BE1029550A1 - Extraction plasmidique automatisée - Google Patents
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Abstract
Procédé d’extraction discontinu de plasmide d’un microorganisme et de purification d’un plasmide d’intérêt comprenant l’ajout d’une solution de neutralisation et ensuite d’une solution de précipitation via une pluralité d’orifices, sous agitation mécanique douce.
Description
EXTRACTION PLASMIDIQUE AUTOMATISÉE Domaine technigue La présente invention concerne l'extraction automatisée d'un plasmide d'intérêt produit par une bactérie.
L'art antérieur La production d’un plasmide d'intérêt dans une bactérie, telle Escherichia coli, est connue, tout comme la lyse alcaline suivie d'une étape de neutralisation et de précipitation (ex. Birnboim et Dolly, 1979, Nucleic Acids Research, 7, pages 1513-1523).
Cette méthode est simple à mettre en pratique et fonctionne bien en mode discontinu («batch ») ; elle est adaptée pour la production de petites quantités de plasmides, telles que de l'ordre du gramme, au maximum.
La demande de brevet WO 2010/136503 (également publiée, entre autres sous EP2435569B1, US8,822,672 et US 9,416,400) décrit un procédé d'extraction de plasmides en continu, basé sur un système d'agencement de tuyaux pour les différentes solutions et leurs mélanges et de contrôle de débits par des pompes. Outre la solution de neutralisation, composée classiquement d'un tampon acide acétique/acétate, ce procédé prévoit l'ajout d'une solution concentrée de précipitation. Les solutions de neutralisation et de précipitation sont mélangées de manière homogène par une adaptation du diamètre interne de la tuyauterie, de manière à provoquer localement un effet Venturi. En effet, l'inventeur de cette demande de brevet a remarqué qu'une agitation mécanique n’était pas possible pour de tels volumes de solutions visqueuses, au risque, sinon, de cisailler l'ADN génomique et même les plasmides, ce qui est inacceptable, au contraire du mélange par effet Venturi. En outre, de manière avantageuse, ce système est à usage unique, si bien qu'il ne nécessite pas de nettoyage. Cependant, si ce système est très efficace pour des très grandes quantités de plasmides à purifier, par exemple 100 g de plasmide, il occasionne des coûts fixes (dispositif à Usage Unique, pertes de plasmide) qui deviennent importants si les quantités de plasmides à purifier sont plus faibles.
| y a donc une gamme de quantités qui est difficile à traiter par un procédé discontinu, et peu efficace à traiter par le procédé en continu résumé ci-dessus, même si les deux approches fonctionnent bien dons leurs créneaux respectifs.
En effet, l'efficacité des systèmes en modes discontinu est limitée par les paramètres physiques tels que la taille des récipients, le temps pour la mise en contact des solutions, ou encore la nécessité d'une homogénéisation rapide. Ainsi, en mode discontinu, une purification idéale se réalise à partir de volumes faibles, ce qui permet de bien contrôler les mélanges, mais complique fortement la production à plus grande échelle.
Bref résumé de l'invention La présente invention a trait à un procédé d'extraction d'un plasmide synthétisé par un microorganisme comprenant les étapes successives de: obtenir un réceptacle 1 couplé à une pompe de soutirage 8, ledit réceptacle 1 étant muni d'un moyen d'agitation mécanique 9, obtenir une suspension cellulaire 2 dudit microorganisme comprenant ledit plasmide à extraire ; adjoindre à ladite suspension cellulaire 2 une solution de lyse alcaline 3 à un débit prédéterminé (Q1) de manière à former un mélange homogène;
placer à un débit prédéterminé (Q2) ledit mélange homogène dans ledit réceptacle 1; après un temps prédéterminé, de préférence sous agitation douce, y ajouter à un débit prédéterminé (Q3) une solution de neutralisation 5 comprenant de l'acide acétique dans ledit réceptacle, via une pluralité d'orifices 7 ; après un temps prédéterminé, y ajouter à un débit prédéterminé (Q4) une solution de précipitation 6 dans ledit réceptacle, via une pluralité d'orifices 7 ; après un temps prédéterminé sous agitation douce, soutirer la suspension ainsi formée via ladite pompe de soutirage 8 à un débit prédéterminé (Q5), puis clarifier, de préférence centrifuger, ledit mélange soutiré de manière à récupérer le surnageant clarifié, comprenant ledit plasmide d'intérêt.
