ES2614429T3 - Método y dispositivo para la producción y/o purificación de polinucleótidos y productos obtenibles de los mismos - Google Patents

Método y dispositivo para la producción y/o purificación de polinucleótidos y productos obtenibles de los mismos Download PDF

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Abstract

Un método para la obtención de un plásmido de ADN de interés, y que comprende las etapas de: b) introducir células que contengan un plásmido de ADN de interés en un conducto y disgregarlas ininterrumpidamente, mezclando dichas células con una solución de lisis alcalina para formar células lisadas y realizar una etapa de neutralización de las células lisadas con una solución de neutralización que es una composición de ácido acético/acetato para formar una primera mezcla en la que el pH de dicha solución de neutralización está dentro del intervalo comprendido entre aproximadamente 5,0 y 6,0; c) realizar ininterrumpidamente en el conducto, una precipitación de contaminantes de plásmidos de ADN, añadiendo a la primera mezcla de la etapa b), una solución que contenga una o más sales, para formar una segunda mezcla usando medios que provoquen un efecto Venturi, en el que dicha sal, o sales, se seleccionan del grupo que consiste en CaCl2, MgCl2, ZnCl2, SrCl2 y BaCl2, LiCl, acetato de amonio, sulfato de amonio, sulfato de sodio y sulfato de magnesio o una mezcla de los mismos y en el que dicha una o más sales están en dicha solución añadida que contiene una o más sales, a una concentración comprendida entre 2 M y 6 M; d) recuperar la segunda mezcla y permitir que se separe un precipitado de la solución de la segunda mezcla; y e) recuperar un material soluble, que comprenda el plásmido de ADN de interés, de la solución de la segunda mezcla, excluyendo al mismo tiempo la recuperación del precipitado de la segunda mezcla.

Description

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preferentemente en una solución acuosa isotónica al 10 % (v:v) tamponada a un pH de aproximadamente 5 a aproximadamente 8.
El aparato de la presente invención comprende adicionalmente un recinto de mezclado 4 (un recipiente o una bolsa que tiene un volumen adecuado) que se coloca en el extremo del elemento de tubería 2.
Preferentemente, este elemento de tubería 2 tiene una longitud total de 0,5 m a aproximadamente 5 m, preferentemente de aproximadamente 1,5 m.
Este elemento de tubería 2 tiene un diámetro interno preferido de aproximadamente 5 mm a aproximadamente 25 mm, preferentemente de aproximadamente 7 mm a aproximadamente 15 mm, más preferentemente de aproximadamente 9 mm a aproximadamente 11 mm.
El aparato de la presente invención puede comprender adicionalmente una (segunda) bomba 11 conectada mediante un elemento de tubería 14 a un tanque 13 o a un recipiente que contiene una solución de lisis, con un flujo de bombeo de aproximadamente 0,1 l/min a aproximadamente 1 l/min, preferentemente de aproximadamente 0,30 l/min, y conectada a los elementos (de tubería) del dispositivo a través de este recinto de mezclado 4 o recipiente equivalente.
Ventajosamente, el recinto de mezclado 4 está provisto de un homogeneizador orbital desechable.
Preferentemente, el recinto de mezclado 4 es un vial cónico desechable de aproximadamente 1 l a aproximadamente 3 l.
Ventajosamente, el flujo de bombeo de la (segunda) bomba 11 es igual al flujo de bombeo de la primera bomba 1.
El aparato de la presente invención puede comprender adicionalmente elementos de tubería 12 que comienzan desde este recinto de mezclado 4 o recipiente equivalente, teniendo estos elementos de tubería 12 un diámetro interno de aproximadamente 0,5 cm a aproximadamente 5 cm, preferentemente de aproximadamente 1 cm a aproximadamente 2 cm, más preferentemente de aproximadamente 1,27 cm.
Los elementos de tubería 12 tienen ventajosamente una longitud total de aproximadamente 5 m a aproximadamente 60 m, preferentemente de aproximadamente 10 m a aproximadamente 30 m, más preferentemente de aproximadamente 20 m a aproximadamente 25 m.
Preferentemente, en el inicio de los elementos de tubería 12, el aparato de la presente invención comprende adicionalmente una (tercera) bomba 21 que tiene un flujo de bombeo de aproximadamente 0,2 a aproximadamente 3 l/min, preferentemente de aproximadamente 0,4 a aproximadamente 1 l/min, más preferentemente de aproximadamente 0,6 l/min.
El flujo en el elemento de tubería 12 es de aproximadamente 0,2 a aproximadamente 3 l/min, preferentemente de aproximadamente 0,4 a aproximadamente 1 l/min, más preferentemente de aproximadamente 0,6 l/min.
Preferentemente, el flujo de bombeo de la (tercera) bomba 21 es igual al flujo de bombeo del elemento de tubería
12.
