KR20210030894A - 염색체외 핵산 서열의 정제를 위한 방법 및 장치 - Google Patents

염색체외 핵산 서열의 정제를 위한 방법 및 장치 Download PDF

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Abstract

본 발명은 염색체외 핵산 서열(들)의 정제 및 회수를 위한 새로운 장치 및 방법에 관한 것이다.

Description

염색체외 핵산 서열의 정제를 위한 방법 및 장치
본 발명은 생명 공학 분야에 있으며, DNA 플라스미드, 코스미드(cosmids), BACs, YACs, MACs, 미니 플라스미드 및 미니 서클로 이루어지는 그룹에서 선택되는 폴리뉴클레오티드 서열, 바람직하게는 염색체외 핵산 서열의 오염물 및 불순물을 정제하기 위한 방법 및 장치와 관련된 것이다.
폴리뉴클레오티드의 정제는 일반적으로 가능하게는 유전 공학 후에 다량의 이들 폴리뉴클레오티드를 생성할 수 있는 숙주 세포로부터 얻어진다.
대장균(Escherichia coli)과 같은 그람-음성 박테리아의 바이오매스(biomass)는 용해될 수 있으며, 이의 관심 있는 뉴클레오티드 서열, 특히 염색체외 핵산 서열은 전체 게놈 핵산 및 단백질로부터, 선택적 침전, 침강, 여과, 크로마토그래피 칼럼(column)에서 특정 유지를 포함하나 이에 제한되지 않는 연속적인 정제 단계에 의해 분리되는 것이 알려져 있다.
그러나, 하기의 프로토콜에 따라, 이들 관심 있는 핵산 서열은 내독소, 페놀, 염화세슘(caesium chlorides), 브로민화 에티듐(ethidium bromides), 트리톤(Triton®), 결합 단백질 또는 다른 핵산과 같은 오염물(또는 불순물)과 조합된다.
고도로 정제된 뉴클레오티드 서열, 특히 염색체외 핵산 서열은 실험실에서 특정 용도 또는 임상 목적으로 사용이 요구됨에 따라, 오염물의 양을 감소시키기 위한 여러 시도가 제안되었다.
일반적으로, 이들의 분리에 적용된 방법은 중화용액 및 궁극적으로 침전된 오염 세포 성분(게놈 DNA, 단백질 및 단백질-핵 복합체)로부터 분리하여 용액에서 염색체외 서열을 회수하기 위한 침전 용액을 혼합하기 전에 알칼리, 계면활성제 또는 효소를 첨가한 세포의 용해 단계를 포함한다.
그러나, 알칼리성 용액, 계면활성제, 가열 단계 및/또는 긴 절차(들)의 사용은 이들 뉴클레오티드 서열을 분해할 것이다. 또한, 염색체외 핵산 서열을 포함한 DNA 분자는 기계적 스트레스에 민감하다. 또한, 고점도 용액은 뉴클레오티드를 분해할 가능성이 있는 국소적 불균일을 유발하거나 광범위한 혼합이 요구될 수 있다. 이는 특히 2가 금속의 농축 염화물(예: CaCl2)이 사용되는 경우이다.
배치식 방법은 특히 대규모로, 오염 및/또는 불균일의 위험을 나타내는 것으로 알려졌다.
문서 WO2010/0136503는 DNA 플라스미드의 효과적인 정제를 위한 방법 및 장치를 기술하며, 여기서 DNA 플라스미드 오염물의 침전은 통로에서 붕괴된 세포와 CaCl2와 같은 하나 이상의 염을 포함하는 용액의 혼합 및 중량 디캔테이션(gravimetric decantation)을 통한 용액으로부터 침전물의 후속적 분리에 의해 얻어진다.
이 방법 및 장치에서, 붕괴된 세포 및 염의 효과적인 혼합과 후속적 침전은 튜빙 요소에서 벤츄리 효과(Venturi effect)를 유도하는 수단의 통합에 의해 얻어진다. 이 벤츄리 효과는 튜빙 요소에서 내경을 약 40% 감소시킴으로써 얻어진다. "벤츄리 효과를 유도하는"이라는 용어는, 사용된 시스템으로부터 얻어진 흐름의 난류를 의미하며, 층류에서의 흐름이 감소된 튜빙으로 통과됨에 따라 그 정도로 흐름의 속도가 증가하고 직경 감소 직후에 그러한 정도로 저기압이 발생한다.
튜빙 요소에서 형성되는 벤츄리 효과는 DNA 플라스미드의 분해 및 액체에서 높은 전단력을 형성하지 않으면서 효과적인 혼합을 발생시킨다. 따라서, 강한 교반 또는 높은 전단력 하에서의 DNA 분자의 분해가 발생하지 않는 것으로 알려져 있고, 이는 상술한 방법에서 5M CaCl2 의 고용도 용액에서 필요하다. 그러나, 벤츄리 효과를 유도하기 위한 수단의 통합을 요구하는 이러한 방법 및 장치는 수 그램의 플라스미드 생산에 기여하고 염색체외 핵산 서열의 생산을 많은 양으로, 예를 들어 수 킬로그램에서 수 톤까지 증가 시키는데 적합하지 않다.
특허 출원 EP 811055-B1, WO99 / 37750 및 WO00 / 05358은 세포 용해의 방법 및 장치를 기술하며, 용해 용액과 세포의 혼합은 이러한 용해를 얻기 위한 적합한 직경 길이 및 바람직하게는 원형을 갖는 작은 튜브 또는 정적 혼합기에서 수행된다.
또한, 세포로부터 추출된 핵산의 정제 단계의 수율 및 효율을 향상시키기 위한 다양한 수단 및 단계가 과학 문헌에 기술되어 있다. 예를 들어, 특허 US 5,096,818-B2는 용해/변성제 및 탈단백질화 및/또는 중화제를, 혼합하지 않고, 재현탁된 세포에 첨가하고, 제 1 원심 분리하여 세포 파편을 부분적으로 펠렛화한 다음, 용액을 혼합하여 용해를 완료한 후, 이어서, 제 2 원심 분리하여 세포 파편을 완전히 펠렛화하여, 세포 배양 매질로부터 핵산 서열을 단리하고 정제하는 방법을 개시하고 있다. 이 원심 분리 방법은 생산량이 충분하지 않은 장비 제약으로 인하여 대규모 공정에 적합하지 않다.
유럽 특허 EP 1 593 741-B1는 이들 핵산 서열을 함유하는 미생물의 현탁액을 반응 완충액과 혼합하여 미생물을 파괴하기 충분한 지속 시간 동안 혼합물을 반응시키고, 수득된 혼합물을 제거될 오염물과 침전물을 형성하는 중화 완충제를 포함하는 용기로 옮기고, 용기의 바닥을 통하여 가스를 분산시켜 기포를 생성하여 용해물(침전되지 않은 액체 부분)로부터 침전물을 분리시킴으로써, 염색체외 핵산 서열(들)을 함유하는 미생물 투명 용해물을 형성하는 방법을 개시하고 있다. 중화 완충액이 지속적으로 첨가되지 않지만, 필요한 양이 용해 시작부터 현탁액에 존재하고, 현탁액 내의 그 농도(및 현탁액에서 이용 가능한 중화력)는 공정 시간에 따라 변화한다, 이는 공정 변동성을 야기한다.
특허 US 8,158, 348-B2; US 7, 771, 945-B2 and US 7, 314, 746-B2는 관심 있는 DNA 플라스미드 회수를 향상시키기 위해 세포의 용해 단계 동안 용해 매질에 미세 가스 기포를 첨가하는 것을 포함하는 DNA 플라스미드 정제를 위한 방법 및 장치를 개시한다. 상기 US 특허의 도 5에 도시된 바와 같이, 용해 동안 주입된 상이한 양의 가스의 상대적인 효과는 분리 후 수득된 최종 액상의 최종 부피의 관점에서는 아주 효율적이지 않고 매우 긴 처치 시간 이후(약 16시간)에 회수된 액체 가용성 분획의 양이 단지 60% 또는 그 이하임을 나타낸다.
본 발명은 종래 기술의 방법 및 장치의 단점을 제시 및 해결하지 않는 방법 및 장치에 관한 것이다.
본 발명의 바람직한 목적은, 불순물(또는 오염물)로부터 하나 이상의 관심 있는 염색체외 핵산 서열(들)을, 특히 개선된 분리(디캔테이션(decantation) 또는 정화(clarification)) 단계를 통하여, 특히 종래 기술의 방법 및 장치로 수득된 양보다 많은 양의, 특히 다량의 관심 있는 염색체외 핵산 서열(들)의 정제, 특히 효율적이고 신속한 정제를 위한, 저렴하고 강력하며 단순화된 방법 및 장치를 얻는 것이다.
본 발명의 추가적 목적은 관심 있는 염색체외 핵산 서열을 함유하는 액체 정화 세포 용해물의 완전하거나 거의 완전한 회수를 가능하게 하는 새로운 방법 및 장치를 얻는 것이며, 여기서 수득된 액체 정화 세포 용해물은 침전물 층으로부터 얻어지는 불순물 (또는 오염물)에 의해 오염되지 않는 관심 염색체외 핵산 서열(들)을 포함한다.
본 발명에 따른 방법 및 장치에서, 용어 "약"은 바람직하게는 언급된 값의 + 또는 - 20% 또는 10%의 값을 의미한다. (예를 들어, 약 5분은 4분 30초에서 5분 30초까지의 모든 값을 의미한다)
연속적인 생산 및/또는 정제 단계에 의해, 바람직하게는 30.000 염기(또는 염기쌍) 보다 작은 크기를 갖는, 바람직하게는 DNA 플라스미드인, 하나 이상의 관심 있는 염색체외 핵산 서열(들)을 수득하는 방법은, 다음 단계를 포함한다(또는 이들로 이루어진다):
a) 임의로 관심 있는 서열(들)을 생산하는(이의 합성에 관여하는) 숙주세포를 배양(바람직하게는 재조합)하고 관심 있는 서열(들)을 함유하는 세포, 바람직하게는 관심 있는 DNA 플라스미드를 함유하는 세포들을 수확하는 단계;
b) 바람직하게는 세포를 통로로 계속적 도입하고, 이 계속적 도입은 흐름 장치에서 세포의 계속적 공급이 되고, 바람직하게 분해는 세포 용해 유닛에서 세포에 (알칼리성) 용해 매질을 첨가하여 얻어지는, 세포 용해 유닛에서 세포를 분해하는 단계;
c) 바람직하게 첨가되고 바람직하게는 아세트산/아세테이트 조성물인, 중화 용액에 의해서, (관심 있는 염색체외 핵산 서열(들), 특히 관심 DNA 플라스미드를 포함하는)가용성 분획 및 관심 서열(들)의 오염물 및/또는 불순물을 포함하는, 침전물을 포함하는 세포 용해물을 제조하기 위해, 중화 유닛에서 용해된 세포(관심 있는 염색체외 핵산 서열(들)을 포함하는)를 중화하는 단계,
d) 세포 용해물 혼합물(단계 c)에서 수득된)을 혼합하여, 유리하게 이 혼합물을 정제하기 위해 임의로 (또한) 관심 있는 염색체외 핵산 서열(들), 특히 관심 DNA 플라스미드의 오염물 및/또는 불순물을 침전시키는 단계이다. 또한 이 침전은 바람직하게는 하나 이상의 수화된, 염(들)을 (약) 2M 및 (약) 6M 사이의 농도의 용액으로, 바람직하게 분해된 세포 용해물 혼합물로 연속적 첨가함으로써 수행되고, 상기 염(들)은 (바람직하게 수화된) CaCl2, (바람직하게 수화된) MgCl2, (바람직하게 수화된) ZnCl2, (바람직하게는 수화된) SrCl2, (바람직하게 수화된) BaCl2, 또는 (덜 바람직하게는) LiCl, 아세트산 암모늄, 황산 암모늄, 황산 나트륨 또는 황산 마그네슘과 같은, 다른 (바람직하게 수화된) 염(들)로 이루어지는(을 포함하는) 군에서 선택되는 것이고, 여기서 선호되는 염은 (바람직하게 수화된) CaCl2 및/또는 (바람직하게 수화된) MgCl2이다;
e) 단계 c) 또는 단계 d)의 분리(디캔테이션 또는 정화) 탱크에서 얻어진 세포 용해물 혼합물을 수집하는 단계;
f) 세포 용해물 혼합물에 함유된 침전물(오염물 또는 불순물을 포함하는)로부터 가용성 분획(관심 있는 염색체외 핵산 서열(들), 특히 관심 있는 DNA 플라스미드)을 분리(디캔팅 또는 정화)하는 단계; 이 분리 단계는 바람직하게는 (약) 5분 내지 몇 시간의 지속 시간을 가지고; 더 바람직하게는 (약) 15분 내지 약 2시간의 지속 시간으로 구성된다. 이 분리 단계는 유리하게는 분리(디캔테이션 또는 정화) 탱크라고 하는 탱크 또는 저장소에서 수행된다.