Ce plasmide extrait et purifié est utilisable directement, ou après filtration stérilisante et/ou polissage par chromatographie.
Brève description des dessins La Figure 1 montre de manière semi-schématique un récipient selon l'invention. Description détaillée d'une réalisation de l'invention Les inventeurs ont réussi à développer un procédé d'extraction de plasmides qui conserve la flexibilité d'un procédé en mode discontinu, tout en permettant de traiter des grandes quantités de plasmide et avec un niveau de pureté très élevé.
Un premier aspect de la présente invention est un procédé d'extraction d'un plasmide synthétisé comprenant les étapes successives de : obtenir un réceptacle 1 couplé à une pompe de soutirage 8, ledit réceptacle 1 étant Muni d’un moyen d'agitation mécanique 9, obtenir une suspension cellulaire 2 comprenant ledit plasmide à extraire ; adjoindre à ladite suspension cellulaire 2 une solution de lyse alcaline 3 à un débit prédéterminé Q1 de manière à former un mélange homogène ; placer à un débit prédéterminé Q2 ledit Mélange homogène dans ledit réceptacle 1; après un temps prédéterminé, de préférence sous agitation douce, y ajouter à un débit prédéterminé Q3 une solution de neutralisation 5 comprenant de l'acide acétique dans ledit réceptacle, via une pluralité d'orifices 7 ; après un temps prédéterminé, y ajouter à un débit prédéterminé Q4 une solution de précipitation 6 dans ledit réceptacle, via une pluralité d'orifices 7 ; après un temps prédéterminé sous agitation douce, soutirer la suspension ainsi formée via ladite pompe de soutirage 8 à un débit prédéterminé Q5 de manière à maintenir un volume de remplissage dudit réceptacle supérieur à une valeur minimale prédéterminée et inférieur à une valeur maximale prédéterminée, puis clarifier, de préférence centrifuger, ledit mélange soutiré de manière à récupérer le surnageant clarifié, comprenant ledit plasmide d'intérêt.
Les cellules synthétisant le plasmide d'intérêt sont typiquement des bactéries Gram-négatif, par exemple Escherichia coli. Cependant, d'autres bactéries Gram-négatif, ou même Gram-positif,
voire d'autres microorganismes, tels Saccharomyces. Sp. ou Pichia Sp. peuvent convenir également.
Le plasmide est avantageusement sous forme dite «super enroulée ».
5 La taille du plasmide n’est pas limitante car la présente méthode fonctionne également avec des plasmides de grande taille. Cependant, comme cela sera décrit plus loin, les plasmides de plus grandes tailles (ex. > 10 kb, par exemple entre 10 et 20 kb, y compris des plasmides codant des vecteurs viraux et/ou comprenant des séquences répétées et/ou inversées) imposent Un contrôle plus précis des temps, en particulier du temps de contact avec le milieu de lyse alcaline et du temps pendant lequel la solution de neutralisation est ajoutée.
La taille du réceptacle 1 n'est pas particulièrement limitée. Des réceptacles 1 trop petits ne permettent pas le traitement de quantités suffisantes de plasmides, alors que des réceptacles 1 remplis par de trop grandes quantités de solution risquent de nécessiter trop de temps de pompage, ce qui est pénalisant, vu que cela complique, voire empêche le contrôle des différents temps. En effet, les solutions étant pompées une- à-une, il y a une hétérogénéité au début de chaque étape : un temps de pompage trop long va donc causer une double hétérogénéité au niveau des compositions et des temps de contact.
Les inventeurs ont trouvé que des réceptacles 1 remplis au final (après incorporation des solutions 2+3+5+6) par 5 à 10 litres des solutions étaient très simples à utiliser. Par contre, des réceptacles 1 remplis au final (après incorporation des solutions 2+3+5+6) par 100 litres deviennent trop complexes à contrôler. Ainsi, une taille préférée des volumes utilisables de réceptacles est comprise entre 1 litres et 50 litres, de préférence entre 2,5 litres et 20 litres, de manière encore plus préférée, entre 5 litres et 10 litres.
Bien évidemment, des réceptacles 1 de contenance plus grande, voire nettement plus grande (que 50 ou 100 litres) peuvent être utilisés, même s'ils ne sont destinés à être remplis au maximum que de 2,5 à 10 litres.
