CN117957319A - 自动质粒提取 - Google Patents

Abstract

公开了一种从微生物中不连续提取质粒和纯化目的质粒的方法，其包括在温和的机械搅拌下通过多个孔口添加中和溶液，然后添加沉淀溶液。

Description

自动质粒提取

技术领域

本发明涉及自动提取细菌产生的目的质粒。

背景技术

在细菌例如大肠杆菌中产生目的质粒是已知的，碱裂解后进行中和与沉淀步骤也是已知的(例如Birnboim和Dolly，1979，《核酸研究》，7，第1513-1523页)。

该方法实施简单，在批处理模式下效果良好；其适用于生产少量质粒，例如最多以克为数量级。

专利申请WO2010/136503(还公开于EP2435569B1、US8,822,672、US9,416,400等)描述了一种连续质粒提取方法，该方法基于用于不同溶液及其混合物的管道布置系统以及通过泵进行流量控制。除了通常由醋酸/醋酸盐缓冲液组成的中和溶液外，该方法还提供了浓缩的沉淀溶液的添加。通过调整管道内径，使中和溶液与沉淀溶液混合均匀，从而在局部产生文丘里效应。事实上，该专利申请的发明人指出，对于如此大量的粘性溶液，机械搅拌是不可能的。不同于通过文丘里效应进行的混合，机械搅拌存在剪切基因组DNA甚至质粒的风险，这是不可接受的。此外，有利的是，该系统为一次性系统，因此不需要清洁。然而，尽管该系统对于纯化大量质粒(例如100克质粒)非常有效，但它会产生固定成本(一次性设备、质粒损失)，如果需要纯化的质粒数量较少，该固定成本就会变得很高。因此，存在一定范围的难以用分批法进行处理的量，也无法用上述连续法有效地处理，即使这两种方法在各自的应用中效果良好。

事实上，批处理模式下系统的效率受到物理参数的限制，例如容器的大小、使溶液接触所需的时间，甚至是快速均质化的需要。因此，在批处理模式下，使用少量即可实现理想的纯化效果，从而能够很好地控制混合物，但却显著增加了大规模生产的复杂性。

发明内容

本发明涉及一种提取由微生物合成的质粒的方法，其包括以下连续步骤：

获得与提取泵8相连的容器1，所述容器1设有机械搅拌装置9；

获得包含待提取质粒的所述微生物的细胞悬浮液2；

以预定流量(Q1)向所述细胞悬浮液2中添加碱性裂解液3，以形成均质混合物；

以预定流量(Q2)将所述均质混合物置于所述容器1中；

经过预定时间后，优选地在温和搅拌下，通过多个孔口7以预定流量(Q3)向容器中添加包含醋酸的中和溶液5；

经过预定时间后，通过多个孔口7以预定流量(Q4)向所述容器中添加沉淀溶液6；

在温和搅拌下经过预定时间后，通过所述提取泵8以预定流量(Q5)提取由此形成的悬浮液，然后澄清提取的混合物，优选离心，以回收包含目的质粒的澄清上清液。

这种经提取和纯化的质粒可以有利地直接使用，也可以在灭菌过滤、超滤和/或精制层析后使用。

附图说明

图1示出了根据本发明的容器的半示意图。

图2示出了通过根据本发明的自动方法提取的质粒的HPLC分析结果。

图3示出了对优选自动方法进行1号、2号、3号和4号变化的效果。

具体实施方式

本发明人成功地开发了一种质粒提取方法，该方法既保留了批处理模式方法的灵活性，又能处理大量质粒，且具有非常高的提取率和纯度。

本发明的第一方面提供了一种提取合成的质粒的方法，其包括以下连续步骤：

获得与提取泵8相连的容器1，所述容器1设有机械搅拌装置9；

获得包含待提取质粒的细胞悬浮液2；

以预定流量Q1向所述细胞悬浮液2中添加碱性裂解液3，以形成均质混合物；

以预定流量Q2将所述均质混合物置于所述容器1中；

经过预定时间后，优选地在温和搅拌下，通过多个孔口7以预定流量Q3向容器中添加包含醋酸的中和溶液5；

经过预定时间后，通过多个孔口7以预定流量Q4向所述容器中添加沉淀溶液6；

在温和搅拌下经过预定时间后，通过所述提取泵8以预定流量Q5提取由此形成的悬浮液，然后澄清提取的混合物，优选离心，以回收包含目的质粒的澄清上清液。

合成目的质粒的细胞通常为革兰氏阴性菌，例如大肠杆菌。然而，其他革兰氏阴性菌，甚至革兰氏阳性菌，甚至其他微生物，例如酵母菌或毕赤酵母菌也可能适用。

质粒有利地以所谓的“超螺旋”形式存在。

质粒的大小并非限制因素，因为该方法也适用于大质粒。然而，如后文所述，较大的质粒(如大于10kb，例如10至20kb，包括编码病毒载体的质粒和/或包含重复和/或反向序列的质粒)需要更精确的时间控制，特别是与碱性裂解液的接触时间以及与中和溶液的添加和接触时间。