g) 세포 용해물 혼합물에 존재하는 관심 있는 염색체외 핵산 서열(들), 특히 관심 있는 DNA 플라스미드를 포함하는 가용성 분획을, 바람직하게는 분리탱크로부터 회수하는 단계;
h) 관심 있는 염색체외 핵산 서열(들), 바람직하게는 관심 있는 DNA 플라스미드를 포함하는 제 1 막 리텐테이트(retentate)를 수득하기 위해, 선택적으로 (약) 0.2 ㎛ 내지 (약) 20 ㎛ 사이의 기공 크기를 갖는 하나 이상의 필터에서, 수득한 가용성 분획의 하나 이상의 추가 분리 단계(들), 디캔테이션 단계(들) 및/또는 여과 단계(들)를 수행하고, 바람직하게는 (약) 30 kDa 막 내지 (약) 500 kDa 막, 바람직하게는 (약) 50 내지 (약) 250 kDa 사이, 더욱 바람직하게는 (약) 50 내지 (약) 100 kDa인 막에서 한외 여과(ultra-filtration)를 이어서 수행하는 단계;
i) 회수된 염색체외 핵산 서열(들), 바람직하게는 관심 있는 DNA 플라스미드를 포함하는, 단계 h)의 제 1 막 리텐테이트(retentate) 또는 단계 g)의 가용성 분획의 크로마토그래피(연마 단계)를 선택적으로 수행하는 단계로, 이 크로마토그래피(chromatography)단계는 선택적으로 크로마토그래피 용출액을 얻기 위해 선택적으로 세척 하위-단계를 포함한다;
j) 선택적으로 (약) 3 kDa 내지 (약) 100 kDa 막에서 단계 i)의 크로마토 그래피 용출액의 한외 여과를 수행하고 수득된 제2리텐테이트를 수집하는 단계; 및 선택적으로 (약) 0.2 μm 막에서 제 2 리텐테이트를 (아직 더 추가로) 여과하여 여과액에서, 불순물 (또는 오염물)로부터 정제된, 관심 있는 염색체외 핵산 서열(들), 바람직하게는 관심 DNA 플라스미드를 회수 및 수집하는 단계;
용어 "가용성 분획"(예를 들어 세포 용해물)은 본 발명의 방법 및 장치에 의하여 회수된 세포 용액의 액체 및 가용성 분획을 의미하며, 여기서 가용성 분획은 침전물 층으로부터 분리되거나, 디캔트 되거나, 정화될 수 있다. 침전물 층은 액체 용해물 혼합물 내 및 그 위에 부유하는 플록(flcos)을 포함 할 수 있고, 침전물 층은 회수되고 정제될 관심 염색체외 핵산 서열(들)의 불순물 (또는 오염물)을 포함하거나 함유할 수 있다. 이후, 분리 이후 수득된 가용성 분획은 또한 "정화된 상"이라고도 한다. 분리 단계, 즉 디캔테이션 단계 및/또는 정화 단계는 바람직하게는 고전적인 연속적 공정 단계에 기초하여 이루어 지지만, 공급 재료의 연속적인 공급을 추가하는 대신 배치 공정에 따라 수행 될 수도 있다.
용어 "염색체외 핵산 서열(들)"은 50 개 초과의 염기 (염기 쌍)의 임의의 뉴클레오티드 서열을 의미한다. 더욱 바람직하게, 이 염색체외 핵산 서열은 DNA 플라스미드, 코스미드, BACS, YAC, MAC, 미니 플라스미드 및 미니-써클 을 포함하는(로 이루어진) 군으로부터 선택되고, 바람직하게는 (DNA) 플라스미드, 예를 들어 300,000 염기쌍보다 작은 크기의 (DNA) 플라스미드일 수 있다.
본 발명에 따르면, 분리 단계 f)는 분리(디캔테이션 또는 정화) 탱크에 포함된 세포 용해물 혼합물로 용해된 가스를 포함하는 액체 수성 매질을 적어도 1회 이상 주입하는 단계를 포함한다. 이 주입은 세포의 용해 또는 용해된 세포의 중화 동안에는 수행되지 않는다. 상기 액체 수성 매질은 액체 수성 매질에 가스를 고압에서 용해시켜 얻을 수 있다. 놀랍게도, 충분한 양의 용해된 가스를 포함하는 액체 수성 매질의 주입은 상술한 분리 탱크에서 수행되는, 침전물 및 관심 있는 염색체외 핵산 서열을 포함하는 가용성 분획 간의 분리(디캔테이션 또는 정화) 단계의 수율을 향상시키는 것으로 밝혀졌다. 개선된 분리 수율은 회수된 가용성 분획, 특히 회수된 관심 있는 핵산 서열(들)의 양을 상당히 개선시킨다. 상기 주입이 없는 경우, 침전물 층은 회수 단계 g) 동안 가용성 분획의 상당량을 포획하여, 가용성 분획 안에 침지된 상태로 남는다. 주입은 침전물 입자 사이에 공간이 (액체) 가용성 분획 대신에 가스로 채워지기 때문에 가용성 분획 위에 침전물 층이 부유하도록 한다.
충분한 양의 용해된 가스를 포함하는 액체 수성 매질은 유리하게는 가스, 바람직하게는 공기, CO2, 산소, 오존, 질소 또는 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 가스를 물과 같은 액체 수성 매질로 용해시킴으로써 수득된다. 바람직하게, 이 가스는 버블링에 의해 액체 수성 매질로 용해된다. 유리하게는, 이러한 용해는 적어도 1 barg, 바람직하게 (약) 2 barg 내지 (약) 50 barg, 바람직하게는 (약) 3 barg 내지 (약) 25 barg, 바람직하게는 (약) 4 barg 내지 (약) 15 barg의 압력과 같은, 대기압을 넘는 압력에서 수행된다. 그렇게 함으로써, 액체 수성 매질에 더 높은 농도로 가스를 용해시킬 수 있다(헨리의 법칙). 액체 수성 매질 중 용해된 가스의 농도는 유리하게는 포화 농도에 근접한다. 예를 들어, 액체 수성 매질 중 용해된 가스의 농도는 지시된 압력에서의 포화 농도의 적어도 50 % 이상, 유리하게는 포화 농도의 60 % 이상, 70 % 이상, 80 % 이상, 90 % 이상에 달한다. 유리하게는, 액체 수성 매질은 용해된 가스로 포화된다. 액체 수성 매질은 바람직하게는 (약) 2 barg보다 높은 압력에서, 바람직하게는 (약) 2 barg 내지 (약) 50 barg 사이, 보다 바람직하게는 (약) 3 barg 내지 (약) 25 barg사이의 압력에서 가스로 포화된다. 유리하게는, 처리되는 세포 용해물 혼합물의 부피(예를 들어, 탱크 내 세포 용해물 혼합물의 총 부피)와 비교하여 세포 용해물 혼합물에 주입된 용해된 가스를 포함하는 액체 수성 매질의 부피량은 (약) 0.2 % v / v 내지 (약) 25 % v / v 사이, 바람직하게는 (약) 0.5 % v / v 내지 (약) 15 % 사이, 보다 바람직하게는 (약) 1 % v / v 내지 (약) 10 % 사이이고, 한번 또는 여러 번 주입된다.
바람직하게는, 용해된 가스를 포함하는 액체 수성 매질은 세포 용해물 혼합물로 용해된 가스를 포함하는 액체 수성 매질을 주입하기 전에 저장소 또는 탱크로 준비된다.
유리하게는, 용해된 가스를 포함하는 액체 수성 매질은 세포 용해물 혼합물에 대기압 이상의 압력으로 주입되며, 후자는 대기압 부근의 압력에 유리하다. 유리하게는,이 액체 수성 매질은 가스가 용해되는 압력과 실질적으로 동일한 압력으로 주입된다. 바람직한 주입 압력은 적어도 (약) 2 barg, 바람직하게는 (약) 3 barg 내지 (약) 50 barg, 바람직하게는 (약) 4 barg 내지 (약) 15 barg이다. 액체 수성 매질은 유리하게는 세포 용해물 혼합물에 간헐적으로 주입된다. 이는 2개의 연속 주입 기간 사이의 정적 휴지 기간이 유리하게는 이 정적 휴지 기간 이전 및 이후의 주입 기간의 지속 시간과 동일한 지속 시간을 갖는 것을 의미한다. 예를 들어, 주입이 이루어지는 시간 (주입 기간)은 (약) 5 초 내지 (약) 10 분, 보다 바람직하게는 (약) 5 초 내지 (약) 5 분이다. 2 개의 연속적인 주입 기간 사이의 정적 휴지 기간은 유리하게는 (약) 5 초 내지 (약) 10 분 사이이며, 유리하게는 주입 기간의 지속 시간과 동일하다.
본 발명에 따르면, 분리(디캔테이션 또는 정화) 탱크에 존재하는 세포 용해물 혼합물에 용해된 가스를 포함하는 액체 수성 매질의 주입은 단일 주입 또는 간헐적인 일련의 연속 주입일 수 있다. 용해된 가스를 포함하는 액체 수성 매질의 간헐적 주입 후 정적 휴지 기간은 정적 휴지 기간이 지속되는 동안 침전물이 상승하고 가용성 분획이 정화되도록 한다. 동시에, 가스 버블은 침전물 층의 플록 내에 포획된 가용성 분획을 대체하여, 침전물이 가용성 분획에 침지되는 대신에 가용성 분획의 상부에서 침전물 층이 부유하도록 한다. 결과적으로, 더 큰 부피의 가용성 분획이 회수 될 수 있다.