De manière surprenante, les inventeurs ont trouvé que cette hétérogénéité, potentiellement cette double hétérogénéité n'est pas fatale, pour autant qu'elle soit contrôlée et/ou qu'elle ne soit pas excessive.
Par exemple, les inventeurs ont déterminé que le contact entre la suspension cellulaire et la solution de lyse est avantageusement compris entre 2 et 5 minutes. Ainsi, les inventeurs ont déduit que l'ajout des solutions 2 et 3 peut se faire en, par exemple, une minute, sans que cela ne cause de problème.
De plus, de préférence, la suspension des cellules 2 et la solution de lyse 3 sont homogénéisées en amont du réceptacle 1 via un système de mélange statique 4.
La suspension des cellules est, de préférence, un culot de culture cellulaire qui a été repris dans Un tampon TRIS-EDTA ; la suspension est à une concentration de 10 à 300, de préférence de 50 à 200, de manière encore plus préférée de 75 à 150, tel que environ 100 g/L (poids des cellules :volume total de la suspension).
Ceci permet une première homogénéisation sans l'implication de forces de cisaillement. Vu que les deux solutions sont combinées à ce niveau, l'éventuelle hétérogénéité est fortement réduite.
De préférence, la solution de lyse 3 est à UN pH compris entre 12,0 et 12,5, de préférence dans lequel le pH est fixé par un hydroxyde d'un alcalin.
Ceci permet une lyse rapide et la dénaturation de l'ADN génomique.
L'utilisation d'un hydroxyde alcalin, tel que le NaOH, permet un pH très basique avec un faible pouvoir tampon, ce qui simplifiera d'autant la neutralisation ultérieure.
Cependant, le pH doit être fixé soigneusement au risque, sinon, de ne pas permettre une lyse et une dénaturation suffisante, ou, au contraire, de dénaturer iréversiblement le plasmide d'intérêt.
De préférence, la solution de lyse 3 comprend en outre un détergent, de préférence 0,1% en poids de dodécyl sulfate de sodium.
Avantageusement, la solution de neutralisation 5 est à UN pH compris entre 4,5 et 5,7 ; de préférence cette solution comprend l'acide acétique à une concentration supérieure à | M, de manière encore plus préférée, la solution de neutralisation à un pH fixé à environ 5,5 au moyen d'un mélange acide acétique/acétate.
Ceci assure à la solution neutralisée (solutions 2, 3 et 5 combinées) un pH inférieur à 7,0, de préférence inférieur à 6,0 et, de préférence (logiquement) un pH supérieur à 4,5, de préférence supérieur à 5,0. De préférence, la suspension comprenant le plasmide reste en présence de la solution de neutralisation pendant au moins 1 minute, par exemple entre 2 et 3 minutes.
Des temps trop importants permettent à l'ADN génomique de se renaturer, ce qui est préjudiciable.
Ainsi, dans le présent procédé discontinu il est préférable que les solutions de neutralisation 5 et de précipitation 6 soient ajoutées rapidement.
Ainsi, pour les plasmides de taille inférieure à 10 kb, un temps de contact avec la solution de neutralisation entre 20 et 80 secondes est avantageux.
Réciproquement, pour des plasmides de taille supérieure à 10 kb, surtout pour ceux qui contiennent des séquences répétées et/ou inversées, un temps de contact avec la solution de neutralisation de 1 à 3 minutes est préféré.
Dans ce cas-ci, le temps d'ajout des solutions 5 et 6 devient un paramètre qu'il convient de contrôler très finement, idéalement de 30 secondes chacune, au maximum.
Cependant, les débits ne sont pas adaptables avec une liberté totale.
Il y a des contraintes physiques de débit, donc de pression à respecter, surtout que (i) le mélange contenant les solutions 2+3+5, ainsi que (ii) la solution 6 sont très visqueux.
En outre, il est préféré d'utiliser des pompes robustes et/ou d'usage courant, ce qui permet une maintenance efficace.
Au besoin, en particulier pour les gros plasmides, les volumes seront réduits, de manière à assurer que les solutions, en particulier les solutions 5 et 6 puissent être apportées rapidement (cfr au paragraphe qui précède). Les pompes péristaltiques sont avantageuses parce que les débits sont bien contrôlés et qu'elles ne causent pas de cisaillement.