容器1的大小没有特别限制。太小的容器1无法处理足够数量的质粒，而填充过量溶液的容器1有需要过长的泵送时间的风险，这是不利的，因为这会使不同时间的控制变得复杂或甚至无法控制。事实上，由于溶液是逐一泵送的，因此在每个步骤开始时都存在异质性：泵送时间过长将因此导致成分和接触时间的双重异质性。

本发明人发现，在最后(加入溶液2+3+5+6之后)填充5升至10升溶液的容器1使用起来非常简单。另一方面，在最后(加入溶液2+3+5+6之后)填充100升溶液的容器1变得难以控制。因此，容器的可用体积的优选大小为1升至50升，优选为2.5升至20升，甚至更优选为5升至10升。

显然，可以使用容量更大甚至显著更大(大于50升或100升)的容器1，即使这些容器1仅旨在最多填充2.5升至10升。

令人惊讶的是，本发明人发现这种异质性，可能是双重异质性，只要其受到控制和/或不过度，就不是致命的。

例如，本发明人确定细胞悬浮液与裂解液之间的接触时间有利地为2至5分钟。因此，本发明人推断溶液2和溶液3可以在例如一分钟内添加，而不会造成任何问题。

此外，优选地，细胞悬浮液2和裂解液3在容器1的上游进行均质化，例如通过静态混合系统4进行均质化。

在本发明的上下文中，术语“静态混合器”优选理解为意指任何能使细胞悬浮液2和裂解液3的混合流产生湍流，从而使该混合流快速均质化的装置。本发明人指出，这种类型的混合的优点在于其不涉及过高的剪切力。

细胞悬浮液优选为已溶解在TRIS-EDTA缓冲液中的细胞培养沉淀；悬浮液的浓度为10至300g/L，优选50至200g/L，甚至更优选75至150g/L，例如约100g/L(细胞重量:悬浮液的总体积)。

这样可以在不涉及剪切力的情况下实现初始均质化。由于两种溶液在该水平上进行了混合，因此任何潜在的异质性都会大大降低。

优选地，裂解液3的pH值为12.0至12.5，裂解液的pH值优选由碱性氢氧化物固定。

这样可以使基因组DNA快速裂解和变性。使用NaOH等碱性氢氧化物可实现缓冲能力较低的强碱性pH值，从而简化后续的中和过程。然而，必须仔细固定pH值，否则可能导致无法充分裂解和变性，或者相反，可能使目的质粒发生不可逆变性。

优选地，裂解液3还包含洗涤剂，优选地，按重量计0.1％的十二烷基硫酸钠。

有利地，中和溶液5的pH值为4.5至5.7；该溶液优选包含浓度大于1M的醋酸，甚至更优选地，通过醋酸/醋酸盐混合物将中和溶液的pH值固定在约5.5。这样可以确保中和溶液(溶液2、3和5的组合)的pH值低于7.0，优选低于6.0，且(逻辑上)高于4.5，更优选高于5.0。

优选地，包含质粒的悬浮液在中和溶液中保持至少1分钟，例如2至3分钟。接触时间过长会使基因组DNA复性，这是不利的。因此，在该批处理工艺中，优选快速添加中和溶液5和沉淀溶液6。

因此，对于小于10kb的质粒，与中和溶液的接触时间为20至80秒是有利的。

相反，对于大于10kb的质粒，特别是对于含有重复和/或反向序列的质粒，与中和溶液的接触时间优选为1至3分钟。在这种情况下，添加溶液5和溶液6的时间就成为必须非常仔细控制的参数，理想情况下最多各30秒。

然而，流量不能完全自由地采用。需要遵守物理流动限制，也就是压力限制，特别是因为(i)含有溶液2+3+5的混合物以及(ii)溶液6非常粘稠。此外，优选使用坚固和/或常用的泵，以便进行有效的维护。必要时，特别是对于大质粒，可减少不同溶液的体积，以确保可以快速添加溶液，特别是溶液5和溶液6(见上段)。