본 발명에 따른 방법 및 장치에 이용되는 숙주 세포는 원핵 세포, 예컨대 박테리아, 특히 대장균 세포(E. coli)이다.
바람직하게는, 본 발명에 따른 방법에서, 단계 b)는 (알칼리성) 용해 매질과 세포를 혼합하는 단계를 포함한다. 바람직하게는, 혼합은 정적 혼합기(static mixer)에서 이루어지며, 이 정적 혼합기는 바람직하게는 6개 이상의 혼합 요소, 바람직하게는 12개의 혼합 요소 내지 24 개의 혼합 요소, 보다 바람직하게는 18개의 혼합 요소를 포함한다. 바람직하게는, 혼합 선형 속도는 150 cm/min이상이고; 바람직하게는 (약) 150 cm/min 내지 (약) 2000 cm/min, 보다 바람직하게는 (약) 500 cm/min 내지 (약) 1500 cm/min 사이에 포함된다.
바람직하게는, 본 발명에 따른 방법에서, 단계 c) 는 중화 용액과 세포 용해물 혼합물을 혼합하는 단계를 포함한다. 바람직하게는, 혼합은 정적 혼합기로 이루어지며, 이 정적 혼합기는 바람직하게는 4개 이상의 혼합 요소, 바람직하게는 6개의 혼합 요소 내지 16 개의 혼합 요소, 보다 바람직하게는 10개의 혼합 요소를 포함한다. 바람직하게는, 혼합 선형 속도는 100 cm/min이상이고; 바람직하게는 (약) 100 cm/min 내지 (약) 2000 cm/min, 보다 바람직하게는 (약) 340 cm/min 내지 (약) 1025 cm/min 사이에 포함된다.
바람직하게는, 본 발명에 따른 방법에서, 단계 d) 단계 d)는 단계 c)로부터 수득된 세포 용해물 혼합물을 염(들)과 혼합하는 단계를 포함한다. 바람직하게는, 혼합은 정적 혼합기로 이루어지며, 이 정적 혼합기는 바람직하게는 2개 이상의 혼합 요소, 바람직하게는2개의 혼합 요소 내지 18 개의 혼합 요소, 보다 바람직하게는 4개의 혼합 요소를 포함한다. 바람직하게는, 혼합 선형 속도는 100 cm/min이상이고; 바람직하게는 (약) 100 cm/min 내지 (약) 1500 cm/min, 보다 바람직하게는 (약) 400 cm/min 내지 (약) 1200 cm/min 사이에 포함된다.
본 발명에 따른 방법 및 장치에서, 세포는 바람직하게는 현탁액에서 유지되고 (알칼리성) 용해 매질의 첨가에 의해 분해된다.
본 발명에 따르면, 세포를 분해시키는 용해 매질은 (약) 11 내지 (약) 12.5의 pH, 바람직하게는 (약) 12 내지 (약) 12.5의 pH를 갖는 알칼리성 용액 일 수 있다. 용해 매질은 충분한 양의 하나 이상의 계면활성제(들)를 포함 할 수 있다.
본 발명에 따른 방법 및 장치에서, (알칼리성) 용해 매질은 적어도 하나의 계면활성제를 갖는 적어도 충분한 양의 NaOH를 혼합함으로써 수득될 수 있다. 본 발명에 따른 방법 및 장치에서, 충분한 양의 NaOH 및 계면활성제는 용해될 필요가 있는 세포의 양에 따라 당업자에 의해 선택된다. 더욱 바람직하게는, 혼합은 충분한 양의 각 반응성 생성 용액(NaOH 및 하나 이상의 계면활성제)을 정적 혼합기에 도입하고, 성분들을 혼합하여 (알칼리성) 용해 매질을 세포에 첨가하기 전에 (알칼리성) 용해 매질을 형성함으로써 수행될 수 있다. 상기 정적 혼합기는 바람직하게는 6개 이상의 혼합 요소, 바람직하게는12개의 혼합 요소 내지 24 개의 혼합 요소, 보다 바람직하게는 18개의 혼합 요소를 포함한다. 바람직하게는, 혼합 선형 속도는 100 cm/min 이상이다.
(알칼리성) 용해 매질은 (약) 0.01 % 내지 (약) 5 %, 바람직하게는 (약) 0.1 % 내지 (약) 3 %, 더욱 바람직하게는 (약) 0.5 % 내지 (약) 3 % (w:v)의 하나 이상의 계면활성제(들)를 포함할 수 있다. 바람직하게는, 계면활성제는 황산 도데실 나트륨(SDS), 소듐 데옥시콜레이트, Triton® X-100, Triton® X-114, Nonidet® P-40, 옥틸글루코시드, Brij® 35, Brij® 56, Tween® 20, CHAPS(3-[(3-Cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-propanesulfonate), 또는 이들의 혼합물로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.
유리하게는, 분해 단계 (step b))에서, 세포는 (알칼리성) 용해 매질과 함께 현탁된다. 바람직하게는, 세포와 (알칼리성) 용해 매질 사이의 최적의 접촉 시간은 (약) 15초 내지 (약) 15분, 바람직하게는 (약) 0.5 분 내지 (약) 5분, 더욱 바람직하게는 (약) 2분이다.
바람직하게는, 중화 용액은 pH가 (약) 5.0 내지 (약) 6.0, 바람직하게는 (약) 5.5 인 아세트산 / 아세테이트 용액이다. 바람직하게는, 중화 용액은 약 3M (mol/l)의 아세테이트 및 약 15 % (v:v)의 아세트산 농도를 갖는다.
바람직하게는, 중화 용액, 특히 상기 언급된 아세트산 / 아세테이트 용액은 상온에서 (약) 2 ℃ 내지 (약) 8 ℃, 바람직하게는 (약) 4 ℃의 온도로 냉각된다. 이 단계는 당업자에게 공지된 방법에 의해, 바람직하게는 충분한 시간 동안 저온실에 완충액을 저장하거나 또는 중화 용액을 운반하는 튜빙 요소를 둘러싸는 열 교환기에 연결된 적절한 극저온 조절기(cryostat)를 사용함으로써 얻어진다.
유리하게는, 관심 있는 염색체외 핵산 서열(들)을 포함하는, 용해된 세포, 및 중화 용액의 최적의 접촉 시간은 (약) 15 초 내지 (약) 5 분 사이, 바람직하게는 (약) 30 초 및 (약) 2 분, 보다 바람직하게는 (약) 1 분이다.
유리하게는, 중화된 용해물 및 침전 용액의 최적의 접촉 시간은 1분 이상이고, 이 기간은 필요한 침전을 얻는데 적합하다.
유리하게는, 본 발명에 따른 방법의 단계 f)의 분리(디캔테이션 또는 정화) 단계의 최적 시간은 (약) 5 분 내지 수 시간, 바람직하게는 (약) 15 분 내지 (약) 2 시간이다.
본 발명에 따른 방법은 선택적으로 관심 있는 염색체외 핵산 서열(들)을 포함하는 (전체) 세포의 현탁액에 충분한 양의 RNase의 첨가를 포함하는 (또는 이루어지는) 단계 a) 와 단계 b) 사이의 예비 단계를 포함할 수 있다. RNase의 양은 정제하고자 하는 관심 있는 서열(들)의 유형 및 양에 따라 당업자에 의해 정의되며, 이 RNase 처리는 특히 3000 염기 (염기쌍)보다 낮은 크기를 갖는 플라스미드 DNA의 정제에 유용하다.
본 발명에 따른 방법의 바람직한 첨가되는 수화 염은 CaCl2.5H2O이고, 이는 (약) 2M 내지 (약) 6M의 농도, 바람직하게는 약 5M의 농도로 첨가된다.
본 발명의 방법 또는 장치에서, 연속 공정 또는 연속 첨가 단계는 유입구/배출구, 펌프 또는 밸브의 개방 및 폐쇄를 통해 수행되며, 이러한 펌프 출력은 유리하게는 본 발명의 공급 용액의 탱크, 저장소, 바이알(vials) 또는 수용기(recipients)를 칭량함으로써 또는 이들 탱크를 연결하는 튜빙(들)에 유량계를 통합함으로써 제어된다.
본 발명의 방법 및 장치에서, 여과 단계는 깊이 있는 필터 또는 표면의 필터에서 수행된다.
본 발명의 방법에 선택적으로 존재하는 크로마토그래피 단계 (단계 i))는 당업자에게 널리 알려진 하나 이상의 고전적 정제 단계를 포함하거나 이로 구성된다.
선택적으로, 이 세척 하위-단계 후 및 용출 하위-단계 전에, 하나 이상의 중성 계면활성제(들)가 보충된 동일한 용액으로 다른 세척 하위-단계가 수행될 수 있다. 바람직하게는, 이 중성 계면활성제는 Triton® X-100, Triton® X-114, Tween® 20, Nonidet® P-40, 옥틸 글루코시드, Brij® 35, Brij® 56 또는 이들의 혼합물로 이루어진 군에서 선택된다. 바람직하게는, 상기 중성 계면활성제는 용액에 (약) 0.1 % 내지 (약) 1 %로 존재한다. 이 선택적인 제 2 세척 하위-단계 다음에 추가 세척 하위-단계가 이어질 수 있으며, 이 추가 하위-단계는 바람직하게는 중성 계면활성제 없이 수행된다.
본 발명의 방법 및 장치는 1 그램 미만에서 수백 그램, 킬로그램, 최대 톤의, 다량의 관심 있는 염색체외 핵산 서열(들)의 생산 및 정제를 허용한다. 다만, 본 발명에 따른 방법에서, 선택적 침전 단계 (단계 d))는 단계 h) 내지 단계 j) 전 또는 후에 다른 정제 단계로 대체되어, 원하는 순도의 관심 있는 염색체외 핵산 서열(들)을 수득할 수 있다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 방법을 수행하기 위한 장치에 관한 것이다. 본 발명의 장치는 가능하면 적합한 탱크, 저장소(들), 바이알 또는 수용기(들)에 연결될 수 있고, 유입구 또는 개구 수단 및 배출구 또는 출구 수단을 갖는, 원형 튜브 또는 튜빙 요소와 같은 연속 흐름을 얻기 위한 수단을 포함(또는 구성)한다.
유리하게는, 장치의 튜빙(들)은 인간 의약, 특히 제약 품질을 갖는 의약에 사용하기 위한 요건에 따르고, 바람직하게는 새지 않고 "Y 형 연결"을 통해 연결된다.
