KR20240027805A - 자동화된 플라스미드 추출 - Google Patents

Abstract

본 발명은 미생물로부터 플라스미드를 불연속적으로 추출하고 중화 용액을 첨가한 다음 복수의 구멍을 통해 침전 용액을 첨가하여 부드러운 기계적 교반을 통해 관심 플라스미드를 정제하는 방법을 개시한다.

Description

자동화된 플라스미드 추출

본 발명은 박테리아에 의해 생산되는 관심 플라스미드의 자동화된 추출에 관한 것이다.

대장균과 같은 박테리아에서 관심 플라스미드를 생산하는 방법은 알칼리 용해 후 중화 및 침전 단계를 거치는 것으로 알려져 있다(예를 들면, Birnboim 및 Dolly, 1979, Nucleic Acids Research, 7, 1513-1523 페이지).

이 방법은 실행이 간단하고 배치 모드에서 잘 작동하며, 최대 그램 단위와 같은 소량의 플라스미드를 생산하는 데 적합하다.

출원 특허 WO 2010/136503(EP2435569B1, US8,822,672 및 US 9,416,400에도 공개됨)은 다양한 용액과 이들의 혼합물을 위한 배관 배열 시스템과 펌프를 통한 유량 제어에 기반한 연속 플라스미드 추출 방법을 기술한다. 일반적으로 아세트산/아세트산염 완충액으로 구성된 중화 용액 외에도, 이 방법은 농축된 침전 용액을 추가로 공급한다. 중화 용액과 침전 용액은 배관의 내부 직경을 조정하여 균일하게 혼합되어 국소적으로 벤츄리 효과(Venturi effect)를 생성한다. 실제로, 이 출원 특허의 발명자는 벤츄리 효과를 통한 혼합과 달리, 이러한 대량의 점성 용액에 대해 기계적 교반이 불가능하며, 이는 게놈 DNA와 심지어 플라스미드까지 전단할 위험이 있어 허용되지 않는다고 언급했다. 또한, 이 시스템은 일회용 시스템이기 때문에 세척이 필요하지 않다는 장점이 있다. 그러나, 이 시스템은 매우 많은 양의 플라스미드, 예를 들어 100 g의 플라스미드를 정제하는 데는 매우 효과적이지만, 정제할 플라스미드의 양이 적을 경우 상당한 비용의 고정 비용(일회용 장치, 플라스미드 손실)이 발생한다.

따라서, 배치 방법(batch method)으로 처리할 수 없는 다양한 수량이 있고, 두 가지 접근 방식이 각각의 응용 분야에서 잘 작동하더라도 상기에 요약된 연속 방법으로는 매우 효율적으로 처리할 수 없다.

실제로, 배치 모드에서 시스템의 효율성은 용기의 크기, 용액을 접촉시키는 데 걸리는 시간, 심지어 신속한 균질화의 필요성과 같은 물리적 매개변수에 의해 제한된다. 따라서, 배치 모드에서는 적은 양을 사용하여 이상적인 정제가 이루어지므로 혼합물을 잘 제어할 수 있지만, 대규모로 생산할 경우 상당히 복잡해진다.

본 발명은 다음의 연속적인 단계를 포함하는 미생물에 의해 합성된 플라스미드를 추출하는 방법에 관한 것이다:

추출 펌프(8)에 결합된 용기(1)를 획득하는 단계, 여기서 상기 용기(1)는 기계적 교반 수단(9)을 구비함,

추출될 상기 플라스미드를 포함하는 상기 미생물의 세포 현탁액(2)을 획득하는 단계;

상기 세포 현탁액(2)에 소정의 유속(Q1)으로 알칼리성 용해 용액(lysis solution)(3)을 첨가하여 균질한 혼합물을 형성하는 단계;

상기 균질한 혼합물을 상기 용기(1) 내에 소정의 유속(Q2)으로 배치하는 단계;

소정의 시간 후에, 바람직하게는 부드럽게 교반하면서, 복수의 구멍(7)을 통해 상기 용기 내에 아세트산을 포함하는 중화 용액(5)을 소정의 유속(Q3)으로 첨가하는 단계;

소정의 시간 후에, 복수의 구멍(7)을 통해 상기 용기 내의 침전 용액(6)을 소정의 유속(Q4)으로 추가하는 단계;

부드럽게 교반하면서 소정의 시간 후에, 상기 추출 펌프(8)를 통해 형성된 현탁액을 소정의 유속(Q5)으로 추출한 다음, 상기 추출된 혼합물을 정화, 바람직하게는 원심분리하여, 상기 관심 플라스미드를 포함하는 정화된 상청액을 회수하는 단계.

