉淀物上，并且所有颗粒同时以线性方式上升到分离罐51的顶部，在相同方向上相互推动。这就产生了强烈的柱塞效应：位于上面的颗粒被位于下面的颗粒进一步推离细胞裂解物的可溶性级分。这种柱塞效应导致了高得多的分离效率。处理后，大部分颗粒不仅在分离罐51的顶部被分离，而且还被推离来自注入溶解气体饱和的液体介质的液相或气体，将替代先前被截留在颗粒之间的空间中的液体细胞裂解物并推动沉淀物层(101)，从而显著提高回收产率，如下表2和对比图6和7所示(见使用本发明的应用的漂浮方法获得的体积增益102和使用现有技术的重力法获得的剩余颗粒100)。
最后，本发明以这样的方式设计，使得在压力下进行具有溶解气体的含水液体介质的后续注入，而不会再次分散已经分离的颗粒。每次后续注入都减少了细胞裂解物中残留的微颗粒量，并使澄清变得容易
表2
| 重力法 | 漂浮 | |
| 体积回收 | 70％-75％ | 85％-90％ |
Claims (17)
1.一种从细胞获得一种或多种染色体外核酸序列的方法，所述方法包括以下步骤：
a)任选地培养包含一种或多种目的染色体外核酸序列的细胞，
b)通过将细胞悬浮液与裂解介质混合来裂解所述细胞以形成裂解的细胞，
c)通过向所述裂解的细胞中添加中和溶液，优选由乙酸/乙酸盐溶液构成的中和溶液来中和所述裂解的细胞，以产生包含可溶性级分和沉淀物的细胞裂解物混合物，
d)任选地，通过将所述细胞裂解物混合物与含有一种或多种盐的溶液混合，进一步沉淀所述一种或多种目的染色体外核酸序列的污染物，其中所述一种或多种盐选自由以下组成的组：CaCl2、MgCl2、ZnCl2、SrCl2、BaCl2、LiCl、乙酸铵、硫酸铵、硫酸钠和硫酸镁或其混合物，
e)收集由步骤c)或由步骤d)获得的细胞裂解物混合物，
f)在分离罐中使所述细胞裂解物混合物的包含所述一种或多种目的染色体外核酸序列的可溶性级分与沉淀分离，以及
g)回收包含所述一种或多种目的染色体外核酸序列的分离的可溶性级分，
其中所述分离步骤f)包括在高于大气压的压力下将气体溶解在液体水性介质中，随后将包含溶解气体的所述液体水性介质注入到包含在所述分离罐中的所述细胞裂解物混合物中。
2.如权利要求1所述的方法，其中通过在至少2表压的压力下的气体鼓泡将所述气体溶解在液体水性介质中。
3.如权利要求1或2所述的方法，其中将包含所述溶解气体的所述液体水性介质以相对于所述细胞裂解物混合物的体积包括在0.2％和25％之间，优选0.5％和15％之间，更优选1％和10％v/v之间的体积量注入所述细胞裂解物混合物中。
4.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中在至少2表压的压力下(例如在注入管道中)将包含所述溶解气体的所述液体水性介质注入到所述细胞裂解物混合物中，其中所述细胞裂解物混合物在所述分离罐中处于大气压。
5.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中注入所述细胞裂解物混合物中的包含所述溶解气体的所述液体水性介质被所述气体饱和。
6.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中包含所述溶解气体的所述液体水性介质朝所述分离罐的底部向下注入。
7.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中包含所述溶解气体的所述液体水性介质的注入是单次注入或连续注入。
8.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中步骤c)的用中和溶液对裂解的细胞的中和通过静态混合器进行，其中混合线速度等于或高于100cm/min。
9.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述裂解介质通过NaOH和洗涤剂，优选十二烷基硫酸钠(SDS)的混合和/或优选使用静态混合器获得。
10.一种用于执行根据前述权利要求中任一项所述的方法的设备，所述设备包括：
-制备单元(1)，制备单元(1)包括一个或多个罐(2，3)，罐(2，3)包含裂解介质的组分并包括出口(10)，
-细胞裂解单元(20)，细胞裂解单元(20)包括含有具有所述一种或多种目的染色体外核酸序列的细胞的细胞悬浮液罐(25)，并且还包括入口(21)和出口(26)，其中入口(21)流体地连接到所述细胞悬浮液罐和制备单元(1)的出口(10)，
-用于产生细胞裂解物混合物的中和单元(30)，中和单元(30)包括中和介质罐(31)、入口(34)和出口(37)，其中入口(34)与中和介质罐(31)和细胞裂解单元(20)的出口(26)处于流体连接，
-用于收集所述细胞裂解物混合物的分离单元(50)，分离单元(50)包括具有与中和单元(30)的出口(37)流体地连接的入口的分离罐(51)，以及
-用于将包含所述溶解气体的所述液体水性介质注入到分离罐(51)中的注入单元(70)，注入单元(70)包括用于在高于大气压的压力下将所述气体溶解在所述液体水性介质中的手段。
11.如权利要求10所述的设备，其中用于注入具有所述溶解气体的所述液体水性介质的手段包括至少一个注入管道(53)，注入管道(53)具有朝向分离罐(51)的底表面(58)设置的离口(54)，优选地注入管道(53)包括离口喷嘴(54)，并且其中注入管道(53)内径与其离口喷嘴(54)直径之间的比率为至少2。
12.如权利要求10或11所述的设备，其中用于注入所述液体水性介质的所述手段被设置成在距离罐底部(58)包括在分离罐(51)的总高度(56)的1/6和5/6之间的高度(57)处，优选地在距离罐底部(58)包括在总高度(56)的1/4和2/4之间的高度处将所述液体水性介质注入分离罐(51)中。
13.如权利要求10至12中任一项所述的设备，其中用于将所述气体溶解在所述液体水性介质中的手段包括液体水性介质罐(72)和用于将所述气体鼓泡到液体水性介质罐(72)中的鼓泡装置(74)，鼓泡装置(74)优选地被构造成在高于或等于2表压，优选地在2表压和50表压之间，更优选地在3表压和25表压之间的压力下将所述气体注入液体水性介质罐(72)中。