본 발명의 장치는 아래 구성으로 포함하거나 바람직하게는 아래 구성으로 이루어진다:
- (알칼리성) 용해 매질의 성분을 함유하는 하나 이상의 탱크를 포함하는 제조 유닛으로서, 상기 탱크(들)는 탱크(들)가 바람직하게는 하나 이상의 튜빙(들)을 통해, 세포 용해 유닛의 유입구로 유체 연결되는 하나 이상의 배출구를 포함하고, 상기 유입구는 바람직하게는 세포 현탁액 탱크로부터 세포 용해 유닛으로 세포를 도입하기 위한 유입구와 구별되는, 제조 유닛,
- 관심 있는 염색체외 핵산 서열(들)을 갖는 세포를 함유하는 세포 현탁액 탱크를 포함하는 세포 용해 유닛으로서, 상기 세포 용해 유닛은 바람직하게는 하나 이상의 튜빙(들)을 통해, 세포 현탁액 탱크 및 제조 유닛의 배출구(들)로 유체 연결되는 하나 이상의 유입구를 포함하고, 더욱 바람직하게는 하나 이상의 튜빙(들)을 통해 중화 유닛의 유입구(들)에 유체 연결되는 하나 이상의 배출구를 추가로 포함하는, 세포 용해 유닛,
- 중화 매질 탱크, 하나 이상의 유입구 및 하나 이상의 배출구(outlet) 또는 출구(exit)를 포함하는 중화 유닛으로, 유입구는 바람직하게는 하나 이상의 튜빙(들)을 통해 중화 매질 탱크와 함께 세포 용해 유닛의 배출구(들) 또는 출구(들)에 유체 연결되고, 배출구(들)는 분리 (디캔테이션 또는 정화) 유닛의 유입구(들) 또는 선택적 침전 유닛에 유동적으로 연결되는, 중화 유닛,
- 선택적으로 하나 이상의 유입구, 하나 이상의 배출구 또는 출구 및 염 용액을 함유하는 탱크를 포함하는 침전 유닛으로, 상기 유입구는 바람직하게는 하나 이상의 튜빙(들)을 통해 염 용액을 함유하는 탱크와 함께 중화 유닛의 배출구 또는 출구(들)에 유체 연결되고, 상기 배출구는 바람직하게는 하나 이상의 튜빙(들)을 통해 분리 유닛의 유입구에 유체 연결되는, 선택적으로 침전 유닛,
- 적어도 하나의 유입구 및 적어도 하나의 배출구를 갖는, 세포 용해물 혼합물을 위한 분리(디캔테이션 또는 정화) 탱크를 포함하는 분리 (디캔테이션 또는 정화) 유닛으로, 상기 유입구(들)는 중화 유닛의 배출구에 유체 연결되거나 또는 경우에 따라, 침전 유닛의 배출구에 유체 연결되고, 분리 탱크는 바람직하게는 세포 용해물 혼합물로부터 관심 있는 염색체외 핵산 서열(들)을 포함하는 가용성 분획을 회수하기 위한 수단을 포함하는, 분리 유닛.
- 대기압보다 높은 압력에서 액체 수성 매질에 가스를 용해시키는 수단 및 분리 탱크에 용해된 가스를 포함하는 액체 수성 매질을 주입하는 수단을 포함하는 주입 유닛, 특히 부상 유닛(floatation unit).
바람직하게는, 액체 수성 매질은 물이고, 이 액체 수성 매질은 유리하게는 용해된 가스로 포화되며, 이 가스는 바람직하게는 공기, CO2, N2, O2, 오존 또는 이들의 혼합물이다. 보다 바람직하게는, 분리 탱크로 가스로 용해된 가스를 포함하는 액체 수성 매질을 주입하기 위한 수단은 출구, 바람직하게는 분리 (디캔테이션 또는 정화) 탱크의 바닥면을 향하는 출구 노즐을 갖는 적어도 하나의 주입 파이프를 포함한다. 바람직하게는, 출구, 바람직하게는 출구 노즐은 상기 탱크 바닥면으로부터, 상기 탱크의 전체 높이의 (약) 1/6 내지 (약) 5/6 사이에, 보다 바람직하게는 탱크의 총 높이의 (약) 1/4 내지 (약) 2/4 사이에 포함되는, 높이로 분리 탱크 내에 배치된다. 이 위치는 유리하게는 이미 분리되어 있는 침전된 오염물 및 불순물의 재 현탁을 피한다.
바람직하게는, 액체 수성 매질에 가스를 용해시키기 위한 수단은 액체 수성 매질 탱크, 바람직하게는 물 탱크 및 버블링 장치를 포함한다. 이 버블링 장치는 바람직하게는 가스 용기에 연결된 파이프(pipe)와 같은 튜빙을 포함하고, 바람직하게는 유량계도 튜빙에 연결되며, 펌프는 튜빙과 가스 용기 사이에 유체 연결된다. 버블링 장치는 가스 용기로부터 액체 수성 매질로 가스의 제어된 버블링을 제공하여 용해된 가스를 포함하는 액체 수성 매질을 수득한다. 바람직하게는, 이 버블링 장치는 1 barg 이상의 압력, 바람직하게는 2 barg 내지 50 barg, 바람직하게는 3 barg 내지 25 barg의 압력으로, 유리하게는 처리되는 세포 용해물 혼합물의 부피와 비교하여 (약) 5% 내지 (약) 20% v/v사이에 포함된 부피로, 액체 수성 매질 탱크 내로 가스를 주입하도록 구성된다.
본 발명에 따른 장치에서, 액체 수성 매질 주입 파이프 내경과 출구 노즐의 직경 사이의 비는 (약) 1 또는 1근처 값일 수 있지만, 바람직하게는 (약) 3보다 높고, 더 바람직하게는 (약) 5 보다 높고, 다만, 바람직하게는 50보다 낮다. 이 특정한 주입 파이프 및 노즐 조합은 용해된 가스를 포함하는 액체 수성 매질을 주입하는 동안 주입 파이프 내부의 압력이 초기 값의 90% 아래로 떨어지지 않도록 보장한다. 이는 세포 용해물 혼합물 내부 대신 주입 파이프 내에서 조기 탈기되는 것을 방지하고, 정제 품질 및 양을 향상시킨다. 대기압으로 유지되는 분리 탱크에 용해된 가스를 포함하는 액체 수성 매질을 주입한 후, 액체 수성 매질은 용해된 가스를 잃고, 이는 세포 용해물 혼합물에서 평균 직경이 1.5mm 이하, 바람직하게는 1mm 이하 또는 0.5mm 이하인 (미세)버블(의 안개)를 발생시킨다.
본 발명에 따른 장치에서, 주입 유닛의 주입 파이프는 분리 유닛 또는 탱크 및 중화 유닛 또는 침전 유닛의 배출구(들) 사이의 튜빙으로의 유입구로부터 분리된다. 결과적으로, 용해된 가스를 포함하는 수성 액체 매질은 세포 용해물 혼합물을 위한 유입구보단 별도의 유입구 또는 튜빙을 통해 분리 탱크로 주입된다.
본 발명에 따른 장치는 더 효과적인 유체 혼합을 위해 선택적으로 하나 이상의 정적 혼합기와 조합되는, 벤츄리 효과를 생성하는 수단 (즉, 본원에 참조로 국제 특허 출원 WO 2010/0136503에 기술된 바와 같은)과 같은 공지의 혼합 요소를 더 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 장치에서, 제조 유닛은 용해 매질을 함유하는 단일 탱크 또는 그의 상이한 성분을 함유하는 둘 이상의 분리된 탱크를 포함하고, 탱크(들)는 바람직하게는 적어도 6 개의 혼합 요소를 포함하는, 제 1 정적 혼합기, 하나의 (또는 여러) 펌프(들)를 통하여, 제 1(세트)의 튜빙(들)에 의해, 세포 용해 유닛에 먼저 연결된다. 상기 제 1 정적 혼합기는 유입구 및 배출구 또는 출구를 가지며, 여기서 상기 유입구는 (알칼리) 용해 매질의 펌프(들) 또는 이의 분리된 구성 요소로부터 나오는 튜빙(들)에 연결되고, 배출구 또는 출구는 제 2 튜빙 또는 그 이상의 튜빙을 통해 세포 용해 유닛에 연결된다. 제 1 정적 혼합기의 크기 (즉, 제1 정적 혼합기 및 펌프(들) 출력의 직경 및 길이뿐 아니라, 도입된 혼합 요소의 개수)는 제 1 정적 혼합기 내로 도입된 요소들의 바람직하게는 100 cm /min을 초과하는 혼합 선형 속도를 허용하도록 선택된다
본 발명에 따른 장치는 또한 제 2 정적 혼합기, 바람직하게는 12 내지 24 개의 혼합 요소, 바람직하게는 18 개의 혼합 요소를 포함하는 제 2 정적 혼합기로 이루어진 세포 용해 유닛을 포함 할 수 있으며, 이 제 2 정적 혼합기는 유입구 및 배출구 또는 출구를 갖고, 상기 유입구는 제 2 튜빙(들)에 의해 제조 유닛의 배출구에 연결되고, 상기 유입구는 제 3 튜빙 또는 그 이상의 튜빙들 및 펌프를 통해 세포 현탁액을 함유하는 세포 현탁액 탱크의 배출구에 연결되며, 제 2 정적 혼합기의 배출구 또는 출구는 제 4 튜빙 또는 그 이상의 튜빙에 연결된다. 제 2 정적 혼합기 및 펌프 출력의 크기는 제 2 정적 혼합기 내로 도입된 용액의 (약) 1000 cm /min 내지 (약) 1500 cm/min으로 구성되는 혼합 선형 속도를 허용하도록 선택된다.
본 발명에 따른 장치는 제 3 정적 혼합기, 바람직하게는 6 개의 혼합 요소와 16 개의 혼합 요소, 바람직하게는 10 개의 혼합 요소를 포함하는 제 3 정적 혼합기를 더 포함 할 수 있으며, 이 제 3 정적 혼합기는 유입구 및 배출구 또는 출구를 가지며, 상기 유입구는 세포 용해 유닛의 배출구로부터 나오는 제 4 튜빙에 연결되고, 제 5 튜빙 및 펌프를 통해 중화 매질 탱크에 연결되며, 제 3 정적 혼합기의 배출구 또는 출구는 제 6 튜빙 또는 그 이상의 튜빙에 연결된다. 제 3 정적 혼합기 및 펌프 출력의 크기는 제 3 정적 혼합기 내로 도입된 용액의 혼합 선형 속도, 바람직하게는 (약) 340 cm/min 내지 (약) 1025 cm/min 사이에 포함되는 혼합 선형 속도를 허용하도록 선택된다.
본 발명에 따른 장치는 제 4 정적 혼합기, 바람직하게는 4 내지 18개의 혼합 요소를 포함하는 제 4 정적 혼합기를 더 포함 할 수 있으며, 이 제 4 정적 혼합기는 유입구 및 배출구 또는 출구를 가지며, 상기 유입구는 중화 유닛으로부터 나오는 제 6 튜빙에 연결되고, 제 7 튜빙 및 펌프를 통해, (2가) 염 용액을 함유하는 탱크에 연결되며, 배출구 또는 출구는 제8 튜빙을 통해 분리 (또는 디캔테이션) 탱크에 연결된다. 제 4 정적 혼합기 및 펌프 출력의 크기는 제 4 정적 혼합기 내로 도입된 용액의 혼합 선형 속도, 바람직하게는 (약) 400 cm/min 내지 (약) 1200 cm/min에 포함되는 혼합 선형 속도를 허용하도록 선택된다.
도면에 도시된 바와 같은 펌프의 위치는 또한 처리 효율을 향상시킨다. 이는 도시된 바와 같은 펌프 각각의 위치가 유리하게는 튜빙(들) 내의 유체를 당기는 대신에 튜빙(들) 내의 유체(의 흐름)를 밀어내도록 할 수 있기 때문이고, 이는 처리 제품이 펌프 헤드에서 발생하는, 제품을 손상 입히고 품질을 저하시키는, 전단력의 영향을 받지 않는 것을 의미한다.