이렇게 추출 및 정제된 플라스미드는 직접 사용하거나 멸균 여과, 한외 여과 및/또는 연마 크로마토그래피 후에 사용하는 것이 유리하다.

도 1은 본 발명에 의한 용기의 반도식 도면이다.
도 2는 본 발명에 의한 자동화된 방법으로 추출한 플라스미드의 HPLC 분석을 나타낸다.
도 3은 바람직한 자동화된 방법에 대한 변형 #1, #2, #3 및 #4의 효과를 나타낸다.

본 발명자들은 배치 모드 방법의 유연성을 유지하면서 대량의 플라스미드를 처리할 수 있고 추출 수율과 순도 수준이 매우 높은 플라스미드 추출 방법을 개발하는 데 성공하였다.

본 발명의 첫 번째 측면은 다음의 연속 단계를 포함하는 합성 플라스미드를 추출하는 방법이다:

추출 펌프(8)에 결합된 용기(1)를 획득하는 단계, 여기서 상기 용기(1)는 기계적 교반 수단(9)을 구비함,

추출될 상기 플라스미드를 포함하는 상기 미생물의 세포 현탁액(2)을 획득하는 단계;

상기 세포 현탁액(2)에 소정의 유속 Q1으로 알칼리성 용해 용액(3)을 첨가하여 균질한 혼합물을 형성하는 단계;

상기 균질한 혼합물을 상기 용기(1) 내에 소정의 유속 Q2로 배치하는 단계;

소정의 시간 후에, 바람직하게는 부드럽게 교반하면서, 복수의 구멍(7)을 통해 상기 용기 내에 아세트산을 포함하는 중화 용액(5)을 소정의 유속 Q3으로 첨가하는 단계;

소정의 시간 후에, 복수의 구멍(7)을 통해 상기 용기 내의 침전 용액(6)을 소정의 유속 Q4로 첨가하는 단계;

부드럽게 교반하면서 소정의 시간 후에, 상기 추출 펌프(8)를 통해 형성된 현탁액을 소정의 유속 Q5로 추출한 다음, 상기 추출된 혼합물을 정화, 바람직하게는 원심분리하여, 상기 관심 플라스미드를 포함하는 정화된 상청액을 회수하는 단계.

관심 플라스미드를 합성하는 세포는 일반적으로 대장균과 같은 그람 음성 박테리아이다. 그러나, 다른 그람 음성 박테리아 또는 심지어 그람 양성 박테리아 또는 심지어 사카로미세스 종(Saccharomyces Sp.)이나 피치아 종(Pichia Sp.)과 같은 다른 미생물에도 적합할 수 있다

플라스미드는 소위 '슈퍼 코일(super coiled)' 형태가 유리하다.

이 방법은 대형 플라스미드에서도 작동하므로 플라스미드의 크기는 제한 요소가 아니다. 그러나, 나중에 설명하겠지만, 크기가 더 큰 플라스미드(예: 10 kb 초과, 예를 들어, 10 내지 20 kb의, 바이러스 벡터를 코딩하거나 반복 및/또는 반전된 서열을 포함하는 플라스미드 포함)는 특히 알칼리성 용해 매질과의 접촉 시간 및 중화 용액과의 첨가 및 접촉 시간과 관련하여 보다 정밀한 타이밍 제어를 필요로 한다.

용기(1)의 크기는 특별히 제한되지 않는다. 너무 작은 용기(1)는 충분한 양의 플라스미드를 처리할 수 없는 반면, 지나치게 많은 양의 용액으로 채워진 용기(1)는 너무 많은 펌핑 시간을 필요로 할 위험이 있으며, 이는 다른 시간 제어를 복잡하게 하거나 심지어 방해하기 때문에 불리하다. 실제로, 용액이 하나씩 펌핑되기 때문에 각 단계가 시작될 때 이질성이 발생하며, 너무 오래 펌핑하면 조성 및 접촉 시간 측면에서 이중적 이질성이 발생할 수 있다.