蠕动泵的优点在于流量可以很好地控制且不会引起剪切。

有利地，沉淀溶液6包含水溶性钙盐(例如CaCl₂)，浓度为3.5至6M，优选为约5M。

由于这种高浓度的钙溶液，在添加沉淀溶液(溶液2、3、5和6的组合)后，(悬浮液)溶液中的钙浓度为至少0.8M，例如至少1.0M，甚至至少1.2M。本发明人优选使用非常高浓度的沉淀溶液(尽管其粘度很高)，以保持合理的体积，同时保证足够的最终钙浓度。这样的最终钙浓度(大于0.8M，甚至大于1M)可以沉淀杂质，特别是还来不及变性的RNA和基因组DNA，也可以沉淀蛋白质和内毒素(如果起始细胞合成了这些物质)，或至少沉淀大部分内毒素。

有利地，多个孔口7为穿孔管道系统。该系统可以是简单的穿孔管，也可以是线圈，甚至是环。

多个孔口的优点是可以将中和溶液5和/或沉淀溶液6注入容器的多个位置，从而导致多个微异质性，而不是大量异质性。再加上温和机械搅拌装置9，可实现非剪切和快速均质化。这解决了上述异质性的双重问题。

本发明人惊讶地注意到，这种方法可以使溶液足够快速地均质化，而不会引起上述剪切问题。

有利地，用于添加中和溶液5的多个孔口7和用于添加沉淀溶液6的多个孔口7是相同的多个孔口7：含有沉淀溶液和中和溶液的容器与容器1的上游连接。这样可以避免使用多个装置，也可以清除所有中和溶液。

有利地，中和溶液5和/或沉淀溶液6基本上通过容器1的底部添加，优选将至少30％、40％、甚至(至少或恰好)50％(按重量和/或体积计)的所述中和溶液和/或所述沉淀溶液添加至所述容器的底部的20％。这样可以控制溶液的注入并增加其扩散。

根据变型，中和溶液5基本上通过容器1的底部添加，优选将至少30％、40％、甚至(至少或恰好)50％(按重量和/或体积计)的中和溶液5添加至所述容器的底部的20％，而沉淀溶液6基本上添加至容器1的顶部，优选将至少30％、40％、甚至(至少或恰好)50％(按重量计)的沉淀溶液6添加至所述容器的顶部的20％。这可以通过改变包括多个孔口7的系统的高度来实现，也可以通过使用包括多个独立孔口7的两个系统来实现。

根据第二变型，中和溶液5基本上添加至容器1的顶部，优选将至少30％、40％、甚至(至少或恰好)50％(按重量计)的中和溶液5添加至所述容器的顶部的20％，而沉淀溶液6基本上通过容器1的底部添加，优选将至少30％、40％、甚至(至少或恰好)50％(按重量和/或体积计)的沉淀溶液6添加至所述容器的底部的20％。这可以通过改变包括多个孔口7的系统的高度来实现，也可以通过使用包括多个独立孔口7的两个系统来实现。

优选地，流量Q1、Q2、Q3、Q4和Q5独立地为0.5升/分钟至25升/分钟，更优选地为1升/分钟至10升/分钟。

流量Q1、Q2、Q3、Q4和/或Q5可以独立地恒定；或者流量Q1、Q2、Q3、Q4和/或Q5可以独立地变化。例如，流量Q1、Q2、Q3、Q4和/或Q5，优选Q3和/或Q4，可以随时间增加(泵送开始时最低，泵送结束时最高)，以限制添加这些粘性溶液时的异质性。增加流量的有利方式是保持恒定或基本恒定的流量/体积比。流量Q1、Q2、Q3和/或Q4可以变化(随时间增加)，与之相对，流量Q5优选恒定。提取泵8优选非常快速，以防止聚集物干扰提取。因此，流量Q5优选恒定且最快。流量Q1和Q2优选匹配(一起确定)，从而(i)同时泵送所有细胞悬浮液2和裂解液3，(ii)混合物的浓度(细胞含量、pH值)保持恒定，例如在静态混合器4的出口处。

