CN102449150A - 用于生产和/或纯化多核苷酸的方法和装置及其可获得的产物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于获得目标(多)核苷酸序列的装置和方法，并且包括步骤：培养宿主细胞以产生目标核苷酸序列并收获这些细胞，将这些细胞引入通道中并且在连续过程中分解它们，在该连续过程中，通过将这些分解的细胞与含有一种或多种盐的溶液混合并且获得混合物，在通道中进行污染物的沉淀，使沉淀物从该混合物的溶液中分离出来，优选地从该混合物的溶液中浮选和/或沉淀1-48小时，并且从该溶液中泵出可溶性材料，同时排除收集沉淀物。

Description

用于生产和/或纯化多核苷酸的方法和装置及其可获得的产物
发明领域
本发明涉及用于获得(生产和/或纯化)多核苷酸序列(如(药物级)质粒DNA)的方法和装置。
现有技术
多核苷酸的纯化通常获自能够产生大量这些多核苷酸的宿主细胞，可能在遗传工程后。
Birnboim等，(Nucleic acids research(核酸研究)，1979，7，1513-1523)描述了将碱性溶液添加至细胞培养物上以分解这些细胞并可能使基因组DNA变性，但不会影响质粒DNA。将这种碱性裂解与使用足量的醋酸盐/醋酸的中和、一个或多个过滤步骤和在色谱柱上的截留步骤结合。
已知可以裂解革兰氏阴性细菌(如，大肠杆菌)的生物质，并通过包括沉淀、过滤、选择性沉淀和在柱子上的特异性截留的连续步骤从大量核酸和蛋白质中分离出目标核苷酸序列。
根据所用的实验方案，这些目标核苷酸序列会与污染物(或杂质)，如内毒素、酚类、氯化铯、溴化乙锭、Triton
Figure BDA0000112176680000011
结合的蛋白质或其他核酸相结合。
因为对于实验室中的特定用途或对于临床目的而言，需要高度纯化的核苷酸序列，因此提出了几种尝试来降低污染物的量。
EP 0880536B1描述了基于使用羟磷灰石色谱的分离来获得内毒素纯的DNA质粒的方法。
US 6410274B1(WO 9916869A1)描述了通过加入0.1-0.4M CaCl2以沉淀污染物，如基因组DNA和RNA分子进行质粒DNA纯化的分批方法。
处理方法必须保证核苷酸序列(优选质粒DNA)的完整性。主要障碍会阻碍这些核苷酸序列的容易回收。例如，使用碱性溶液或加热步骤和/或长程序将会分解这些核苷酸序列。此外，DNA分子，包括质粒，对机械应力敏感。此外，高粘度的溶液可能引起局部不均匀性或需要强烈搅拌，这两者都可能分解这些核苷酸序列。当使用浓缩的二价金属氯化物(如CaCl2)溶液时，这种情况尤其明显。为了避免分解，现有技术的一些处理方法需要在4℃下操作溶液，这导致较高的操作限制和成本。还已知分批方法进一步呈现出污染的风险。
美国专利申请2005/0026177描述了用于获得药物级质粒DNA的装置和连续方法，包括碱性裂解、中和和出口上方截留层中的沉淀物的沉降，在出口处澄清的裂解产物离开截留反应器。
发明目的
本发明涉及不呈现现有技术的方法和装置的缺陷的方法和装置，尤其是不需要色谱步骤或色谱装置的廉价且简化的方法和装置，并且可以优选地在室温下进行或使用，用于有效且快速地生产和/或纯化一种或多种目标(多)核苷酸序列，如目标病毒序列或(可能是药物(临床)级)DNA质粒。
发明概述
用于获得(通过生产和/或纯化)目标(多)核苷酸序列的本发明方法包括步骤(或由这些步骤组成)：
a)可能培养生产(涉及合成)该(多)核苷酸序列(尤其是目标DNA质粒)的宿主细胞(优选重组的)，并收获这些含有该(多)核苷酸序列(优选该质粒)的细胞；
b)将这些细胞(生产该(多)核苷酸序列，优选该目标DNA质粒)引入通道中并在连续的方法中(即，在连续流动装置中连续地)(通过该通道)分解这些细胞；
c)在这种连续的方法中(即，在这个连续流动装置中连续地)，通过将这些(分解的)细胞与一种或多种二价离子的(水合)盐混合，在该通道中进行该(多)核苷酸序列(尤其是该DNA质粒)的污染物(或杂质)的(连续)沉淀，优选地盐选自(水合)CaCl2、(水合)MgCl2、(水合)ZnCl2、(水合)SrCl2和(水合)BaCl2，或(不太优选)其他(水合)盐，如LiCl、醋酸铵、硫酸铵、硫酸钠或硫酸镁(优选的盐是(水合)CaCl2和(水合)MgCl2)；