Opcionalmente, una (cuarta) bomba 31, está conectada en el extremo de los elementos de tubería 12.
Esta (cuarta) bomba 31 tiene un flujo de bombeo de aproximadamente 0,2 a aproximadamente 3 l/min, preferentemente de aproximadamente 0,4 a aproximadamente 1 l/min, más preferentemente de aproximadamente 0,6 l/min.
Preferentemente, el flujo de bombeo de la (cuarta) bomba 31 es igual al flujo de bombeo del elemento de tubería 12.
Dicha (cuarta) bomba 31 está conectada (en el extremo del elemento de tubería 12) con un tanque 32 (una bolsa o un recipiente equivalente que tiene un volumen adecuado) que posiblemente contiene la solución de neutralización, y está conectada a través de una conexión de tipo Y (o de tipo T) para formar un elemento de tubería 33.
Preferentemente, estos elementos de tubería 33 presentan medios 34 para inducir (provocar) un efecto Venturi (de mezclado) en el elemento de tubería 33.
Preferentemente, el diámetro interno del elemento de tubería 33 está comprendido en el intervalo de entre aproximadamente 0,5 a aproximadamente 5 cm, preferentemente de aproximadamente 1 cm a aproximadamente 2 cm, más preferentemente de aproximadamente 1,27 cm, excluyendo los medios 34 (diámetro modificado de estos elementos de tubería) usados para inducir (provocar) el efecto Venturi (de mezclado) mencionado anteriormente.
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La longitud de este elemento de tubería 33 es de aproximadamente 1 m a aproximadamente 20 m, preferentemente de aproximadamente 5 m a aproximadamente 15 m, más preferentemente de aproximadamente 8 m a aproximadamente 12 m.
Ventajosamente, este efecto Venturi (de mezclado) se induce (obtiene o provoca) mediante una reducción en el diámetro interno de aproximadamente 40 % (de aproximadamente 50 % a aproximadamente 80 % del diámetro interno inicial) del elemento de tubería 33.
La posición de las bombas, como se representa en la Figura 1 adjunta, también mejora la eficiencia del tratamiento, debido a su posición respectiva como se representa, estas bombas pueden impulsar ventajosamente (el flujo de) los fluidos en los elementos de tubería en lugar de impulsar los fluidos presentes en estos elementos de tubería, pudiendo dicho movimiento de impulso inducir un efecto colapsante del (de los) elemento(s) de tubería, que modificará la calidad del producto a recuperar.
El aparato de la presente invención comprende adicionalmente una (quinta) bomba 41 conectada en el extremo de los elementos de tubería 12 o 33, y que presenta un flujo de bombeo de aproximadamente 0,1 l/min a aproximadamente 1 l/min, preferentemente de aproximadamente 0,3 l/min (conectada a través de una conexión de tipo Y (o de tipo T) a un elemento de tubería 42.
La (quinta) bomba 41 está conectada con un tanque 43 (una bolsa o un recipiente de un volumen adecuado) que contiene la solución de precipitación y está conectada a través de una conexión de tipo Y (o de tipo T) al inicio de los elementos de tubería 42.
Ventajosamente, las bombas del aparato de la invención son bombas peristálticas.
Estos elementos de tubería 42 también pueden comprender medios 44 para inducir (provocar) un efecto de Venturi (de mezclado).
Ventajosamente, este efecto de Venturi (de mezclado) (en los elementos de tubería 42 está causado (obtenido o provocado) por una reducción en su diámetro interno de aproximadamente 40 % (de aproximadamente 50 % a aproximadamente 80 % del diámetro interno inicial).
Por efecto Venturi (de mezclado), se entiende una turbulencia obtenida de (inducida por) un sistema, en el que se hace pasar un fluido en flujo laminar, por el interior de un tubo reducido, en una extensión tal, que el fluido tiene una velocidad aumentada y justo después del diámetro reducido se produce una depresión.
Preferentemente, el medio para producir el efecto de Venturi (de mezcla) se coloca después de aproximadamente 1 a aproximadamente 100 cm, preferentemente después de 5 a aproximadamente 20 cm, más preferentemente después de 9 a aproximadamente 30 cm del inicio de los elementos de tubería 33 y/o 42, preferentemente después de que el flujo en los elementos de tubería 33 y/o 42 sea laminar.
Ventajosamente, el (los) efecto(s) Venturi (de mezclado) de acuerdo con la invención, permite(n) una mezcla de fluidos viscosos (no newtonianos) que puede dar como resultado un líquido homogéneo adecuado.
Los elementos de tubería 42 tienen una longitud total de aproximadamente 1 m a aproximadamente 45 m, preferentemente de aproximadamente 5 m a aproximadamente 15 m, más preferentemente de aproximadamente 10 m a aproximadamente 14 m.