바람직하게는, 본 발명의 장치는 튜빙(들)에서 상이한 매질 또는 세포 또는 세포 분획의 도입을 제어하기 위하여, 상이한 탱크, 저장소, 백 또는 수용기에 존재하는 소위 공급 용액 (즉, 중화 용액, 용해 용액 등)을 칭량하는 수단을 더 포함하고 및/또는 하나 이상의 유량계를 포함한다. 이는 본 발명의 방법이 연속적으로 수행되는 단계 및 배치 순서(batch sequence) 후에 배치(batch)에서 수행되는 단계들을 포함할 수 있음을 의미한다. 바람직하게는, 중화 단계는 배치 순서 후에 배치에서 수행된다.
본 발명의 방법 또는 장치에 대한 대안은 용해된 가스를 포함하는 액체 수성 매질을 주입하지 않고 용해된 가스를 포함하는 액체 수성 매질을 주입하기 위한 주입 유닛이 없는, 기술된 분리 단계 및 분리 유닛을 포함하는 기술된 방법 및 장치에 관한 것이다. 다만, 이 방법 및 장치는 상기 기술된 특징들과 함께, 하나 이상의 정적 혼합기(들) 및 하나 이상의 정적 혼합기(들)의 사용을 포함하는 하나 이상의 모든 혼합 단계(들)를 포함 할 것이다.
본 발명에 따른 방법 및 장치는 비제한적인 선호되는 실시예로서, 제시된 다음의 상세한 설명에서 첨부된 도면을 참조하여 설명한다.
도 1은 발명의 장치를 개략적으로 나타낸다.
도 2 및 도 3은 본 발명에 따른 장치의 분리 유닛의 상이한 구성을 나타낸다.
도 4는 본 발명에 따른 분리 유닛에 연결된 주입 유닛을 나타낸다.
도 5는 본 발명에 따른 장치의 분리 유닛에 연결된 여과 유닛을 나타낸다.
도 6은 최신 기술의 방법 및 장치로 얻은 분리 결과를 나타낸다.
도 7은 본 발명에 따른 방법 및 장치로 얻은 분리 결과를 나타낸다.
도 1은 원형 단면을 가지며 서로 유체 연결되고 정적 혼합기 및 탱크 또는 저장소로 유체 연결된 수 개의 튜브 또는 튜빙 요소로 제조되고, 수 미터 길이의 파이프 또는 튜브인, 본 발명의 방법의 단계를 수행할 수 있는 장치를 도시한다. 바람직하게는, 본 발명에 따른 장치 및 방법은 세포 불순물(또는 오염물), 특히 숙주 세포 단백질, RNA 서열, 게놈 RNA 서열, 내독소 등과 같은 대장균(E. coli) 오염물로부터 정제될 DNA 플라스미드와 같은 염색체외 핵산 서열의 세포로부터의 회수 및 정제에 전념한다.
본 발명에 따른 방법에 사용된 장치는 제조 유닛 (1), 세포 용해 유닛 (20), 중화 유닛 (30), 선택적으로 침전 유닛 (40), 분리 (디캔테이션 또는 정화) 유닛 (50), 주입 유닛 (70) 및 여과 유닛을 포함하는 유체 연결된 다수의 유닛을 포함하거나 이로 구성된다.
게다가, 세포 용해 유닛 (20)은 생산 유닛(도면에 도시되지 않은 반응 탱크 포함)에 유체 연결될 수 있지만, 회수될 관심 있는 염색체외 핵산 서열(들)을 포함하는 세포의 성장 및 증식에 사용된다.
본 발명에 따른 장치의 통로에서 유량 추적은 크로노미터(chronometer), 중량 모니터링 및 /또는 상이한 튜빙(들)에 추가된 유량계에 의해 얻어지고 튜빙(들)사이의 연결은 "Y 타입"이다.
본 발명에 따른 장치의 제 1 부분은 2 개의 상이한 포맷을 제시할 수 있는 제조 유닛 (1)이다. 도면에 도시되지 않은 제 1 실시예에 따르면, 본 발명에 따른 장치는 세포에 (알칼리성) 용해 매질을 첨가하고 혼합하기 위해, 제 1 튜빙, 펌프 및 가능하게는 유량계에 의해, 용해 유닛(20)에 연결된, (알칼리성) 용해 매질을 함유한 용해 매질 탱크 또는 저장소를 포함한다.
본 발명의 다른 실시 예에 따르면, 그리고 도면에 제시된 바와 같이, 제조 유닛 (1)은 유리하게는 둘 다 실온에서 유지되는 두 개 이상의 분리된 탱크 (2 및 3)로 이루어지며, 제 1 탱크 (2)는 NaOH (RM2-A)를 함유하고 제 2 탱크(3)는 하나 이상의 계면활성제 (RM2-B), 바람직하게는 황산 도데실 나트륨(SDS)을 함유한다.
탱크 (2 및 3)는 각각 바람직하게는 제 1 펌프 (6) 및 제 2 펌프 (7)를 통해, 제 1 세트의 튜빙 요소 (4 및 5)에 유체 연결되어 있으며, 이들 펌프 (6 및 7)는 각 반응 생성물(NaOH, 계면활성제 및 가능하게는 하나 이상의 다른 분자(들))의 적절한 첨가량이 혼합되고 제 1 정적 혼합기(9)에 공급되어 용해 용액을 형성하도록 제어한다.
제 1 튜빙 세트 (4 및 5)의 튜빙에 존재하는 반응성 화합물은 "Y 타입" 연결로 만나고, 유입구 또는 개구(8)를 통해, 용해 완충액(RM2 완충 매질)를 형성하기 위해, 도입된 화합물의 효율적인 균질 혼합에 사용되는, 제 1 정적 혼합기(9) 내로 밀려진다. 이러한 혼합은 (알칼리성) 용해 매질의 안정성 및 일정한 조성 품질을 보장한다. 균질 혼합은 육안으로 균질한 혼합을 의미한다.
제조 유닛 (1)의 이 제 1 정적 혼합기 (9)의 배출구 또는 출구(10)는 제 2 튜빙 (11)를 통해 세포 용해 유닛 (20)의 일부인 제 2 정적 혼합기(22)의 유입구 또는 개구 (21)에 유체 연결된다. 바람직하게는, 세포 용해 유닛 (20)의 제 2 정적 혼합기 (22)는 12 내지 24 개의 혼합 요소, 바람직하게는 18 개의 혼합 요소를 포함한다.
세포 용해 유닛 (20)은 상술한 바와 같은 통로이며, 바람직하게는 유입구(21)에서 "Y 타입" 연결에 의해, 제조 유닛 (1)의 제 2 튜빙 (11) 및, 제 3 튜빙 (23)와 펌프 (24)를 통해, 적절한 온도, 바람직하게는 약 2 ℃ 내지 약 8 ℃ 사이의 온도에서, 회수할 염색체외 핵산을 갖는 현탁된 세포를 함유하는 세포 현탁액 탱크 (25)에 유체 연결된다.
용해 또는 세포 분해는 바람직하게는 NaOH + SDS의 혼합물인 세포 용해 완충액을 제 1 정적 혼합기 (9)로부터 제 2 정적 혼합기 (22)로, 현탁된 세포를 세포 현탁액 탱크 (25)로부터 제 2 정적 혼합기 (22)로 첨가함으로써 수행된다. 생성된 분해된 세포의 용액이 점성이 있음에도 불구하고, 플라스미드를 분해하지 않고 효율적인 균질화가 얻어졌다.
본 발명자들은 세포와 용해 완충액의 최적 평균 접촉 시간을 평가하기 위해 튜빙 직경과 길이 및 펌프 출력을 최적화 하였다. 본 발명자들이 개발한 장치는 유리하게는 관심 있는 염색체외의 핵산 서열(들), 바람직하게는 DNA 플라스미드의 분해를 방지하는, 놀랍게도 짧은 평균 접촉 시간, 예컨대 5 분 미만, 바람직하게는 (약) 1 분 내지 (약) 5 분, 더욱 바람직하게는 (약) 2 분의 평균 접촉 시간을 허용한다.
이 제 2 정적 혼합기 (22)의 배출구 또는 출구 (26)는 세포 용해물의 회수를 위한 최적의 접촉 시간을 얻을 수 있도록 적절한 길이 및 직경을 갖는 제 4 튜빙 (27)을 통해 중화 유닛 (30)의 특징부와 유체 연결되어있다.
중화 유닛 (30)은 바람직하게는 아세트산 및 아세테이트 용액으로 제조되고, 바람직하게는 약 5.0 내지 약 6.0 사이의 pH로 유지되고 바람직하게는 약 5.5의 pH로 유지되며 3M의 아세테이트 및 15 % (v : v)의 아세트산으로 이루어지는, 바람직하게 2 ℃ 내지 8 ℃, 바람직하게는 약 4 ℃의 온도에서 사용되는, 중화 매질(RM3)을 함유하는 중화 탱크 (31)를 포함한다.
이 중화 탱크 (31)는 제 5 튜빙 (32) 및 펌프 (33)를 통해 제 3 정적 혼합기 (35)의 유입구 또는 개구 (34)에 유체 연결된다. 중화 매질은 충분한 양의 시간 동안 저온실의 중화 탱크 (31)에 저장됨으로써 사용 전에 냉각될 수 있고, 또는 제 4 튜빙(32)의 섹션을 둘러싸는 극저온 조절기 (36) 및 열 교환기 (39)에 의해, 실온(20 ℃ 내지 25 ℃로 구성됨)에서 2 ℃내지 8 ℃로 구성되는, 바람직하게는 4 ℃의 저온으로, 바람직하게는 연속적인 방식으로 냉각될 수 있다.
이 제 3 정적 혼합기 (35)의 유입구 또는 개구 (34)는 또한 세포 용해물을 제공하는 제 4 튜빙 (27)에 유체 연결된다. 바람직하게는, 이 제 3 정적 혼합기 (35)는 6개 내지 16 개의 혼합 요소, 바람직하게는 10 개의 혼합 요소를 포함한다.
이 제 3 정적 혼합기 (35)의 유입구(34)는 바람직하게는 두 개의 튜빙 요소(32 및 27)에 "Y 타입" 연결에 의해 유체 연결되어 있어, 두 유체 흐름은 용해 반응을 정지시키기 위한 세포 용해물의 빠르고 효율적인 중화를 얻고 중화된 세포 용해물을 형성하기 위해 정적 혼합기 (35)로 보내진다.
본 발명자들은 중화 중 용해된 세포의 최적의 평균 접촉 시간을 평가하기 위해 튜빙 직경과 길이, 및 펌프 출력을 추가로 최적화 하였다. 개발된 장치는 3 분 미만, 바람직하게는 (약) 0.5 분 내지 (약) 3 분, 보다 바람직하게는 (약) 1 분의 짧은 평균 접촉 시간을 허용하며, 이는 유리하게는 침전제의 첨가 전에 용해된 세포의 효율적인 중화로 이어진다.
이 제 3 정적 혼합기 (35)의 배출구 또는 출구(37)는 수득된 중화 용해물 혼합물을 수집하는 제 6 튜빙 (38)에 유체 연결된다. 제 6 튜빙 (38)은 침전 유닛 (40)의 일부를 형성하는 제 4 정적 혼합기 (41)의 유입구 또는 개구 (45)에 유체 연결된다.