d)收集所获得的混合物(在一个小瓶中)并且使沉淀物分离(从混合物的溶液中分离出来)，优选地浮选和/或沉淀介于约1小时和约48小时之间的时间段；
e)优选地通过抽空，从该溶液中收集包含该多核苷酸序列(尤其是该DNA质粒)的可溶性材料，同时排除收集沉淀物；
f)优选地在一个或多个具有约0.22μm至约1.5μm孔径的滤器上进行该可溶性材料的一个或多个过滤步骤，优选地接着在约50kDa膜至约500kDa膜(优选约50至约250kDa，更优选约70至约100kDa)上进行超滤步骤，以保留第一个膜截留物并从该第一个截留物中收集待纯化的目标核苷酸序列，优选目标DNA序列。
更精确地，本发明涉及(通过生产和/或纯化)获得大小小于约3000个碱基(碱基对)的目标DNA质粒的方法，并且包括步骤(由这些步骤组成)：
a)可能培养包含该目标DNA质粒的宿主细胞(优选重组的)，并且收获含有该质粒的这些细胞；
b)将这些细胞(包含目标DNA质粒)引入通道中，使用足量的RNA酶进行处理并在连续的方法中(在连续流动装置中连续地)分解这些细胞；
c)在这个连续的方法中(在连续流动装置中连续地)，通过将这些(分解的)细胞与一种或多种二价离子的(水合)盐混合，在该通道中进行该质粒的污染物(或杂质)的(连续)沉淀，优选地盐选自(水合)CaCl2、(水合)MgCl2、(水合)ZnCl2、(水合)SrCl2和(水合)BaCl2，或(不太优选的)其他(水合)盐，如LiCl、醋酸铵、硫酸铵、硫酸钠或硫酸镁(优选的盐是(水合)CaCl2和(水合)MgCl2)；
d)收集所获得的混合物(在一个小瓶中)并且使沉淀物分离(从混合物的溶液中分离出来)，优选地浮选和/或沉淀约1小时至约48小时之间的时间段；
e)优选地通过抽空，从该溶液中收集包含质粒的可溶性材料，同时排除收集沉淀物(以及沉淀和浮选单元)；
f)优选地在一个或多个具有约0.22μm至约1.5μm孔径的滤器上进行该可溶性材料的一个或多个过滤步骤，优选地接着在约50kDa膜至约500kDa膜(优选约50至约250kDa，更优选约70至约100kDa)上进行超滤(步骤)，以保留第一个膜截留物并从该第一个截留物中收集目标质粒。
根据本发明的方法中所用的宿主细胞是原核生物细胞，如细菌，或真核生物细胞，优选选自酵母、植物、真菌、昆虫或哺乳动物细胞(包括人细胞，限制条件是这些哺乳动物细胞不是人胚胎细胞)。
本发明的优选的真核生物细胞是酵母，如酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)细胞或巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)细胞和/或动物细胞，如果蝇(Drosophilla)S2细胞或中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。
优选地，宿主细胞是原生生物细胞，如革兰氏阳性或革兰氏阴性细菌，如大肠杆菌(Escherichia coli)或枯草芽孢杆菌(BacillusSubtilis)细胞。
术语“(多)核苷酸”意思是任何超过50个碱基的核苷酸序列，优选超过50个碱基对。更优选地，该(多)核苷酸序列是DNA分子。
优选地，本发明的(多)核苷酸序列是(DNA)质粒形式的，可能是大小小于3000个碱基对的(DNA)质粒。
有利地，在本发明的方法中，通过加入裂解溶液来分解细胞(悬浮液)。
有利地，用于分解细胞(悬浮液)的(裂解)溶液是碱性溶液，优选以约11至约12.5的pH存在，优选约12至约12.5的pH。
分解这些细胞的优选方法包括将细胞(悬浮液)与碱性(裂解)溶液混入(连续添加)通道中的步骤，此后在该通道中通过将由足量醋酸/醋酸盐组合物(溶液)组成的中和溶液(优选约5.0至约6.0的pH)加入裂解的细胞中(连续)来获得中和，以形成第一种混合物。