본 발명자들은 최종적으로(용액 2+3+5+6의 혼합 후) 용기(1)에 5 내지 10 리터의 용액을 채우면 매우 쉽게 사용할 수 있다는 사실을 발견했다. 반면, 최종적으로(용액 2+3+5+6의 혼합 후) 용기(1)에 100 리터를 채우면 제어하기가 너무 어려웠다. 따라서, 사용 가능한 용기 부피의 바람직한 크기는 1 리터 내지 50 리터, 바람직하게는 2.5 리터 내지 20 리터, 더욱 바람직하게는 5 리터 내지 10 리터이다.

확실히, 최대 2.5 리터 내지 10 리터까지만 채울 수 있는 용량이더라도, 이보다 크거나 훨씬 큰 용량(50 리터 또는 100 리터 초과)의 용기(1)를 사용할 수 있다.

놀랍게도, 본 발명자들은 이러한 이질성, 잠재적으로 이중적 이질성이 통제되거나 과도하지 않다면 치명적이지 않다는 사실을 발견했다.

예를 들어, 본 발명자들은 세포 현탁액과 용해 용액 사이의 접촉 시간이 유리하게는 2분 내지 5분 이라는 것을 확인했다. 따라서, 본 발명자들은 용액 2와 3을, 예를 들어 1분 안에 아무런 문제 없이 첨가할 수 있다고 추론했다.

또한, 바람직하게는 세포 현탁액(2) 및 용해 용액(3)은, 예를 들어 정적 혼합 시스템(4)을 통해 용기(1)의 상부에서 균질화된다.

본 발명의 맥락에서, "정적 혼합기"라는 용어는 세포 현탁액(2)과 용해 용액(3)의 결합 흐름에 난류를 유발하여 이 결합 흐름의 신속한 균질화를 초래하는 임의의 장치를 의미하는 것으로 이해되는 것이 바람직하다. 본 발명자들은 이러한 유형의 혼합물이 지나치게 높은 전단력과 관련되지 않는다는 점에서 유리하다는 것에 주목했다.

세포 현탁액은 바람직하게는 TRIS-EDTA 완충액에서 흡수된 세포 배양 펠릿이며, 현탁액은 10 내지 300, 바람직하게는 50 내지 200, 더욱 바람직하게는 75 내지 150, 예를 들어 약 100 g/L(세포의 무게: 현탁액의 총 부피)의 농도이다.

이를 통해 전단력의 개입 없이 초기 균질화가 가능하다. 두 용액이 이 수준에서 결합되기 때문에 잠재적인 이질성이 크게 감소한다.

바람직하게는, 용해 용액(3)의 pH는 12.0 내지 12.5이며, 용해 용액의 pH는 알칼리성 수산화물에 의해 고정되는 것이 바람직하다.

이를 통해 게놈 DNA의 신속한 용해 및 변성이 가능하다. NaOH와 같은 알칼리성 수산화물을 사용하면 완충 용량이 낮은 높은 염기성 pH를 유지할 수 있어 후속되는 중화를 간소화할 수 있다. 그러나, pH를 신중하게 고정하지 않으면 충분한 용해와 변성을 허용하지 않거나, 반대로 관심 플라스미드가 비가역적으로 변성될 위험이 있다.

바람직하게는, 용해 용액(3)은 세제, 바람직하게는 0.1 중량% 의 도데실황산나트륨을 더 포함한다.

유리하게는, 중화 용액(5)은 4.5 내지 5.7의 pH를 가지며, 이 용액은 바람직하게는 1 M 초과의 농도의 아세트산을 포함하고, 더욱 바람직하게는, 중화 용액은 아세트산/아세테이트 혼합물에 의해 약 5.5로 고정된 pH를 갖는다. 이것은 중화 용액(용액 2, 3 및 5를 합한 것)은 7.0보다 낮고, 바람직하게는 6.0보다 낮으며, 바람직하게는(논리적으로) 4.5보다 높고, 바람직하게는 5.0보다 높은 pH를 갖도록 보장한다.

플라스미드를 포함하는 현탁액은 적어도 1분 동안, 예를 들어 2분 내지 3분 동안 중화 용액의 존재 하에 유지되는 것이 바람직하다. 접촉 시간이 지나치게 길면 게놈 DNA가 재형성될 수 있으며, 그리고 이것는 해롭다. 따라서, 이 배치 공정에서는 중화 용액(5)와 침전 용액(6)을 빠르게 첨가하는 것이 바람직하다.