제 4 정적 혼합기 (41)의 유입구 또는 개구 (45)는 또한 펌프 (43)를 통해 제 7 튜빙 (42)에 2가 이온 염 (RM4), 바람직하게는 수화된 염화 칼슘의 용액을 포함하는 2가 염 (들) 용액 탱크 (44)에 유체 연결된다.
다시, "Y 타입" 연결은 바람직하게는 두 튜빙 (38 및 42) 사이에 사용되어, 두 유체 유동이 제 4 정적 혼합기 (41)로 보내져 빠르고 효율적인 혼합을 얻는다. 탱크 (44)로부터 제 7 튜빙 (42)을 통해 제 4 정적 혼합기(41)의 유입구(45)로 펌핑된 2가 염 용액은 세포 용해물 혼합물을 수득하기 위해 제 6 튜빙 (38)으로부터 제 4 정적 혼합기에 (41)에 첨가 된 중화된 세포 용해물에 연속적으로 첨가된다. 이 제 4 정적 혼합기 (41)는 조밀한 점성 용액의 철저한 혼합을 보장하고 침전 반응을 개선시킨다. 다만, 벤츄리 효과를 발생시키는 수단을 포함하는, 정적 혼합기 이외의 다른 수단이 탱크 (44)로부터 수득된 조밀하고 점성이 있는 2가 염(들) 용액을 포함하는 유체의 효율적인 혼합을 위해 사용될 수 있다.
이 제 4 정적 혼합기 (41)는 4 개의 혼합 요소와 18 개의 혼합 요소, 바람직하게는 단지 4 개의 혼합 요소를 포함한다. 염 및 중화 된 용해된 세포를 효율적으로 혼합하여 세포 용해물 혼합물을 수득하기 위해 최적의 수의 10 개의 혼합 요소를 선택할 수 있다. 다만, 더 많은 수의 혼합 요소는 분리(디캔테이션 또는 정화) 동안 가용성 분획으로부터 덜 쉽게 제거되는 더 작은 입자 및 침전물을 생성할 것이고, 이는 생산 및 정제 수율을 감소시키고 정제 시간을 증가시킬 것이다.
제 4 정적 혼합기 (41)의 배출구 또는 출구(46)는 제 8 튜빙 (47)을 통해 분리 유닛 (50)의 분리 탱크 (51)로 유체 연결된다. 세포 용해물 혼합물 (52)은 제 4정적 혼합기 (41)로부터 분리 탱크 (51)로 공급된다. 제 4 정적 혼합기 (41)는 선택적이며, 튜빙(38)은 분리 (또는 디캔테이션 또는 정화) 유닛 (50)의 분리 탱크 (51)에 직접 공급 될 수 있다는 점에 유의하는 것이 편리 할 것이다.
본 발명에 따른 장치에서, 분리 유닛 (50)은 불순물 (또는 오염물)로부터 관심있는 서열 (들)로부터 세포 용해물 혼합물 (52)의 분리, 디캔테이션 또는 정화를 위해 사용되며, 이는 수율, 특히 분리, 디캔테이션 또는 정화의 지연 및 효율을 개선시킨다. 이 세포 용 해 혼합물 (52)로부터 관심 있는 염색체외 핵산 서열(들)의 회수를 향상시킨다.
도 2 및 도 3에 도시된 분리 유닛 (50)은 도 4에 도시된 주입 (부상) 유닛 (70)에 연결되며, 다량의 용해된 가스, 바람직하게는 공기, 질소, CO2, 오존, 더욱 바람직하게는 공기를 포함하는, 액체 수성 매질, 더욱 바람직하게는 물의 분리 탱크 (51)로의 주입을 허용한다. 이 액체 수성 매질은 가스, 바람직하게는 공기와 함께 상온에서 유지되고, 적절한 압력, 바람직하게는 적어도 2 barg 의 압력으로 도입된다.
분리, 디캔테이션 또는 정화는, 바람직하게는 포화 또는 거의 포화 수준의, 바람직하게는 공기, CO2 또는 질소 또는 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된, 용해된 가스를 포함하는 액체 수성 매질, 바람직하게는 물을, 가능하게는 분리 탱크 (51)에 존재하는 세포 용해물 혼합물 (52) 내로의 노즐을 포함하는, 출구 (54)를 갖는 하나 이상의 주입 파이프(들) (53)을 통해, 주입하는 것에 의해 효율적으로 개선된다. 이 주입 파이프 (53)의 출구 (54)는 분리 탱크 (51)에 존재하는 세포 용해물 혼합물 (52)의 표면 (55)에 대향하여 배치되고, 분리 탱크 (51)의 바닥면 (58)을 향하여 또는 그 방향으로 배치된다.
도 3에 도시된 바와 같이, 디캔테이션 유닛 (50)의 구성은 분리 탱크 (51)를 포함할 수 있으며, 여기서 하나 이상의 주입 파이프(들) (53), 바람직하게는 2개, 3개, 또는 4개의 주입 파이프 (53)가 도입되며, 가능하게는 분리 탱크(51) 내에서 대각선으로 대향하여 배치되고, 바람직하게는 주입 파이프 (53)의 출구 (54)는 분리 탱크 (51)의 바닥에 의해 형성된 평면과 평행한 동일 평면에 위치되고, 유리하게는 디캔테이션 탱크 측면 및 바닥으로부터와 서로로부터 등가의 거리로 배치된다. 도 3에서, 4 개의 주입 파이프(53)는 정반대로 또는 대각선으로 반대 위치에 도시되어있다.
도 3에 도시된 바와 같이, 각각의 주입 파이프 (53)의 출구 (54)는 분리 탱크 (51)에 존재하는 세포 용해물 혼합물 (52)의 상부 표면 (55)으로부터 멀어지도록 배치되고, 이 출구 (54)는 탱크 바닥면 (58)을 향한다. 이 구성은 세포 용해물에서 중요한 대류 운동의 형성을 피하고 상부 침전층으로부터 침전물 또는 플록의 분산을 막는다.
본 발명에 따른 장치의 분리 유닛 (50)에서, 세포 용해물 혼합물 (52)은 분리 탱크 (51)의 측벽을 따라 배치된 제 8 튜빙 (47)에 의해 도입되고 분리 탱크 (51)를 부분적으로 채운다. 분리 탱크 (51) 내에, 압력 하에서 가스로 포화된 액체 수성 매질의 첨가를 처리하기에 충분한, 잔여 부피가 남아있어야 한다.
주입 파이프(들) (53)의 출구 (54)는 유리하게는 분리 탱크 (51)의 바닥으로부터 분리 탱크 (51)의 높이 (56)의 1/6 내지 5/6 사이의 높이 (57)에 위치되며, 더욱 유리하게는 분리 탱크 (51)의 바닥으로부터 분리 탱크 (51)의 높이의 1/4 내지 3/4 사이의 높이 (57)에 위치된다.
주입 파이프 (53)는 좁은 출구를 갖는 노즐 출구 (54)를 제공 할 수 있다. 유리하게는, 주입 파이프 (53)는 내부 직경과 노즐 출구 (54)의 직경 사이의 비를 나타내며, 이는 (약) 2 이상, 보다 바람직하게는 (약) 3 이상이며, 50 이하 일 수 있다. 내경 파이프 크기와 노즐 출구 사이의 이러한 구성 및 비율은 액체 수성 매질의 감압이 주입 튜빙(53)이 아닌 노즐 자체에서만 시작되도록 보장한다. 이로써, 용해된 가스가 있는 액체 수성 매질은 출구 노즐까지 적절한 상승 압력을 유지하여 노즐 출구에서만 압력이 떨어진다. 그러나, 더 적은 양의 관심 염색체외 핵산 서열 (들)을 생성 할 수있게 하는 본 발명의 장치의 특정 구성에서, 이 비율은 노즐을 및 출구 (54) 직경의 감소를 포함하지 않는 주입 파이프(53)에 대해 (약) 1 또는 거의 1에 가까운 값이다. 그 결과, 분리 탱크 (51)에 분산된 오염물 또는 불순물로부터 세포 용해물 혼합물 (52)의 빠르고 효율적인 분리, 정화 또는 디캔테이션이 얻어 질 수 있다. 오염물 또는 불순물은 세포 용해물 혼합물 (52)의 상부 표면 (55)에서 부유 할 것이다. 바람직하게는, 이 분리 기간은 (약) 5 분 내지 (약) 3 시간 사이에 포함되지만, 최대 1 또는 2일까지 보다 긴 기간 동안 적용될 수 있다.
도 4에 도시된 바와 같이, 용해된 가스를 함유하는 첨가 된 액체 수성 매질은 바람직하게는 밸브 (71)를 통해 주입 또는 부상 유닛 (70)에 연결된 주입 파이프(53)로부터 얻어진다.
주입 (또는 부상 유닛) (70)은 액체 수성 매질, 바람직하게는 물을 함유하는 탱크 (72)를 포함한다. 이 액체 수성 매질 탱크 (72)는 유리하게는 탱크 (72)의 하부에 배치되는 유입구를 포함하며, 이는 바람직하게는 밸브 (73)를 통해 버블링 장치의 튜빙 요소 (74)에 연결되어 액체 수성 매질 탱크 (72)에 가스, 바람직하게는 공기를 공급한다. 가스(공기)의 도입 및 배출을 위한 추가 튜빙 요소 (75 및 76) 및 밸브 (77 및 78)가 수성 매질 탱크 (72)에 연결될 수 있다.
액체 수성 매질 탱크 (72)는 유리하게는 적절한 고압 하에서 액체를 유지하도록 배열된 밀폐 용기이다. 분리 (또는 디캔테이션) 탱크 (51)는 유리하게는 세포 용해물 혼합물 (52)을 실질적으로 대기압으로 유지하도록 구성된다.
액체 수성 매질은 버블링 장치로부터 수득된 가압 가스를 액체 수성 매질 내로 버블링 함으로써, 압력 하에서 용해된 가스로 농축되고 유리하게 포화된다. 이로써, 이 액체 수성 매질은 용해된 가스로 풍부해진다(헨리의 법칙). 유리하게는, 버블링은 완전한 포화에 도달하기에 충분한 시간 동안 수행된다. 액체 수성 매질 탱크 (72)의 압력은 유리하게는 버블링 동안 2 barg 이상, 바람직하게는 2 barg 내지 50 barg, 보다 바람직하게는 3 barg 내지 25 barg 사이 값으로 일정하게 유지된다.
용해된 가스가 풍부한 액체 수성 매질은 유리하게는 몇 초 내지 몇 분, 바람직하게는 5 초 내지 5 분으로 구성된 기간 동안 분리 탱크 (51)에 주입된다. 바람직하게는, 본 발명에 따른 방법 및 장치에서, 준비된 액체 수성 매질의 부피 %는 (디캔트 된) 세포 용해물 혼합물의 부피와 비교하여 0.2 % 내지 25 % (v / v), 바람직하게는 0.5 % 내지 15 %, 보다 바람직하게는 1 % 내지 10% 사이로 구성된다.
도 2 및 3을 다시 참조하면, 분리 탱크 (51)는 분리 탱크 (51)에 존재하는 세포 용해물 혼합물 (52)로부터 관심 있는 염색체외 핵산 서열 (들)을 함유하는 가용성 분획 또는 정화된 상을 회수하기 위한 수집 튜빙 (61)을 더 포함한다.