有利地，该进行分解(裂解)组合物(溶液)的pH为约12至约12.5，并且给该溶液补充足量的一种或多种净化剂。
优选地，该碱性裂解溶液由足量的NaOH、Na2CO3或其混合物组成，并且优选是足量的NaOH。
用于分解细胞的裂解溶液可以进一步包含约0.01至约5％的一种或多种净化剂，优选约0.1至约2％，更优选约0.5至约1％(w∶v)，优选净化剂选自十二烷基硫酸钠(SDS)、去氧胆酸钠、Triton
Figure BDA0000112176680000051
X-100、Triton
Figure BDA0000112176680000052
X-114、Nonidet
Figure BDA0000112176680000053
P-40、辛基-葡糖苷、Brij
Figure BDA0000112176680000054
35、Brij
Figure BDA0000112176680000055
56、Tween
Figure BDA0000112176680000056
20和CHAPS(3-[(3-胆酰胺丙基)二甲氨基]-1-丙烷磺酸盐)，或其混合物。
有利地，包含目标生物分子的细胞(悬浮液)和用于(连续)分解这些细胞的(裂解)溶液之间的最佳接触时间为约15秒钟至约15分钟，优选约3分钟至约10分钟，更优选约5分钟。
或者，包含目标生物分子的细胞(悬浮液)和用于(连续)分解这些细胞的(裂解)溶液之间的最佳接触时间优选为约2分钟至约3分钟。
优选地，醋酸/醋酸盐组合物具有约5.0至约6.0的pH，优选约5.5。
优选地，醋酸/醋酸盐组合物具有3M(mol/l)醋酸盐和15％(v/v)醋酸的浓度。
优选地，醋酸/醋酸盐组合物在约4℃下冷藏。
有利地，这些包含目标生物分子的裂解的细胞和中和溶液的最佳接触时间为约15秒钟至约5分钟，优选约30秒钟至约2分钟，更优选约1分钟。
有利地，这些裂解的细胞和该沉淀溶液的最佳接触时间为15秒钟至约5分钟，优选约30秒钟至约2分钟，更优选约1分钟。
有利地，涉及倾析、沉淀和/或浮选的步骤d)的最佳时间为约5小时至约24小时，优选约8小时至约24小时，更优选约20小时至约24小时。
约优选地意指一个值加上或减去20或10％(例如，约5分钟意思是从4分30秒至5分30秒的每一个值)。
本发明的方法可以任选包括预备步骤，该步骤由将足量的RNA酶加入包含目标质粒的(完整)细胞(悬浮液)中并可以通过细胞膜扩散组成。这种RNA酶处理对于大小小于3000个碱基(碱基对)的质粒DNA的纯化尤其有用。
优选地，(水合)盐选自(水合)CaCl2、(水合)MgCl2、(水合)ZnCl2、(水合)SrCl2和(水合)BaCl2，或(不太优选的)其他(水合)盐，如LiCl、醋酸铵、硫酸铵、硫酸钠或硫酸镁(优选的盐是(水合)CaCl2和(水合)MgCl2)，并且以约2M至约6M的浓度(连续)加入溶液中的这些(分解的)细胞中。
优选的水合盐是CaCl2.2H2O，并且以约2M至约6M，优选约5M的浓度加入。
有利地，这些(分解的)细胞和加入的盐之间的最佳接触时间为约15秒至约5分钟，优选约30秒至约2分钟，更优选约1分钟，该阶段适于获得所需的沉淀，而没有引起剪切力，剪切力可能破坏待纯化的目标生物分子。
有利地，进行本发明的连续方法，而没有接触含有本发明的(多)核苷酸序列(优选质粒)的溶液和非一次性的材料(如泵和控制泵输出的装置)。
在本发明的方法中，通过入口/出口、泵或阀的打开来进行连续处理过程(或连续添加步骤)，并且通过称量本发明进料溶液的小瓶或容器来有利地控制这些泵的输出。
优选地，连续处理过程中和本发明装置中所用的泵是蠕动泵。
在不太优选的实施方案中，通过入口出口、泵或阀的打开来进行该连续处理过程，并且通过进入不同管状元件中的泵输出的测量来控制这些泵输出。
在本发明的方法中，在深床滤器上进行过滤步骤。
或者，在本发明的方法中，在表面滤器上进行过滤步骤。
本发明的方法优选进一步包括步骤g)：进行阴离子交换色谱(滤清(polishing)步骤)，使用洗涤子步骤，优选确切地在(阴离子交换)色谱上进行一个(滤清)步骤。
