CN108368162A - 一种重组人粒细胞刺激因子的复性及纯化方法 - Google Patents

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Abstract

一种重组人粒细胞刺激因子的复性及纯化方法，通过在复性前以缓冲液置换方式去除还原剂，提高了复性工艺的可控性和复性率，优化了复性缓冲液的组成。上述方法适合大规模工业化放大生产，对设备要求低，操作简单，得到的蛋白纯度高，稳定性好，可降低最终产品在临床中的副作用，提高药品的安全性和有效性。

Description

一种重组人粒细胞刺激因子的复性及纯化方法 技术领域
本发明涉及的是生物医药及生物工程下游蛋白纯化领域，具体的涉及一种重组人粒细胞刺激因子(recombinant human granulocyte colony stimulating factor，rhG-CSF)的复性及纯化方法，本发明复性率高，操作简单，适合于工业化放大生产。
背景技术
人粒细胞集落刺激因子(human granulocyte colony stimulating factor，hG-CSF)属于造血生长因子家族。hG-CSF是由单核巨噬细胞、血管内皮细胞及成纤维细胞合成的蛋白，由174个氨基酸组成，分子量为19KD，其序列是公知的，如序列1所示。hG-CSF的主要作用机理有：(1)特异地作用于骨髓粒细胞和巨噬细胞的前驱细胞，促进其向成熟粒细胞分化、增殖；(2)作用于骨髓成熟中性粒细胞，促进其从骨髓向外周血释放；(3)激活成熟粒细胞的功能，增强其游走、吞噬及杀菌能力，延长其存活时间；(4)刺激骨髓造血干细胞向外周血释放。
hG-CSF在临床上有非常广泛的用途，治疗各种原因引起的中性粒细胞减少症，目前主要用于防治化疗及放疗后引起的骨髓抑制；此外还用于自身骨髓移植、某些类型的白血病、艾滋病的白细胞减少和再生障碍性贫血等，均显示具有显著的疗效。
hG-CSF的天然来源有限，产量甚微，不能满足临床应用的需要。同时聚乙二醇修饰的hG-CSF实现了长效增加外周血中性粒细胞数的目的，其规模化生产同样需要大量的hG-CSF原液，因此hG-CSF原液的大规模生产有重大的经济意义和社会意义。
大肠杆菌是目前最为广泛用来表达外源蛋白的表达系统，然而rhG-CSF在大肠杆菌系统中基本以包涵体形式表达，表达产物没有生物活性，欲利用其生物活性，必须先经变性剂充分溶解，然后经复性过程恢复其天然构象，才能得到高活性的蛋白样品，尔后通过纯化步骤得到高纯度，有功能的产品。利用rhG-CSF不依赖于糖基化修饰即可发挥天然分子相应的生物学活性的特点，选择在大肠杆菌中表达该蛋白是最为简便可行而且产率较高的方法。
工艺研发过程中，影响得率的主要步骤在于复性，复性效果好，得率必然高。复性完全是自发和随机的，因此复性速度慢，回收率低。目前国内外所用的蛋白质复性方法均是依据排除使蛋白变性的环境，具体方法有透析法、超滤复性、柱上复性、稀释法等。
透析法需要时间长，且需要多次更换透析溶液，同时透析袋内部溶液在透析过程中是不均一的，靠近透析膜的溶液变性剂浓度下降快而内部下降慢，只有部分蛋白处于适于复性的环境，其他蛋白很容易聚集、絮凝、沉淀，使复性回收率下降，更主要的是受透析袋规格的限制，透析法难以放大至生产规模。
Amgen公司的美国专利5,849,883在1998年公开了一种G-CSF纯化方法，其中rhG-CSF的复性采用了在搅拌条件下加入硫酸铜，通过金属离子氧化的的方式进行蛋白复性。该方法缺点是有痕量金属离子残留的风险，进而影响药品相关检测及药品安全性，目前在工业化生产中已很少采用。