따라서, 크기가 10 kb 미만인 플라스미드의 경우, 중화 용액과의 접촉 시간은 20초 내지 80초가 유리하다.

반대로, 크기가 10 kb보다 큰 플라스미드의 경우, 특히 반복 및/또는 반전된 서열을 포함하는 플라스미드의 경우, 중화 용액과의 접촉 시간은 1분 내지 3분이 바람직하다. 이 경우, 용액 5와 6을 추가하는 시간은 매우 신중하게 제어해야 하는 매개변수가 되며, 최대 각각 30초가 가장 이상적이다.

그러나, 유속을 완전히 자유롭게 적용할 수는 없다. 특히 (i) 용액 2+3+5를 포함하는 혼합물과, (ii) 용액 6은 점성이 매우 높기 때문에, 물리적 유량 제약, 따라서 압력 제약이 존재하므로 이를 준수해야 한다. 또한, 효율적인 유지 보수를 위해 견고하고/또는 일반적으로 사용되는 펌프를 사용하는 것이 바람직하다. 필요한 경우, 특히 큰 플라스미드의 경우, 용액, 특히 용액 5와 6을 빠르게 첨가할 수 있도록 다른 용액의 부피를 줄일 수 있다(위 단락 참조).

연동 펌프는 유속이 잘 제어되고 전단을 일으키지 않기 때문에 유리하다.

유리하게는, 침전 용액(6)은 3.5 내지 6 M, 바람직하게는 약 5 M 농도의 수용성 칼슘염(예를 들어, CaCl₂)을 포함한다.

이러한 농축된 칼슘 용액 때문에, 침전 용액(용액 2, 3, 5 및 6을 합한 것)을 첨가한 후 (현탁) 용액 내의 칼슘 농도는 적어도 0.8 M, 예를 들어 적어도 1.0 M 또는 적어도 1.2 M이다. 본 발명자들은 충분한 최종 칼슘 농도를 보장하면서 합리적인 용량를 유지하기 위해 점도에도 불구하고 매우 농축된 침전 용액을 사용하는 것을 선호한다. 이러한 최종 칼슘 농도(0.8 M 초과, 또는 심지어 1 M 초과)는 불순물, 특히 변성될 시간이 없는 RNA 및 게놈 DNA뿐만 아니라 단백질 및 내독소(시작 세포가 이를 합성하는 경우) 또는 적어도 내독소의 상당 부분의 침전을 허용한다.

유리하게는, 복수의 구멍(7)는 천공된 배관 시스템이다. 이 시스템은 단순한 천공 파이프, 코일, 또는 심지어 링일 수 있다.

복수의 구멍의 장점은 중화 용액(5) 및/또는 침전 용액(6)을 용기 내의 복수의 위치로 주입하여 대량의 이질성이 아닌 복수의 미세 이질성을 초래한다는 것이다. 이는 부드러운 기계적 교반(9)과 결합하여 전단되지 않고 신속한 균질화를 가능하게 한다. 이는 위에서 언급한 이질성의 이중 문제에 대응한다.

본 발명자들은 이러한 접근이 위에서 언급한 전단 문제를 일으키지 않으면서도 용액을 충분히 빠르게 균질화할 수 있다는 사실에 놀랐다.

유리하게는, 중화 용액(5)의 첨가에 사용되는 복수의 구멍(7)과 침전 용액(6)의 첨가에 사용되는 복수의 구멍(7)은 동일한 복수의 구멍(7)이며, 침전 용액 및 중화 용액을 포함하는 용기는 용기(1)의 상부에 연결된다. 이렇게 하면 여러 개의 장치가 필요하지 않고, 또한 모든 중화 용액을 퍼지할 수 있다.

유리하게는, 중화 용액(5) 및/또는 침전 용액(6)은 용기(1)의 바닥을 통해 실질적으로 첨가되며, 바람직하게는 상기 중화 및/또는 침전 용액의 중량 및/또는 부피에 의해 적어도 30, 40 또는 심지어 (적어도 또는 정확히) 50%가 상기 용기의 바닥의 20%에 첨가된다. 이를 통해 용액의 주입을 제어하고 용액의 확산을 증가시킬 수 있다.