阴离子交换色谱(步骤g)包括(或由其组成)本领域技术人员公知的经典纯化步骤并包括子步骤：
-结合第一个截留物中存在的(多)核苷酸序列
-洗涤
-洗脱目标(多)核苷酸序列。
优选地通过使用pH为约6至约10的缓冲溶液来进行洗涤子步骤，优选地包括约50mM Tris(HCl)和约0.4至约0.6M NaCl。
任选地，在该洗涤子步骤后(并且在洗脱子步骤前)，使用补充了一种或多种中性净化剂的相同溶液来进行另一个洗涤子步骤，优选净化剂选自Triton
Figure BDA0000112176680000071
X-100、Triton
Figure BDA0000112176680000072
X-114、Tween
Figure BDA0000112176680000073
20、Nonidet
Figure BDA0000112176680000074
P-40、辛基葡糖苷、Brij
Figure BDA0000112176680000075
35、Brij
Figure BDA0000112176680000076
56，或其混合物，优选地以约0.1％至约1％存在于溶液中，并且接着进行第三个未用中性净化剂的洗涤子步骤。
通过使用盐梯度进行第一个截留物级分的洗脱步骤(以收集第一个截留物并回收目标(多)核苷酸序列)，优选地通过加入pH为约6至约10并且具有从约0.4M递增至约2M NaCl，优选约0.5至约1M NaCl的盐浓度的缓冲溶液来形成盐梯度。
有利地，对于每种溶液，通过添加至少三倍柱体积来进行根据本发明方法的阴离子色谱的这些洗涤和洗脱(子)步骤，优选对于每种溶液，通过添加(至少)五倍柱体积。
本发明的方法优选地进一步包括步骤h)：在约30kDa膜上进行第一个截留物的超滤并收集(新)获得的第二个(约30kDa)膜截留物，并可能在约0.22μm膜上进行该(新)获得的(约30kDa)第二个截留物的(最终)过滤，以在渗透物中收集(从这些污染物或杂质)纯化的(多)核苷酸序列，优选本发明的质粒。
有利地，本发明的方法使得现有技术的方法变得简单并且成本降低，因为其有利地在室温下进行：约15℃至约35℃的温度，优选约20至约25℃的温度。
有利地，本发明的整个方法在室温下进行(约15℃至约35℃的温度)，除了步骤d)在约4℃下进行，使用合适的可以用于获得包含目标(多)核苷酸序列的溶液冷却的培养基，以改进混合并避免核酸损坏。
本发明还涉及用于进行该方法的装置(设备、设施或成套装备)，优选地进行该方法的步骤b)至c)或所有步骤。
有利地，本发明的装置包括(或由其组成)用于获得连续流动的部件，并且由一次性(单次使用)管状元件制得，使用圆管形成，可能连接合适的存储器或容器，并且具有用于引入培养基和细胞(或细胞级分)的入口部件和用于收集污染物和从收集的目标(多)核苷酸序列中分离出来的培养基的出口部件，目标(多)核苷酸序列获自这些细胞并从这些污染物中纯化出来。
有利地，本发明的管状元件是根据用于人类药物中的需求(药物品质)。
有利地，本发明的管状元件是不可沥滤的。
本发明的装置包括(或由其组成)(第一个)泵1，具有约0.1L/分钟至约1L/分钟，优选约0.30L/分钟的泵输出，并连接到管状元件2。
在本发明的装置中，该(第一个)泵1连接到能够包含优选悬浮于pH为约5至约8缓冲的10％(v∶v)等渗水溶液中的细胞混合物的小瓶3(或相似的包括或呈现一定体积的容器)。
本发明的装置进一步包括置于管状元件2末端的混合室4(具有合适体积的容器或袋子)。
优选地，该管状元件2具有0.5m至约5m，优选约1.5m的总长度。
该管状元件2具有约5mm至约25mm的优选内径，优选约7mm至约15mm，更优选约9mm至约11mm。
本发明的装置可以进一步包括(第二个)泵11，通过管状元件14连接含有裂解溶液的存储器13或容器，该泵具有约0.1L/分钟至约1L/分钟的泵输出，优选约0.30L/分钟，并通过该混合室4或等价容器连接到设备的(管状)元件。