14.如权利要求13所述的设备，其中所述鼓泡装置被构造成将液体水性介质罐(72)保持在至少2表压的压力下。
15.如权利要求10至14中任一项所述的设备，其中注入单元(70)被构造成将具有所述溶解气体的所述液体水性介质间歇地注入到分离罐(51)中。
16.如前述权利要求10至15中任一项所述的设备，所述设备还包括在中和单元(30)和分离单元(50)之间的沉淀单元(40)，沉淀单元(40)包括一种或多种二价离子盐的溶液罐(44)、入口(45)和出口(46)，其中所述沉淀单元入口(45)与中和单元(30)的出口(37)处于流体连接，用于接收所述中和的细胞裂解物，并且与一种或多种二价离子盐的溶液罐(44)连接，并且其中沉淀单元出口(46)与分离单元(50)处于流体连接。
17.如前述权利要求10至16中任一项所述的设备，其中制备单元(1)、细胞裂解单元(20)、中和单元(30)和/或沉淀单元(40)包括一个或多个静态混合器(9、22、35、41)。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP18183258.5 | 2018-07-12 | ||
| EP18183258.5A EP3594338A1 (en) | 2018-07-12 | 2018-07-12 | Method and apparatus for the purification of extra-chromosomal nucleic acid sequences |
| PCT/EP2019/067997 WO2020011641A1 (en) | 2018-07-12 | 2019-07-04 | Method and apparatus for the purification of extra-chromosomal nucleic acids sequences |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN111601889A true CN111601889A (zh) | 2020-08-28 |
| CN111601889B CN111601889B (zh) | 2024-02-13 |
Family
ID=63077690
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201980008445.5A Active CN111601889B (zh) | 2018-07-12 | 2019-07-04 | 纯化染色体外核酸序列的方法和设备 |
Country Status (14)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US12060552B2 (zh) |
| EP (3) | EP3594338A1 (zh) |
| JP (1) | JP7321177B2 (zh) |
| KR (1) | KR20210030894A (zh) |
| CN (1) | CN111601889B (zh) |
| AU (1) | AU2019302727A1 (zh) |
| DK (1) | DK3821007T3 (zh) |
| ES (1) | ES2931979T3 (zh) |
| HU (1) | HUE060825T2 (zh) |
| LT (1) | LT3821007T (zh) |
| PL (1) | PL3821007T3 (zh) |
| PT (1) | PT3821007T (zh) |
| SI (1) | SI3821007T1 (zh) |
| WO (1) | WO2020011641A1 (zh) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN117050865A (zh) * | 2023-08-16 | 2023-11-14 | 浙江健新原力制药有限公司 | 一种质粒生产全自动系统及制备方法 |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN117183126B (zh) * | 2023-08-24 | 2024-09-06 | 江苏欧西盾科技有限公司 | 一种沥青改性ecm防水卷材、卷材制备方法及制备装置 |
Citations (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5837529A (en) * | 1994-10-17 | 1998-11-17 | Genzyme Corporation | Method for lysing cells |
| US20050014245A1 (en) * | 2003-05-30 | 2005-01-20 | Advisys, Inc. | Devices and methods for biomaterial production |
| US20050244947A1 (en) * | 2004-05-03 | 2005-11-03 | Carsten Voss | Method for producing extra-chromosomal nucleic acid molecules |
| US7067287B1 (en) * | 1997-10-28 | 2006-06-27 | Hitachi, Ltd. | Method for recovery of nucleic acids |
| US20060166331A1 (en) * | 2002-09-13 | 2006-07-27 | Valentis, Inc. | Apparatus and method for preparative scale purification of nucleic acids |
| CN101998991A (zh) * | 2008-02-08 | 2011-03-30 | 贝林格尔.英格海姆Rcv两合公司 | 用于生产生物分子的方法和设备 |
| CN102449150A (zh) * | 2009-05-26 | 2012-05-09 | 欧洲生物技术股份有限公司 | 用于生产和/或纯化多核苷酸的方法和装置及其可获得的产物 |