제1 변형에 따르면, 중화 용액(5)은 용기(1)의 바닥을 통해 실질적으로 첨가되고, 바람직하게는 중화 용액(5)의 중량 및/또는 부피의 적어도 30, 40 또는 심지어 (적어도 또는 정확히) 50%가 상기 용기의 바닥의 20%에 첨가되고, 침전 용액(6)은 용기(1)의 상단에 실질적으로 첨가되고, 바람직하게는 침전 용액(6)의 중량 중 적어도 30, 40 또는 심지어 (적어도 또는 정확히) 50%가 상기 용기의 상단의 20%에 첨가된다. 이는 복수의 구멍(7)을 포함하는 시스템의 높이를 변경시키거나, 복수의 개별 구멍(7)울 포함하는 두 개의 시스템을 사용함으로써 수행될 수 있다.

제2 변형에 따르면, 중화 용액(5)은 용기(1)의 상부에 실질적으로 첨가되고, 바람직하게는 중화 용액(5)의 적어도 30, 40 또는 심지어 (적어도 또는 정확히) 50 중량%가 상기 용기의 상부의 20%에 첨가되고, 침전 용액(6)은 용기(1)의 하부를 통해 실질적으로 첨가되며, 바람직하게는 침전 용액(6)의 적어도 30, 40 또는 심지어 (적어도 또는 정확히) 50 중량%가 상기 용기의 하부의 20%에 첨가된다. 이는 복수의 구멍(7)을 포함하는 시스템의 높이를 변경시키거나, 복수의 개별 구멍(7)을 포함하는 두 개의 시스템을 사용함으로써 수행될 수 있다.

바람직하게는, 유속 Q1, Q2, Q3, Q4 및 Q5는 독립적으로 0.5 L/분 내지 25 L/분이고, 더 바람직하게는 1 L/분 내지 10 L/분이다.

유속 Q1, Q2, Q3, Q4 및/또는 Q5는, 독립적으로, 일정할 수 있고, 또는 유속 Q1, Q2, Q3, Q4 및/또는 Q5는, 독립적으로, 가변적일 수 있다. 예를 들어, 이들 점성 용액을 추가할 때 이질성을 제한하기 위해 유속 Q1, Q2, Q3, Q4 및/또는 Q5, 바람직하게는 Q3 및/또는 Q4는 시간에 따라 증가될 수 있다(펌핑이 시작될 때 가장 낮고 펌핑이 완료될 때 가장 높음). 유속을 증가시키는 유리한 방법은 유량/부피 비율을 일정하거나 실질적으로 일정하게 유지하는 것이다. 가변적(시간에 따라 증가)일 수 있는 유속 Q1, Q2, Q3 및/또는 Q4와 관계 없이, 유속 Q5는 일정한 것이 바람직하다. 추출(8)은 응집체가 이를 방해하는 것을 방지하기 위해 매우 빠른 것이 바람직하다. 따라서, 유속 Q5는 일정하고 가장 빠른 것이 바람직하다. 유속 Q1 및 유속 Q2는 (i) 모든 세포 현탁액(2) 및 용해 용액(3)이 동시에 펌핑되고, (ii) 예를 들어, 정적 혼합기(4)의 출구에서 혼합물의 농도(세포 내 함량, pH)가 일정하도록 일치하는 것이 바람직하다(함께 결정하는 것).

유리하게는, 부드럽게 교반(9)하면 숙주로부터 플라스미드 DNA 또는 게놈 DNA를 전단하기에 충분한 전단 응력이 생성된다.

따라서, 가능한 예비 단계는 미생물의 유형, 정제될 플라스미드의 크기 및 용액의 선택된 농도에 따라 전단 응력의 수용 가능성을 테스트하는 것으로 구성된다.

본 발명의 관련된 측면은 상기에 따라 정화된 상청액으로부터 관심 플라스미드를 정제하는 방법으로, 다음의 단계를 포함한다:

상기 플라스미드를 포함하는 상기 정화된 상청액을 채취하는 단계,

상기 플라스미드를 포함하는 여과된 용액을 얻기 위해 0.1 내지 0.4 ㎛, 바람직하게는 0.15 내지 0.3 ㎛, 바람직하게는 약 0.2 ㎛의 다공성을 갖는 필터 상에서 상기 정화된 상청액을 여과하는 단계,

선택적으로, 여과된 용액을 한외 여과하는 단계,

음이온 교환 수지 상에서 크로마토그래피 연마하는 단계, 바람직하게는, 상기 연마는 폴리옥시에틸렌(10) 이소옥틸시클로헥실 에테르를 포함하는 용액에 의해 수지에 고정된 상기 플라스미드를 세척하는 단계를 포함함,

상기 플라스미드를 최종 용액에 제형화하는 단계.