有利地，混合室4装备有一次性轨道式均质机。
优选地，混合室4是约1l至约3l的一次性圆锥形小瓶。
有利地，(第二个)泵11的泵输出等于第一个泵1的泵输出。
本发明的装置可以进一步包括从该混合室4或等价容器开始的管状元件12，这些管状元件12具有约0.5cm至约5cm，优选约1cm至约2cm，更优选约1.27cm的内径。
管状元件12有利地具有约5m至约60m，优选约10m至约30m，更优选约20m至约25m的总长度。
优选地，在管状元件12开始处，本发明的装置进一步包括(第三个)泵21，具有约0.2至约3L/分钟，优选约0.4至约1L/分钟，更优选约0.6L/分钟的泵输出。
管状元件12中的流动为约0.2至约3L/分钟，优选约0.4至约1L/分钟，更优选约0.6L/分钟。
优选地，(第三个)泵21的泵输出等于管状元件12的泵输出。
任选地，(第四个)泵31连接到管状元件12的末端。
该(第四个)泵31具有约0.2至约3L/分钟，优选约0.4至约1L/分钟，更优选约0.6L/分钟的泵输出。
优选地，(第四个)泵31的泵输出等于管状元件12的泵输出。
所述(第四个)泵31在管状元件12的末端与可能含有中和溶液的存储器32(具有适当体积的袋子或等价容器)连接，并通过Y-型(或T-型)接头连接以形成管状元件33。
优选地，这些管状元件33呈现部件34，以促使(促进)管状元件33中的有效文丘里(混合)效应。
优选地，管状元件33的内径为约0.5至约5cm，优选约1cm至约2cm，更优选约1.27cm，除去用于促使(促进)上述文丘里(混合)效应的部件34(这些管状部件的直径改变了)。
该管状部件33的长度为约1m至约20m，优选约5m至约15m，更优选约8m至约12m。
有利地，通过将管状元件33的内径缩减约40％(约50％至约80％的初始内径)来促使(获得或促进)该文丘里(混合)效应。
如附图1中所示的泵的位置，由于如所示的各自的位置，也提高了处理效率，这些泵可以有利地推动管状元件中流体(的流动)，替代牵引这些管状元件中存在的流体，这样的牵引移动可能促使管状元件的扁平效应，这将改变待收集产物的品质。
本发明的装置进一步包括在管状元件12或33的末端处连接的(第五个)泵41，并且呈现出约0.1L/分钟至约1L/分钟，优选约0.3L/分钟的泵输出，通过Y-型(或T-型)接头连接到管状元件42。
(第五个)泵41与含有沉淀溶液的存储器43(适当体积的袋子或容器)连接并通过Y-型(或T-型)接头连接于管状元件42的开始处。
有利地，本发明装置的泵是蠕动泵。
这些管状元件42还可以包括部件44，以促使(促进)文丘里(混合)效应。
有利地，通过将内径缩减约40％(约50％至约80％的初始内径)来促使(获得或促进)管状元件42中的这种文丘里(混合)效应。
文丘里(混合)效应意思是从系统(促使)获得的紊流，其中迫使层流中的流体在流体具有提高的速度和恰在缩减直径后引起低压的程度上通过缩减的管道。
优选地，将引起文丘里(混合)效应的部件放置在管状元件33和/或42开始后的约1至约100cm处，优选约5至约20cm，更优选约9至约30cm，优选管状元件33和/或42中的流动是层流之后。
有利地，根据本发明的文丘里(混合)效应使得粘性(非牛顿)流体混合，形成适当的均质液体。
管状部件42具有约1m至约45m的总长度，优选约5m至约15m，更优选约10m至约14m。
管状部件42具有约0.5cm至约5cm的内部管径，优选约1cm至约2cm，更优选约1.27cm，除去产生这种文丘里(混合)效应的所述部件。
优选地，本发明的装置进一步包括称重不同存储器(袋子或容器)中存在的(不同)料液的部件。
本发明还涉及(从其污染物)新分离和纯化的组合物，其包含可获得的目标生物分析，优选地通过上述方法获得。
更特别地，所获得的这种纯化和分离的生物分子是DNA质粒，包括具有低于3000个碱基(碱基对)大小的DNA质粒。