Los elementos de tubería 42 tienen un diámetro interno de aproximadamente 0,5 cm a aproximadamente 5 cm, preferentemente de aproximadamente 1 cm a aproximadamente 2 cm, más preferentemente de aproximadamente 1,27 cm, excluyendo dicho medio para producir este efecto Venturi (de mezclado).
Preferentemente, el aparato de la invención comprende adicionalmente medios para pesar las (diferentes) soluciones de suministro presentes en los diferentes tanques (bolsas o recipientes).
La presente invención también se refiere a una nueva composición aislada y purificada (de sus contaminantes) que comprende esta molécula biológica de interés que puede obtenerse, preferentemente se obtiene, mediante el método indicado anteriormente descrito.
Más particularmente, esta molécula biológica purificada y aislada obtenida es un plásmido de ADN, incluyendo un plásmido de ADN que tiene un tamaño inferior a 3.000 bases (pares de bases).
Preferentemente, esta composición de ADN plasmídico, purificada y aislada de la invención, carece al menos de contaminantes: de ADN genómico, de ARN y comprende entre aproximadamente 40 y aproximadamente 100 unidades de endotoxina/mg de ADN (más preferentemente la composición de ADN plasmídico comprende aproximadamente 55 unidades de endotoxina/mg de ADN). Esta composición que también carece ventajosamente
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de productos químicos (incluyendo RNasa) posiblemente añadidos a los medios usados en las diferentes etapas del método de la invención, también puede corresponder a una composición farmacéutica que comprende un transportador (o diluyente) farmacéutico adecuado y una cantidad suficiente de esta molécula biológica de interés, como se ha descrito anteriormente (purificada de sus contaminantes).
Ventajosamente, esta composición de ADN plasmídico, purificada y aislada de la invención, carece al menos libre de contaminantes: de ADN genómico, de ARN y comprende entre aproximadamente 0,2 y aproximadamente 100 (preferentemente entre aproximadamente 2y aproximadamente 10) unidades de endotoxina/mg de ADN. Esta composición, que también ventajosamente carece de productos químicos (incluyendo RNasa), posiblemente añadidos a los medios usados en las diferentes etapas del método de la invención, también pueden corresponder a una composición farmacéutica que comprende un transportador (o diluyente) farmacéutico adecuado y una cantidad suficiente de esta molécula biológica de interés como se ha descrito anteriormente (purificada de sus contaminantes).
Como alternativa, el contenido de endotoxina de la composición de ADN plasmídico es de aproximadamente 55.
Posiblemente, el contenido de endotoxina de la composición de ADN plasmídico está comprendido entre aproximadamente 0,2 y aproximadamente 2 unidades de endotoxina/mg de ADN.
Por el término “carece”, se entiende que el contenido residual del contaminante de la composición es menor de 2 % (p:p), preferentemente menor de 1 % (p:p), o menor de 0,5 % o 0,1 % (p:p). La presente invención se describe en referencia a las figuras que se adjuntan en los siguientes ejemplos preferidos presentados como realizaciones no limitantes de la presente invención.
Descripción detallada de la invención
La Fig. 1 ilustra el aparato o dispositivo de acuerdo con la invención y que permite realizar las etapas a a c del método de la presente invención y que es un conducto desechable de aproximadamente 45,6 metros de longitud, formado con tubos circulares (elementos de tubería). Este aparato o dispositivo se provee en un elemento de tubería 2 que comprende las células recogidas a un flujo de 0,30 l/min. A aproximadamente 1,5 m, una bomba 11, con un flujo de bombeo de 0,30 l/min, se conecta a un tanque o un recipiente 13 que contiene una solución de lisis (para disgregar células), que está conectado al elemento de tubería 2 a través de un recinto de mezclado 4. El flujo es de 0,6 l/min. Opcionalmente, a 21,3 m, otra bomba 31, con un flujo de bombeo de 0,6 l/min, está conectada a un tanque 32 que contiene una solución de neutralización que está conectado a través de una conexión de tipo Y (o de tipo T) y en el que se provoca una mezcla homogénea, no mecánica, mediante un efecto Venturi. Después de aproximadamente 9,5 m, otra bomba 41, con un flujo de bombeo de 0,30 l/min y conectada con un tanque 43 que contiene la solución de precipitación que está conectado a través de una conexión de tipo Y (o de tipo T) y en el que se provoca una mezcla homogénea, no mecánica, mediante otro efecto Venturi. Después de aproximadamente 11,8 m, existen medios para recoger la mezcla.
Ejemplos
Cultivo
Un vial de la semilla maestra GMP se retira del tanque de nitrógeno (-170 °C) y, antes de su proceder a su uso, se descongela a temperatura ambiente durante 5 minutos, después se incuba en un medio adecuado usando agitación a 37 °C.