실시예들

본 발명은 상술한 실시예에 한정되지 않으며, 첨부된 청구 범위의 범위를 벗어나지 않으면서도 많은 수정이 이루어질 수 있음이 이해된다.

비교예

본 발명자들은 "병 내" 배치 방법을 개발하고자 했다. 참조의 편의를 위해, 요소 4와 7이 없는 도 1과 용기(1)의 상부에 있는 배관 및 펌프 시스템을 참조한다. 이를 위해, 플라스미드를 생성하는 농축 세포 현탁액(2)(세포 100 g/L Tris-EDTA 배지) 0.3 리터를 2 리터 용량의 용기(1)에 넣은 다음, 알칼리성 용해 용액(3)(NaOH, pH 12.5, SDS 0.1 중량%)을 빠르게 첨가하고 용기(1)를 작업자가 정확히 90초 동안 수동으로 교반했다. 그런 다음, 0.6 리터의 중화 용액(5)(AcOH 15%, v:v/3M 아세트산칼륨, pH 4.5~5.7)을 빠르게 첨가하고 용기(1)의 내용물을 정확히 90초 동안 수동으로 교반했다. 마지막으로, 0.23 리터의 침전 용액(6)(CaCl₂, 5 M)을 빠르게 첨가하고 용기(1)의 내용물을 정확히 90초 동안 수동으로 교반한 다음, 원심분리를 통해 혼합물을 추출하여 정화했다.

본 발명자들은 리터당 200 mg의 플라스미드만 회수했으며, 이 플라스미드에는 측정 가능한 양의 게놈 DNA와 RNA가 포함되어 있어, 실제로 크로마토그래피 단계를 추가해야 하므로 추가 비용과 수율 손실이 발생했다. 본 발명자들은 이 수동 방법을 개선하기 위해 이 방법을 반복하여 단일에서 두 배까지 다양한 수율을 얻었지만, 오염 RNA와 "개방형 원형(Open circular)" 형태의 플라스미드의 함량도 다양했으며, 최고 수율은 오염 물질의 함량이 증가함에 따라 달라졌다. 따라서, 개방형 원형 형태의 플라스미드 DNA의 비율은 7에서 12%까지 다양했으며, 10% 초과의 값은 높은 것으로 간주된다. 실제로, 원하는 형태는 소위 "슈퍼 코일" 형태이며, 두 세포가 겹치는 경향이 있기 때문에 HPLC 또는 다른 방법으로 이 두 형태를 분리하기가 어렵다.

이러한 결과에 직면한 본 발명자들은 오염 물질 수준의 증가는 이 수동 추출 중에 전단력이 더 많이 적용되고, 이러한 전단력의 강도가 배치(작업자의 신분, 작업자의 잠재적 피로 수준)에 따라 달라지기 때문이라고 생각한다.

실시예 1

본 발명자들은 비효율적이라고 생각한 이 시스템을 개발할 아이디어를 가지고 있었다. 이를 위해 플라스미드가 포함된 1.2 리터의 농축 세포 현탁액(2)(동일한 Tris-EDTA 배지에 세포 100 g/L)을 연동 펌프를 통해 10 리터 용량의 용기(1)에 알칼리성 용해 용액(3)(NaOH, pH 12.5, SDS 0.1 중량%)과 동시에 삽입하고, 이 두 용액을 정적 믹서(4)를 통해 통과시켰다. 주입 시간은 30초였다. 용기에 정확히 90초 동안 느리게 기계적 교반(9)(비전단)을 실시했다. 그런 다음, 비교예에서와 동일한 중화 용액(5) 2.4 L를 연동 펌프와 수많은 구멍(7)으로 천공된 확산 링을 통해 바닥에서 빠르게(유속 6 L/분) 추가하고, 용기(1)의 내용물을 기계적이지만 비전단 방식으로 정확히 90초 동안 교반하였다. 마지막으로, 0.92 L의 침전 용액(6)(CaCl₂, 5 M)을 연동 펌프와 구멍(7)으로 천공된 동일한 장치를 통해 빠르게(유속 2.3 L/분) 첨가하고, 여전히 정확히 90초 동안 느린 기계적 교반(9)을 한 다음, 혼합물을 추출(8)하고 원심분리하여 정화했다.