有利地，温和搅拌9产生的剪切应力不足以剪切来自宿主的质粒DNA或基因组DNA。

因此，可能的初步步骤包括测试剪切应力的可接受性，这取决于微生物的类型、待纯化质粒的大小以及所选的溶液浓度。

本发明的一个相关方面是根据上述从澄清上清液中纯化目的质粒的方法，其包括以下步骤：

收获包含所述质粒的澄清上清液；

在孔隙率为0.1至0.4μm、优选0.15至0.3μm、有利地约0.2μm的过滤器上过滤所述澄清上清液，以获得包含所述质粒的过滤溶液；

任选地，对所述过滤溶液进行超滤；

在阴离子交换填料上进行层析精制，优选地，所述层析精制包括用包含聚氧代乙烯(10)异辛基环己基醚的溶液洗涤固定在填料上的质粒的步骤；

将质粒配制成终溶液。

实施例

应当理解，本发明绝不限于上述实施方案，并且在不脱离所附权利要求的范围的情况下可以对其进行许多修改。

比较实施例

本发明人试图开发一种“瓶内”批处理方法。为便于参考，将引用图1，图中不可能具有元件4和7以及容器1上游的管道和泵系统。为此，将0.3升产生质粒的浓缩细胞悬浮液2(100克细胞/升Tris-EDTA培养基)注入容量为2升的容器1中，然后快速添加0.3升碱性裂解液3(NaOH；pH值为12.5；按重量计0.1％的SDS)，并由操作员手动搅拌容器1正好90秒。然后，快速添加0.6升中和溶液5(按体积计15％的醋酸/3M的醋酸钾，pH值为4.5至5.7)，并将容器1中的内容物手动搅拌正好90秒。最后，快速添加0.23升沉淀溶液6(CaCl₂，5M)，并将容器1中的内容物手动搅拌正好90秒；然后通过离心提取混合物进行澄清。

本发明人仅从每升中回收了200毫克质粒，且该质粒含有可测量数量的基因组DNA和RNA，这实际上需要增加层析步骤，从而导致额外成本和产量损失。通过重复该手动方法以对其进行改进，本发明人获得了从单倍到双倍不等的产率，还获得了不同含量的“开环”形式的污染RNA和质粒，最佳产率与污染物含量的增加相关。因此，开环形式的质粒DNA的比例从7％到12％不等；超过10％的值被认为是高值。事实上，所需的形式是所谓的“超螺旋”形式，很难通过HPLC或任何其他方法将这两种形式分离，因为这两种细胞往往重叠在一起。

面对这些结果，本发明人认为污染物水平的增加是由于在这种手动提取过程中更显著地施加了剪切力，且这些剪切力的强度因批次(操作员的身份、操作员的潜在疲劳程度)而异。

实施例1

本发明人萌生了开发这一他们认为无效的系统的想法。为此，通过蠕动泵将1.2升含有质粒的浓缩细胞悬浮液2(100克细胞/升，在相同的Tris-EDTA培养基中)和1.2升碱性裂解液3(NaOH；pH值为12.5；按重量计0.1％的SDS)同时注入容量为10升的容器1中，这两种溶液都通过静态混合器4。注入时间为30秒。容器经过缓慢机械搅拌9(非剪切)正好90秒。然后，通过蠕动泵和开有许多孔口7的扩散环在底部快速添加2.4升与比较实施例中相同的中和溶液5(流量为6升/分钟)，并将容器1中的内容物机械搅拌9，但以非剪切方式进行，持续正好90秒。最后，通过蠕动泵和开有孔口7的同一装置快速添加0.92升沉淀溶液6(CaCl₂，5M)(流量为2.3升/分钟)，依旧在缓慢机械搅拌9下持续正好90秒；然后通过离心提取混合物进行澄清。

本发明人从每升中回收了约400毫克质粒，且该质粒不含可测量数量的基因组DNA和几乎不含RNA。

由于搅拌时间为90秒，本发明人得出结论，稍微改变搅拌的持续时间便可以容易地调整该装置(体积、流量)。

实施例2

本发明人随后通过HPLC分析了根据本发明的方法获得的质粒。这使得提取率达到84％，而“开环”质粒含量仅为7.2％(因此超螺旋形式几乎达到93％，这也是优选形式)。通过HPLC，RNA含量也非常低：见图2，左侧第一个峰代表残余盐，第二组峰代表RNA，双峰代表质粒，其中右侧最大的峰为超螺旋形式，此处HPLC信号显示已饱和。

除此之外，根据本发明的方法的主要优点还在于可重复性和大规模生产的可能性：根据本发明的多个反应器可以由单个操作员并行管理，而手动搅拌则每瓶需要一名操作员，且不能太快进行。