优选地，本发明的这种纯化和分离的质粒DNA组合物是至少无污染物的：无基因组DNA、无RNA并且包括约40至约100内毒素单位/mg DNA(更优选质粒DNA组合物包括约55内毒素单位/mg DNA)。这种还有利地不含可能在本发明不同方法步骤中加入培养基中的化学物质(包括RNA酶)的组合物还可以对应于包含适当的药物载体(或稀释剂)和足量的(从其污染物纯化的)上述这种目标生物分子的药物组合物。
有利地，本发明这种纯化和分离的质粒DNA组合物至少是无污染物的：无基因组DNA、无RNA并且包括约0.2至约100(优选约2至约10)内毒素单位/mg DNA。这种还有利地不含可能在本发明不同方法步骤中加入培养基中的化学物质(包括RNA酶)的组合物还可以对应于包含适当的药物载体(或稀释剂)和足量的(从其污染物纯化的)上述这种目标生物分子的药物组合物。
有利地，质粒DNA组合物的内毒素含量为约55。
或者，质粒DNA组合物的内毒素含量为约0.2至约2内毒素单位/mgDNA。
术语“不含”意思是组合物中污染物的剩余含量低于2％(w∶w)，优选低于1％(w∶w)，或低于0.5％或0.1％(w∶w)。
在以下作为本发明的非限制性实施方案呈现的优选实施例中，参照附图描述了本发明。
发明详述
图1说明了根据本发明的装置或设备，可以进行本发明方法的步骤a至c并且是用圆管(管状元件)形成的约45.6米长的一次性管。
该装置或设备插入包含以0.30L/分钟流动的收集细胞的管状元件2中。在约1.5m处，具有0.30L/分钟泵输出的泵11连接到含有裂解溶液(用于分解细胞)的存储器或容器13，其通过混合室4连接到管状元件2。流动为0.6L/分钟。
任选地，在21.3m处，另一个具有0.6L/分钟泵输出的泵31连接到含有中和溶液的存储器32，其通过Y-型(或T-型)接头连接，并且其中通过文丘里效应来促进均质非机械混合。
在约9.5m处，另一个具有0.30L/分钟泵输出的泵41连接到含有沉淀溶液的存储器43，其通过Y-型(或T-型)接头连接，并且其中通过另一个文丘里效应来促进均质非机械混合。
在约11.8m处，存在用于收获混合物的部件。
实施例
培养物
从氮气瓶(-170℃)取出一小瓶GMP主种子(master seed)，并且在使用前5分钟在室温下解冻，然后在37℃下在适当的培养基中振荡培养。
使具有目标质粒的大肠杆菌生长至OD600获得0.8单位。选择该规格(OD600-纯度)下的一个培养物接种发酵罐。取出选定培养物的样品用于质量控制(QC)测试。
通过定期添加NaOH和HNO3，将pH维持在7.0+/-0.2。将温度维持于37+/-0.5℃，并且将气流固定于1vvm(＝150L/分钟)；将压力调节至360mbar并且将搅拌固定于700RPM。发酵过程中的发酵参数是恒定的。如果需要，加入少量消泡剂。
在发酵15小时后，每小时取样，以追踪OD600。当OD600达到至少35个单位时，将培养物冷却低于20℃。在冷却步骤过程中，将搅拌和气流各自降至200RPM和40L/分钟。
当培养物温度低于20℃时，在无菌条件下取样(用于QC测试)并且将培养物在两个装备有JLA-8.1000转子的Beckman Avanti J-20间歇式离心机中在6700g下离心20分钟。收集沉淀并保存在4℃下，直至发酵罐收集(和离心)步骤结束。然后将沉淀重悬浮于用于裂解的无菌袋中，或存储在-20℃下。
裂解和过滤
下文证明的生产规模对应于4000g新鲜细胞糊状物，等于100L发酵罐中所生产批次的大约1/3。
在18+/-3小时的过程中，将4000g新鲜细胞糊状物在2-8℃下解冻。将解冻的悬浮液稀释于RM1缓冲液中，以获得40l悬浮液(稀释10倍的细胞糊状物)。
然后将悬浮液以0.3L/分钟引入通道中；参见图1。
有利地，因为通道是用于单次使用的，因此不需要清洗和/或净化。
使用连续系统进行裂解(细胞分解)，使用2步的缓冲液添加(60LRM2：200mM NaOH；1％w∶v SDS和100L RM3：3M CH3COOK，CH3COOH 15％v∶v)。
将细胞悬浮液和RM2在混合室中在轨道式搅拌下(使用一次性使用的塑料(聚四氟乙烯：PTFE)螺旋状物)混合来进行裂解(细胞分解)的第一个步骤。