수집 튜빙 (61)의 유입구는 유리하게는 오염물 또는 불순물 침전물의 재-현탁액을 피하기 위해 분리 탱크 (51) 내의 액체 이동을 최소화하면서 가용성 분획 또는 정화 상의 효율적인 펌핑을 얻기 위해 분리 탱크 (51)의 저부에 배치된다. 튜빙 (61)은 유리하게는 주입 파이프(53)의 출구 (54) 레벨 아래에서 분리 탱크 (51)의 바닥 부분 (57)으로부터 가용성 분획을 제거한다. 튜빙 (61)은 여과 유닛에 연결될 수 있다.
또한, 공지된 수단 (예를 들어, 필터, 크로마토그래피 컬럼 및 수집 탱크) 및 당업자에게 널리 공지 된 방법 단계로 추가 정제가 수행 될 수 있다.
도 5에 도시된 바와 같이, 분리 탱크 (51) 외부로의 이러한 가용성 분획 또는 정화된 세포 용해물 혼합물의 흐름은 당업자에게 널리 공지된 방법 단계에 의한 추가 정제를 위해 다른 여과 유닛을 향해 세포 용해물 혼합물의 가용성 분획 또는 정화된 상의 흐름을 허용하는 튜빙 요소 (64)의 다른 섹션에 연결된 밸브 (62) 및 펌프 (63)의 개방을 통해 유리하게 얻어진다. 이 여과 유닛은 하나 이상의 필터 (65 및 66) 및 / 또는 적합한 용출 물질을 갖는 하나 이상의 크로마토그래피 컬럼을 포함 할 수 있다. 또한, 여과, 한외 여과(ultrafiltration) 및 / 또는 정용 여과(diafiltration) 동안, 하나 이상의 튜빙 섹션 (들), 특히 튜빙 요소 (64)의 섹션 (들)은 여과되고 정화된 용해물을 가능한 4 ℃에 가까운 온도 (2 ℃ 내지 8 ℃의 범위에서), 바람직하게는 적절한 (및 가능하게는 냉장된) 탱크 (69)에서 적절한 시간(밤새) 동안 유지될 수 있는 온도로 냉각하기 위해 극저온 조절기 (68)에 연결된 열 교환 장치 (67)에 의해 둘러싸일 수 있다.
본 발명에 따른 장치 및 방법에서, 튜빙 요소는 용해 시스템, 탱크 또는 저장소에 필요한 상이한 유체를 적절한 부피 (시간 당)로 도입을 제어하기 위해 유량계 또는 다른 장치를 포함 할 수 있다. 장치는 또한 상이한 탱크 또는 저장소의 중량 균형과 같은 중량 모니터링 요소를 포함하여 본 발명에 따른 방법의 각 단계에서 도입된 용액 또는 활성 화합물(용해 용액, 중화 용액, 현탁액의 세포, 압력 하에서 가스에 포화된 액체 수성 매질)의 양을 측정 할 수 있다. 본 발명의 장치 및 방법에 의해 얻어진 정제 조건 및 효율은 가능한 공정 조건의 개요를 나타내는 하기 표 1에 요약되어 있다.
액체 수성 매질 온도 4°C 에서 상온
(공기는 4 °C 에서 더욱 천천히 용해된다)
기압 6 barg
수성 매질에서 압축 가스 버블링 지속 시간 >= 1 분
처리된 용해물 부피 주입 시스템에 따라 거의 1 리터 미만에서 수 입방 미터(KEGT 에서 단계 2 용량 확장을 위해 계획된 3 x 1500 L).
액체 수성 매질 부피 (% v/v) 주입 마다 0.5 에서 20 %, 연속적인 주입은 부상 효과를 강화시킴
액체 수성 매질 주입 지속 시간 주입 유량 및 주입된 부피에 따라 5 초에서 5 분
부상(floatation) 지속 시간 5 분 내지 3 시간 사이, 각 주입 사이 또는 수집 전 일반적으로 15-30 분
전체 공정 지속 시간 세포 용해에서 최종 0.2 μm 여과: 어떤 규모든 약 8시간 미만
분리 효율 회수된 깨끗한 용해물의 부피/ 전체 부피 (용해물 + 침전층): 중량 디캔팅(gravimetric decanting): 70 % 에서 75 % 회수
부상(floatation): 85 % 에서 90 % 회수
⇒ 10 에서 15%의 회수 부피 이득
탁도 감소(Turbidimetry reduction) 중량 디캔팅(gravimetric decanting): 약 50 NTU부상(floatation): < 20 NTU
⇒ 2배 이상의 탁도 감소
⇒ 필요한 깊이 있는 여과 막 면적은 거의 같은 요소 만큼 감소함
본 발명의 새로운 공정 및 장치에 의해 얻어지는 이점이 많다. 이는 간단하고 강력하고 효율적이며 재현 가능하며 자동화 가능한 프로세스이며 장치(또는 플랜트)를 사용할 수 있다.
본 발명에 따른 방법 및 장치의 하나의 목적은 분리 지속 시간을 매우 낮게, 바람직하게는 최대 2 시간으로 유지하는 것이다. 전체 분리가 약 1 시간 또는 그보다 더 짧은 시간 후에 얻어져, 해당 목표는 초과달성 하였다.
다른 목적은 각각의 실행에 대해, 분리 탱크 (51)의 바닥에 입자가 거의 남아 있지 않거나 세포 용해물 혼합물에 분산되지 않은 강력한 분리 (디캔테이션 또는 정화)를 얻는 것이다. 입자들은 빠르게 깊이 있는 정화 필터를 막고, 펌프되어서는 안된다. 이 목표는 부상 후에 거의 모든 입자가 분리 (디캔테이션 또는 정화) 탱크 (51)의 상단에 뜨며, 더 나아가 용해물의 정화된 부분이 고전적인 중량 분리(gravimetric separation)보다 훨씬 더 명확하기 때문에 (탁도가 감소함에 따라) 초과 달성된다. 결과적으로 분리에 깊이가 적은 필터 표면이 요구되므로, 비용, 폐기물, 구역에 필요한 공간, 처리 등이 줄어든다.
추가적인 목표는 (총) 가용성 분획 또는 정화된 상의 회수를 향상시키는 것이며, 이 목표는 침전층에서 손실된 가용성 분획 또는 정화된 상이 공기와 같은 가스로 대체됨에 따라, 침전층이 가용성 분획 또는 정화 상에 침지되는 대신 가용성 분획 또는 정화 상 위에 부상하여 달성된다. 회수된 가용성 분획 또는 정화 상의 부피는 이에 따라 10 % 내지 15 % 증가되었다.
본 발명의 새로운 방법 및 장치의 추가의 목표는 바람직하게는 유량을 증가시키면서, 다량의 정제된 관심 있는 염색체외 핵산 서열 (들)의 회수를 위해 모든 규모에 대해 적어도 동일한 공정 지속 시간 (약 4 시간 미만)을 유지하면서 다량의(kgs) 세포 펠렛(pellets)을 처리하는 것이다.
본 발명자들은 또한 분리 탱크 (51)에 포함 된 세포 용해물 혼합물 내로 용해된 가스를 포함하는 액체 수성 매질 대신 가스 버블의 직접 주입을 시험하였다. 그러나, 가스 버블의 주입으로 버블이 상부로 상승함에 따라 아래에서 위로의 움직임이 발생하고, 따라서, 세포 용해물 혼합물로부터 회수될 염색체외 핵산 서열(들)의 불순물 및 오염물을 함유하는, 침전층과 가용성 분획의 혼합이 발생한다. 가용성 분획 또는 정화 단계에서 회수될 염색체외 핵산 서열의 오염물을 포함하는 플록 및 다른 고체 입자의 이러한 혼합 및 도입은 이러한 가용성 분획의 회수 및 염색체외 핵산의 정제 효율을 감소시킬 것이다.
다른 한편으로, 본 발명에 따른 방법 및 장치에서, 용해된 가스를 포함하는 액체 수성 매질의 세포 용해물 혼합물 내로의 주입은 유리하게는 가용성 분획 또는 정화된 상을 완전히 또는 거의 완전히 회수 할 수 있게 하고, 세포 용해물 혼합물의 가용성 분획 위에 부유하는 플록으로 이루어진 침전층에 의해 가용성 분획 또는 정화된 상이 오염되지 않거나 거의 오염되지 않는다.
또한, 본 발명에 따른 방법 및 장치는 버블 크기를 감소시키기 위해 필요한 가스 주입 프릿 또는 다른 미세 다공성 물질을 함유하지 않으며, 그러한 장치는 침전된 입자에 의해 막히기 쉽고 또한 불량한 세척성으로 인해 배치에서 배치로의 주요 상호 오염원이 된다. 본 발명에 따른 방법 및 장치의 설계는 세포 용해물 회수의 가용성 분획 (또는 정화된 상) 후에 분리 (디캔테이션 또는 정화) 수단, 특히 분리 탱크 (51)의 신속하고 효율적인 후속 세척을 가능하게 한다. 주입 파이프 (53)로부터 또는 다른 튜빙 요소들로부터 이 분리 탱크 (51) 내로 세척액(들)을 분사함으로써 추가적 사용이 가능하다.
용해 후, 침전물은 세포 용해물의 액체상(가용성 분획) 또는 정화 상)과 유사한 밀도를 갖는다. 여전히, 이들은 종종 출발 시약에 용해된 소량의 가스로부터 나오는, 달라붙는 몇 개의 미세버블로 인해 분리 탱크의 상부로 매우 느리게 상승하는 경향이 있다. 최신 공보에 제안된 용해 공정 동안 연속적으로 가스 버블의 첨가는 이러한 부상 효과(floatation effect)를 돕기 위해 버블의 양을 증가시키는 방법이다. 다른 한편으로, 종래 기술의 방법에서, 버블의 침전물에 대한 결합 강도는 매우 낮으므로, 혼합 운동 또는 교반은 침전물로부터 버블을 쉽게 떨어지게 하여, 부상 효과(floatation effect)를 깨고 다시 가라앉도록 한다.
연속 용해 시스템의 출구에서, 용해물은 분리 탱크로 보내져야 하고, 플록 (101) 또는 입자 (100)로 만들어진 침전물 (회수하고자 하는 관심 있는 서열(들)의 불순물로 만들어진)은 가용성 분획으로부터 분리된다. 세포 용해물이 바닥으로 보내지고 (세포 용해물에 침지된 출구), 종래 기술에서 제안된 바와 같이, 용해 동안 가스 버블이 연속적으로 첨가되면, 가스 버블은 출구 바로 위에서 빠르게 올라가고 (수족관의 공기 펌프와 같은) 세포 용해물 내에서 상승 흐름을 생성하여, 침전물이 분리 탱크의 상단에 올바르게 침전되는 것을 방지하는 혼합 움직임을 초래한다. 세포 용해물이 분리 탱크의 상부로 보내지면, 또한 이미 부상하기 시작한 입자 (100)의 상부 층 내에서 혼합 움직임을 생성하고, 부상 효과의 일부를 파괴하여 입자들을 용액으로 다시 밀어 넣을 것이다. 이들 혼합 움직임은 용해 공정 동안 버블의 연속적인 첨가를 필요로 하는 최신 기술의 단점 중 하나이다. 또 다른 단점은 처리의 연속적인 특성에서 비롯된다. 침전물이 있는 새로운 세포 용해물 및 버블은 이미 생성된 세포 용해물을 포함하고 이미 침전되기 시작한 분리 탱크에 연속적으로 첨가된다. 이는 분리 탱크에서 처리 불균일성을 초래한다.