Escherichia coli, que tiene un plásmido de interés, se cultivó hasta alcanzar una DO600 de 0,8 unidades. Para inocular el fermentador, se selecciona un cultivo en las especificaciones (DO600 -pureza). Se toma una muestra del cultivo seleccionado para realizar ensayos de control de calidad (CC).
El pH se mantiene a 7,0 +/-0,2 por adición periódica de NaOH y HNO3. La temperatura se mantiene a 37 +/-0,5 °C y el flujo de aire se fija a 1 vvm (=150 l/min); la presión se regula a 360 mbar y la agitación se fija a 700 RPM. Los parámetros de fermentación son constantes durante la fermentación. Si fuera necesario, se añaden pequeñas cantidades de antiespumante.
Después de 15 horas de fermentación, se toma una muestra cada hora para seguir la DO600. Cuando la DO600 alcanza al menos 35 unidades, el cultivo se enfría por debajo de 20 °C. Durante la etapa de enfriamiento, la agitación y el flujo de aire se reducen a 200 RPM y a 40 l/min, respectivamente.
Cuando la temperatura del cultivo está por debajo de 20 °C, se toma una muestra en condiciones estériles (para ensayos de CC) y el cultivo se centrifuga durante 20 min a 6700 g en dos centrífugas discontinuas Beckman Avanti J-20 dotadas de un rotor JLA-8.1000.
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La ultrafiltración se realizó en membranas de PES de 100 kDa o, como alternativa, en membranas de 70 kDa (para plásmidos más cortos de 3.000 pares de bases).
Los inventores midieron la pureza de una alícuota del plásmido retenido y observaron una contaminación de
5 aproximadamente 50 a 100 unidades de endotoxina (UE)/mg de ADN, y más generalmente de aproximadamente 55 UE/mg de ADN. Los inventores llegaron a la conclusión de que este nivel era notable, ya que aún no se habían efectuado etapas de purificación real.
Por tanto, la solución ultrafiltrada se diafiltró.
10 La solución ultrafiltrada, sin contaminantes, se sometió a una cromatografía de intercambio aniónico. Los inventores ensayaron diversas cromatografías de intercambio aniónico. El experto en la técnica puede encontrar fácilmente la más adecuada.
15 Se realizaron etapas de lavado con una solución de Tris (-HCl) 50 mM, NaCl 0,54 M, pH 8,5.
Opcionalmente, antes de efectuar las etapas de lavado con Tris (-HCl) 50 mM, NaCl 0,54 M, pH 8,5, se realizó un lavado con Tris (-HCl) 50 mM, NaCl 0,54 M, pH 8,5 complementado con Triton X-100 de 0,1 a 1 %.
20 La elución se realizó mediante un gradiente lineal, hecho mezclando una solución de Tris (HCl) 50 mM, pH 8,5 complementada con NaCl 0,54 M con una solución de Tris (HCl) 50 mM pH 8,5 complementada con NaCl 1 M.
El material eluido se ultrafiltró en una membrana de 30 kDa, después el retenido concentrado se filtró a través de un filtro de 0,22 μm y el filtrado se recogió y se conservó a -20 C.
25 El nivel de ARN no puede detectarse con HPLC (por debajo del límite de detección). El contenido de proteína está por debajo de 10 μg/mg de plásmido.
Después de la etapa cromatográfica, los inventores midieron un contenido de endotoxina de aproximadamente 2 a 30 aproximadamente 10 unidades /mg de ADN.
La endotoxina se midió mediante el método cromogénico de lisado de amebocitos de Limulus (KQCL). Las endotoxinas activan una proenzima en el reactivo KQCL que cataliza la separación del sustrato cromogénico, que se mide ininterrumpidamente fotométricamente, a 405 nm, durante todo el periodo de incubación. Una correlación
35 log/log entre el tiempo necesario para la aparición de color (tiempo de reacción) y la concentración de endotoxina es lineal de 0,005 a 50 UE/ml. La concentración de endotoxina en una muestra se calcula a partir de su tiempo de reacción por comparación con el tiempo de reacción de soluciones que contienen cantidades conocidas de patrón de endotoxina.
40 Cuando se realizó la etapa cromatográfica, el contenido de endotoxina disminuyó a aproximadamente 1,42 unidades /mg de ADN.
Como alternativa, cuando todo el proceso, incluyendo la etapa cromatográfica, se optimizó, el contenido de endotoxina disminuyó a aproximadamente 0,2 unidades/mg de ADN.
45 La recuperación de plásmido es de aproximadamente 30 %. Sin embargo, los inventores descubrieron que esta proporción podía aumentarse a costa de la pureza, y dependiendo de las necesidades del experimento, el experto en la técnica puede encontrar la mejor solución.

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