Avantageusement, la solution de précipitation 6 comprend un sel de calcium soluble dans l'eau (tel que CaCl) à une concentration comprise entre 3,5 et 6 M, de préférence environ 5M.
Grâce à cette solution concentrée en calcium, la concentration en calcium dans la solution (de suspension) après ajout de la solution de précipitation (solutions 2, 3, 5 et 6 combinées) est d'au moins 0,8 M, par exemple au moins 1,0 M, voire d'au moins 1,2 M.
Les inventeurs préfèrent utiliser une solution de précipitation très concentrée, malgré sa viscosité, de manière à conserver des volumes raisonnables, tout en assurant une concentration finale en calcium qui soit suffisante.
Une telle concentration finale en calcium (> 08 M, voire > 1M) permet la précipitation des impuretés, en particulier de l'ARN et de l'ADN génomique qui n'a pas eu le temps de se renaturer, mais également des protéines et des endotoxines (si la cellule de départ en synthétise), ou à tout le moins d'une partie importante des endotoxines.
Avantageusement, la pluralité d'orifices 7 est un système de tuyauterie percée. Ce système peut être un simple tuyau percé, un serpentin, ou encore un anneau.
L’avantage de la pluralité d'orifices est d'injecter la solution de neutralisation 5 et/ou la solution de précipitation 6 en une pluralité d'endroits dans le réceptacle, ce qui aboutit à une pluralité de micro- hétérogénéités, plutôt qu’à une hétérogénéité massive. Ceci, couplé à une agitation mécanique douce 9, permet une homogénéisation non- cisaillante et rapide. Ceci répond au double problème d'hétérogénéité mentionné ci-dessus.
Les inventeurs ont remarqué à leur surprise que cette approche permettait une homogénéisation suffisamment rapide des solutions, sans causer les problèmes de cisaillement déjà mentionnés.
Avantageusement, la pluralité d'orifices 7 utilsée pour l'addition de la solution de neutralisation 5 et la pluralité d'orifices 7 utilisée pour l'addition de la solution de précipitation 6 sont la même pluralité d'orifices 7 : les récipients contenant les solutions de précipitation et de neutralisation étant connectés en amont du réceptacle 1. Ceci permet de ne pas multiplier les dispositifs, et permet également de purger l'ensemble de la solution de neutralisation.
Avantageusement, les solutions de neutralisation 5 et/ou de précipitation 6 sont ajoutées substantiellement via le bas du réceptacle 1, de préférence au moins 30, 40, voire (au moins ou exactement) 50% en poids et/ou volume desdites solutions de neutralisation et/ou de précipitation sont ajoutées dans les 20% du bas dudit réceptacle. Ceci permet une injection contrôlée des solutions et augmente leurs diffusions.
Alternativement, ou en outre, les solutions de neutralisation 5 et/ou de précipitation 6 sont ajoutées substantiellement dans le haut du réceptacle 1, de préférence au moins 30, 40, voire (au moins ou exactement) 50% en poids desdites solutions de neutralisation et/ou de précipitation sont ajoutées dans les 20% du haut dudit réceptacle.
Ceci améliore la diffusion des solutions de neutralisation et/ou de précipitation.
Selon une variante, la solution de neutralisation 5 est ajoutée substantiellement via le bas du réceptacle 1, de préférence au moins 30, 40, voire (au moins ou exactement) 50% en poids et/ou volume de la solution de neutralisation 5 sont ajoutées dans les 20% du bas dudit réceptacle et la solution de précipitation 6 est ajoutée substantiellement dans le haut du réceptacle 1, de préférence au moins 30, 40, voire (au moins ou exactement) 50% en poids de la solution de précipitation 6 sont ajoutées dans les 20% du haut dudit réceptacle.
Ceci peut se faire en faisant varier la hauteur du système comprenant la pluralité d'orifices 7, ou en utilisant deux systèmes comprenant la pluralité d'orifices 7 distincts.
Selon une seconde variante, la solution de neutralisation 5 est ajoutée substantiellement dans le haut du réceptacle 1, de préférence au moins 30, 40, voire (au moins ou exactement) 50% en poids de la solution de neutralisation 5 sont ajoutées dans les 20% du haut dudit réceptacle et la solution de précipitation 6 est ajoutée substantiellement via le bas du réceptacle 1, de préférence au moins 30, 40, voire (au moins ou exactement) 50% en poids et/ou volume de la solution de précipitation 6 sont ajoutées dans les 20% du bas dudit réceptacle.
Ceci peut se faire en faisant varier la hauteur du système comprenant la pluralité d'orifices 7, ou en ufilisant deux systèmes comprenant la pluralité d'orifices 7 distincts.
De préférence les débits QI, Q2, Q3, Q4 et QS sont indépendamment compris entre 05 L/min et 25 L/min, plus préférentiellement entre 1 L/min et 10 L/min.
Les débits Q1, QZ, Q3, Q4 et/ou Q5 peuvent être, indépendamment, constants ; ou les débits Q1, Q2, Q3, Q4 et/ou Q5 peuvent être, indépendamment, variables. Par exemple, les débits QT, Q2, Q3, Q4 et/ou Q5, de préférence Q3 et/ou Q4, peuvent être augmentés au cours du temps (plus faible au début du pompage, maximal à la fin) de manière à limiter les hétérogénéités lors de l'ajout de ces solutions visqueuses. Une manière avantageuse de procéder à l'augmentation des débits est de conserver un ratio débit/volume constant, ou substantiellement constant. Indépendamment des débits QT, Q2, Q3 et/ou Q4 qui peuvent être variables (augmenter au cours du temps), le débit Q5 est, de préférence, constant. Le soutirage 8 est, de préférence, très rapide, de manière à éviter que des agrégats ne le perturbent. Ainsi, le débit Q5 est, de préférence, constant et maximal. De préférence les débits Q1 et Q2 sont appariés (déterminés ensemble) pour que (i) l'ensemble de la suspension cellulaire 2 et de la solution de lyse 3 soient pompés en même temps et (ii) pour que la concentration du mélange (teneur en cellules, pH), par exemple à la sortie du mélangeur statique 4, soit constante.
Avantageusement, l'agitation douce 9 génère des contraintes de cisaillement insuffisantes que pour cisailler l'ADN plasmidique ou l'ADN génomique de l'hôte.
Ainsi, une étape préliminaire possible consiste en un test de l'acceptabilité des contraintes de cisaillement, selon le type de microorganisme, la taille du plasmide à purifier et les concentrations choisies des solutions.
Un aspect lié de la présente invention est un procédé de purification du plasmide d'intérêt à partir du surnageant clarifié selon ce qui précède, comprenant les étapes de : une récolte du surnageant clarifié comprenant ledit plasmide, Une filtration du surnageant clarifié sur un filtre d’une porosité comprise entre 0,1 et 0,4 um, préférentiellement entre 0,15 et 0,3 um, de manière favorable autour de 0,2 um, pour donner une solution filtrée comprenant ledit plasmide, optionnellement, une ultrafiltration de la solution filtrée, Un polissage par chromatographie sur une résine échangeuse d'anions, de préférence ledit polissage comprenant une étape de lavage du plasmide fixé sur la résine au moyen d'une solution comprenant du Polyoxyéthylène (10) isooctylcyclohexyl éther ; une formulation du plasmide dans une solution finale.
Exemples.- Il est bien entendu que la présente invention n'est en aucune façon limitée aux formes de réalisations décrites ci-dessous et que bien des modifications peuvent y être apportées sans sortir du cadre des revendications annexées.
Exemple comparatif Les inventeurs ont cherché à développer un procédé discontinu « en bouteille ». Pour plus de facilité, les références se feront par rapport à la figure 1, qui serait dépourvue des éléments 4 et 7, ainsi que du système de tuyauterie et de pompe en amont du récipient 1. Pour ce faire, 0,3 litre d'une suspension cellulaire concentrée 2 (100 g de cellules/litre de milieu Tris-EDTA) produisant un plasmide a été inséré dans le récipient 1 d'une contenance de 2 litres, puis 0,3 litre de la solution de lyse alcaline 3 (NaOH; pH 12,5; SDS 0,1% en poids) a été ajouté rapidement et le récipient 1 a été agité manuellement par l'opérateur pendani exactement 90 secondes.
Ensuite, 0,6 litre de la solution de neutralisation 5 (ACOH 15% v :v/acétate de potassium 3M, pH compris entre 4,5 et 5,7) a été ajouté rapidement et le contenu du récipient 1 a été agité manuellement pendant exactement 90 secondes.