实施例3：比较实施例

本发明人将4种条件与根据本发明的条件进行了比较(见图3中的HPLC图谱)。

1.扩散环置于瓶中间，而不是底部；

2.省略了扩散环；

3.省略了静态混合器；

4.同时省略了扩散环和静态混合器。

目测结果表明，在2号和3号条件下，瓶上部呈现很强的异质性。经过简单的视觉分析，4号条件似乎受异质性的影响较小。1号条件显示出中等水平的异质性，介于将扩散环置于底部的方法和将扩散环移至容器中间的方法之间。

过滤参数也有所降低，在1号和4号条件下需要更换两次过滤器，在2号条件下需要更换一次过滤器。

然而，最显著的差异在于产率，在1号条件下产率下降至67％，而在2号、3号和4号条件下产率分别仅为22.6％、14％和30％。“开环”质粒的比例也有所增加，1号条件下为16％，3号条件下为9.9％，4号条件下为13.7％。除3号条件外，RNA污染(RNA：质粒)也有所增加。

Claims (16)

1.一种提取由微生物合成的质粒的方法，其包括以下连续步骤：

-获得与提取泵(8)相连的容器(1)，所述容器(1)设有机械搅拌装置(9)；

-获得包含待提取质粒的所述微生物的细胞悬浮液(2)；

-以预定流量Q1向所述细胞悬浮液(2)中添加碱性裂解液(3)，以形成均质混合物；

-以预定流量Q2将所述均质混合物置于所述容器(1)中；

-经过预定时间后，优选地在温和搅拌下，通过多个孔口(7)以预定流量Q3向容器中添加包含醋酸的中和溶液(5)；

-经过预定时间后，通过多个孔口(7)以预定流量Q4向所述容器中添加沉淀溶液(6)；

-在温和搅拌下经过预定时间后，通过所述提取泵(8)以预定流量Q5提取由此形成的悬浮液，然后

-澄清提取的混合物，优选离心，以回收包含目的质粒的澄清上清液。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述细胞悬浮液(2)和所述碱性裂解液(3)通过静态混合系统(4)在容器上游进行均质化。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述碱性裂解液(3)的pH值为12.0至12.5，优选地，其中所述pH值由碱性氢氧化物固定。

4.根据权利要求3所述的方法，其中所述碱性裂解液(2)还包含洗涤剂，优选按重量计0.1％的十二烷基硫酸钠。

5.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述中和溶液(5)的pH值为4.5至5.7。

6.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述中和溶液(5)包含浓度大于1M的醋酸，优选地，其中所述中和溶液具有通过醋酸/醋酸盐混合物固定的pH值。

7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中溶液被中和至pH值小于7.0，优选小于6.0，且大于4.5，更优选小于6.0，且大于5.0。

8.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述沉淀溶液(6)包含水溶性钙盐，浓度为3.5至6M，优选为约5M。

9.根据权利要求8所述的方法，其中在添加所述沉淀溶液后，溶液中的钙浓度为至少0.8M，优选至少1.0M，甚至更优选至少1.2M。

10.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述多个孔口(7)为穿孔管道系统。

11.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中用于添加所述中和溶液的所述多个孔口(7)和用于添加所述沉淀溶液的所述多个孔口(7)是相同的多个孔口(7)。

12.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述中和溶液(5)和/或所述沉淀溶液(6)基本上添加至所述容器(1)的底部，优选将按重量计至少50％的所述中和溶液和/或所述沉淀溶液添加至所述容器的底部的20％。

13.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中流量Q1、Q2、Q3、Q4和Q5独立地为0.5升/分钟至25升/分钟，优选为1升/分钟至10升/分钟，甚至为2升/分钟至8升/分钟。

14.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中温和搅拌产生的剪切应力不足以剪切来自宿主的质粒DNA或基因组DNA。

15.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中通过蠕动泵添加和/或提取所述溶液。

16.根据前述权利要求中任一项从澄清上清液中纯化目的质粒的方法，其包括以下步骤：

-收获包含所述质粒的澄清上清液；

-在孔隙率为0.1至0.4μm、优选0.15至0.3μm、有利地约0.2μm的过滤器上过滤所述澄清上清液，以获得包含所述质粒的过滤溶液；

-任选地，对所述过滤溶液进行超滤；

-在阴离子交换填料上进行层析精制，优选地，所述层析精制包括用包含聚氧代乙烯(10)异辛基环己基醚的溶液洗涤固定在填料上的质粒的步骤；-将质粒配制成终溶液。