Family Cites Families (13)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US8158A (en) | 1851-06-17 | Mahlon gregg | ||
| US348A (en) | 1837-08-08 | Commo | ||
| DE3011844A1 (de) * | 1980-03-27 | 1981-10-01 | Röhm GmbH, 6100 Darmstadt | Verfahren und vorrichtung zur umwandlung und trennung von in einer traegerfluessigkeit enthaltenden oder eingebrachten geloesten bzw. loesbaren substanzen |
| US5096818A (en) | 1990-06-04 | 1992-03-17 | Autogen Instruments, Inc. | Nucleic acid separation method |
| AU706857B2 (en) * | 1995-12-21 | 1999-06-24 | Genzyme Corporation | Method for lysing cells |
| US7807822B2 (en) | 1996-08-01 | 2010-10-05 | Robert Bridenbaugh | Methods for purifying nucleic acids |
| FR2773818B1 (fr) | 1998-01-21 | 2000-02-18 | Pasteur Merieux Serums Vacc | Procede et dispositif de lyse de bacteries |
| EP1462519A1 (en) | 2003-03-24 | 2004-09-29 | Boehringer Ingelheim Austria GmbH | Method and devices for producing biomolecules |
| US7255332B2 (en) * | 2004-05-25 | 2007-08-14 | The Board Of Trustees Of The University Of Arkansas | System and method for dissolving gases in liquids |
| JP2007130591A (ja) | 2005-11-11 | 2007-05-31 | Univ Of Miyazaki | 炭酸ガスナノバブルおよびマイクロバブルを用いた金属イオンの沈殿回収 |
| JP4364876B2 (ja) | 2006-03-06 | 2009-11-18 | 戸倉工業株式会社 | 気体溶解装置 |
| PT2153260T (pt) | 2007-05-23 | 2017-04-24 | Vgxi Inc | Composição que compreende uma alta concentração de moléculas biologicamente ativas e processos de preparação da mesma |
| JP2015029968A (ja) | 2013-08-05 | 2015-02-16 | 国立大学法人京都大学 | 水中の微生物及び有機物の除去方法、並びに除去装置 |
-
2018
- 2018-07-12 EP EP18183258.5A patent/EP3594338A1/en not_active Withdrawn
-
2019
- 2019-07-04 AU AU2019302727A patent/AU2019302727A1/en active Pending
- 2019-07-04 DK DK19734431.0T patent/DK3821007T3/da active
- 2019-07-04 SI SI201930391T patent/SI3821007T1/sl unknown
- 2019-07-04 US US16/965,211 patent/US12060552B2/en active Active
- 2019-07-04 EP EP19734431.0A patent/EP3821007B1/en active Active
- 2019-07-04 PL PL19734431.0T patent/PL3821007T3/pl unknown
- 2019-07-04 ES ES19734431T patent/ES2931979T3/es active Active
- 2019-07-04 CN CN201980008445.5A patent/CN111601889B/zh active Active
- 2019-07-04 JP JP2020549597A patent/JP7321177B2/ja active Active
- 2019-07-04 PT PT197344310T patent/PT3821007T/pt unknown
- 2019-07-04 LT LTEPPCT/EP2019/067997T patent/LT3821007T/lt unknown
- 2019-07-04 HU HUE19734431A patent/HUE060825T2/hu unknown
- 2019-07-04 WO PCT/EP2019/067997 patent/WO2020011641A1/en unknown
- 2019-07-04 KR KR1020207022987A patent/KR20210030894A/ko not_active Application Discontinuation
- 2019-07-04 EP EP22192819.5A patent/EP4116417A1/en not_active Withdrawn