본 발명은 용해가 완료되고 분리 탱크 (51)가 채워질 때, "정적 방식(static manner)"으로 부상(floatation)을 수행함으로써, 이러한 혼합 움직임 및 처리 불균일성을 피하기 위한 해결책을 제공한다. 용해된 가스를 갖는 액체 수성 매질을 압력 하에서 주입하면 전체 세포 용해물 부피의 처리가 동시에 가능해진다. 가스 대신 액체가 주입됨에 따라, 전체 부피로 빠르게 혼합되어 처리된다. 주입 직후, 분리 탱크가 대기압에 있다는 사실로 인해, 압력 하에서 액체 매질에 용해된 가스 (즉, 액체상)는 주로 핵 형성 중심의 역할을 하는 입자와 접촉하여, 기체 상으로 되돌아 간다. 이에 따라, 미세버블은 침전물에 달라 붙고 모든 입자는 동시에 분리 탱크 (51)의 상단으로 선형으로 상승하여, 동일한 방향으로 서로를 밀어낸다. 이는 강한 플런저 효과(plunger effect)를 생성한다: 위의 입자는 아래의 입자에 의해 세포 용해물의 가용성 분획으로부터 멀리 밀려난다. 이 플런저 효과는 훨씬 높은 분리 효율로 이어진다. 처리 이후, 대부분의 입자는 분리 탱크 (51)의 상부에서 분리 될 뿐만 아니라, 액체상 또는 용해된 가스로 포화된 액체 매질의 주입으로부터 나오는 가스로 밀려나고, 액체상 또는 가스는 이전에 입자들 사이의 공간에 포획되어 있던 액체 세포 용해물을 대체하고, 침전층 (101)을 밀어내어, 하기의 표 2 및 비교되는 도 6 및 도 7 내에 나타난 바와 같이, 회수 수율을 상당히 증가시킬 것이다(본 발명의 부상 방법이 적용되어 얻어진 부피 이득 (102) 및 최신 기술의 중량법이 적용되어 얻어진 잔류 입자 (100)를 참조).
마지막으로, 본 발명은 분리된 입자들을 다시 분산시키지 않고 압력 하에서 용해된 가스를 갖는 수성 액체 매질의 연속적 주입이 수행되도록 설계된다. 각각의 후속 주입은 세포 용해물에 남은 미세 입자의 양을 감소시키고 정화를 용이하게 한다.
중량법(Gravimetric) 부상 방법(Floatation)
회수 부피 70-75% 85 - 90%

Claims (17)

  1. 세포로부터 염색체외 핵산 서열(들)을 수득하는 방법으로서,
    a) 임의로 관심 있는 염색체외 핵산 서열(들)을 포함하는 세포를 배양하는 단계,
    b) 용해된 세포를 형성하기 위해 용해 매질에 세포 현탁액을 혼합하여 세포를 분해시키는 단계,
    c) 가용성 분획 및 침전물을 포함하는 세포 용해물 혼합물(cell lysate mixture)을 제조하기 위해, 상기 용해된 세포에 중화 용액, 바람직하게는 아세트산/아세테이트 용액으로 구성된 중화 용액을 첨가하여 용해된 세포를 중화시키는 단계,
    d) 임의로 상기 세포 용해물 혼합물을 CaCl2, MgCl2, ZnCl2, SrCl2, BaCl2, LiCl, 아세트산 암모늄, 황산 암모늄, 황산 나트륨 및 황산 마그네슘 또는 이들의 혼합물로 이루어진 그룹에서 선택되는 하나 이상의 염(들)을 함유하는 용액과 혼합하여 관심 있는 염색체외 핵산 서열(들)의 오염물을 추가로 침전시키는 단계,
    e) 단계 c) 또는 단계 d)에서 얻어진 세포 용해물 혼합물을 수집하는 단계,
    f) 분리 탱크 내의 침전물로부터 세포 용해물 혼합물의 관심 있는 염색체외 핵산 서열(들)을 포함하는 가용성 분획을 분리하는 단계, 및
    g) 관심 있는 염색체외 핵산 서열(들)을 포함하는 분리된 가용성 분획을 회수하는 단계를 포함하고, 분리 단계f)는 액체 수성 매질에 대기압 보다 높은 압력 하에서 가스를 용해시킨 후 분리 탱크에 함유된 세포 용해물 혼합물 내로 용해된 가스를 포함하는 액체 수성 매질을 주입하는 단계
    를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  2. 제 1항의 방법에 있어서,
    가스는 적어도 2 barg의 압력으로 가스 버블링(gas bubbling)하여 액체 수성 매질에 용해시키는 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제 1항 또는 제 2항의 방법에 있어서,
    용해된 가스를 포함하는 액체 수성 매질는 세포 용해물 혼합물의 부피에 대해 0.2% 내지 25%, 바람직하게는 0.5% 내지 15%, 보다 바람직하게는 1% 내지 10% V/V 를 포함하는 부피량으로 세포 용해물 혼합물로 주입되는 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 있어서,
    용해된 가스를 포함하는 액체 수성 매질는 적어도 2 barg의 압력으로(예를 들어, 주입 파이프에서) 세포 용해물 혼합물로 주입되고, 세포 용해물 혼합물은 분리 탱크에서 대기압인 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 있어서,
    세포 용해물 혼합물에 주입된 용해된 가스를 포함하는 액체 수성 매질는 상기 가스로 포화된 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제 1항 내지 제 5항 중 어느 한 항에 있어서,
    용해된 가스를 포함하는 액체 수성 매질는 분리 탱크의 바닥을 향해 아래쪽으로 주입되는 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제 1항 내지 제 6항 중 어느 한 항에 있어서,
    용해된 가스를 포함하는 액체 수성 매질의 주입은 단일 주입 또는 연속적인 주입인 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제 1항 내지 제 7항 중 어느 한 항에 있어서,
    단계 c)에서 중화 용액으로 용해된 세포의 중화시키는 것은 정적 혼합기(static mixer)에 의해 수행되고, 혼합 선형 속도는 100 cm/min 이상인 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제 1항 내지 제 8항 중 어느 한 항에 있어서,
    용해 매질는 NaOH 및 계면활성제(detergent), 바람직하게는 황산 도데실 나트륨(SDS)의 혼합에 의해, 및/또는 바람직하게는 정적 혼합기를 이용하여 수득하는 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제 1항 내지 제 9항 중 어느 한 항에 따른 방법을 수행하기 위한 장치로서,
    - 용해 매질의 성분을 함유하고 배출구(10)를 포함하는 하나 이상의 탱크(2, 3)를 포함하는 제조 유닛(1),
    - 관심 있는 염색체외 핵산 서열(들)을 갖는 세포를 함유하는 세포 현탁액 탱크 (25); 유입구(21); 및 배출구 (26);를 포함하고, 유입구(21)는 세포 현탁액 탱크로 유체 연결되고 제조 유닛 (1)의 배출구 (10)와 유체 연결되는, 세포 용해 유닛 (20),
    - 중화 매질 탱크 (31); 유입구(34); 및 배출구 (37);를 포함하고, 유입구(34)는 중화 매질 탱크 (31) 및 세포 용해 유닛 (20)의 배출구 (26)와 유체 연결되는, 세포 용해물 혼합물을 제조하기 위한 중화 유닛(30),
    - 중화 유닛 (30)의 배출구 (37)에 유체 연결된 유입구를 갖는 분리 탱크 (51)를 포함하는 세포 용해물 혼합물을 수집하기 위한 분리 유닛 (50), 및
    - 액체 수성 매질에 대기압보다 높은 압력으로 가스를 용해시키기 위한 수단을 포함하는, 용해된 가스를 포함하는 액체 수성 매질을 분리 탱크 (51)로 주입하기 위한 주입 유닛 (70)
    을 포함하는 장치.
  11. 제 10항의 장치에 있어서,
    용해된 가스를 갖는 액체 수성 매질을 주입시키기 위한 수단은 분리 탱크 (51)의 바닥면 (58)을 향해 배치된 출구(54)를 갖는 적어도 하나의 주입 파이프 (53)를 포함하고, 바람직하게는 주입 파이프 (53)는 출구 노즐 (54)을 포함하고, 주입 파이프 (53)의 내경 및 그 출구 노즐 (54) 직경 사이의 비는 적어도 2 이상인 것을 특징으로 하는 장치.
  12. 제 10항 또는 제 11항에 있어서,
    액체 수성 매질을 주입하기 위한 수단은 액체 수성 매질을 분리 탱크 (51)로 주입하도록 탱크 바닥(58)으로부터 분리 탱크(51)의 총 높이 (56)의 1/6 내지 5/6 사이에 포함된 높이(57)로 배치되고, 바람직하게는 탱크 바닥(58)으로부터 상기 총 높이 (56)의 1/4 내지 2/4로 포함된 높이에 배치되는 것을 특징으로 하는 장치.
  13. 제 10항 내지 제 12항 중 어느 한 항에 있어서,
    액체 수성 매질에 가스를 용해시키기 위한 수단은 액체 수성 매질 탱크 (72) 및 액체 수성 매질 탱크 (72) 내로 가스를 버블링 하기 위한 버블링 장치(74)를 포함하고, 바람직하게는 2 barg이상의 압력으로, 바람직하게는 2 barg 내지 50 barg의 압력으로, 더욱 바람직하게 3 barg 내지 25 barg의 압력으로 액체 수성 매질 탱크 (72) 내로 가스를 주입하도록 구성되는 것을 특징으로 하는 장치.
  14. 제 13항에 있어서,
    버블링 장치는 액체 수성 매질 탱크 (72)를 적어도 2 barg의 압력 하에 유지하도록 구성되는 것을 특징으로 하는 장치.
  15. 제 10항 내지 제 14항 중 어느 한 항에 있어서,
    주입 유닛 (70)은 용해된 가스를 갖는 액체 수성 매질을 간헐적으로 분리 탱크(51)로 주입하도록 구성되는 것을 특징으로 하는 장치.
  16. 제 10항 내지 제 15항 중 어느 한 항에 있어서,
    중화 유닛 (30)과 분리 유닛 (50) 사이에, 2가 이온 염(들) 용액 탱크 (44), 유입구(45) 및 배출구 (46)을 포함하는 침전 유닛 (40)을 더 포함하고, 상기 침전 유닛 유입구(45)는 중화된 세포 용해물을 수용하기 위해 중화 유닛 (30)의 배출구 (37)와 유체 연통하고, 2가 이온 염(들) 용액 탱크 (44) 연결되고, 침전 유닛의 배출구 (46)는 분리 유닛 (50)과 유체 연통되는 것을 특징으로 하는 장치.
  17. 제 10항 내지 제 16항 중 어느 한 항에 있어서,
    제조 유닛 (1), 세포 용해 유닛 (20), 중화 유닛 (30) 및/ 또는 침전 유닛 (40)은 하나 이상의 정적 혼합기(들)(9, 22, 35, 41)을 포함하는 것을 특징으로 하는 장치.
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