ES2931979T3 - Método y aparato para la purificación de secuencias de ácidos nucleicos extracromosómicas - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a un nuevo aparato y un nuevo método para la purificación y recuperación de secuencias de ácidos nucleicos extracromosómicos. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Método y aparato para la purificación de secuencias de ácidos nucleicos extracromosómicas

Campo de la invención

La presente invención está en el campo de la biotecnología y se refiere a un método y a un aparato para la purificación de contaminantes e impurezas de secuencias de polinucleótidos, preferentemente secuencia(s) de ácidos nucleicos extracromosómica(s) seleccionada(s) del grupo que consiste en plásmidos de ADN, cósmidos, BAC, YAC, MAC, miniplásmidos y mini-círculos.

Antecedentes de la invención y estado de la técnica

La purificación de polinucleótidos se obtiene, en general, de células hospedadoras capaces de producir grandes cantidades de estos polinucleótidos, posiblemente después de la ingeniería genética.

Se conoce que una biomasa de bacterias Gram-negativas, tales como Escherichia ^coI^í, se puede lisar y sus secuencias de nucleótidos de interés, especialmente secuencias de ácidos nucleicos extracromosómicas, separar de la mayor parte de los ácidos nucleicos genómicos y proteínas por etapas de purificación sucesivas que incluyen, pero no se limitan a, una precipitación selectiva, una sedimentación, una filtración y una retención específica sobre columnas cromatográficas.

Sin embargo, dependiendo del protocolo seguido, estas secuencias de ácidos nucleicos de interés están combinadas con contaminantes (o impurezas), tales como endotoxinas, fenoles, cloruros de cesio, bromuros de etidio, Triton®, proteínas unidas u otros ácidos nucleicos.

Como las secuencias de nucleótidos altamente purificadas, especialmente las secuencias de ácidos nucleicos extracromosómicas, se requieren para usos específicos en laboratorios o para fines clínicos, se propusieron varios intentos para reducir la cantidad de contaminantes.

En general, los métodos aplicados para su aislamiento implican una etapa de lisis de células con la adición de álcali, tensioactivo o enzimas, antes de una mezcla con una disolución neutralizante y con el tiempo una disolución precipitante para recuperar la(s) secuencia(s) extracromosómica(s) en disolución separadas de componentes celulares contaminantes precipitados (ADN genómico, proteínas y complejos proteína-nucleico).

Sin embargo, el uso de disolución alcalina, tensioactivos, etapa de calentamiento y/o procedimiento(s) largo(s) degradará(n) estas secuencias de nucleótidos. Además, las moléculas de ADN, que incluyen esta(s) secuencia(s) de ácidos nucleicos extracromosómica(s), son sensibles al esfuerzo mecánico. Además, la disolución altamente viscosa puede causar o heterogeneidades locales o requerir una amplia mezcla, teniendo ambas el potencial de degradar estas secuencias de nucleótidos. Esto es especialmente el caso cuando se usan disoluciones concentradas de cloruro de metales divalentes (tales como CaCb).

Se conoce que los métodos discontinuos presentan un riesgo de contaminación y/o heterogeneidad, especialmente a gran escala.

El documento WO2010/0136503 describe un método y un aparato para una purificación eficaz de un plásmido de ADN, en donde la precipitación de los contaminantes de plásmido de ADN se obtiene por una mezcla de las células disgregadas con una disolución que contiene una o más sales, tales como CaCl², en un pasadizo y por una separación posterior de los precipitados de la disolución mediante decantación gravimétrica.

En este método y aparato, se obtiene una mezcla eficiente de las células disgregadas y sales y la posterior precipitación por la integración de medios que inducen un efecto de Venturi en los elementos de tubo. Este efecto de Venturi se obtiene por una reducción en el diámetro interno en los elementos de tubo de aproximadamente el 40 %. Por los términos "inducir un efecto de Venturi" se indica una turbulencia en el flujo obtenido del sistema usado, en donde un fluido en el flujo laminar es forzado a pasar dentro de un tubo reducido en tal medida que el fluido tenga un aumento de velocidad y que se cause una depresión justo después del diámetro reducido.

Un efecto de Venturi creado en los elementos de tubo causa una mezcla eficiente obtenida sin degradación del plásmido de ADN y sin crear altas fuerzas de cizallamiento en el líquido. Por lo tanto, no se conoce que ocurra degradación de moléculas de ADN con agitación fuerte o fuerzas de cizallamiento fuertes, que es necesario dado que se observó la alta viscosidad de una disolución 5 M de CaCl² en el método descrito. Sin embargo, dicho método y aparato que requieren la integración de medios para inducir un efecto de Venturi está dedicado a la producción de algunos gramos de plásmido y no es adecuado para un aumento de escala de la producción a cantidades de secuencias de ácidos nucleicos extracromosómicas, es decir, desde kilogramos hasta toneladas.

Las solicitudes de patente EP 811055B1, WO99/37750 y WO00/05358 describen métodos y aparatos de lisis celular en donde una mezcla de células con una disolución de lisado se realiza en pequeños tubos o mezcladoras estáticas que tienen una longitud de diámetro adecuada y preferentemente perfil circular para obtener dicha lisis.

Además, en la bibliografía científica se describen diversos medios y etapas para mejorar el rendimiento y la eficiencia de las etapas de purificación de ácidos nucleicos extraídos de células. Por ejemplo, la patente US 5.096.818 B2 desvela un método de aislamiento y purificación de secuencias de ácidos nucleicos de un medio de cultivo de células añadiendo los agentes de lisado/desnaturalizantes y los agentes desproteinizadores y/o neutralizadores, sin mezclar, a células resuspendidas, seguido de una primera centrifugación que sedimenta parcialmente el residuo celular, y luego mezclando la disolución para finalizar la lisis, seguido de una segunda centrifugación para sedimentar completamente el residuo celular. Este método de centrifugación no es adecuado para procesos a gran escala debido a limitaciones de equipo que conducen a un rendimiento de producción insuficiente.

La patente europea EP 1593 741B1 desvela un método de producción de un lisado microbiano claro que contiene secuencia(s) de ácidos nucleicos extracromosómica(s) mezclando una suspensión de microorganismos que contiene estas secuencias de ácidos nucleicos con un tampón de reacción, haciendo reaccionar la mezcla durante una duración suficiente para romper los microorganismos, transfiriendo la mezcla obtenida en un recipiente que comprende un tampón neutralizante para formar un precipitado con los contaminantes a retirar y generando burbujas de gas dispersando un gas a través del fondo del recipiente para separar el precipitado del lisado (fracción líquida que no se precipita). Como el tampón de neutralización no se añade continuamente, sino que la cantidad total requerida está presente en la suspensión desde el comienzo de la lisis, su concentración dentro de la suspensión (y, por lo tanto, la potencia de neutralización disponible en la suspensión) cambia con el tiempo de proceso, que induce variabilidad de proceso. Otra restricción es que cantidades de células muy grandes no se pueden tratar fácilmente debido al diseño del sistema y al procesamiento de lotes.

Las patentes US 8.158.348-B2; US 7.771.945-B2 y US 7.314.746-B2 desvelan métodos y aparatos para la purificación de un plásmido de ADN que comprende la adición de microburbujas de gas con un medio de lisis durante la etapa de lisis de células para mejorar la recuperación del plásmido de ADN de interés. Como se representa en la Figura 5 de estas patentes de EE. UU., el efecto relativo de las diferentes cantidades de gas inyectado durante la lisis no es muy eficiente, en vista del volumen definitivo de la fase líquida resultante obtenida después de la separación, e indican que la cantidad de fracción recuperada de líquido soluble es solo del 60 % o menor después de un retraso muy largo del tratamiento (aproximadamente 16 horas).

Objetivos de la invención

La presente invención está relacionada con un método y un aparato que no presentan y resuelven los inconvenientes de los métodos y aparatos del estado de la técnica.

Un objetivo preferido de la presente invención es obtener un método y aparato barato, robusto y simplificado para una purificación eficiente y rápida, especialmente mediante una etapa de separación mejorada (decantación o clarificación), de una o más secuencia(s) de ácidos nucleicos extracromosómica(s) de interés de sus impurezas (o contaminantes), especialmente una purificación de grandes cantidades de la(s) secuencia(s) de ácidos nucleicos extracromosómica(s) de interés, en particular en cantidades que son mayores que la(s) cantidad(es) obtenida(s) con los métodos y aparatos del estado de la técnica.

Un objetivo adicional de la invención es obtener un nuevo método y aparato que permita una recuperación completa o casi completa del lisado líquido clarificado de células que contiene la(s) secuencia(s) de ácidos nucleicos extracromosómica(s) de interés, y en donde el lisado líquido clarificado de células obtenido comprende la(s) secuencia(s) de ácidos nucleicos extracromosómica(s) de interés que está(n) menos o no está(n) contaminadas por sus impurezas (o contaminantes) obtenidos de una capa de precipitado.

Sumario de la invención

En el método y aparato según la invención, por los términos "aproximadamente" o "alrededor" se indica preferentemente un valor más o menos el 20 % o 10 % (por ejemplo, aproximadamente 5 minutos significa cada valor desde 4 minutos y 30 segundos hasta 5 minutos y 30 segundos) por encima o por debajo del valor mencionado.

El presente método de obtención por etapas sucesivas de producción y/o purificación de una o más secuencia(s) de ácidos nucleicos extracromosómica(s) de interés, preferentemente un plásmido de ADN, que tiene preferentemente un tamaño inferior a 30.000 bases (o pares de bases), comprende (o consiste en) las etapas de:

a) opcionalmente cultivar células hospedadoras (preferentemente recombinantes) que producen (implicadas en la síntesis de) la(s) secuencia(s) de interés y recoger estas células que contienen la(s) secuencia(s) de interés, preferentemente células que contienen este plásmido de ADN de interés;

b) disgregar estas células en una unidad de lisis celular, preferentemente mediante la introducción continua de células en un pasaje, siendo esta introducción continua una alimentación continua de células en un dispositivo de flujo, en donde preferentemente esta disgregación se obtiene mediante la adición de un medio de lisis (alcalino) a las células en la unidad de lisis celular;

c) neutralizar las células lisadas (que comprenden la(s) secuencia(s) de ácidos nucleicos extracromosómica(s) de interés) en una unidad de neutralización, por medio de una disolución de neutralización, siendo esta disolución de neutralización añadida preferentemente y estando compuesta preferentemente de una composición de ácido acético/acetato, para producir una mezcla de lisado celular que comprende una fracción soluble (que comprende la(s) secuencia(s) de ácidos nucleicos extracromosómica(s) de interés, especialmente el plásmido de ADN de interés) y un precipitado, comprendiendo este precipitado contaminantes y/o impurezas de la(s) secuencia(s) de interés;

d) opcionalmente precipitar (adicionalmente) estos contaminantes y/o impurezas de la(s) secuencia(s) de ácidos nucleicos extracromosómica(s) de interés, especialmente del plásmido de ADN de interés, mezclando la mezcla de lisado celular (obtenida de la etapa c)), para purificar ventajosamente esta mezcla. Esta precipitación (adicional) se realiza añadiendo una o más sal(es), preferentemente hidratada(s), en un forma continua a la mezcla de lisado celular, preferentemente disgregada, en una disolución a una concentración comprendida entre (aproximadamente) 2 M y (aproximadamente) 6 M, en donde la(s) sal(es) se selecciona(n) del grupo que consiste en (que comprende) CaCl² (preferentemente hidratado), MgCl² (preferentemente hidratado), ZnCl² (preferentemente hidratado), SrCl² (preferentemente hidratado), BaCl² (preferentemente hidratado) o (menos preferentemente) otra(s) sal(es) (preferentemente hidratadas), tales como LiCl, acetato de amonio, sulfato de amonio, sulfato de sodio o sulfato de magnesio, en donde las sales preferidas son CaCl² (preferentemente hidratado) y/o MgCh (preferentemente hidratado);

e) recoger la mezcla de lisado celular obtenida de la etapa c) o de la etapa d) en un tanque de separación (decantación o clarificación);

f) separar (decantar o clarificar) la fracción soluble (que comprende la(s) secuencia(s) de ácidos nucleicos extracromosómica(s) de interés, especialmente el plásmido de ADN de interés) del precipitado (que comprende contaminantes o impurezas) contenido en la mezcla de lisado celular; teniendo esta etapa de separación preferentemente una duración comprendida entre (aproximadamente) 5 minutos y algunas horas; más preferentemente comprendida entre (aproximadamente) 15 minutos y (aproximadamente) 2 horas. Esta etapa de separación se realiza ventajosamente en un tanque o deposito, llamado el tanque de separación (decantación o clarificación);

g) recuperar del tanque de separación, preferentemente por bombeo, la fracción soluble separada, que comprende la(s) secuencia(s) de ácidos nucleicos extracromosómica(s) de interés, especialmente el plásmido de ADN de interés, presente en esta mezcla de lisado celular de este tanque de separación;

h) opcionalmente realizar una o más etapa(s) de separación adicional(es), etapa(s) de decantación y/o etapa(s) de filtración de la fracción soluble obtenida en uno o más filtro(s) que tienen un tamaño de poro comprendido entre (aproximadamente) 0,2 pm y (aproximadamente) 20 pm, preferentemente seguido por una etapa de ultrafiltración sobre una membrana (aproximadamente) de 30 kDa a membrana de (aproximadamente) 500 kDa, preferentemente entre (aproximadamente) 50 y (aproximadamente) 250 kDa, más preferentemente entre (aproximadamente) 50 y (aproximadamente) 100 kDa, para obtener un primer concentrado de membrana que comprende la(s) secuencia(s) de ácidos nucleicos extracromosómica(s) de interés, preferentemente el plásmido de ADN de interés;

i) opcionalmente realizar una cromatografía (de etapa de refino) de la fracción soluble de la etapa g) o del primer concentrado en membrana de la etapa h), que comprende las secuencias de ácidos nucleicos extracromosómicas(s) recuperada(s), preferentemente el plásmido de ADN de interés, comprendiendo esta etapa de cromatografía opcionalmente una subetapa de lavado para obtener un eluato de cromatografía;

j) opcionalmente realizar una ultrafiltración del eluato de cromatografía de la etapa i) sobre una membrana de (aproximadamente) 3 kDa a (aproximadamente) 100 kDa y recoger un segundo concentrado obtenido; y opcionalmente realizar una filtración (incluso adicional) del segundo concentrado sobre una membrana de (aproximadamente) 0,2 pm para recuperar y recoger un filtrado, la(s) secuencia(s) de ácidos nucleicos extracromosómica(s) de interés, preferentemente el plásmido de ADN de interés, que se purifica de sus impurezas (o contaminantes).

Por los términos "fracción soluble" (por ejemplo del lisado celular) se indica la porción de líquido y soluble de una mezcla de lisado celular recuperada por el método y aparato de la invención, en donde esta fracción soluble se puede separar, decantar o clarificar de una capa de precipitado, que puede comprender flóculos que flotan en y sobre la mezcla de lisado líquido y en donde esta capa de precipitado puede comprender o contener impurezas (o contaminantes) de la(s) secuencia(s) de ácidos nucleicos extracromosómica(s) de interés a recuperar y purificar. Después, esta fracción soluble obtenida después de la separación, decantación y/o clarificación también se denomina "la fase clarificada". La etapa de separación, es decir, la etapa de decantación y/o etapa de clarificación, se basa preferentemente en una etapa de proceso continua clásica, pero que también se puede realizar según un proceso discontinuo en lugar de añadir un suministro continuo de material de alimentación.

Por el término "secuencia(s) de ácidos nucleicos extracromosómica(s)" se indica cualquier secuencia de nucleótidos de más de 50 bases (par de bases). Más preferentemente, esta secuencia del ácido nucleico extracromosómica se selecciona del grupo que comprende en (que consiste en) plásmidos de ADN, cósmidos, BAC, YAC, MAC, miniplásmidos y mini-círculos, preferentemente un plásmido (de ADN), tal como un plásmido (de ADN) de un tamaño inferior a 30.000 pares de bases.

Según la presente invención, la etapa de separación f) comprende al menos una inyección de un medio acuoso líquido que comprende un gas disuelto en la mezcla de lisado celular contenida en un tanque de separación (decantación o clarificación). Esta inyección no se hace durante la lisis de las células ni durante la neutralización de las células lisadas. Dicho medio acuoso líquido se puede obtener disolviendo un gas en el medio acuoso líquido a una presión elevada. Se ha descubierto de manera sorprendente que la inyección de un medio acuoso líquido que comprende una cantidad suficiente de gas disuelto en la mezcla de lisado celular mejora el rendimiento de la etapa de separación (decantación o clarificación) entre la fracción soluble que comprende la secuencia de ácidos nucleicos extracromosómica de interés y el precipitado, siendo esta etapa de separación realizada en el tanque de separación mencionado anteriormente. El rendimiento de separación mejorado mejora significativamente la cantidad de fracción soluble recuperada, en particular de secuencia(s) del ácido nucleico recuperada(s) de interés. En ausencia de dicha inyección, la capa de precipitados sigue sumergida en la fracción soluble, atrapando un volumen significativo de esta fracción soluble que se pierde durante la etapa de recuperación g). La inyección realiza la flotación de la capa de precipitado sobre la superficie de la fracción soluble debido a que los espacios entre las partículas precipitadas se llenan con gas en lugar de fracción soluble (líquida).

El medio acuoso líquido que comprende la cantidad suficiente del gas disuelto se obtiene ventajosamente disolviendo el gas, preferentemente un gas seleccionado del grupo que consiste en aire, CO² , oxígeno, ozono, nitrógeno o una mezcla de los mismos, en un medio acuoso líquido, tal como agua. Preferentemente, este gas se disuelve en el medio acuoso líquido por medio de burbujeo. Ventajosamente, esta disolución se realiza a una presión por encima de la presión atmosférica, tal como una presión de al menos 1 barg, preferentemente entre (aproximadamente) 2 barg y (aproximadamente) 50 barg, preferentemente entre (aproximadamente) 3 barg y (aproximadamente) 25 barg, preferentemente entre (aproximadamente) 4 barg y (aproximadamente) 15 barg. De esta manera, se puede obtener una mayor concentración de gas disuelto en el medio acuoso líquido (ley de Henry). La concentración del gas disuelto en el medio acuoso líquido se aproxima ventajosamente a la concentración de saturación, por ejemplo la concentración del gas disuelto en el medio acuoso líquido asciende a al menos el 50 % de la concentración de saturación a las presiones indicadas, ventajosamente a al menos el 60 %, al menos el 70 %, al menos el 80 %, al menos el 90 % de la concentración de saturación. Ventajosamente, el medio acuoso líquido se satura con el gas disuelto. El medio acuoso líquido se satura preferentemente con el gas a una presión superior a (aproximadamente) 2 barg, preferentemente comprendida entre (aproximadamente) 2 barg y (aproximadamente) 50 barg, más preferentemente entre (aproximadamente) 3 barg y (aproximadamente) 25 barg. Ventajosamente, la cantidad en volumen del medio acuoso líquido que comprende el gas disuelto inyectado en la mezcla de lisado celular en comparación con el volumen de la mezcla de lisado celular que está tratándose (por ejemplo, volumen total de la mezcla de lisado celular en el tanque) comprende entre (aproximadamente) 0,2 % v/v y (aproximadamente) 25 % v/v, preferentemente entre (aproximadamente) 0,5 % v/v y (aproximadamente) 15 %, más preferentemente entre (aproximadamente) 1 % v/v y (aproximadamente) 10 %, inyectado una vez o varias veces.

Preferentemente, el medio acuoso líquido que comprende el gas disuelto se prepara en un depósito o tanque antes de la inyección del medio acuoso líquido que comprende el gas disuelto en la mezcla de lisado celular.

Ventajosamente, el medio acuoso líquido que comprende el gas disuelto se inyecta a una presión por encima de la presión atmosférica en la mezcla de lisado celular, estando la última ventajosamente a una presión alrededor de la presión atmosférica. Ventajosamente, este medio acuoso líquido se inyecta a sustancialmente la misma presión que la presión a la que se disuelve el gas. La presión de inyección preferible es al menos (aproximadamente) 2 barg, preferentemente entre (aproximadamente) 3 barg y (aproximadamente) 50 barg, preferentemente entre (aproximadamente) 4 barg y (aproximadamente) 15 barg. El medio acuoso líquido se inyecta ventajosamente en la mezcla de lisado celular intermitentemente. Esto significa que un periodo de reposo estático entre dos periodos de inyección consecutivos tiene ventajosamente al menos una duración igual a la duración del periodo de inyección antes y después de este periodo de reposo estático. A modo de ejemplo, un periodo de tiempo durante el que la inyección tiene lugar (periodo de inyección) es entre (aproximadamente) 5 segundos y (aproximadamente) 10 minutos, más preferentemente de (aproximadamente) 5 segundos y (aproximadamente) 5 minutos. El periodo de reposo estático entre dos periodos de inyección consecutivos es ventajosamente entre (aproximadamente) 5 segundos y (aproximadamente) 10 minutos, ventajosamente al menos igual a la duración del periodo de inyección.

Según la invención, la inyección del medio acuoso líquido que comprende un gas disuelto en el mezcla de lisado celular presente en el tanque de separación (decantación o clarificación) puede ser una única inyección o una serie de inyección (inyecciones) sucesiva(s) intermitentemente. Una inyección intermitente del medio acuoso líquido que comprende el gas disuelto seguido por un periodo de reposo estático permite al precipitado ascender y a la fracción soluble clarificarse durante el tiempo de reposo estático. Al mismo tiempo, las burbujas de gas sustituyen a la fracción soluble atrapada dentro de los flóculos de la capa de precipitado, que conduce a la flotación de la capa de precipitado encima de la fracción soluble en lugar de que el precipitado se sumerja en la fracción soluble. Como resultado, se puede recuperar un mayor volumen de la fracción soluble.

Las células hospedadoras usadas en el método e integradas en el aparato según la invención son células procariotas, tales como bacterias, especialmente células de E. ^coI^í .

Preferentemente, en el método según la invención, la etapa b) comprende una mezcla de las células con el medio de lisis (alcalino) añadido. Preferentemente, la mezcla se hace en una mezcladora estática, comprendiendo esta mezcladora estática preferentemente al menos 6 elementos de mezcla, preferentemente entre 12 elementos de mezcla y 24 elementos de mezcla, más preferentemente 18 elementos de mezcla. Preferentemente, la velocidad lineal de mezcla es igual o superior a 150 cm/min; preferentemente comprendida entre (aproximadamente) 150 cm/min y (aproximadamente) 2000 cm/min, más preferentemente comprendida entre (aproximadamente) 500 cm/min y (aproximadamente) 1500 cm/min.

Preferentemente, en el método según la invención, la etapa c) comprende una mezcla de la mezcla de lisado celular con la disolución de neutralización. Preferentemente, la mezcla se hace en una mezcladora estática, comprendiendo esta mezcladora estática preferentemente al menos 4 elementos de mezcla, preferentemente entre 6 y 16 elementos de mezcla, más preferentemente 10 elementos de mezcla. Preferentemente, la velocidad de la mezcla lineal es igual a o superior a 100 cm/min, preferentemente comprendida entre (aproximadamente) 100 cm/min y (aproximadamente) 2000 cm/min, más preferentemente comprendida entre (aproximadamente) 340 cm/min y (aproximadamente) 1025 cm/min.

Preferentemente, en el método según la invención, la etapa d) comprende una mezcla de la mezcla de lisado celular obtenida de la etapa c) con la(s) sal(es). Preferentemente, la mezcla se hace en una mezcladora estática, comprendiendo esta mezcladora estática preferentemente al menos 2 elementos de mezcla, preferentemente entre 2 y 18 elementos de mezcla, más preferentemente 4 elementos de mezcla. Preferentemente, la velocidad de la mezcla lineal es igual a o superior a 100 cm/min, preferentemente comprendida entre (aproximadamente) 100 cm/min y (aproximadamente) 1500 cm/min, más preferentemente entre (aproximadamente) 400 cm/min y (aproximadamente) 1200 cm/min.

En el método y aparato de la invención, las células se mantienen preferentemente en una suspensión y se disgregan por una adición de un medio de lisis (alcalino).

Según la invención, el medio de lisis para disgregar las células puede ser una disolución alcalina que tiene un pH comprendido entre (aproximadamente) 11 y (aproximadamente) 12,5, preferentemente un pH comprendido entre (aproximadamente) 12 y (aproximadamente) 12,5. El medio de lisis puede comprender una cantidad suficiente de uno o más detergente(s).

En el método y aparato según la invención, el medio de lisis (alcalino) se puede obtener mezclando al menos una cantidad suficiente de NaOH con una cantidad suficiente de al menos un detergente. En el método y aparato según la invención, cantidades suficientes de NaOH y detergente son seleccionadas por el experto según la(s) cantidad(es) de células que necesitan ser lisadas. Más preferentemente, la mezcla se puede realizar por introducción de cantidades suficientes de cada disolución de producto reactivo (NaOH y el al menos un detergente) en una mezcladora estática, y mezclando los componentes para formar un medio de lisis (alcalino) antes de la adición de este medio de lisis (alcalino) a las células. Dicha mezcladora estática comprende preferentemente al menos al menos 6 elementos de mezcla, preferentemente entre 12 y 24 elementos de mezcla, más preferentemente 18 elementos de mezcla. Preferentemente, la velocidad de la mezcla lineal es igual a o superior a 100 cm/min.

El medio de lisis (alcalino) puede comprender entre (aproximadamente) 0,01 % y (aproximadamente) 5 %, preferentemente entre (aproximadamente) 0,1 % y (aproximadamente) 3 %, más preferentemente entre (aproximadamente) 0,5 % y (aproximadamente) 3 % (p:v) de uno o más detergente(s). Preferentemente, el detergente se selecciona del grupo que consiste en dodecilsulfato de sodio (SDS), desoxicolato de sodio, Triton® X-100, Triton® X-114, Nonidet® P-40, octil-glucósido, Brij® 35, Brij® 56, Tween® 20, CHAPS(3-[(3-colamidopropil)dimetilamonio]-1-propanosulfonato), o una mezcla de los mismos.

Ventajosamente, en la etapa de disgregación del proceso (etapa b)), las células se llevan a suspensión con el medio de lisis (alcalino). Preferentemente, el tiempo de contacto óptimo entre las células y el medio de lisis (alcalino) comprende entre (aproximadamente) 15 segundos y (aproximadamente) 15 minutos, preferentemente entre (aproximadamente) 0,5 minutos y (aproximadamente) 5 minutos, más preferentemente (aproximadamente) 2 minutos.

Preferentemente, la disolución de neutralización es una disolución de ácido acético/acetato que tiene un pH comprendido entre (aproximadamente) 5,0 y (aproximadamente) 6,0, preferentemente de (aproximadamente) 5,5. Preferentemente, la disolución de neutralización tiene una concentración de aproximadamente 3 M (mol/l) de acetato y aproximadamente 15 % (v:v) de ácido acético.

Preferentemente, la disolución de neutralización, en particular la disolución de ácido acético/acetato mencionada anteriormente, se enfría desde temperatura ambiente hasta una temperatura comprendida entre (aproximadamente) 2 °C y (aproximadamente) 8 °C, preferentemente de (aproximadamente) 4 °C. Esta etapa se obtiene por métodos bien conocidos por el experto en la técnica, preferentemente almacenando el tampón en una sala fría durante una cantidad de tiempo suficiente o usando un crióstato adecuado conectado a un intercambiador de calor que rodea al elemento de tubo que lleva la disolución de neutralización.

Ventajosamente, el tiempo de contacto óptimo de las células lisadas, que comprende la(s) secuencia(s) de ácidos nucleicos extracromosómica(s) de interés, y la disolución de neutralización comprende entre (aproximadamente) 15 segundos y (aproximadamente) 5 minutos, preferentemente entre (aproximadamente) 30 segundos y (aproximadamente) 2 minutos, más preferentemente de (aproximadamente) 1 minuto.

Ventajosamente, el tiempo de contacto óptimo del lisado neutralizado y la disolución de precipitación es superior a 1 minuto, siendo este periodo adecuado para obtener la precipitación requerida.

Ventajosamente, el tiempo óptimo de la separación (decantación o clarificación) de la etapa f) del método según la invención comprende entre (aproximadamente) 5 minutos y varias horas, preferentemente entre (aproximadamente) 15 minutos y (aproximadamente) 2 horas.

El método de la invención puede comprender opcionalmente una etapa preliminar entre la etapa a) y la etapa b) que comprende (o que consiste en) la adición de una cantidad suficiente de RNasa a la suspensión de (todas) las células que comprenden la(s) secuencia(s) de ácidos nucleicos extracromosómica(s) de interés. La cantidad de RNasa añadida se define por el experto según el tipo y la cantidad de secuencia(s) de interés a purificar y este tratamiento con RNasa es especialmente útil para una purificación de ADN de plásmido que tiene un tamaño inferior a 3000 bases (pares de bases).

La sal hidratada añadida preferida del método según la invención es CaCl2.5H2O que se añade a una concentración comprendida entre (aproximadamente) 2 M y (aproximadamente) 6 M, preferentemente a una concentración de aproximadamente 5 M.

En el método o aparato de la invención, el proceso continuo o las etapas de adición continua se realizan por una abertura y cierre de entradas / salidas, bombas o válvulas y estas salidas de las bombas se controlan ventajosamente pesando los tanques, depósitos, viales o recipientes de las disoluciones de alimentación de la invención, o por integración de caudalímetros en el (los) tubo(s) que conectan estos tanques.

En el método y aparato de la invención, la etapa de filtración se hace en filtros de profundidad o sobre filtros de superficie.

La etapa de cromatografía (etapa i)) opcionalmente presente en el método de la invención comprende (o consiste en) una o más etapas de purificación clásicas bien conocidas por el experto en la técnica.

Opcionalmente, después de esta subetapa de lavado y antes de la subetapa de elución, otra subetapa de lavado se puede realizar con la misma disolución complementada con uno o más detergente(s) neutro(s). Preferentemente, este detergente neutro se selecciona del grupo que consiste en Triton® X-100, Triton® X-114, Tween® 20, Nonidet® P-40, octilglucósido, Brij® 35, Brij® 56, o una mezcla de los mismos. Preferentemente, dicho detergente neutro está presente en la disolución a (aproximadamente) 0,1 % al (aproximadamente) 1 %. Esta segunda subetapa de lavado opcional puede ir seguida de una subetapa de lavado adicional y esta subetapa adicional se realiza preferentemente sin que esté presente detergente neutro.

El método y el aparato de la invención permiten la producción y purificación de grandes cantidades de secuencia(s) de ácidos nucleicos extracromosómica(s) de interés, desde menos de un gramo hasta cientos de gramos, kilogramos, hasta toneladas. Sin embargo, en el proceso según la invención, la etapa de precipitación opcional (etapa d)) se puede sustituir por otras etapas de purificación antes o después de las etapas h) a j) para obtener la(s) secuencia(s) de ácidos nucleicos extracromosómica(s) de interés de pureza deseada.

La invención también se refiere a un aparato para llevar a cabo el método según la presente invención. El aparato de la presente invención comprende (o consiste en) medios para obtener un flujo continuo, tal como conductos circulares o elementos de tubo, posiblemente conectados a tanques adecuados, depósito(s), viales o envase(s), y que tienen medios de entrada o abertura y medios de desagüe o salida.

Ventajosamente, el (los) tubo(s) del aparato son de acuerdo a los requisitos para su uso en medicina humana, especialmente con calidad farmacéutica, y preferentemente son no lixiviables y se unen mediante "conexiones de tipo Y".

El aparato de la presente invención comprende o consiste preferentemente en:

- una unidad de preparación que comprende uno o más tanques que contienen compuestos de un medio de lisis (alcalino), comprendiendo el (los) tanque(s) una o más salidas a las que el (los) tanque(s) están conectados de forma fluida, preferentemente por uno o más tubo(s), con la una entrada de una unidad de lisis celular, siendo esta entrada preferentemente distinta de la entrada para la introducción de las células del tanque de suspensión de células a la unidad de lisis celular,

- una unidad de lisis celular que comprende un tanque de suspensión de células que contiene células con la(s) secuencia(s) de ácidos nucleicos extracromosómica(s) de interés, comprendiendo la unidad de lisis celular al menos una entrada que está conectada de forma fluida, preferentemente por uno o más tubo(s), con el tanque de suspensión de células y con la(s) salida(s) de la unidad de preparación, que comprende además al menos una salida que está conectada de forma fluida, preferentemente por uno o más tubo(s), con la(s) entrada(s) de una unidad de neutralización,

- una unidad de neutralización que comprende un tanque de medio de neutralización, al menos una entrada y al menos un desagüe o salida, estando la entrada en conexión fluida, preferentemente por uno o más tubo(s), con el tanque de medio de neutralización y con el desagüe(s) o salida(s) de la unidad de lisis celular, y estando la(s) salida(s) conectadas de forma fluida con la(s) entrada(s) de una unidad de separación (decantación o clarificación), o con una unidad de precipitación opcional,

- opcionalmente una unidad de precipitación que comprende al menos una entrada, al menos un desagüe o salida y un tanque que contiene una disolución de sales, estando la entrada(s) en conexión fluida, preferentemente por uno o más tubo(s), conteniendo el tanque una disolución de sales y con el desagüe(s) o salida(s) de la unidad de neutralización, y estando la salida conectada de forma fluida, preferentemente por uno o más tubo(s), con la entrada de la unidad de separación,

- una unidad de separación (decantación o clarificación) que comprende un tanque de separación (decantación o clarificación) para una mezcla de lisado celular, que tiene al menos una entrada y al menos un salida, estando la entrada(s) conectada de forma fluida con la salida de la unidad de neutralización, o según lo requiera el caso, de la unidad de precipitación, comprendiendo el tanque de separación preferentemente medios para recuperar la fracción soluble que comprende la(s) secuencia(s) de ácidos nucleicos extracromosómica(s) de interés de la mezcla de lisado celular, y

- una unidad de inyección, en particular una unidad de flotación, que comprende medios para disolver un gas en un medio acuoso líquido a una presión superior a presión atmosférica y medios para inyectar el medio acuoso líquido que comprende un gas disuelto en el tanque de separación.

Preferentemente, el medio acuoso líquido es agua y este medio acuoso líquido está saturado ventajosamente con un gas disuelto, siendo este gas preferentemente aire, CO², N² , O² , ozono o una mezcla de los mismos. Más preferentemente, los medios para inyectar el medio acuoso líquido que comprende un gas disuelto en el tanque de separación comprende al menos una tubería de inyección que tiene una salida, preferentemente una boquilla de salida orientada hacia la superficie inferior del tanque de separación (decantación o clarificación). Preferentemente, la salida, preferentemente la boquilla de salida, está dispuesta en el tanque de separación a una altura, medida desde la superficie inferior del tanque, comprendida entre (aproximadamente) 1/6 y (aproximadamente) 5/6 de la altura total del tanque, más preferentemente entre (aproximadamente) 1/4 y (aproximadamente) 2/4 de la altura total del tanque. Esta posición evita ventajosamente la resuspensión de los contaminantes precipitados e impurezas que ya están siendo separados.

Preferentemente, los medios para disolver un gas en un medio acuoso líquido comprenden un tanque de medio acuoso líquido, preferentemente un tanque de agua, y un dispositivo de burbujeo. Este dispositivo de burbujeo comprende preferentemente un tubo, tal como una tubería, conectada con un recipiente de gas y, preferentemente, un caudalímetro también está conectado con el tubo, y una bomba está conectada de forma fluida entre el tubo y este recipiente de gas. El dispositivo de burbujeo proporcionó burbujeo controlado del gas desde el recipiente de gas en el medio acuoso líquido para obtener un medio acuoso líquido que comprende un gas disuelto. Preferentemente, este dispositivo de burbujeo está configurado para inyectar gas en el tanque de medio acuoso líquido a una presión superior o igual a 1 barg, preferentemente entre 2 barg y 50 barg, preferentemente entre 3 barg y 25 barg, y ventajosamente en un volumen comprendido entre (aproximadamente) el 5 % y (aproximadamente) el 20 % v/v en comparación con el volumen de la mezcla de lisado celular a tratar.

En el aparato según la invención, la relación entre el diámetro interno de la tubería de inyección de medio acuoso líquido y su diámetro de boquilla de salida puede ser (aproximadamente) 1 o cerca del valor de 1, pero preferentemente es superior a (aproximadamente) 3, más preferentemente superior a (aproximadamente) 5, pero preferentemente inferior a 50. Esta tubería de inyección específica y combinación de boquilla garantiza que la presión en el interior de la tubería de inyección no disminuya por debajo del 90 % del valor inicial durante la inyección del medio acuoso líquido que comprende el gas disuelto. Esto previene una desgasificación temprana dentro de la tubería de inyección en lugar de en el interior de la mezcla de lisado celular, y mejora la calidad y la cantidad de purificación. Después de la inyección del medio acuoso líquido que comprende un gas disuelto en el tanque de separación que se mantiene a presión atmosférica, el medio acuoso líquido pierde su gas disuelto, que genera en la mezcla de lisado celular (una niebla de) (micro)burbujas que tienen un diámetro promedio más pequeño de o igual a 1,5 mm, preferentemente más pequeño de o igual a 1 mm o incluso más pequeño de o igual a 0,5 mm.

En el aparato según la invención, la tubería de inyección de la unidad de inyección está separada de la entrada donde el tubo entre la unidad de separación o tanque y la salida(s) de la unidad de neutralización o la unidad de precipitación. Por consiguiente, el medio líquido acuoso que comprende un gas disuelto se inyecta en el tanque de separación por una entrada separada o tubo distinto de la entrada para la mezcla de lisado celular.

El aparato según la invención puede incluir además cualquier elemento de mezcla conocido, tal como medios que generan un efecto de Venturi (es decir, como se describe en la solicitud de patente internacional WO2010/0136503 descrita en el presente documento como referencia), opcionalmente combinados con una o más mezcladora(s) estática(s) para la mezcla eficiente de los fluidos.

En el aparato según la invención, la unidad de preparación comprende o un único tanque que contiene el medio de lisis o dos o más tanques separados que contienen sus componentes diferentes, el (los) tanque(s) están conectados a la unidad de lisis celular por un primer (conjunto de) tubo(s), por una (o varias) bomba(s), una primera mezcladora estática, que comprende preferentemente al menos 6 elementos de mezcla, teniendo esta primera mezcladora estática una entrada y un desagüe o salida, en donde esta entrada está conectada con el (los) tubo(s) que viene(n) de la(s) bomba(s) del medio de lisis (alcalino) o sus componentes separados, y en donde el desagüe o salida está conectado, por un segundo tubo o más tubos, con la unidad de lisis celular. El tamaño de la primera mezcladora estática (es decir, el número de elementos de mezcla introducidos), así como el diámetro y la longitud de la primera mezcladora estática y la(s) salida(s) de la bomba(s), se seleccionan para permitir una velocidad lineal de mezcla de los elementos introducidos en la primera mezcladora estática, que preferentemente es superior a 100 cm/min.

El aparato según la invención también puede comprender una unidad de lisis celular compuesta de una segunda mezcladora estática, preferentemente una segunda mezcladora estática que comprende entre 12 y 24 elementos de mezcla, preferentemente 18 elementos de mezcla, teniendo esta segunda mezcladora estática una entrada y un desagüe o salida, estando la entrada conectada por el (los) segundo(s) tubo(s) con la salida de la unidad de preparación y estando conectada por un tercer tubo o más tubos y una bomba con la salida del tanque de suspensión de células que contiene la suspensión de células, y el desagüe o salida de la segunda mezcladora estática que está conectada con un cuarto tubo o más tubos. El tamaño de la segunda mezcladora estática y las salidas de las bombas se seleccionan para permitir una velocidad de mezcla lineal de las disoluciones introducidas en la segunda mezcladora estática que comprende entre (aproximadamente) 1000 cm/min y (aproximadamente) 1500 cm/min.

El aparato según la invención puede comprender además una tercera mezcladora estática, preferentemente una tercera mezcladora estática que comprende entre 6 elementos de mezcla y 16 elementos de mezcla, preferentemente 10 elementos de mezcla, teniendo esta tercera mezcladora estática una entrada y un desagüe o salida, estando la entrada conectada con un cuarto tubo que viene de la salida de la unidad de lisis celular y que está conectada, por un quinto tubo y una bomba, con un tanque de medio de neutralización, estando conectado el desagüe o salida de la tercera mezcladora estática con un sexto tubo o más tubos. El tamaño de la tercera mezcladora estática y las salidas de las bombas se seleccionan para permitir una velocidad lineal de mezcla de las disoluciones introducidas en la tercera mezcladora estática que comprende preferentemente entre (aproximadamente) 340 cm/min y (aproximadamente) 1025 cm/min.

El aparato según la invención puede comprender además una cuarta mezcladora estática, preferentemente una cuarta mezcladora estática que comprende entre 4 y 18 elementos de mezcla, teniendo esta cuarta mezcladora estática una entrada y un desagüe o salida, estando la entrada conectada con un sexto tubo que viene de la unidad de neutralización y conectado por un séptimo tubo y una bomba, con un tanque que contiene una disolución de sales (divalentes), y en donde el desagüe o salida está conectado por un octavo tubo con un tanque de separación (o decantación). El tamaño de la cuarta mezcladora estática y las salidas de las bombas se seleccionan para permitir una velocidad lineal de mezcla de las disoluciones introducidas en la cuarta mezcladora estática que comprende preferentemente entre (aproximadamente) 400 cm/min y (aproximadamente) 1200 cm/min.

La posición de las bombas como se representa en las figuras también mejora la eficiencia del tratamiento, debido a que la posición respectiva de las bombas como se representa puede permitir ventajosamente un empuje (el flujo) de fluidos en el (los) tubo(s), en lugar de una extracción de fluidos en este (estos) tubo(s), lo que significa que el producto tratado no es afectado por las fuerzas de cizallamiento que ocurren en los cabezales de las bombas que podrían dañarlo y reducir su calidad.

Preferentemente, el aparato de la invención comprende además medios para pesar las denominadas disoluciones de alimentación (es decir, la disolución de neutralización, disolución de lisis, ...) presentes en los diferentes tanques, depósitos, bolsas o recipientes y/o comprende uno o más caudalímetro(s), para controlar la introducción de los diferentes medios o células o células fracciones en el (los) tubo(s). Esto significa que el método de la invención puede comprender etapas que se realizan continuamente y etapas que se realizan en un lote después de la secuencia discontinua. Preferentemente, la etapa de neutralización se realiza en un lote después de la secuencia discontinua.

Una alternativa al método o aparato Z que no es parte de la invención se refiere al método y aparato descrito que incluye la etapa de separación y la unidad de separación descritas sin inyección de un medio acuoso líquido que comprende gas disuelto y sin la unidad de inyección para inyectar un medio acuoso líquido que comprende gas disuelto, pero que incluirá, junto con las características técnicas anteriormente descritas, una o más de la(s) mezcladora(s) estática(s) anteriormente descritas y una o más o toda(s) la(s) etapa(s) de mezcla que comprenden el uso de una o más de la(s) mezcladora(s) estática(s).

El método y aparato según la presente invención se describe con referencia a las figuras adjuntas en la siguiente descripción detallada presentada como una realización preferida no limitante.

Breve descripción de las figuras

La Figura 1 representa esquemáticamente el aparato de la invención.

Las Figuras 2 y 3 representan diferentes configuraciones de la unidad de separación del aparato según la invención.

La Figura 4 representa la unidad de inyección conectada con la unidad de separación del aparato según la invención.

La Figura 5 representa una unidad de filtración conectada con la unidad de separación del aparato según la invención.

La Figura 6 representa los resultados de separación obtenidos con los métodos y el aparato del estado de la técnica.

La Figura 7 representa los resultados de separación obtenidos con el método y el aparato según la invención.

Descripción detallada de la invención

La Figura 1 ilustra el aparato que permite llevar a cabo etapas del método de la presente invención, que es una tubería o conducto de varios metros de longitud, fabricada de varios conductos o elementos de tubo que tienen sección circular y están conectados (o unidos) juntos de forma fluida y conectados a mezcladoras estáticas y tanques o depósitos.

Preferentemente, el aparato y el método según la invención se dedican a la recuperación y a la purificación de células, de secuencia(s) de ácidos nucleicos extracromosómica(s), tales como plásmido(s) de ADN que se purificarán de impurezas de células (o contaminantes), especialmente de contaminantes de E. ^coI^í, tales como proteínas de células hospedadoras, secuencias de ARN, secuencias de ADN genómico, endotoxinas,...

El aparato usado en el método según la invención comprende o consiste en varias unidades que están conectadas de forma fluida e incluyen una unidad de preparación 1, una unidad de lisis celular 20, una unidad de neutralización 30, opcionalmente una unidad de precipitación 40, una unidad de separación (decantación o clarificación) 50, una unidad de inyección 70 y una unidad de filtración.

Además, la unidad de lisis celular 20 se podría conectar de forma fluida con una unidad de producción (que incluye un tanque de reacción no representado en las figuras), pero usado para el crecimiento y la multiplicación de células que comprenden la(s) secuencia(s) de ácidos nucleicos extracromosómica(s) de interés a recuperar.

En el pasadizo del aparato según la invención, el seguimiento de los caudales se obtiene por cronómetros, monitorización del peso y/o por medidores de flujo añadidos a los diferentes tubo(s) y las conexiones entre tubo(s) son del "tipo Y".

La primera parte del aparato según la invención es una unidad de preparación 1 que puede presentar dos formatos diferentes. Según una primera realización, no presentada en las figuras, el aparato según la invención contiene un tanque de medio de lisis o depósito con el medio de lisis (alcalino) conectado por un primer tubo y una bomba y posiblemente un caudalímetro, a la unidad de lisis 20 para mezclar las células con el medio de lisis (alcalino) añadido.

Según otra realización de la presente invención y como se presenta en las figuras, la unidad de preparación 1 se fabrica ventajosamente de al menos dos tanques separados (2 y 3), ambos mantenidos a temperatura ambiente, conteniendo el primer tanque 2 NaOH (RM2-A) y conteniendo el segundo tanque 3 uno o más detergentes (RM2-B), preferentemente dodecilsulfato de sodio (SDS).

Ambos tanques 2 y 3 están en conexión fluida respectivamente con un primer conjunto de elementos de tubo 4 y 5, preferentemente por una primera bomba 6 y una segunda bomba 7, en donde estas bombas (6 y 7) están controlando las cantidades añadidas adecuadas de cada producto reactivo (NaOH, detergente y posiblemente una o varias de otras moléculas) se mezclan y se alimentan a una primera mezcladora estática 9 para formar la disolución de lisis.

Los compuestos reactivos presentes en los tubos del primer conjunto de tubos (4 y 5) se encuentran en una conexión de "tipo Y" y son empujados, por una entrada o abertura 8, en la primera mezcladora estática 9 usada para la mezcla homogénea eficiente de todos los compuestos introducidos, para formar el tampón de lisis (medio de tampón RM2). Esta mezcla asegura la estabilidad y la calidad constante de la composición del medio de lisis (alcalino). Una mezcla homogénea significa una mezcla que es homogénea a simple vista.

El desagüe o salida 10 de esta primera mezcladora estática 9 de la unidad de preparación 1 está en conexión fluida, por un segundo tubo 11, con la entrada o abertura 21 de una segunda mezcladora estática 22 que es parte de la unidad de lisis celular 20. Preferentemente, la segunda mezcladora estática 22 de la unidad de lisis celular 20 comprende entre 12 y 24 elementos de mezcla, preferentemente 18 elementos de mezcla.

La unidad de lisis celular 20 es el pasadizo descrito anteriormente y preferentemente incluye la segunda mezcladora estática 22, que está en conexión fluida por una conexión de "tipo Y" en su entrada 21, con tanto el segundo tubo 11 de la unidad de preparación 1, como por un tercer tubo 23 y una bomba 24, con un tanque de suspensión de células 25 que contiene a una temperatura adecuada, preferentemente una temperatura comprendida entre aproximadamente 2 °C y aproximadamente 8 °C, las células suspendidas con la(s) secuencia(s) de ácidos nucleicos extracromosómica(s) a recuperar.

La lisis o la disgregación de las células se realiza mediante la adición del tampón de lisis de células, que es preferentemente una mezcla de NaOH SDS, de la primera mezcladora estática 9 y las células suspendidas del tanque de suspensión de células 25 a la segunda mezcladora estática 22. Aunque la disolución generada de células disgregadas es viscosa, se obtuvo una homogeneización eficiente sin degradar el plásmido.

Los inventores han optimizado el diámetro del tubo y las longitudes y la salida de la bomba para evaluar el tiempo de contacto medio óptimo de las células y el tampón de lisis. El aparato que desarrollaron permite sorprendentemente tiempos de contacto medios cortos, tales como menos de 5 minutos, preferentemente entre (aproximadamente) 1 minuto y (aproximadamente) 5 minutos, más preferentemente (aproximadamente) 2 minutos, que previene ventajosamente la degradación de la(s) secuencia(s) de ácidos nucleicos extracromosómica(s) de interés, preferentemente el plásmido de ADN.

El desagüe o la salida 26 de esta segunda mezcladora estática 22 está en conexión fluida con las características de la unidad de neutralización 30, por un cuarto tubo 27 que tiene una longitud y diámetro adecuados que permite obtener el tiempo de contacto óptimo para la recuperación del lisado celular.

La unidad de neutralización 30 comprende un tanque de neutralización 31 que contiene un medio de neutralización (RM3), preferentemente compuesto de una disolución de ácido acético y acetato, preferentemente mantenida a un pH comprendido entre aproximadamente 5,0 y aproximadamente 6,0, preferentemente de aproximadamente 5,5 y que consiste en 3 M de acetato y 15 % (v:v) de ácido acético, usada preferentemente a una temperatura comprendida entre 2 °C y 8 °C, preferentemente de aproximadamente 4 °C.

Este tanque de neutralización 31 está en conexión fluida, por un quinto tubo 32 y por una bomba 33, con una entrada o abertura 34 de una tercera mezcladora estática 35. El medio de neutralización se puede enfriar antes de uso por almacenamiento del tanque de neutralización 31 en una sala fría durante una cantidad suficiente de tiempo, o refrigerar de una manera continua desde la temperatura ambiente (comprendida entre 20 °C y 25 °C) hasta una menor temperatura comprendida entre 2 °C y 8 °C, preferentemente de aproximadamente 4 °C, por un crióstato 36 y un intercambiador de calor 39 que rodea una sección del quinto tubo 32.

La entrada o abertura 34 de esta tercera mezcladora estática 35 también está en conexión fluida con el cuarto tubo 27 que proporciona el lisado celular. Preferentemente, esta tercera mezcladora estática 35 comprende entre 6 y 16 elementos de mezcla, preferentemente 10 elementos de mezcla.

La entrada 34 de esta tercera mezcladora estática 35 está preferentemente en conexión fluida por una conexión de "tipo Y" con los dos elementos de tubo 32 y 27, de manera que ambos flujos de líquido sean enviados a la mezcladora estática 35 para obtener una neutralización rápida y eficiente del lisado celular para detener la reacción de lisis y para formar un lisado celular neutralizado.

Los inventores han optimizado además el diámetro y la longitud del tubo, y la salida de la bomba para evaluar el tiempo de contacto medio óptimo de las células lisadas en neutralización. El aparato desarrollado permite un tiempo de contacto medio corto, tal como inferior a 3 minutos, preferentemente de (aproximadamente) 0,5 minutos a (aproximadamente) 3 minutos, más preferentemente (aproximadamente) 1 minuto, que conduce ventajosamente a una neutralización eficiente de las células lisadas antes de la adición del agente de precipitación.

El desagüe o salida 37 de esta tercera mezcladora estática 35 está en conexión fluida con un sexto tubo 38 que recoge la mezcla de lisado neutralizado obtenida. El sexto tubo 38 se puede dirigir a y está en conexión fluida con la entrada o abertura 45 de una cuarta mezcladora estática 41 que forma parte de la unidad de precipitación 40.

La entrada o abertura 45 de la cuarta mezcladora estática 41 también está en conexión fluida con un séptimo tubo 42, por una bomba 43, con un tanque de disolución de sal(es) divalente(s) 44 que comprende una disolución de sal(es) de iones divalentes (RM4), preferentemente cloruro de calcio hidratado.

Nuevamente, una conexión de "tipo Y" se usa preferentemente entre ambos tubos 38 y 42, de manera que ambos flujos de líquido se envíen a la cuarta mezcladora estática 41 para obtener una mezcla rápida y eficiente. Una disolución de sal(es) divalente(s) bombeada desde el tanque 44, por el séptimo tubo 42 a la entrada 45 de la cuarta mezcladora estática 41, se añade continuamente al lisado celular neutralizado añadido en la cuarta mezcladora estática 41 desde el sexto tubo 38 para obtener una mezcla de lisado celular. Esta cuarta mezcladora estática 41 asegura una mezcla completa de las disoluciones densas y viscosas y mejora la reacción de precipitación. Sin embargo, otros medios distintos de estas mezcladoras estáticas, que incluyen medios para generar un efecto de Venturi, se pueden usar para la eficiente mezcla de fluidos, que incluye la disolución de sal(es) divalente(s) densa(s) y viscosa(s) obtenida del tanque 44.

Esta cuarta mezcladora estática 41 comprende entre 4 elementos de mezcla y 18 elementos de mezcla, preferentemente solo 4 elementos de mezcla. Un número óptimo de 10 elementos de mezcla se podría seleccionar para una mezcla eficiente de las sales y las células lisadas neutralizadas para obtener la mezcla de lisado celular. Sin embargo, como un mayor número de elementos de mezcla producirá partículas más pequeñas y precipitado, que se eliminan menos fácilmente de la fracción soluble durante la separación (decantación o clarificación) y reduciría el rendimiento de producción y purificación y aumentaría el tiempo de purificación.

El desagüe o salida 46 de la cuarta mezcladora estática 41 está en conexión fluida, por un octavo tubo 47, con un tanque de separación 51 de la unidad de separación 50. La mezcla de lisado celular 52 se suministra a este tanque de separación 51 desde la cuarta mezcladora estática 41. Será conveniente observar que la cuarta mezcladora estática 41 es opcional, y el tubo 38 puede ser directamente alimentado al tanque de separación 51 de la unidad de separación (o decantación o clarificación) 50.

En el aparato según la invención, la unidad de separación 50 se usa para la separación, decantación o clarificación de una mezcla de lisado celular 52 de la(s) secuencia(s) de interés de impurezas (o contaminantes) y mejora el rendimiento, especialmente el retraso y la eficiencia de separación, decantación o clarificación, y mejora la recuperación de la(s) secuencia(s) de ácidos nucleicos extracromosómica(s) de interés de esta mezcla de lisado celular 52.

La unidad de separación 50 representada en las Figuras 2 y 3 está conectada a una unidad de inyección (flotación) 70 representada en la Figura 4 y que permite la inyección en el interior del tanque de separación 51 de un medio acuoso líquido, más preferentemente agua, que comprende grandes cantidades de un gas disuelto que es preferentemente aire, nitrógeno, CO² , oxígeno u ozono, más preferentemente aire en el tanque de separación 51. Este medio acuoso líquido se mantiene a temperatura ambiente con el gas, preferentemente aire, y se introduce a una presión adecuada, preferentemente una presión de al menos 2 barg.

La separación, decantación o clarificación mejora eficientemente por medio de una inyección de este medio acuoso líquido, preferentemente agua que comprende niveles saturados o casi saturados del gas disuelto, seleccionado preferentemente del grupo que consiste en aire, CO² o nitrógeno, o una mezcla de los mismos, por una o más tubería(s) de inyección 53 que tienen una salida 54, que comprenden posiblemente una boquilla en la mezcla de lisado celular 52 presente en el tanque de separación 51. La salida 54 de esta tubería de inyección 53 está dispuesta en la dirección opuesta a la superficie 55 de la mezcla de lisado celular 52 presente en el tanque de separación 51 y hacia o en la dirección de la superficie inferior 58 del tanque de separación 51.

Como se representa en la Figura 3, la configuración de la unidad de decantación 50 puede incluir un tanque de separación 51 en donde más de una tubería(s) de inyección 53 se introduce, preferentemente dos, tres o cuatro tuberías de inyección 53, posiblemente dispuestas en posiciones diagonalmente opuestas en el tanque de separación 51, preferentemente con una salida 54 de cada tubería de inyección 53 que está dispuesta en el mismo plano paralelo al plano formado por la parte inferior del tanque de separación 51 y ventajosamente a distancia equivalente entre sí y desde las paredes y el fondo del tanque de decantación. En la Fig. 3 se representan cuatro tuberías de inyección 53 en posiciones diametral o diagonalmente opuestas.

Como se representa en la Figura 3, la salida 54 de cada tubería de inyección 53 está dispuesta en dirección opuesta a la superficie superior 55 de la mezcla de lisado celular 52 presente en el tanque de separación 51 y esta salida 54 está orientada hacia la superficie inferior del tanque 58, pero orientada para inyectar el medio acuoso líquido verticalmente hacia abajo de la dirección de esta superficie inferior 58. Esta configuración evita la formación de un importante movimiento de convección en el lisado celular y evita la dispersión de los precipitados o flóculos desde la capa de precipitado superior.

En la unidad de separación 50 del aparato según la invención, la mezcla de lisado celular 52 se introduce por el octavo tubo 47 dispuesto a lo largo de la pared lateral del tanque de separación 51 y llena parcialmente el tanque de separación 51. Debería quedar un volumen libre en este tanque de separación 51 suficiente para manipular la adición del medio acuoso líquido saturado con gas a presión.

La salida 54 de la(s) tubería(s) de inyección 53 está situada ventajosamente a una altura 57 desde el fondo del tanque de separación 51 entre 1/6 y 5/6 de la altura 56 de este tanque de separación 51, más ventajosamente situada a una altura 57 desde el fondo del tanque de separación 51 entre 1/4 y 3/4.

La tubería de inyección 53 puede presentar una salida de boquilla 54, con una salida estrecha. Ventajosamente, la tubería de inyección 53 presenta una relación entre su diámetro interno y el diámetro de su salida de boquilla 54 que es superior o igual a (aproximadamente) 2, más preferentemente superior o igual a (aproximadamente) 3, y puede ser inferior o igual a 50. Esta configuración y relación entre el tamaño de la tubería en diámetro interno y su salida de boquilla garantizan que la despresurización del medio acuoso líquido solo empiece en la boquilla en sí, y no dentro del tubo de inyección 53. Haciendo esto, el medio acuoso líquido con el gas disuelto se mantiene a una presión elevada adecuada hasta la boquilla de salida, por lo que la presión disminuye en la salida de la boquilla solo. Sin embargo, en una configuración específica del aparato de la invención que permite la producción de menores cantidades de secuencia(s) de ácidos nucleicos extracromosómica(s) de interés, esta relación es de (aproximadamente) 1 o cerca del valor de 1 con una tubería de inyección 53 que ni incluye una boquilla ni una reducción de la salida 54 diámetro. Como resultado, se puede obtener una rápida y eficiente separación, clarificación o decantación de la mezcla de lisado celular 52 de sus contaminantes o impurezas, que se dispersan en el tanque de separación 51. Los contaminantes o impurezas flotarán en la superficie superior 55 de la mezcla de lisado celular 52. Preferentemente, esta duración de la separación comprende entre (aproximadamente) 5 minutos y (aproximadamente) 3 horas, pero se podría aplicar para periodos más largos de hasta 1 o 2 días.

Como se representa en la Figura 4, el medio acuoso líquido añadido que contiene el gas disuelto se obtiene de la tubería de inyección 53 que está conectada, preferentemente a través de una válvula 71, a la unidad de inyección o de flotación 70.

La unidad de inyección (o flotación) 70 comprende un tanque 72 que contiene un medio acuoso líquido, preferentemente agua. Este tanque de medio acuoso líquido 72 comprende una entrada, ventajosamente dispuesta en una parte más baja del tanque 72, que está conectada, preferentemente por una válvula 73, a un elemento de tubo 74 de un dispositivo de burbujeo, que suministra en el tanque de medio acuoso líquido 72 un gas, preferentemente aire. Se pueden conectar elementos de tubo adicionales (75 y 76) y válvulas (77 y 78) para una introducción y expulsión de gas (aire) al tanque de medio acuoso 72.

El tanque de medio acuoso líquido 72 es ventajosamente un recipiente cerrado dispuesto para contener un líquido a presión elevada adecuada. El tanque de separación (o decantación) 51 está configurado ventajosamente para contener la mezcla de lisado celular 52 a presión sustancialmente atmosférica.

El medio acuoso líquido está enriquecido y ventajosamente saturado con el gas disuelto a presión, por un burbujeo del gas presurizado obtenido del dispositivo de burbujeo en el medio acuoso líquido. De esta forma, este medio acuoso líquido se enriquece en el gas disuelto (ley de Henry). Ventajosamente, el burbujeo se realiza durante una cantidad suficiente de tiempo para alcanzar la saturación completa. La presión en el tanque de medio acuoso líquido 72 se mantiene constante ventajosamente durante el burbujeo, a un valor de 2 barg o más, preferentemente entre 2 barg y 50 barg, más preferentemente entre 3 barg y 25 barg.

El medio acuoso líquido enriquecido en gas disuelto se inyecta en el tanque de separación 51 ventajosamente durante un periodo comprendido entre algunos segundos y algunos minutos, preferentemente entre 5 segundos y 5 minutos. Preferentemente, en el método y aparato según la invención, el % en volumen del medio acuoso líquido inyectado comprende entre 0,2 % y 25 % (v/v), preferentemente comprende entre 0,5 % y 15 %, más preferentemente comprende entre 1 % y 10 %, en comparación con el volumen de la mezcla de lisado celular (decantada).

Refiriéndose de nuevo a las Figuras 2 y 3, el tanque de separación 51 incluye además un tubo de recogida 61 para la recuperación de la fracción soluble o fase clarificada que contiene la(s) secuencia(s) de ácidos nucleicos extracromosómica(s) de interés, de la mezcla de lisado celular 52 presente en el tanque de separación 51.

La entrada del tubo de recogida 61 se dispone ventajosamente en la parte inferior del tanque de separación 51 para obtener un bombeo eficiente de la fracción soluble o fase clarificada minimizando los movimientos de líquido en el tanque de separación 51 para evitar una resuspensión de los precipitados de contaminantes o impurezas. El tubo 61 retira ventajosamente la fracción soluble del tanque de separación 51 en la parte inferior 57, por debajo del nivel de salida 54 de la tubería de inyección 53. El tubo 61 se puede conectar a una unidad de filtración.

También se puede realizar una purificación adicional con medios conocidos (tales como filtros, columnas cromatográficas y tanques de recogida) y etapas de método bien conocidas por el experto.

Como se representa en la Figura 5, el flujo de esta fracción soluble o fase clarificada de la mezcla de lisado celular, fuera del tanque de separación 51, se obtiene ventajosamente a través de la abertura de una válvula 62 y una bomba 63 conectada a otra sección de un elemento de tubo 64 que permite el flujo de la fracción soluble o fase clarificada de la mezcla de lisado celular hacia otra unidad de filtración 60 para su purificación adicional con etapas de métodos bien conocidas por el experto. Esta unidad de filtración puede comprender uno o más filtros 65 y 66 y/o una o más columnas cromatográficas con material de elución adecuado. Además, durante la filtración, ultrafiltración y/o diafiltración, una o más secciones de tubo, especialmente sección (secciones) del elemento de tubo 64, podrían ser rodeadas por un dispositivo de intercambio de calor 67 conectado con un crióstato 68 para un enfriamiento del lisado filtrado y clarificado hasta una temperatura tan próxima a 4 °C como sea posible (en el intervalo de 2 °C a 8 °C), preferentemente una temperatura que se puede mantener durante un tiempo adecuado (durante la noche) en el tanque 69 adecuado (y posiblemente refrigerado).

En el aparato y método según la invención, los elementos de tubo pueden incluir caudalímetros u otros dispositivos para controlar la introducción de volúmenes adecuados (por unidad de tiempo) de los diferentes fluidos necesarios para el sistema de lisis, los tanques o depósitos. El aparato también puede incluir elementos de monitorización del peso, tales como balanzas de peso de los diferentes tanques o depósitos para medir la cantidad de disolución introducida o compuestos activos (disolución de lisis, disolución de neutralización, células en suspensión, medio acuoso líquido saturado en gas a presión) en cada etapa del método según la invención. Las condiciones y la eficiencia de purificación obtenida por el aparato y el método de la invención se resumen en la siguiente Tabla 1 que presenta una visión general de las posibles condiciones de proceso.

TABLA 1:

Son numerosas las ventajas aportadas por el nuevo proceso y aparato de la invención. Es un proceso simple y robusto, eficiente, reproducible y automatizable y se pueden usar el aparato (o planta).

Un objetivo del proceso y aparato según la invención es mantener la duración de la separación muy baja, preferentemente en un máximo de dos horas. Este objetivo se alcanzó e incluso superó, siendo la separación completa obtenida después de solo aproximadamente 1 hora o incluso menos tiempo.

Otro objetivo es obtener una separación (decantación o clarificación) robusta donde, para cada serie, casi no se dejaron partículas en el fondo del tanque de separación (51) o se dispersaron en la mezcla de lisado celular, ya que obstruyeron rápidamente los filtros de profundidad de clarificación y no deben ser bombeadas. Este objetivo se alcanzó, ya que casi todas las partículas están flotando en la parte superior del tanque de separación (decantación o clarificación) 51 después de la flotación, e incluso se supera a medida que la fracción clarificada del lisado es mucho más clara (turbidez reducida) que con una etapa de separación gravimétrica clásica. Como consecuencia, se necesitan filtros de menos profundidad para la separación, que significa menores costes, residuos, espacio necesario en la zona, manipulación, etc.

Un objetivo adicional es potenciar la recuperación de la fracción soluble (total) o fase clarificada, y también se alcanza a medida que la fracción soluble o fase clarificada perdida en la capa de precipitados se sustituye ahora por un gas, tal como aire, flotando esta capa de precipitados por encima de esta fracción soluble o fase clarificada en lugar de ser sumergida en ella. El volumen de fracción soluble recuperada o fase clarificada se ha aumentado, por lo tanto, en del 10 % al 15 %.

Un objetivo adicional del nuevo proceso y aparato de la invención es el tratamiento de grandes cantidades de sedimentos de células, preferentemente aumentando los caudales, mientras se mantiene al menos el mismo tiempo de duración del proceso (inferior a aproximadamente 4 horas) para cada escala y para obtener la recuperación de grandes cantidades (kg) de secuencia(s) purificada(s) de ácidos nucleicos extracromosómica(s) de interés.

Los inventores también han probado la inyección directa de burbujas de gas, en lugar del medio acuoso líquido que comprende el gas disuelto en la mezcla de lisado celular contenida en el tanque de separación 51. Sin embargo, la inyección de burbujas de gas genera movimientos desde abajo hacia arriba debido al ascenso de las burbujas hacia arriba y, por lo tanto, una mezcla de la fracción soluble con la capa de precipitado, que contiene impurezas y contaminantes de la(s) secuencia(s) de ácidos nucleicos extracromosómica(s) a recuperar de la mezcla de lisado celular. Esta mezcla e introducción de flóculos y otras partículas sólidas, que incluyen contaminantes de la(s) secuencia(s) de ácidos nucleicos extracromosómica(s) a recuperar en la fracción soluble o fase clarificada, reducirá la eficiencia de esta recuperación de fracción soluble y también la purificación de secuencia(s) de ácidos nucleicos extracromosómica(s).

Por otra parte, en el método y aparato según la invención, la inyección del medio acuoso líquido que comprende gas disuelto en la mezcla de lisado celular permite ventajosamente una recuperación completa o casi completa de la fracción soluble o fase clarificada que no está, o casi no está, contaminada por la capa de precipitado formada de flóculos que flotan por encima de la fracción soluble de la mezcla de lisado celular.

Además, el método y aparato según la invención no contiene frita de inyección de gas u otro material microporoso que sería necesario para reducir los tamaños de las burbujas, siendo dichos dispositivos muy propensos a ser obstruidos por las partículas precipitadas y que también son una fuente importante de contaminaciones cruzadas de lote a lote debido a su escasa capacidad para ser limpiados. El diseño del método y aparato según la invención permite, después de la recuperación de fracción soluble (o fase clarificada) del lisado celular, un rápido y eficiente lavado posterior de los medios de separación (decantación o clarificación), especialmente el tanque de separación 51 para su uso posterior, posiblemente mediante la inyección de líquido(s) de lavado de la tubería de inyección 53 o de otros elementos de tubo en este tanque de separación 51.

Después de la lisis, los precipitados tienen una densidad similar a la fase líquida (fracción soluble o fase clarificada) del lisado celular. Aún, tienden frecuentemente a subir muy lentamente hasta la parte superior del tanque de separación debido a algunas microburbujas que se pegan a ellos, que proceden de pequeñas cantidades de gas disueltas en los reactivos de partida. La adición de las burbujas de gas como se propone en la publicación del estado de la técnica, en continuo durante el proceso de lisis, es una forma de aumentar la cantidad de burbujas para ayudar a este efecto de flotación. Por otra parte, en el método del estado de la técnica, la fuerza de unión de las burbujas a los precipitados es muy baja, por lo que los movimientos de mezcla o agitación despegan fácilmente las burbujas de los precipitados, rompiendo el efecto de flotación y haciendo que se hundan otra vez.

En la salida de un sistema de lisis continuo, el lisado debe ser enviado a un tanque de separación, donde el precipitado compuesto de flóculos 101 o partículas 100 (compuestas de las impurezas de las secuencias(s) de interés a recuperar) se separan de la fracción soluble. Si el lisado celular se envía a la parte inferior (salida sumergida en el lisado celular) y si las burbujas de gas se añaden en continuo durante la lisis, como se propone en el estado de la técnica, las burbujas de gas subirán rápidamente por encima de la salida (como una bomba de aire en un acuario) y producirán una corriente ascendente dentro del lisado celular, que conduce a movimientos de mezcla que previenen que los precipitados se depositen en la parte superior del tanque de separación correctamente. Si el lisado celular se envía a la parte superior del tanque de separación, también creará movimientos de mezcla dentro de la capa superior de las partículas 100 que ya han empezado a flotar y los empujará de nuevo en la disolución, rompiendo parte del efecto de flotación. Estos movimientos de mezcla son uno de los inconvenientes del estado de la técnica que requieren la adición continua de burbujas durante el proceso de lisis. Otro inconveniente procede de la naturaleza continua del tratamiento. El nuevo lisado celular con precipitados y burbujas se añade continuamente al tanque de separación que ya contiene el lisado celular previamente generado y que ya ha empezado a depositarse. Esto conduce a heterogeneidad del tratamiento en el tanque de separación.

La presente invención aporta una disolución para evitar estos movimientos de mezcla y la heterogeneidad del tratamiento realizando la flotación en "un modo estático", cuando la lisis se acaba y el tanque de separación 51 se llena. La inyección del medio acuoso líquido con el gas disuelto a presión permite el tratamiento del volumen de lisado de células completas al mismo tiempo. Como se inyecta un líquido en lugar de un gas, se mezcla rápidamente con el volumen completo a tratar. Poco después de la inyección, debido al hecho que el tanque de separación está a presión atmosférica, el gas que se disolvió en el medio líquido a presión (es decir, en una fase líquida) se vuelve a la fase gaseosa, principalmente en contacto con las partículas que desempeñan la función de centros de nucleación. Por lo tanto, las microburbujas se pegan a los precipitados y todas las partículas ascienden al mismo tiempo de una forma lineal hasta la parte superior del tanque de separación 51, empujándose entre sí en la misma dirección. Esto crea un fuerte efecto de émbolo: las partículas que están por encima son empujadas fuera de la fracción soluble del lisado celular por las que están por debajo. Este efecto de émbolo conduce a una eficiencia de separación mucho mayor. Después del tratamiento, la mayoría de las partículas que no solo se han separado en la parte superior del tanque de separación 51, sino también empujado fuera de la fase líquida o el gas que procede de la inyección del medio líquido saturado con un gas disuelto, sustituirán el lisado celular líquido que era previamente atrapado en los espacios entre las partículas y empujarán la capa de precipitado (101), aumentando así significativamente el rendimiento de recuperación, como se muestra en la siguiente Tabla 2 y dentro de las Figuras 6 y 7 comparativas (véase el aumento de volumen 102 con el método de flotación aplicado de la invención y las partículas restantes 100 obtenidas con el método gravimétrico aplicado del estado de la técnica).

Finalmente, la presente invención se diseña de tal forma que las inyecciones sucesivas del medio líquido acuoso con el gas disuelto a presión se realicen sin dispersar otra vez las partículas que han sido separadas. Cada inyección sucesiva disminuye la cantidad de micropartículas que quedan en el lisado celular y facilita la clarificación TABLA 2

Claims (15)

REIVINDICACIONES

1. Un método de obtención de secuencia(s) de ácidos nucleicos extracromosómica(s) de células y que comprende las etapas de:

a) opcionalmente cultivar células que comprenden la(s) secuencia(s) de ácidos nucleicos extracromosómica(s) de interés,

b) disgregar las células mezclando las células suspensión con un medio de lisis para formar células lisadas,

c) neutralizar las células lisadas añadiendo una disolución de neutralización a dichas células lisadas, preferentemente una disolución de neutralización compuesta de una disolución de ácido acético/acetato, para producir una mezcla de lisado celular que comprende una fracción soluble y un precipitado,

d) opcionalmente precipitar adicionalmente contaminantes de la(s) secuencia(s) de ácidos nucleicos extracromosómica(s) de interés, mezclando la mezcla de lisado celular con una disolución que contiene una o más sal(es), en donde la(s) sal(es) se selecciona(n) del grupo que consiste en CaCl² , MgCl² , ZnCl² , SrCl² , BaCl² , LiCl, acetato de amonio, sulfato de amonio, sulfato de sodio y sulfato de magnesio, o una mezcla de los mismos,

e) recoger la mezcla de lisado celular obtenida de la etapa c) o de la etapa d),

f) separar la fracción soluble que comprende la(s) secuencia(s) de ácidos nucleicos extracromosómica(s) de interés de la mezcla de lisado celular del precipitado en un tanque de separación, y

g) recuperar la fracción soluble separada que comprende la(s) secuencia(s) de ácidos nucleicos extracromosómica(s) de interés,

en donde la etapa de separación f) comprende disolver un gas en un medio acuoso líquido a una presión superior a presión atmosférica, seguido de inyectar el medio acuoso líquido que comprende el gas disuelto en la mezcla de lisado celular contenida en el tanque de separación.

2. El método de la reivindicación 1, en donde el gas se disuelve en el medio acuoso líquido por burbujeo de gas a presión de al menos 2 barg.

3. El método de la reivindicación 1 o 2, en donde el medio acuoso líquido que comprende el gas disuelto se inyecta en la mezcla de lisado celular en una cantidad en volumen comprendida entre el 0,2 % y el 25 %, preferentemente entre el 0,5 % y el 15 %, más preferentemente entre el 1 % y el 10 % v/v, con respecto al volumen de la mezcla de lisado celular.

4. El método de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde el medio acuoso líquido que comprende el gas disuelto se inyecta en la mezcla de lisado celular a una presión de al menos 2 barg, en donde la mezcla de lisado celular está a presión atmosférica en el tanque de separación y en donde el medio acuoso líquido que comprende el gas disuelto inyectado en la mezcla de lisado celular se satura preferentemente con el gas.

5. El método de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde el medio acuoso líquido que comprende el gas disuelto se inyecta hacia abajo hacia el fondo del tanque de separación.

6. El método de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde la inyección del medio acuoso líquido que comprende un gas disuelto es una inyección única o son inyecciones sucesivas.

7. El método según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde la neutralización de las células lisadas de la etapa c) con una disolución de neutralización se hace por medio de una mezcladora estática, en donde la velocidad lineal de mezcla es igual o superior a 100 cm/min.

8. El método según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde el medio de lisis se obtiene por una mezcla de NaOH y un detergente, preferentemente dodecilsulfato de sodio (SDS), y/o preferentemente usando una mezcladora estática.

9. Un aparato para realizar el método según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que comprende:

- una unidad de preparación (1) que comprende uno o más tanques (2, 3) que contienen los constituyentes de un medio de lisis y que comprende una salida (10),

- una unidad de lisis celular (20) que comprende un tanque de suspensión de células (25) que contiene células con la(s) secuencia(s) de ácidos nucleicos extracromosómica(s) de interés, y que comprende además una entrada (21) y una salida (26), en donde la entrada (21) se conecta de forma fluida con el tanque de suspensión de células y con la salida (10) de la unidad de preparación (1),

- una unidad de neutralización (30) para generar una mezcla de lisado celular, que comprende un tanque de medio de neutralización (31), una entrada (34) y una salida (37), en donde la entrada (34) está en conexión fluida con el tanque de medio de neutralización (31) y con la salida (26) de la unidad de lisis celular (20),

- una unidad de separación (50) para recoger la mezcla de lisado celular, que comprende un tanque de separación (51) que tiene una entrada conectada de forma fluida con la salida (37) de la unidad de neutralización (30), y

- una unidad de inyección (70) para inyectar el medio acuoso líquido que comprende el gas disuelto en la mezcla de lisado celular presente en el tanque de separación (51), comprendiendo la unidad de inyección (70) además medios para disolver el gas en el medio acuoso líquido a una presión superior a la presión atmosférica.

10. El aparato de la reivindicación 9, en donde los medios para inyectar el medio acuoso líquido con el gas disuelto en el mezcla de lisado celular comprenden al menos una tubería de inyección (53) que tiene una salida (54) dispuesta hacia una superficie inferior (58) del tanque de separación (51), preferentemente una tubería de inyección (53) que comprende una boquilla de salida (54) y en donde la relación entre el diámetro interno de la tubería de inyección (53) y su diámetro de la boquilla de salida (54) es al menos 2.

11. El aparato de la reivindicación 9 o 10, en donde los medios para inyectar el medio acuoso líquido están dispuestos para inyectar el medio acuoso líquido en la mezcla de lisado celular presente en el tanque de separación (51) a una altura (57) situada desde el fondo del tanque (58) comprendida entre 1/6 y 5/6 de la altura total (56) del tanque de separación (51), preferentemente a una altura desde el fondo del tanque (58) comprendida entre 1/4 y 2/4 de la altura total (56).

12. El aparato según una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 11, en donde los medios para disolver el gas en el medio acuoso líquido comprenden un tanque de medio acuoso líquido (72) y un dispositivo de burbujeo (74) para el burbujeo del gas en el tanque de medio acuoso líquido (72), preferentemente configurado para inyectar el gas en el tanque de medio acuoso líquido (72), a una presión superior o igual a 2 barg, preferentemente entre 2 barg y 50 barg, más preferentemente entre 3 barg y 25 barg, y en donde el dispositivo de burbujeo está configurado preferentemente para mantener el tanque de medio acuoso líquido (72) a una presión de al menos 2 barg.

13. El aparato según una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 12, en donde la unidad de inyección (70) está configurada para inyectar el medio acuoso líquido con el gas disuelto intermitentemente en la mezcla de lisado celular presente en el tanque de separación (51).

14. El aparato según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes 9 a 13, que comprende además entre la unidad de neutralización (30) y la unidad de separación (50) una unidad de precipitación (40) que comprende un tanque de disolución de sal(es) de iones divalentes (44), una entrada (45) y una salida (46), en donde dicha entrada de la unidad de precipitación (45) está en comunicación fluida con la salida (37) de la unidad de neutralización (30), para recibir el lisado celular neutralizado y se une con el tanque de disolución de sal(es) de iones divalentes (44) y en donde la salida de la unidad de precipitación (46) está en comunicación fluida con la unidad de separación (50).

15. El aparato según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes 9 a 14, en donde la unidad de preparación (1), la unidad de lisis celular (20), la unidad de neutralización (30) y/o la unidad de precipitación (40) comprende(n) una o más mezcladora(s) estática(s) (9, 22, 35, 41).