Patent Citations (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5837529A (en) * | 1994-10-17 | 1998-11-17 | Genzyme Corporation | Method for lysing cells |
| US7067287B1 (en) * | 1997-10-28 | 2006-06-27 | Hitachi, Ltd. | Method for recovery of nucleic acids |
| US20060166331A1 (en) * | 2002-09-13 | 2006-07-27 | Valentis, Inc. | Apparatus and method for preparative scale purification of nucleic acids |
| US20050014245A1 (en) * | 2003-05-30 | 2005-01-20 | Advisys, Inc. | Devices and methods for biomaterial production |
| US20050244947A1 (en) * | 2004-05-03 | 2005-11-03 | Carsten Voss | Method for producing extra-chromosomal nucleic acid molecules |
| CN101998991A (zh) * | 2008-02-08 | 2011-03-30 | 贝林格尔.英格海姆Rcv两合公司 | 用于生产生物分子的方法和设备 |
| CN102449150A (zh) * | 2009-05-26 | 2012-05-09 | 欧洲生物技术股份有限公司 | 用于生产和/或纯化多核苷酸的方法和装置及其可获得的产物 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| WRIGHT JL等: "Extraction of plasmid DNA using reactor scale alkaline lysis and selective precipitation for scalable transient transfection", CYTOTECHNOLOGY, vol. 35, no. 3, pages 165 - 173, XP009014604, DOI: 10.1023/A:1013106032341 * |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN117050865A (zh) * | 2023-08-16 | 2023-11-14 | 浙江健新原力制药有限公司 | 一种质粒生产全自动系统及制备方法 |
| CN117050865B (zh) * | 2023-08-16 | 2024-08-27 | 浙江健新原力制药有限公司 | 一种质粒生产全自动系统及制备方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US12060552B2 (en) | 2024-08-13 |
| EP3821007B1 (en) | 2022-09-21 |
| SI3821007T1 (sl) | 2023-04-28 |
| JP7321177B2 (ja) | 2023-08-04 |
| WO2020011641A1 (en) | 2020-01-16 |
| JP2021530962A (ja) | 2021-11-18 |
| PT3821007T (pt) | 2022-11-28 |
| EP3594338A1 (en) | 2020-01-15 |
| LT3821007T (lt) | 2023-02-27 |
| ES2931979T3 (es) | 2023-01-05 |
| EP4116417A1 (en) | 2023-01-11 |
| DK3821007T3 (da) | 2022-10-31 |
| EP3821007A1 (en) | 2021-05-19 |
| KR20210030894A (ko) | 2021-03-18 |
| US20210062182A1 (en) | 2021-03-04 |
| PL3821007T3 (pl) | 2023-05-22 |
| CN111601889B (zh) | 2024-02-13 |
| AU2019302727A1 (en) | 2020-07-16 |
| HUE060825T2 (hu) | 2023-04-28 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP5658040B2 (ja) | 生物分子の生成方法及び装置 | |
| EP1608749B1 (en) | Methods and devices for producing biomolecules | |
| US20130331560A1 (en) | Methods and devices for producing biomolecules | |
| US8822672B2 (en) | Method and device for producing and/or purifying polynucleotides and products obtainable thereof | |
| CN111601889B (zh) | 纯化染色体外核酸序列的方法和设备 | |
| CA2498518A1 (en) | Apparatus and method for preparative scale purification of nucleic acids | |
| KR20240133994A (ko) | 거대분자의 정제 | |
| CN117957319A (zh) | 自动质粒提取 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |