WO2023275406A1 - Extraction plasmidique automatisée - Google Patents

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WO2023275406A1
WO2023275406A1 PCT/EP2022/068461 EP2022068461W WO2023275406A1 WO 2023275406 A1 WO2023275406 A1 WO 2023275406A1 EP 2022068461 W EP2022068461 W EP 2022068461W WO 2023275406 A1 WO2023275406 A1 WO 2023275406A1
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WO
WIPO (PCT)
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solution
plasmid
receptacle
neutralization
precipitation
Prior art date
Application number
PCT/EP2022/068461
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English (en)
Inventor
Marc DAUKANDT
Philippe Ledent
Christian Rodriguez
Original Assignee
Xpress Biologics
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Publication date
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Priority to EP22744169.8A priority patent/EP4363571A1/fr
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1003—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1003—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor
    • C12N15/1017—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor by filtration, e.g. using filters, frits, membranes

Definitions

  • the present invention relates to the automated extraction of a plasmid of interest produced by a bacterium.
  • a plasmid of interest in a bacterium such as Escherichia coli
  • alkaline lysis followed by a neutralization and precipitation step eg Birnboim and Dolly, 1979, Nucleic Acids Research, 7, pages 1513-1523.
  • This method is simple to put into practice and works well in discontinuous mode (“batch”); it is suitable for the production of small quantities of plasmids, such as the order of a gram, at most.
  • Patent application WO 2010/136503 (also published, among others under EP2435569B1, US8,822,672 e ⁇ US 9,416,400) describes a process for the continuous extraction of plasmids, based on a pipe arrangement system for the different solutions and ⁇ their mixtures e ⁇ flow control by pumps.
  • this method provides for the addition of a concentrated precipitation solution.
  • the neutralization and precipitation solutions are ⁇ homogeneously mixed by adapting the internal diameter of the piping, so as to cause a Venturi effect locally.
  • this system is advantageously disposable, so that it does not require cleaning.
  • this system is ⁇ very effective for very large quantities of plasmids to be purified, for example 100 g of plasmid, it entails fixed costs (disposable device, losses of plasmid) which become significant if the quantities of plasmids to be purify his weakest ⁇ .
  • discontinuous mode the efficiency of systems in discontinuous mode is limited by physical parameters such as the size of the containers, the time for bringing the solutions into contact, or even the need for rapid homogenization.
  • an ideal purification is achieved from low volumes, which allows good control of the mixtures, but greatly complicates production on a larger scale.
  • the present invention relates to a method for extracting a plasmid synthesized by a microorganism comprising the successive steps of: obtaining a receptacle 1 coupled to a withdrawal pump 8, said receptacle 1 being provided with a means of mechanical stirring 9, obtaining a cell suspension 2 of said microorganism comprising said plasmid to be extracted; adding to said cell suspension 2 an alkaline lysis solution 3 at a predetermined rate (Q 1 ) so as to form a homogeneous mixture; placing at a predetermined rate (Q2) said homogeneous mixture in said receptacle 1; after a predetermined time, preferably with gentle agitation, adding thereto at a predetermined rate (Q3) a neutralization solution 5 comprising acetic acid in said receptacle, via a plurality of orifices 7; after a predetermined time, adding thereto at a predetermined rate (Q4) a precipitation solution 6 in said receptacle, via a
  • This extracted and purified plasmid can advantageously be used directly, or after sterilizing filtration, ultrafiltration and/or polishing by chromatography.
  • Figure 1 shows semi-schematically a container according to the invention.
  • Figure 2 shows an HPLC analysis of plasmid exfrai ⁇ by the automated method according to the invention
  • Figure 3 shows the effect of variations #1; #2; #3 e ⁇ #4 made to the preferred automated process.
  • the inventors have succeeded in developing a process for extracting plasmids which retains the flexibility of a process in batch mode, for ⁇ by making it possible to process large quantities of plasmid e ⁇ with an extraction yield e ⁇ a level of purity very high.
  • a first aspect of the present invention is ⁇ a method for extracting a synthesized plasmid comprising the successive steps of: obtaining a receptacle 1 coupled to a withdrawal pump 8, said receptacle 1 being provided with a means of mechanical agitation 9, obtaining a cell suspension 2 comprising said plasmid to be extracted; adding to said cell suspension 2 an alkaline lysis solution 3 at a predetermined rate Q1 so as to form a homogeneous mixture; placing at a predetermined rate Q2 said homogeneous mixture in said receptacle 1; after a predetermined time, preferably with gentle stirring, add thereto at a predetermined rate Q3 a neutralization solution 5 comprising acetic acid in said receptacle, via a plurality of orifices 7; after a predetermined time, adding thereto at a predetermined rate Q4 a precipitation solution 6 in said receptacle, via a plurality of orifices 7; after a predetermined time with gentle stirring, withdraw
  • the cells synthesizing the plasmid of interest are typically Gram-negative bacteria, for example Escherichia coli. However, other Gram-negative or even Gram-positive bacteria, or even other microorganisms, such as Saccharomyces Sp. or Pichia Sp. may also be suitable.
  • the plasmid is advantageously in so-called “super coiled” form.
  • the size of the plasmid is not limiting because the present method also works with large plasmids.
  • larger plasmids eg > 10 kb, e.g. between 10 and 20 kb
  • plasmids encoding viral vectors and/or comprising repeated and/or inverted sequences impose a more precise control of the times, in particular of the contact time with the alkaline lysis medium e ⁇ of the addition time e ⁇ of contact with the neutralization solution.
  • the size of the receptacle 1 is not particularly limited. Receptacles 1 that are too small do not allow the treatment of sufficient quantities of plasmids, whereas receptacles 1 filled with too large quantities of solution risk requiring too much pumping time, which is penalizing, since this complicates, even prevents the control of different times. Indeed, the solutions being pumped one-by-one, there is a heterogeneity at the beginning of each step: too long a pumping time will therefore cause a double heterogeneity at the level of the compositions e ⁇ of the contact times.
  • receptacles 1 filled in the end (after incorporation of the 2+3+5+6 solutions) with 5 to 10 liters of the solutions were very simple to use.
  • receptacles 1 filled in the end (after incorporation of the solutions 2+3+5+6) per 100 liters become too complex to control.
  • a preferred size of usable volumes of receptacles are between 1 liter and 50 liters, preferably between 2.5 liters and 20 liters, even more preferably between 5 liters and 10 liters.
  • receptacles 1 of larger, or even much larger, capacity can be used, even if they are only intended to be filled with a maximum of 2.5 to 10 liters.
  • the inventors have determined that the contact between the cell suspension and the lysis solution is advantageously between 2 and 5 minutes.
  • the inventors have deduced that the addition of the solutions 2 e ⁇ 3 can be done in, for example, one minute, without this causing any problem.
  • the cell suspension 2 and the lysis solution 3 are ⁇ homogenized upstream of the receptacle 1, for example via a static mixing system 4.
  • the term preferably means the term “static mixer” fo ⁇ device which causes turbulence to the combined flow of the cell suspension 2 e ⁇ of the lysis solution 3, resulting in a rapid homogenization of this combined flow.
  • This type of mixture is advantageous in that it is not associated with excessive shearing forces.
  • the cell suspension is ⁇ preferably a cell culture pellet which has been taken up in a TRIS-EDTA buffer; suspension es ⁇ at a concentration of 10 to 300, preferably 50 to 200, even more preferably 75 to 150, such as about 100 g/L (cell weight:total suspension volume).
  • the lysis solution 3 is ⁇ at a pH of between 12.0 and ⁇ 12.5, preferably the pH of the lysis solution is ⁇ fixed by a hydroxide of an alkali.
  • the lysis solution 3 additionally comprises a detergent, preferably 0.1% by weight of sodium dodecyl sulphate.
  • This ensures the neutralized solution (2, 3 e ⁇ 5 solutions combined) has a pH below 7.0, preferably below 6.0 e ⁇ , preferably (logically) above 4.5, preferably above at 5.0.
  • the suspension comprising the plasmid remains in the presence of the neutralization solution for at least 1 minute, for example between 2 and 3 minutes. Excessive times allow the genomic DNA to renature, which is detrimental. Thus, in the present batch process it is preferable that the neutralization solutions 5 e ⁇ of precipitation 6 are added quickly. Thus, for plasmids smaller than 10 kb, a contact time with the neutralization solution between 20 and 80 seconds is advantageous.
  • a contact time with the neutralization solution of 1 to 3 minutes is preferred.
  • the addition time of the 5 e ⁇ 6 solutions becomes a parameter that should be controlled very finely, ideally 30 seconds each, at most.
  • the precipitation solution 6 comprises a water-soluble calcium salt (such as CaCh) at a concentration of between 3.5 and 6 M, preferably about 5 M. Thanks to this concentrated calcium solution, the calcium concentration in the (suspension) solution after addition of the precipitation solution (solutions 2, 3, 5 and 6 combined) is at least 0.8 M, for example at least 1.0 M, or even at least 1.2 M.
  • the inventors prefer to use a highly concentrated precipitation solution, despite its viscosity, so as to keep volumes reasonable, while ensuring a final calcium concentration which is ⁇ sufficient.
  • Such a final calcium concentration (> 0.8 M, or even > IM) allows impurities to precipitate, in particular e ⁇ RNA from genomic DNA which has not had time to renature, but also proteins and endotoxins (if the starting cell synthesizes them), or at least a significant part of the endotoxins.
  • the plurality of orifices 7 are ⁇ a pierced piping system.
  • This system can be a simple drilled pipe, a coil, or even a ring.
  • the advantage of the plurality of orifices is to inject the neutralization solution 5 and/or the precipitation solution 6 at a plurality of places in the receptacle, which results in a plurality of micro heterogeneities, rather than to massive heterogeneity.
  • the plurality of orifices 7 used for the addition of the neutralization solution 5 e ⁇ the plurality of orifices 7 used for the addition of the precipitation solution 6 are ⁇ the same plurality of orifices 7: the containers containing the precipitation solutions e ⁇ of neutralization being connected upstream of the receptacle 1. This makes it possible not to multiply the devices, e ⁇ also makes it possible to purge all of the neutralization solution.
  • the neutralization 5 and/or precipitation 6 solutions are substantially added via the bottom of the receptacle 1, preferably at least 30, 40, or even (at least or exactly) 50% by weight and/or volume of said solutions of neutralization and/or precipitation is ⁇ added to the bottom 20% of said receptacle. This allows a controlled injection of the solutions and increases their diffusion.
  • the neutralization solution 5 is ⁇ added substantially via the bottom of the receptacle 1, preferably at least 30, 40, or even (at least or exactly) 50% by weight and/or volume of the neutralization solution 5 ⁇ added to the bottom 20% of said receptacle e ⁇
  • the precipitating solution 6 is ⁇ substantially added to the top of receptacle 1, preferably at least 30, 40, or even (at least or exactly) 50% by weight of the solution precipitation 6 bran ⁇ added to the top 20% of said receptacle.
  • This can be done by varying the height of the system comprising the plurality of orifices 7, or by using two systems comprising the plurality of distinct orifices 7.
  • the neutralization solution 5 is ⁇ substantially added to the top of the receptacle 1, preferably at least 30, 40, or even (at least or exactly) 50% by weight of the neutralization solution 5 is ⁇ added in the top 20% of said receptacle e ⁇ the precipitation solution 6 is ⁇ added substantially via the bottom of the receptacle 1, preferably at least 30, 40, or even (at least or exactly) 50% by weight and/or volume of the 6 bran ⁇ precipitation solution added to bottom 20% of said receptacle.
  • This can be done by varying the height of the system comprising the plurality of orifices 7, or by using two systems comprising the plurality of separate orifices 7.
  • the flow rates Q1, Q2, Q3, Q4 and Q5 are independently between 0.5 L/min and 25 L/min, more preferably between 1 L/min and 10 L/min.
  • the flow rates Q1, Q2, Q3, Q4 and/or Q5 can be independently constant; or the flow rates Q1, Q2, Q3, Q4 and/or Q5 can be independently variable.
  • the flow rates Q1, Q2, Q3, Q4 and/or Q5, preferably Q3 and/or Q4 can be increased over time (lower at the start of pumping, maximum at the end) so as to limit the heterogeneities when adding these viscous solutions.
  • An advantageous way to proceed with the increase in flow rates is ⁇ to keep a constant, or substantially constant, flow/volume ratio.
  • the flow rate Q5 is preferably constant.
  • the flow rate Q5 is ⁇ , preferably, constant e ⁇ maximum.
  • the flow rates Q1 e ⁇ Q2 are paired (determined together) so that (i) all of the cell suspension 2 e ⁇ of the lysis solution 3 are pumped at the same time e ⁇ (ii) so that the concentration of the mixture (cell content, pH), for example at the outlet of the static mixer 4, constant self ⁇ .
  • the gentle agitation 9 generates insufficient shearing stresses to shear the plasmid DNA or the genomic DNA of the host.
  • a possible preliminary step consists of a test ⁇ of the acceptability of the shear stresses, according to the type of microorganism, the size of the plasmid to be purified and the chosen concentrations of the solutions.
  • a related aspect of the present invention is ⁇ a method for purifying the plasmid of interest from the supernatant clarified according to the above, comprising the steps of: harvesting the clarified supernatant comprising said plasmid, filtering the clarified supernatant on a filter with a porosity of between 0.1 and 0.4 miti, preferably between 0.15 and 0.3 miti, favorably around 0.2 miti, to give a filtered solution comprising said plasmid, optionally ⁇ , ultrafiltration of the filtered solution, polishing by chromatography on an anion exchange resin, preferably said polishing comprising a step of washing the plasmid attached to the resin by means of a solution comprising polyoxyethylene (10) isooctylcyclohexyl ether; a formulation of the plasmid in a final solution.
  • the inventors only recovered 200 mg of the plasmid per litre, and this plasmid contained measurable quantities of genomic DNA and RNA, which requires, in practice, to add a chromatography step, which means additional costs, e ⁇ loss of yield.
  • yields which varied from simple to double, but also variable contents of contaminating RNA and in plasmid in "Open circular” form, the best yield being associated with an increased content of contaminants.
  • the ratio of plasmid DNA in unrolled form (open circular) varied from 7 to 12%; values above 10% are ⁇ considered high.
  • the desired shape is ⁇ the so-called “super coiled” one, and it is ⁇ difficult to achieve a separation of these two forms by HPLC or by fou ⁇ other means, the two peaks tending to overlap.
  • 1.2 liters of a concentrated cell suspension 2 (100 g of cells/lifre in the same Tris-EDTA medium) containing the plasmid was inserted into container 1 with a capacity of 10 liters, via a peristaltic pump at the same time as 1.2 liters of the alkaline lysis solution 3 (NaOH; pH 12.5; SDS 0.1% by weight), these two solutions passing through a static mixer 4.
  • the injection time was of 30 seconds.
  • the vessel was under slow (non-shearing) mechanical agitation for exactly 90 seconds.
  • this device can be easily adapted (volumes, flow rates) by slightly modifying the duration of the agitation.
  • the inventors then analyzed by HPLC the plasmid obtained by the process according to the invention.
  • the main advantages of the process according to the invention relate to the reproducibility and the possibility of production on a larger scale: a plurality of reactors according to the invention can be managed in parallel by a single operator, whereas the Manual stirring requires one operator per bottle, and cannot be performed at too high a rate, otherwise there is a risk of abusing the physical capacities of the operator, which will have an impact on the quality of the plasmid.
  • Example 3 comparative example The inventors compared 4 conditions with respect to the condition according to the invention (see the HPLC profiles in Figure 3).
  • the diffusion ring is placed in the middle of the bottle, not at the bottom; 2. Diffusion ring omitted;
  • Condition #1 shows heterogeneities at an intermediate level between the process where the diffusion ring is ⁇ at the bottom, and the process where the diffusion ring is ⁇ moved towards the middle of the container.
  • the filtration parameters are also degraded, where the filters had to be changed twice for conditions #1 and #4 and once for condition #2.
  • RNA (RNA:plasmid) contamination also increases, except for condition #3.

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Abstract

Procédé d'extraction discontinu de plasmide d'un microorganisme et de purification d'un plasmide d'intérêt comprenant l'ajout d'une solution de neutralisation et ensuite d'une solution de précipitation via une pluralité d'orifices, sous agitation mécanique douce.

Description

EXTRACTION PLASMI PIQUE AUTOMATISÉE
Domaine technique
La présente invention concerne l'extraction automatisée d'un plasmide d'intérêt produit par une bactérie.
L'art antérieur
La production d'un plasmide d'intérêt dans une bactérie, telle Escherichia coli, est connue, tout comme la lyse alcaline suivie d'une étape de neutralisation et de précipitation (ex. Birnboim et Dolly, 1979, Nucleic Acids Research, 7, pages 1513-1523).
Cette méthode est simple à mettre en pratique et fonctionne bien en mode discontinu (« batch ») ; elle es† adaptée pour la production de petites quantités de plasmides, telles que de l'ordre du gramme, au maximum.
La demande de brevet WO 2010/136503 (également publiée, entre autres sous EP2435569B1 , US8,822,672 e† US 9,416,400) décrit un procédé d'extraction de plasmides en continu, basé sur un système d'agencement de tuyaux pour les différentes solutions e† leurs mélanges e† de contrôle de débits par des pompes. Outre la solution de neutralisation, composée classiquement d'un tampon acide acétique/acétate, ce procédé prévoit l'ajout d'une solution concentrée de précipitation. Les solutions de neutralisation e† de précipitation son† mélangées de manière homogène par une adaptation du diamètre interne de la tuyauterie, de manière à provoquer localement un effet Venturi. En effet, l'inventeur de cette demande de brevet a remarqué qu'une agitation mécanique n'étai† pas possible pour de tels volumes de solutions visqueuses, au risque, sinon, de cisailler l'ADN génomique e† même les plasmides, ce qui es† inacceptable, au contraire du mélange par effet Venfuri. En outre, de manière avantageuse, ce système es† à usage unique, si bien qu'il ne nécessite pas de nettoyage. Cependant, si ce système es† très efficace pour de très grandes quantités de plasmides à purifier, par exemple 100 g de plasmide, il occasionne des coûts fixes (dispositif à usage unique, pertes de plasmide) qui deviennent importants si les quantités de plasmides à purifier son† plus faibles.
Il y a donc une gamme de quantités qui es† difficile à traiter par un procédé discontinu, e† peu efficace à traiter par le procédé en continu résumé ci-dessus, même si les deux approches fonctionnent bien dans leurs créneaux respectifs.
En effet, l'efficacité des systèmes en mode discontinu es† limitée par les paramètres physiques tels que la taille des récipients, le temps pour la mise en contact des solutions, ou encore la nécessité d'une homogénéisation rapide. Ainsi, en mode discontinu, une purification idéale se réalise à partir de volumes faibles, ce qui permet de bien contrôler les mélanges, mais complique fortement la production à plus grande échelle.
Bref résumé de l'invention La présente invention a trait à un procédé d'extraction d'un plasmide synthétisé par un microorganisme comprenant les étapes successives de: obtenir un réceptacle 1 couplé à une pompe de soutirage 8, ledit réceptacle 1 étant muni d'un moyen d'agitation mécanique 9, obtenir une suspension cellulaire 2 dudit microorganisme comprenant ledit plasmide à extraire ; adjoindre à ladite suspension cellulaire 2 une solution de lyse alcaline 3 à un débit prédéterminé (Q 1 ) de manière à former un mélange homogène; placer à un débit prédéterminé (Q2) ledit mélange homogène dans ledit réceptacle 1 ; après un temps prédéterminé, de préférence sous agitation douce, y ajouter à un débit prédéterminé (Q3) une solution de neutralisation 5 comprenant de l'acide acétique dans ledit réceptacle, via une pluralité d'orifices 7 ; après un temps prédéterminé, y ajouter à un débit prédéterminé (Q4) une solution de précipitation 6 dans ledit réceptacle, via une pluralité d'orifices 7 ; après un temps prédéterminé sous agitation douce, soutirer la suspension ainsi formée via ladite pompe de soutirage 8 à un débit prédéterminé (Q5), puis clarifier, de préférence centrifuger, ledit mélange soutiré de manière à récupérer le surnageant clarifié, comprenant ledit plasmide d'intérêt.
Ce plasmide extrait e† purifié es† avantageusement utilisable directement, ou après filtration stérilisante, ultrafiltration et/ou polissage par chromatographie.
Brève description des dessins
La Figure 1 montre de manière semi-schématique un récipient selon l'invention.
La figure 2 montre une analyse par HPLC du plasmide exfrai† par le procédé automatisé selon l'invention
La figure 3 montre l'effet des variations #1 ; #2 ; #3 e† #4 apportées au procédé automatisé préféré. Description détaillée d'une réalisation de l'invention
Les inventeurs ont réussi à développer un procédé d'extraction de plasmides qui conserve la flexibilité d'un procédé en mode discontinu, fou† en permettant de traiter des grandes quantités de plasmide e† avec un rendement d'extraction e† un niveau de pureté très élevés.
Un premier aspect de la présente invention es† un procédé d'extraction d'un plasmide synthétisé comprenant les étapes successives de : obtenir un réceptacle 1 couplé à une pompe de soutirage 8, ledit réceptacle 1 étant muni d'un moyen d'agitation mécanique 9, obtenir une suspension cellulaire 2 comprenant ledit plasmide à extraire ; adjoindre à ladite suspension cellulaire 2 une solution de lyse alcaline 3 à un débit prédéterminé Q1 de manière à former un mélange homogène ; placer à un débit prédéterminé Q2 ledit mélange homogène dans ledit réceptacle 1 ; après un temps prédéterminé, de préférence sous agitation douce, y ajouter à un débit prédéterminé Q3 une solution de neutralisation 5 comprenant de l'acide acétique dans ledit réceptacle, via une pluralité d'orifices 7 ; après un temps prédéterminé, y ajouter à un débit prédéterminé Q4 une solution de précipitation 6 dans ledit réceptacle, via une pluralité d'orifices 7 ; après un temps prédéterminé sous agitation douce, soutirer la suspension ainsi formée via ladite pompe de soutirage 8 à un débit prédéterminé Q5, puis clarifier, de préférence centrifuger, ledit mélange soutiré de manière à récupérer le surnageant clarifié, comprenant ledit plasmide d'intérêt. Les cellules synthétisant le plasmide d'intérêt sont typiquement des bactéries Gram-négatif, par exemple Escherichia coli. Cependant, d'autres bactéries Gram-négatif, ou même Gram-positif, voire d'autres microorganismes, tels Saccharomyces Sp. ou Pichia Sp. peuvent convenir également.
Le plasmide es† avantageusement sous forme dite « super enroulée » (super coiled) .
La taille du plasmide n'es† pas limitante car la présente méthode fonctionne également avec des plasmides de grande taille. Cependant, comme cela sera décrit plus loin, les plasmides de plus grandes tailles (ex. > 10 kb, par exemple entre 10 e† 20 kb, y compris des plasmides codant des vecteurs viraux et/ou comprenant des séquences répétées et/ou inversées) imposent un contrôle plus précis des temps, en particulier du temps de contact avec le milieu de lyse alcaline e† du temps d'ajout e† de contact avec la solution de neutralisation.
La taille du réceptacle 1 n'es† pas particulièrement limitée. Des réceptacles 1 trop petits ne permettent pas le traitement de quantités suffisantes de plasmides, alors que des réceptacles 1 remplis par de trop grandes quantités de solution risquent de nécessiter trop de temps de pompage, ce qui es† pénalisant, vu que cela complique, voire empêche le contrôle des différents temps. En effet, les solutions étant pompées une- à-une, il y a une hétérogénéité au début de chaque étape : un temps de pompage trop long va donc causer une double hétérogénéité au niveau des compositions e† des temps de contact.
Les inventeurs on† trouvé que des réceptacles 1 remplis au final (après incorporation des solutions 2+3+5+6) par 5 à 10 litres des solutions étaient très simples à utiliser. Par contre, des réceptacles 1 remplis au final (après incorporation des solutions 2+3+5+6) par 100 litres deviennent trop complexes à contrôler. Ainsi, une taille préférée des volumes utilisables de réceptacles es† comprise entre 1 litres e† 50 litres, de préférence entre 2,5 litres e† 20 litres, de manière encore plus préférée, entre 5 litres e† 10 litres.
Bien évidemment, des réceptacles 1 de contenance plus grande, voire nettement plus grande (que 50 ou 100 litres) peuvent être utilisés, même s'ils ne son† destinés à être remplis au maximum que de 2,5 à 10 litres.
De manière surprenante, les inventeurs ont trouvé que cette hétérogénéité, potentiellement cette double hétérogénéité n'est pas fatale, pour autan† qu'elle soi† contrôlée et/ou qu'elle ne soi† pas excessive.
Par exemple, les inventeurs on† déterminé que le contact entre la suspension cellulaire e† la solution de lyse es† avantageusement compris entre 2 e† 5 minutes. Ainsi, les inventeurs on† déduit que l'ajout des solutions 2 e† 3 peu† se faire en, par exemple, une minute, sans que cela ne cause de problème.
De plus, de préférence, la suspension des cellules 2 e† la solution de lyse 3 son† homogénéisées en amont du réceptacle 1, par exemple via un système de mélange statique 4. Dans le contexte de la présente invention, on entend de préférence par le vocable « mélangeur statique » fou† dispositif qui provoque des turbulences au flux combiné de la suspension des cellules 2 e† de la solution de lyse 3, résultant en une homogénéisation rapide de ce flux combiné. Les inventeurs on† remarqué que ce type de mélange es† avantageux en ce qu'il n'es† pas associé à des forces de cisaillement trop importantes.
La suspension des cellules es†, de préférence, un culot de culture cellulaire qui a été repris dans un tampon TRIS-EDTA ; la suspension es† à une concentration de 10 à 300, de préférence de 50 à 200, de manière encore plus préférée de 75 à 150, tel que environ 100 g/L (poids des cellules :volume total de la suspension).
Ceci permet une première homogénéisation sans l'implication de forces de cisaillement. Vu que les deux solutions son† combinées à ce niveau, l'éventuelle hétérogénéité es† fortement réduite.
De préférence, la solution de lyse 3 es† à un pH compris entre 12,0 e† 12,5, de préférence le pH de la solution de lyse es† fixé par un hydroxyde d'un alcalin.
Ceci permet une lyse rapide e† la dénaturation de l'ADN génomique. L'utilisation d'un hydroxyde alcalin, tel que le NaOH, permet un pH très basique avec un faible pouvoir tampon, ce qui simplifiera d'autan† la neutralisation ultérieure. Cependant, le pH doit être fixé soigneusement au risque, sinon, de ne pas permettre une lyse e† une dénaturation suffisante, ou, au contraire, de dénaturer irréversiblement le plasmide d'intérêt.
De préférence, la solution de lyse 3 comprend en outre un détergent, de préférence 0,1 % en poids de dodécyl sulfate de sodium.
Avantageusement, la solution de neutralisation 5 es† à un pH compris entre 4,5 e† 5,7 ; de préférence cette solution comprend l'acide acétique à une concentration supérieure à 1 M, de manière encore plus préférée, la solution de neutralisation à un pH fixé à environ 5,5 au moyen d'un mélange acide acétique/acétate. Ceci assure à la solution neutralisée (solutions 2, 3 e† 5 combinées) un pH inférieur à 7,0, de préférence inférieur à 6,0 e†, de préférence (logiquement) un pH supérieur à 4,5, de préférence supérieur à 5,0.
De préférence, la suspension comprenant le plasmide reste en présence de la solution de neutralisation pendant au moins 1 minute, par exemple entre 2 et 3 minutes. Des temps trop importants permettent à l'ADN génomique de se renaturer, ce qui est préjudiciable. Ainsi, dans le présent procédé discontinu il est préférable que les solutions de neutralisation 5 e† de précipitation 6 soient ajoutées rapidement. Ainsi, pour les plasmides de taille inférieure à 10 kb, un temps de contact avec la solution de neutralisation entre 20 e† 80 secondes es† avantageux.
Réciproquement, pour des plasmides de taille supérieure à 10 kb, surtout pour ceux qui contiennent des séquences répétées et/ou inversées, un temps de contact avec la solution de neutralisation de 1 à 3 minutes es† préféré. Dans ce cas-ci, le temps d'ajout des solutions 5 e† 6 devient un paramètre qu'il convient de contrôler très finement, idéalement de 30 secondes chacune, au maximum.
Cependant, les débits ne son† pas adaptables avec une liberté totale. Il y a des contraintes physiques de débit, donc de pression à respecter, surtout que (i) le mélange contenant les solutions 2+3+5, ainsi que (ii) la solution 6 son† très visqueux. En outre, il es† préféré d'utiliser des pompes robustes ef/ou d'usage courant, ce qui permet une maintenance efficace. Au besoin, en particulier pour les gros plasmides, les volumes des différentes solutions seront réduits, de manière à assurer que les solutions, en particulier les solutions 5 e† 6 puissent être apportées rapidement (cfrau paragraphe qui précède).
Les pompes péristaltiques son† avantageuses parce que les débits son† bien contrôlés e† qu'elles ne causent pas de cisaillement. Avantageusement, la solution de précipitation 6 comprend un sel de calcium soluble dans l'eau (tel que CaCh) à une concentration comprise entre 3,5 e† 6 M, de préférence environ 5M. Grâce à cette solution concentrée en calcium, la concentration en calcium dans la solution (de suspension) après ajout de la solution de précipitation (solutions 2, 3, 5 et 6 combinées) est d'au moins 0,8 M, par exemple au moins 1 ,0 M, voire d'au moins 1 ,2 M. Les inventeurs préfèrent utiliser une solution de précipitation très concentrée, malgré sa viscosité, de manière à conserver des volumes raisonnables, tou† en assurant une concentration finale en calcium qui soi† suffisante. Une telle concentration finale en calcium (> 0,8 M, voire > IM) permet la précipitation des impuretés, en particulier de l'ARN e† de l'ADN génomique qui n'a pas eu le temps de se renaturer, mais également des protéines e† des endotoxines (si la cellule de départ en synthétise), ou à tou† le moins d'une partie importante des endotoxines.
Avantageusement, la pluralité d'orifices 7 es† un système de tuyauterie percée. Ce système peu† être un simple tuyau percé, un serpentin, ou encore un anneau.
L'avantage de la pluralité d'orifices es† d'injecter la solution de neutralisation 5 et/ou la solution de précipitation 6 en une pluralité d'endroits dans le réceptacle, ce qui abouti† à une pluralité de micro hétérogénéités, plutôt qu'à une hétérogénéité massive. Ceci, couplé à une agitation mécanique douce 9, permet une homogénéisation non- cisaillante e† rapide. Ceci répond au double problème d'hétérogénéité mentionné ci-dessus.
Les inventeurs on† remarqué à leur surprise que ceffe approche permettait une homogénéisation suffisamment rapide des solutions, sans causer les problèmes de cisaillement déjà mentionnés.
Avantageusement, la pluralité d'orifices 7 utilisée pour l'addition de la solution de neutralisation 5 e† la pluralité d'orifices 7 utilisée pour l'addition de la solution de précipitation 6 son† la même pluralité d'orifices 7 : les récipients contenant les solutions de précipitation e† de neutralisation étant connectés en amont du réceptacle 1. Ceci permet de ne pas multiplier les dispositifs, e† permet également de purger l'ensemble de la solution de neutralisation.
Avantageusement, les solutions de neutralisation 5 et/ou de précipitation 6 son† ajoutées substantiellement via le bas du réceptacle 1 , de préférence au moins 30, 40, voire (au moins ou exactement) 50% en poids et/ou volume desdites solutions de neutralisation et/ou de précipitation son† ajoutées dans les 20% du bas dudit réceptacle. Ceci permet une injection contrôlée des solutions e† augmente leurs diffusions. Selon une variante, la solution de neutralisation 5 es† ajoutée substantiellement via le bas du réceptacle 1 , de préférence au moins 30, 40, voire (au moins ou exactement) 50% en poids et/ou volume de la solution de neutralisation 5 son† ajoutées dans les 20% du bas dudit réceptacle e† la solution de précipitation 6 es† ajoutée substantiellement dans le haut du réceptacle 1, de préférence au moins 30, 40, voire (au moins ou exactement) 50% en poids de la solution de précipitation 6 son† ajoutées dans les 20% du haut dudit réceptacle. Ceci peu† se faire en faisan† varier la hauteur du système comprenant la pluralité d'orifices 7, ou en utilisant deux systèmes comprenant la pluralité d'orifices 7 distincts. Selon une seconde variante, la solution de neutralisation 5 es† ajoutée substantiellement dans le haut du réceptacle 1, de préférence au moins 30, 40, voire (au moins ou exactement) 50% en poids de la solution de neutralisation 5 son† ajoutées dans les 20% du haut dudit réceptacle e† la solution de précipitation 6 es† ajoutée substantiellement via le bas du réceptacle 1 , de préférence au moins 30, 40, voire (au moins ou exactement) 50% en poids et/ou volume de la solution de précipitation 6 son† ajoutées dans les 20% du bas dudit réceptacle. Ceci peu† se faire en faisan† varier la hauteur du système comprenant la pluralité d'orifices 7, ou en utilisant deux systèmes comprenant la pluralité d'orifices 7 distincts.
De préférence les débits Ql , Q2, Q3, Q4 et Q5 son† indépendamment compris entre 0,5 L/min e† 25 L/min, plus préférentiellement entre 1 L/min e† 10 L/min.
Les débits Ql , Q2, Q3, Q4 et/ou Q5 peuvent être, indépendamment, constants ; ou les débits Ql , Q2, Q3, Q4 et/ou Q5 peuvent être, indépendamment, variables. Par exemple, les débits Ql , Q2, Q3, Q4 et/ou Q5, de préférence Q3 et/ou Q4, peuvent être augmentés au cours du temps (plus faible au début du pompage, maximal à la fin) de manière à limiter les hétérogénéités lors de l'ajout de ces solutions visqueuses. Une manière avantageuse de procéder à l'augmentation des débits es† de conserver un ratio débit/volume constant, ou substantiellement constant. Indépendamment des débits Ql , Q2, Q3 et/ou Q4 qui peuvent être variables (augmenter au cours du temps), le débit Q5 es†, de préférence, constant. Le soutirage 8 es†, de préférence, très rapide, de manière à éviter que des agrégats ne le perturbent. Ainsi, le débit Q5 es†, de préférence, constant e† maximal. De préférence les débits Ql e† Q2 son† appariés (déterminés ensemble) pour que (i) l'ensemble de la suspension cellulaire 2 e† de la solution de lyse 3 soient pompés en même temps e† (ii) pour que la concentration du mélange (teneur en cellules, pH), par exemple à la sortie du mélangeur statique 4, soi† constante.
Avantageusement, l'agitation douce 9 génère des contraintes de cisaillement insuffisantes que pour cisailler l'ADN plasmidique ou l'ADN génomique de l'hôte.
Ainsi, une étape préliminaire possible consiste en un tes† de l'acceptabilité des contraintes de cisaillement, selon le type de microorganisme, la taille du plasmide à purifier e† les concentrations choisies des solutions.
Un aspect lié de la présente invention es† un procédé de purification du plasmide d'intérêt à partir du surnageant clarifié selon ce qui précède, comprenant les étapes de : une récolte du surnageant clarifié comprenant ledit plasmide, une filtration du surnageant clarifié sur un filtre d'une porosité comprise entre 0,1 e† 0,4 miti, préférentiellement entre 0,15 e† 0,3 miti, de manière favorable autour de 0,2 miti, pour donner une solution filtrée comprenant ledit plasmide, optionnellemen†, une ultrafiltration de la solution filtrée, un polissage par chromatographie sur une résine échangeuse d'anions, de préférence ledit polissage comprenant une étape de lavage du plasmide fixé sur la résine au moyen d'une solution comprenant du Polyoxyéthylène (10) isooctylcyclohexyl éther ; une formulation du plasmide dans une solution finale.
Exemples. -
Il es† bien entendu que la présente invention n'es† en aucune façon limitée aux formes de réalisations décrites ci-dessous et que bien des modifications peuvent y être apportées sans sortir du cadre des revendications annexées.
Exemple comparatif Les inventeurs ont cherché à développer un procédé discontinu « en bouteille ». Pour plus de facilité, les références se feront par rapport à la figure 1 , qui serai† dépourvue des éléments 4 e† 7, ainsi que du système de tuyauterie e† de pompe en amont du récipient 1 . Pour ce faire, 0,3 litre d'une suspension cellulaire concentrée 2 ( 100 g de cellules/litre de milieu Tris-EDTA) produisant un plasmide a été inséré dans le récipient 1 d'une contenance de 2 litres, puis 0,3 litre de la solution de lyse alcaline 3 (NaOH ; pH 12,5 ; SDS 0,1 % en poids) a été ajouté rapidement e† le récipient 1 a été agité manuellement par l'opérateur pendant exactement 90 secondes. Ensuite, 0,6 litre de la solution de neutralisation 5 (AcOH 15% v :v/acétate de potassium 3M, pH compris entre 4,5 e† 5,7) a été ajouté rapidement e† le contenu du récipient 1 a été agité manuellement pendant exactement 90 secondes. Enfin, 0,23 litre de la solution de précipitation 6 (CaCh, 5M) a été ajouté rapidement e† le contenu du récipient 1 a été agité manuellement pendant exactement 90 secondes ; ensuite le mélange a été soutiré en vue d'une clarification par centrifugation.
Les inventeurs n'on† récupéré que 200 mg du plasmide par litre, e† ce plasmide contenait des quantités mesurables d'ADN génomique e† d'ARN, ce qui impose, en pratique, de rajouter une étape de chromatographie, ce qui signifie des coûts additionnels, e† une perte de rendement. En répétant ce procédé manuel dans le bu† de l'améliorer, les inventeurs on† obtenu des rendements qui variaient du simple au double, mais également des teneurs variables en ARN contaminant e† en plasmide sous forme « Open circular », le meilleur rendement étant associé à une teneur accrue en contaminants. Ainsi, le ratio d'ADN plasmidique sous forme déroulée (Open circular) variai† de 7 à 12% ; les valeurs au-dessus de 10% son† considérées comme élevées. En effet, la forme voulue es† celle dite « super enroulée » (Super coiled), e† il es† difficile de réaliser une séparation de ces deux formes par HPLC ou par fou† autre moyen, les deux pics ayant tendance à se chevaucher.
Les inventeurs, face à ces résultats, pensent que l'augmentation des teneurs en contaminants es† due à une application plus marquée des forces de cisaillement lors de cette extraction manuelle, e† que l'intensité de ces forces de cisaillement varie selon les lots (identité de l'opérateur, fatigue éventuelle de l'opérateur).
Exemple 1
Les inventeurs ont eu l'intuition de développer ce système qu'ils considéraient comme peu efficace. Pour ce faire, 1 ,2 litres d'une suspension cellulaire concentrée 2 (100 g de cellules/lifre dans le même milieu Tris-EDTA) contenant le plasmide a été inséré dans le récipient 1 d'une contenance de 10 litres, via une pompe péristaltique en même temps que 1 ,2 litres de la solution de lyse alcaline 3 (NaOH ; pH 12,5 ; SDS 0, 1 % en poids) , ces deux solutions passant dans un mélangeur statique 4. Le temps d'injection était de 30 secondes. Le récipient était sous agitation mécanique 9 lente (non cisaillante) pendant exactement 90 secondes. Ensuite, 2,4 L de la même solution de neutralisation 5 que dans l'exemple comparatif a été ajouté rapidement (débit de 6L/min) par le bas, via une pompe péristaltique e† un anneau de diffusion percé de nombreux orifices 7, et le contenu du récipient 1 a été agité mécaniquement 9, mais de manière non-cisaillanfe, pendant exactement 90 secondes. Enfin, 0,92 L de la solution de précipitation 6 (CaCh, 5M) a été ajoutée rapidement (débit de 2,3 L/min) via une pompe péristaltique et le même dispositif percé d'orifices 7, toujours sous agitation mécanique 9 lente pendant exactement 90 secondes ; ensuite le mélange a été soutiré 8 en vue d'une clarification par centrifugation. Les inventeurs on† récupéré environ 400 mg de plasmide/L, e† ce plasmide ne contenait pas de quantités mesurables d'ADN génomique e† peu d'ARN.
Vu que l'agitation se fai† pendant 90 secondes, les inventeurs concluent que ce dispositif peu† être facilement adapté (volumes, débits) en modifiant un peu la durée de l'agitation.
Exemple 2
Les inventeurs on† ensuite analysé par HPLC le plasmide obtenu par le processus selon l'invention. Celui-ci a permis un rendement d'extraction de 84%, e† une teneur en plasmide « open circular » de seulement 7,2% (donc presque de 93% sous la forme super enroulée (super colied), qui es† la forme préférée. Via HPLC, également, les teneurs en ARN son† très faibles : voir à la figure 2, le premier pic à la gauche représentant les sels résiduels, le second massif de pics représentant l' ARN, e† le double pic représentant le plasmide, le pic de droite, le plus important, étant la forme super enroulée, pour lequel le signal HPLC montré es†, ici, saturé.
Outre ceci, les avantages principaux du procédé selon l'invention portent sur la reproductibilité e† la possibilité de production à plus grande échelle : une pluralité de réacteurs selon l'invention peu† être gérée en parallèle par un seul opérateur, alors que l'agitation manuelle nécessite un opérateur par bouteille, e† ne peu† pas être réalisée à trop forte cadence, au risque, sinon, d'abuser des capacités physiques de l'opérateur, ce qui aura un impact sur la qualité du plasmide.
Exemple 3 - exemple comparatif Les inventeurs ont comparé 4 conditions par rapport à la condition selon l'invention (voir les profils HPLC à la Figure 3).
1. L'anneau de diffusion es† placé au milieu de la bouteille, e† pas dans le bas ; 2. L'anneau de diffusion es† omis ;
3. Le mélangeur statique es† omis ;
4. A la fois l'anneau de diffusion e† le mélangeur statique son† omis.
Une inspection visuelle montre des fortes hétérogénéités dans la partie supérieure des bouteilles pour les conditions #2 e† #3. La condition #4 semble moins affectée par des hétérogénéités, après une simple analyse visuelle. La condition #1 montre des hétérogénéités à un niveau intermédiaire entre le procédé où l'anneau de diffusion es† dans le bas, e† le procédé où l'anneau de diffusion es† déplacé vers le milieu du récipient.
Les paramètres de filtration son† également dégradés, où il a fallu changer les filtres 2 fois pour les conditions #1 e† #4 e† une fois pour la condition #2.
Toutefois, les différences les plus marquées se retrouvent au niveau du rendement, qui chute à 67% pour la condition # 1 , mais à seulement 22,6, 14 e† 30% pour les conditions #2, #3 e† #4. La proportion en plasmides « open circular » es† également en augmentation, à 16% pour la condition #1, 9,9% pour la condition #3 e† 13,7% pour la condition #4. La contamination en ARN (ARN :plasmide) augmente également, sauf pour la condition #3.

Claims

REVENDICATIONS
1. Un procédé d'extraction d'un plasmide synthétisé par un microorganisme comprenant les étapes successives de :
- obtenir un réceptacle (1 ) couplé à une pompe de soutirage (8), ledit réceptacle (1 ) étant muni d'un moyen d'agitation mécanique (9),
- obtenir une suspension cellulaire (2) dudit microorganisme comprenant ledit plasmide à extraire ;
- adjoindre à ladite suspension cellulaire (2) une solution de lyse alcaline (3) à un débit prédéterminé Q1 de manière à former un mélange homogène ;
- placer à un débit prédéterminé Q2 ledit mélange homogène dans ledit réceptacle ( 1 ) ;
- après un temps prédéterminé, de préférence sous agitation douce, y ajouter à un débit prédéterminé Q3 une solution de neutralisation (5) comprenant de l'acide acétique dans ledit réceptacle, via une pluralité d'orifices (7) ;
- après un temps prédéterminé, y ajouter à un débit prédéterminé Q4 une solution de précipitation (6) dans ledit réceptacle, via une pluralité d'orifices (7) ;
- après un temps prédéterminé sous agitation douce, soutirer la suspension ainsi formée via ladite pompe de soutirage (8) à un débit prédéterminé Q5, puis
- clarifier, de préférence centrifuger, ledit mélange soutiré de manière à récupérer le surnageant clarifié, comprenant ledit plasmide d 'inféré†.
2. Le procédé selon la revendication 1 dans lequel la suspension des cellules (2) et la solution de lyse (3) sont homogénéisées en amont du réceptacle via un système de mélange statique (4).
3. Le procédé selon la revendication 1 ou 2, dans lequel la solution de lyse (3) est à un pH compris entre 12,0 et 12,5, de préférence dans lequel le pH es† fixé par un hydroxyde d'un alcalin.
4. Le procédé selon la revendication 3, dans lequel la solution de lyse (2) comprend en outre un détergent, de préférence 0,1% en poids de dodécyl sulfate de sodium. 5. Le procédé selon une quelconque des revendications précédentes dans lequel la solution de neutralisation (5) es† à un pH compris entre 4,
5 e† 5,7.
6. Le procédé selon une quelconque des revendications précédentes dans lequel la solution de neutralisation (5) comprend de l'acide acétique à une concentration supérieure à 1 M, de préférence dans lequel la solution de neutralisation à un pH fixé au moyen d'un mélange acide acétique/acétate.
7. Le procédé selon une quelconque des revendications précédentes dans lequel la solution neutralisée a un pH inférieur à 7,0, de préférence inférieur à 6,0 e†, de préférence un pH supérieur à 4,5, de préférence supérieur à 5,0.
8. Le procédé selon une quelconque des revendications précédentes dans lequel la solution de précipitation (6) comprend un sel de calcium soluble dans l'eau à une concentration comprise entre 3,5 e† 6 M, de préférence environ 5M.
9. Le procédé selon la revendication 8 dans lequel la concentration en calcium dans la solution après ajout de la solution de précipitation es† d'au moins 0,8 M, de préférence au moins 1,0 M, de manière encore plus préférée d'au moins 1,2 M.
10. Le procédé selon une quelconque des revendications précédentes dans lequel la pluralité d'orifices (7) es† un système de tuyauterie percée.
11. Le procédé selon une quelconque des revendications précédentes dans lequel la pluralité d'orifices (7) utilisée pour l'addition de la solution de neutralisation e† la pluralité d'orifices (7) utilisée pour l'addition de la solution de précipitation son† la même pluralité d'orifices (7).
12. Le procédé selon une quelconque des revendications précédentes dans lequel les solutions de neutralisation (5) et/ou de précipitation (6) son† ajoutées substantiellement dans le bas du réceptacle (1), de préférence au moins 50% en poids desdites solutions de neutralisation et/ou de précipitation son† ajoutées dans les 20% du bas dudit réceptacle.
13. Le procédé selon une quelconque des revendications précédentes dans lequel les débits Ql, Q2, Q3, Q4 e† Q5 son† indépendamment compris entre 0,5 L/min e† 25 L/min, plus préférentiellement entre 1 L/min e† 10 L/min, voire entre 2 L/min e† 8 L/min.
14. Le procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel l'agitation douce génère des contraintes de cisaillement insuffisantes pour cisailler l'ADN plasmidique ou l'ADN génomique de l'hôte.
15. Le procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel les solutions son† ajoutées et/ou soutirées par une ou des pompe(s) péristaltique(s).
16. Procédé de purification du plasmide d'intérêt à partir du surnageant clarifié selon l'une quelconque des revendications précédentes, comprenant les étapes de :
- une récolte du surnageant clarifié comprenant ledit plasmide, - une filtration du surnageant clarifié sur un filtre d'une porosité comprise entre 0,1 et 0,4 mΐti, préférentiellement entre 0,15 et 0,3 mΐti, de manière favorable autour de 0,2 mΐΎΊ, pour donner une solution filtrée comprenant ledit plasmide,
- optionnellement, une ultrafiltration de la solution filtrée,
- un polissage par chromatographie sur une résine échangeuse d'anions, de préférence ledit polissage comprenant une étape de lavage du plasmide fixé sur la résine au moyen d'une solution comprenant du
Polyoxyéthylène (10) isooctylcyclohexyl éther ;
- une formulation du plasmide dans une solution finale.
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