发明人观察到尽管裂解的溶液(分解的细胞)是粘稠的，但获得了有效的均质，而没有破坏质粒。
发明人进一步优化管道长度和泵输出，以评价细胞和裂解混合物的最佳平均接触时间。他们发现了他们研发的系统允许短的持续时间，如少于5分钟，这有利地减少了受基因组DNA的污染，并且观察到2或3分钟的最佳时间。
在管状系统中进行了第二次缓冲液添加，利用管状元件33中的文丘里(混合)效应。
发明人观察到尽管中和的混合物非常粘稠，但文丘里的利用引起了所获得的有效混合，而没有破坏质粒(没有在液体中形成高剪切力)。
对于连续方法，细胞悬浮液和RM2培养基之间的接触时间为5分钟，而裂解的(分解的)细胞和RM3之间的接触时间为一分钟。
然后将5M CaCl2.2H2O的溶液连续加入中和的悬浮液中，并且在通道中的接触时间为1分钟。
有利地，不需要搅拌来确保该均质混合，因为上述通道包括具有文丘里(混合)效应的管状结构，并且令人惊讶地可以形成均匀的溶液，即使在加入这种非常粘稠的溶液后。因此，在本发明中没有观察到DNA分子的分解(已知在强烈搅拌或强剪切力下发生，必须给予高粘度的5MCaCl2溶液)。
将混合物收集于300l袋子中并且存储在2-8℃或室温下过夜(20+/-4小时)，使其沉淀。
发明人观察到污染物沉淀(薄层)和浮选在混合物顶部(大部分)。因此，澄清的相在300L袋子的中部。
将澄清的相(表示约80至90％)小心地从300l袋子中泵出(最小化袋子中液体的移动，以避免絮凝物的重悬浮)并且收集在200l Tankliner中，并进一步在至少20分钟内析出。
将澄清的相在1.5μm和两个0.2μm的三个滤器上连续过滤。
收获并存储滤过的相。
在100kDa PES膜上进行超滤，或者在70kDa膜上进行(对于短于3000个碱基对的质粒)。
发明人测量了截留质粒的等份试样的纯度，并且观察到约50至100内毒素单位(EU)/mg DNA的污染，并且更常见地为约55EU/mg DNA。发明人推断该水平是显著的，因为尚未进行实质的纯化步骤。
然后将超滤的溶液渗析。
将从污染物澄清得到的超滤过的溶液接受阴离子交换色谱。发明人测试了几种阴离子交换色谱。本领域技术人员可以容易地发现最合适的一种。
使用50mM Tris(-HCl)、0.54M NaCl，pH8.5的溶液进行洗涤步骤。
任选，在用50mM Tris(-HCl)、0.54M NaCl，pH8.5的洗涤步骤之前，用补充了0.1至1％的曲通X-100的50mM Tris(-HCl)、0.54M NaCl，pH8.5进行一次洗涤。
通过线性梯度进行洗脱，线性梯度由混合补充了0.54M NaCl的50mMTris(HCl)pH8.5的溶液和补充了1M NaCl的50mM Tris(HCl)pH8.5的溶液来形成。
将洗脱过的材料在30kDa膜上超滤，然后将浓缩的截留物通过0.22μm滤器过滤，收集滤器，并储存在-20℃。
通过HPLC未检测到RNA水平(低于检测极限)。蛋白含量低于10μg/mg质粒。
在色谱步骤后，发明人测量了约2至约10单位/mg DNA的内毒素含量。
通过显色鲎裂解产物方法(KQCL)来测量内毒素。内毒素激活了KQCL试剂中的酶原，其催化发色底物的分解，在整个培养阶段中，在405nm处，通过光度连续测量。颜色消失需要的时间(反应时间)和内毒素之间的log/log相关性从0.005至50EU/ml是线性的。通过与含有已知含量的内毒素标品的反应时间相比，从其反应时间计算样品中内毒素的浓度。
当进行色谱步骤时，内毒素含量降至约1.42单位/mg DNA。
或者，当优化整个过程时，包括色谱步骤，内毒素含量降至0.2单位/mg DNA。
质粒回收率为约30％。然而，发明人发现了以纯度为代价时，可以提高该比率，并且本领域技术人员将根据实验需要找到最好的解决办法。

Claims (19)

1.一种用于获得目标多核苷酸序列，优选目标DNA质粒的方法，并且包括步骤：
a)可能培养包含一种或多种目标多核苷酸序列的细胞并收获所述细胞；