Enfin, 0,23 litre de la solution de précipitation 6 (CaCl», 5M) a été ajouté rapidement et le contenu du récipient 1 a été agité manuellement pendant exactement 90 secondes ; ensuite le mélange a été soutiré en vue d'une clarification par centrifugation.
Les inventeurs n'ont récupéré que 200 mg du plasmide par litre et ce plasmide contenait des quantités mesurables d'ADN génomique et d'ARN, ce qui impose, en pratique, de rajouter une étape de chromatographie, ce qui signifie des coûts additionnels, et une perte de rendement.
Exemple 1 Les inventeurs ont eu l'intuition de développer ce système qu'ils considéraient comme peu efficace. Pour ce faire, 1,2 litres d'une suspension cellulaire concentrée 2 (100 g de cellules/litre dans le même milieu Tris-EDTA) contenant le plasmide a été inséré dans le récipient 1 d'une contenance de 10 litres, via une pompe péristaltique en même temps que 1,2 litres de la solution de lyse alcaline 3 (NaOH ; pH 12,5 ; SDS 0,1% en poids). Le temps d'injection était de 30 secondes. Le récipient était sous agitation mécanique 9 lente (non cisaillante) pendant exactement 90 secondes. Ensuite, 2,4 L de la même solution de neutralisation 5 que dans l'exemple comparatif a été ajouté rapidement (débit de 6L/min) par le bas, via une pompe péristaltique et un anneau de diffusion percé de nombreux orifices 7 de petite taille, et le contenu du récipient 1 a été agité mécaniquement 9, mais de manière non- cisaillanie, pendant exactement 90 secondes. Enfin, 0,92 L de la solution de précipitation 6 (CaCl», 5M) a été ajoutée rapidement (débit de 2,3 L/min via une pompe péristaltique et le même dispositif percé d'orifices 7, toujours sous agitation mécanique 9 lente pendant exactement 90 secondes ; ensuite le mélange a été soutiré 8 en vue d'une clarification par cenirifugation.
Les inventeurs ont récupéré environ 300 mg de plasmide/L, et ce plasmide ne contenait pas de quantités mesurables d'ADN génomique ou d'ARN.
Vu que l'agitation se fait pendant 90 secondes, les inventeurs concluent que ce dispositif peut être facilement adapté (volumes, débits) en modifiant un peu la durée de l'agitation.
Exemple 2 La même procédure que l'exemple 1 a été suivie, sauf que les solutions 2 et 3 ont été mélangées via le mélangeur statique 4, ce qui a permis une augmentation des rendements du plasmide récolté à 400 mg/Letla pureté était aussi bonne.
Exemple 3 La même procédure que l'exemple 2 a été suivie, sauf que les solutions 5 et 6 ont été ajoutées majoritairement via la partie supérieure durécipient 1, ce qui a permis une légère augmentation des rendements, surtout lorsqu'un plasmide d’une taille > 10 kb a été utilisé.
Claims (17)
1. Un procede d’extraction d’un plasmide synthetise par un microorganisme comprenant les étapes successives de : - obtenir un réceptacle (1) couplé à une pompe de soutirage (8), ledit réceptacle (1) étant muni d'un moyen d'agitation mécanique (9), - obtenir une suspension cellulaire (2) dudit microorganisme comprenant ledit plasmide à extraire ; - adjoindre à ladite suspension cellulaire (2) une solution de lyse alcaline (3) à un débit prédéterminé Q1 de manière à former un mélange homogène ; - placer à un débit prédéterminé Q2 ledit mélange homogène dans ledit réceptacle (1) ; - après un temps prédéterminé, de préférence sous agitation douce, y ajouter à un débit prédéterminé Q3 une solution de neutralisation (5) comprenant de l'acide acétique dans ledit réceptacle, via une pluralité d’orifices (7) : - après un temps prédéterminé, y ajouter à un débit prédéterminé Q4 une solution de précipitation (6) dans ledit réceptacle, via une pluralité d'orifices (7) ; - après un temps prédéterminé sous agitation douce, soutirer la suspension ainsi formée via ladite pompe de soutirage (8) à un débit prédéterminé Q5, puis - Clarifier, de préférence centrifuger, ledit mélange soutiré de manière à récupérer le sumageant Cclarifié, comprenant ledit plasmide d'intérêt.