본 발명자들은 약 400 mg의 플라스미드/L를 회수했으며, 이 플라스미드에는 측정 가능한 양의 게놈 DNA가 포함되어 있지 않았고 RNA는 거의 포함되어 있지 않았다.

교반이 90초 동안 수행되기 때문에 본 발명자들은 교반 시간을 약간 수정하여 이 장치를 쉽게 조정(부피, 유량)할 수 있다고 결론지었다 .

실시예 2

그런 다음, 본 발명자들은 본 발명에 따른 방법으로 얻은 플라스미드를 HPLC로 분석했다. 그 결과 84%의 추출 수율과 7.2%에 불과한 "개방형 원형" 플라스미드 함량(따라서 슈퍼 코일 형태에서는 거의 93%)을 얻을 수 있었는데, 이것은 선호되는 형태이다. 또한, HPLC를 통해 RNA 함량이 매우 낮다. 도 2를 참조하면, 왼쪽의 첫 번째 피크는 잔류 염을 나타내고, 두 번째 피크 세트는 RNA를 나타내며, 이중 피크는 플라스미드를 나타내며, 오른쪽 피크는 가장 큰 것으로 슈퍼코일 형태이며, 여기에서 HPLC 신호는 포화 상태를 보여준다.

이 외에도, 본 발명에 따른 방법의 주요 장점은 재생력 및 대규모 생산 가능성에 관한 것으로, 본 발명에 따른 복수의 반응기는 단일 작업자에 의해 병렬로 관리 될 수 있는 반면, 수동 교반은 병당 한 명의 작업자가 필요하며 너무 빨리 수행 할 수 없다.

실시예 3 - 비교예

발명자들은 4가지 조건을 본 발명에 따른 조건과 비교했다(도 3의 HPLC 프로파일 참조).

1. 확산 링은 병의 바닥이 아닌 중앙에 배치된다;

2. 확산 링이 생략된다;

3. 정적 믹서가 생략된다;

4. 확산 링과 정적 믹서가 모두 생략된다.

육안 검사 결과 2번과 3번 조건의 경우 병 윗부분에 강한 이질성이 나타난다. 조건 #4는 간단한 육안 분석 결과 이질성의 영향을 덜 받는 것으로 보인다. 조건 #1은 확산 링이 하단에 있는 방식과 확산 링이 용기 중앙으로 이동한 방식 간에 중간 수준의 이질성을 보여준다.

여과 매개변수도 감소하여, 조건 #1과 #4의 경우 필터를 두 번, 조건 #2의 경우 한 번만 교체하면 되었다.

그러나, 가장 큰 차이는 수율에서 발견되는데, 조건 #1의 경우 67%까지 떨어지지만 조건 #2, #3 및 #4의 경우 22.6%, 14% 및 30%에 불과하다. "개방형 원형" 플라스미드의 비율도 조건 #1의 경우 16%, 조건 #3의 경우 9.9%, 조건 #4의 경우 13.7%로 증가한다. RNA 오염(RNA: 플라스미드)도 또한 조건 #3을 제외하고 증가한다.

Claims (16)

1. 하기 연속적인 단계를 포함하는 미생물에 의해 합성되는 플라스미드를 추출하는 방법은,
   - 추출 펌프(8)에 결합된 용기(1)를 획득하는 단계, 여기서 상기 용기(1)는 기계적 교반 수단(9)을 구비함,
   - 추출될 상기 플라스미드를 포함하는 상기 미생물의 세포 현탁액(2)을 획득하는 단계;
   - 상기 세포 현탁액(2)에 소정의 유속 Q1으로 알칼리성 용해 용액(3)을 첨가하여 균질한 혼합물을 형성하는 단계;
   - 상기 균질한 혼합물을 상기 용기(1) 내에 소정의 유속 Q2로 배치하는 단계;
   - 소정의 시간 후에, 바람직하게는 부드럽게 교반하면서, 복수의 구멍(7)을 통해 상기 용기 내에 아세트산을 포함하는 중화 용액(5)을 소정의 유속 Q3으로 첨가하는 단계;
   - 소정의 시간 후에, 복수의 구멍(7)을 통해 상기 용기 내의 침전 용액(6)을 소정의 유속 Q4로 첨가하는 단계;
   - 부드럽게 교반하면서 소정의 시간 후에, 상기 추출 펌프(8)를 통해 형성된 현탁액을 소정의 유속 Q5로 추출한 다음,
   - 상기 추출된 혼합물을 정화, 바람직하게는 원심분리하여, 상기 관심 플라스미드를 포함하는 정화된 상청액을 회수하는 단계를 포함하는, 방법.
2. 제1항에 있어서,
   상기 세포 현탁액(2) 및 용해 용액(3)이 정적 혼합 시스템(4)을 통해 상기 용기의 상부에서 균질화되는, 방법.
3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
   상기 용해 용액(3)은 12.0 내지 12.5의 pH를 가지며, 바람직하게는 상기 pH가 알칼리의 수산화물에 의해 고정되는, 방법.
4. 제3항에 있어서,
   상기 용해 용액(3)은 세제, 바람직하게는 0.1 중량%의 도데실황산나트륨을 더 포함하는, 방법.
5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
   상기 중화 용액(5)은 4.5 내지 5.7의 pH를 갖는, 방법.
6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
   상기 중화 용액(5)은 1 M 초과의 농도의 아세트산을 포함하는, 바람직하게는 상기 중화 용액은 아세트산/아세트산염 혼합물에 의해 고정된 pH를 갖는, 방법.
7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
   상기 용액은 pH 7.0 미만, 바람직하게는 pH 6.0 미만, 바람직하게는 pH 4.5 초과, 바람직하게는 pH 5.0 초과로 중화되는, 방법.
8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
   상기 침전 용액(6)은 3.5 내지 6 M, 바람직하게는 약 5 M의 농도의 수용성 칼슘염을 포함하는, 방법.
9. 제8항에 있어서,
   상기 침전 용액을 첨가한 후 상기 용액 내의 칼슘 농도는 적어도 0.8 M, 바람직하게는 적어도 1.0 M, 더욱 바람직하게는 적어도 1.2 M인, 방법.
10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 복수의 구멍(7)은 천공된 배관 시스템인, 방법.
11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 중화 용액의 첨가에 사용되는 상기 복수의 구멍(7)과 상기 침전 용액의 첨가에 사용되는 상기 복수의 구멍(7)은 동일한 복수의 구멍인, 방법.
12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 중화 용액(5) 및/또는 침전 용액(6)은 상기 용기(1)의 바닥에 실질적으로 첨가되는, 바람직하게는 상기 중화 용액 및/또는 침전 용액의 적어도 50 중량%가 상기 용기의 바닥의 20%에 첨가되는, 방법.
13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 유량 Q1, Q2, Q3, Q4 및 Q5는 독립적으로 0.5 L/분 내지 25 L/분, 더 바람직하게는 1 L/분 내지 10 L/분, 또는 심지어 2 L/분 내지 8 L/분인, 방법.
14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서,
    부드럽게 교반하는 것은 숙주로부터 플라스미드 DNA 또는 게놈 DNA를 전단하기에 불충분한 전단 응력을 발생시키는, 방법.
15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 용액은 연동 펌프(들)에 의해 첨가 및/또는 추출되는, 방법.
16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 따라 정화된 상청액으로부터 관심 플라스미드를 정제하는 하기 단계를 포함하는 공정은,
    - 상기 플라스미드를 포함하는 상기 정화된 상청액을 채취하는 단계,
    - 상기 플라스미드를 포함하는 여과된 용액을 얻기 위해 0.1 내지 0.4 ㎛, 바람직하게는 0.15 내지 0.3 ㎛, 바람직하게는 약 0.2 ㎛의 다공성을 갖는 필터 상에서 상기 정화된 상청액을 여과하는 단계,
    - 선택적으로, 여과된 용액을 한외 여과하는 단계,
    - 음이온 교환 수지 상에서 크로마토그래피 연마하는 단계, 바람직하게는, 상기 연마는 폴리옥시에틸렌(10) 이소옥틸시클로헥실 에테르를 포함하는 용액에 의해 수지에 고정된 상기 플라스미드를 세척하는 단계를 포함함,
    - 상기 플라스미드를 최종 용액에 제형화하는 단계를 포함하는, 공정.