b)将所述含有目标多核苷酸序列的细胞引入通道中，并且通过将所述分解的细胞与碱性裂解溶液混合来连续地分解它们以形成裂解的细胞，并且使用中和溶液进行裂解细胞的中和步骤，所述中和溶液由醋酸/醋酸盐组合物组成，以形成第一种混合物；
c)通过将含有一种或多种盐的溶液加入步骤b)的第一种混合物中以形成第二种混合物，在通道中连续进行多核苷酸序列污染物的沉淀，其中所述盐选自CaCl2、MgCl2、ZnCl2、SrCl2和BaCl2、LiCl、醋酸铵、硫酸铵、硫酸钠和硫酸镁或其混合物；
d)收集第二种混合物并且使沉淀物从第二种混合物的溶液中分离出来，优选从第二种混合物的溶液中浮选和/或沉淀介于1小时和48小时之间的时间段；和
e)从第二种混合物的溶液中收集包含目标多核苷酸序列的可溶性材料，同时排除收集第二种混合物的沉淀物。
2.权利要求1的方法，其中加入的盐是2M至6M浓度的CaCl2。
3.根据之前的权利要求1至2任一项的方法，其中分解的细胞和碱性裂解溶液的接触时间为15秒至15分钟。
4.权利要求3的方法，其中分解的细胞和碱性裂解溶液的接触时间为约2分钟至约3分钟。
5.根据之前的权利要求1至4任一项的方法，其中裂解的细胞和中和溶液的接触时间为15秒至5分钟。
6.之前的权利要求1至5任一项的方法，其进一步包括步骤f)：在一个或多个具有0.22μm至1.5μm孔径的滤器上进行收集的可溶性材料的过滤步骤，可能接着在50kDa至500kDa膜上进行可溶性材料的超滤，并且收集包含目标多核苷酸序列的第一个截留物。
7.根据权利要求6的方法，进一步包括步骤g)：进行第一个截留物的阴离子交换色谱。
8.之前的任一项权利要求的方法，进一步包括步骤h)：在30kDa膜上进行第一个截留物的超滤，收集第二个截留物，和此第二个截留物在0.22μm膜上过滤，以收集目标多核苷酸序列。
9.根据之前的权利要求1至8任一项的方法，其中在室温下，优选在15℃至35℃的温度下进行(方法)步骤。
10.根据之前的权利要求1至8任一项的方法，其中通过使用蠕动泵连续进行(方法)步骤b)和c)，并且其中通过称重进料溶液的小瓶来控制所述泵输出。
11.一种用于进行根据之前的权利要求1至10任一项的方法的装置，其由圆管形成，并且包括：
-具有0.1L/分钟至1L/分钟的泵输出并且连接到含有细胞混合物的小瓶(3)和管状元件(2)的(第一个)泵(1)，所述管状元件(2)；
-混合室(4)；
-(第二个)泵(11)，具有0.1l/分钟至1l/分钟的泵输出，并且通过所述混合室(4)连接到该装置的其他元件；
-从所述混合室(4)开始的管状元件(21)，具有0.5cm至5cm的内径，和5m至60m的长度；
-任选地，泵(31)，在管状部件(12)的末端与存储器(32)连接，通过Y-型接头连接以形成管状元件(33)，并且优选地具有约0.2至约3L/分钟的输出；
-泵(41)，其连接于管状元件(12或33)的末端，其具有0.1L/分钟至1L/分钟的泵输出，并且其通过Y-型接头连接到管状元件(42)；
-部件(34，44)，以引发管状元件(33或42)中的文丘里效应；
-其中管状元件(42)具有1m至50m的总长，和0.5cm至5cm的内径，排除所述诱导这些管状元件(33或42)中的文丘里效应的部件(34，44)。
12.权利要求11的装置，其中泵是蠕动泵。
13.权利要求11或12的装置，进一步包括称重不同进料溶液的部件。
14.通过根据之前的权利要求1至11任一项的方法可获得的分离且纯化的DNA质粒组合物，其无基因组DNA、无RNA并且包括0.2至100内毒素单位/mg DNA。
15.权利要求14的质粒，具有约2至10EU/mg DNA的内毒素。
16.权利要求14的质粒，具有约50至100EU/mg DNA的内毒素。
17.权利要求16的质粒，具有约55EU/mg DNA的内毒素。
18.权利要求14的质粒，具有约0.2至2EU/mg DNA的内毒素。
19.根据之前的权利要求14至18任一项的组合物，其是药物组合物，进一步包含适当的药物载体。
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