2. Le procédé selon la revendication 1 dans lequel la suspension des cellules (2) et la solution de lyse (3) sont homogénéisées en amont du réceptacle via un système de mélange statique (4).
3. Le procédé selon la revendication 1 ou 2 dans lequel la solution de lyse (3) est à un pH compris entre 12,0 et 12,5, de préférence dans lequel le pH est fixé par un hydroxyde d'un alcalin.
4. Le procédé selon la revendication 3 dans lequel la solution de lyse (2) comprend en outre un détergent, de préférence 0,1% en poids de dodécyl sulfate de sodium.
5. Le procédé selon une quelconque des revendications précédentes dans lequel la solution de neutralisation (5) est à un pH compris entre 4,5 et 5,7.
6. Le procédé selon une quelconque des revendications précédentes dans lequel la solution de neutralisation (5) comprend de l'acide acétique à une concentration supérieure à 1 M, de préférence dans lequel la solution de neutralisation à un pH fixé au moyen d'un mélange acide acétique/acétate.
7. Le procédé selon une quelconque des revendications précédentes dans lequel Ia solution neutralisée a un pH inférieur à 7,0, de préférence inférieur à 6,0 et, de préférence un pH supérieur à 4,5, de préférence supérieur à 5,0.
8. Le procédé selon une quelconque des revendications précédentes dans lequel la solution de précipitation (6) comprend un sel de calcium soluble dans l'eau à une concentration comprise entre 3,5 et 6 M, de préférence environ 5M.
9. Le procédé selon la revendication 8 dans lequel la concentration en calcium dans la solution après ajout de la solution de précipitation est d'au moins 0,8 M, de préférence au moins 1,0 M, de manière encore plus préférée d'au moins 1,2 M.
10. Le procédé selon une quelconque des revendications précédentes dans lequel la pluralité d'orifices (7) est un système de tuyauterie percée.
11. Le procédé selon une quelconque des revendications précédentes dans lequel la pluralité d'orifices (7) utilisée pour l'addition de la solution de neutralisation et la pluralité d'orifices (7) utilisée pour l'addition de la solution de précipitation sont la même pluralité d'orifices (7).
12. Le procédé selon une quelconque des revendications précédentes dans lequel les solutions de neutralisation (5) et/ou de précipitation (6) sont ajoutées substantiellement dans le bas du réceptacle (1), de préférence au moins 50% en poids desdites solutions de neutralisation et/ou de précipitation sont ajoutées dans les 20% du bas dudit réceptacle.
13. Le procédé selon une quelconque des revendications précédentes 1 à 11, dans lequel les solutions de neutralisation (5) et/ou de précipitation (6) sont ajoutées substantielement dans le haut du réceptacle (1), de préférence au moins 50% en poids desdites solutions de neutralisation et/ou de précipitation sont ajoutées dans les 20% du haut dudit réceptacle.
14. Le procédé selon une quelconque des revendications précédentes dans lequel les débits Q1, Q2, Q3, Q4 et Q5 sont indépendamment compris entre 05 L/min et 25 L/min, plus préférentiellement entre 1 L/min et 10 L/min, voire entre 2 L/min et 8 L/min.
15. Le procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel l'agitation douce génère des contraintes de cisaillement insuffisantes pour cisailler l'ADN plasmidique ou l'ADN génomique de l'hôte.
16. Le procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel les solutions sont ajoutées et/ou soutirées par une ou des pompe(s) péristaltique(s).
17. Procédé de purification du plasmide d'intérêt à partir du surnageant clarifié selon l'une quelconque des revendications précédentes, comprenant les étapes de : - une récolte du surnageant clarifié comprenant ledit plasmide, - une filtration du surnageant clarifié sur un filtre d'une porosité comprise entre 0,1 et 0,4 um, préférentiellement entre 0,15 et 0,3 um, de manière favorable autour de 0,2 um, pour donner une solution filtrée comprenant ledit plasmide, - optionnellement, une ultrafiltration de la solution filtrée, - UN polissage par chromatographie sur une résine échangeuse d'anions, de préférence ledit polissage comprenant une étape de lavage du plasmide fixé sur la résine au moyen d'une solution comprenant du Polyoxyéthylène (10) isooctylcyclohexyl éther ; - une formulation du plasmide dans une solution finale.
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