中国专利CN1167150A报道了使用中空纤维超滤的方式进行rhG-CSF的复性，虽然可以用于大规模生产，但存在以下缺点：①受浓差极化现象影响，复性蛋白溶液在中空纤维柱内浓度并不均一，容易出现蛋白絮集、沉淀甚至堵塞中空纤维柱的情况；②大规模生产中往往需要长度超过90cm的中空纤维柱提供足够的膜面积，研发阶段的中空纤维柱长度都是在30-60cm范围内，因此中空纤维超滤的操作无法线性放大，对于复杂的复性过程难以进行细致的工艺研究来保障工艺的稳定性。
中国专利CN102344931A提供了一种镍亲和层析柱上复性的方法，该方法操作繁琐，难以放大。中国专利CN 104120159 A提供了一种Sephadex G-25柱层析复性的方式，层析柱直径在5-20cm，柱床高度60-100cm，层析上样蛋白浓度1.0-2.0mg/ml，上样体积小于柱床体积的20％，上样和洗脱流速为5-10cm/h；按其报道的规模计算，批量约为10-20g，难以满足商业化生产的需要。
稀释复性同其他方法相比而言具有设备要求简单、操作方便、成本低、容易放大的优点，但是也存在大量错误的折叠和聚合，以至蛋白沉淀，使复性收率大大降低，平均只有20％左右。
中国专利CN1718739A报道的rhG-CSF的复性方法是：第一次稀释复性20小时以上→超滤浓缩→第二次稀释复性96小时以上→超滤浓缩，即进行两次稀释复性操作和两次超滤处理，该方法虽然结合使用了稀释复性和超滤处理，复性率较高，但是存在复性步骤多、复性时间过长、效率低的缺点，这势必影响整体收率并增加工艺放大的难度。
针对上述问题，从包涵体变性溶解及复性的整个过程考虑，在包涵体蛋白变性溶解过程中需加入还原剂对其进行还原，通常使用二硫苏糖醇(DL-Dithiotheitol,DTT)，然而，由于DTT容易被氧化，稳定性较差，而且容易挥发，作用易受环境影响，难以控制，因此在包涵体溶解后增加去除DTT的步骤再稀释复性是稳妥的做法。
中国专利CN101045742A提供了一种重组人粒细胞刺激因子的复性纯化方法，在复性前增加了将裂解液进行Sephadex G-25分离，去除多余的还原剂DTT 的步骤，复性质量收率高于50％，纯化后rhG-CSF的RP-HPLC纯度高于97％，该方法通过Sephadex G-25层析虽然可以达到除去裂解液中过量还原剂的目的，但是含有Urea的裂解液盐浓度极高，进行Sephadex G-25层析时存在反压大，存在层析流速慢，处理时间长，工业化放大难度大的缺点。
同时，在复性过程中需要为蛋白分子内二硫键的正确形成提供适当的氧化还原环境，通常所用的氧化还原剂为GSH/GSSG，其中GSH和GSSG的比例也会影响蛋白的复性效率。通过研究不同GSH和GSSG的添加比例对复性效果的影响，本发明创新性地开发了仅添加GSSG进行rhG-CSF稀释复性的方法，开发了一种rhG-CSF更简单、高效的复性和纯化工艺。
发明内容
本发明提供了一种重组人粒细胞刺激因子的制备方法，包括以下步骤：
a)对rhG-CSF基因工程菌进行发酵培养，经分离和洗涤，获得精制的包涵体；
b)包涵体经变性液溶解得变性蛋白液；
c)对变性蛋白液进行缓冲液置换，得置换后变性液；
d)将置换后变性液进行稀释复性；
e)对复性后的rhG-CSF进行纯化，获得rhG-CSF原液。
其中，所述步骤a中rhG-CSF基因工程菌系由带有rhG-CSF基因的重组质粒转化的大肠杆菌，如重组质粒pBV220/G-CSF转化的大肠杆菌DH5α菌株。
包涵体洗涤缓冲液可以是：缓冲液A(5-100mmol/L Tris-HCl，2-20mmol/L EDTA，100-500mmol/L NaCl，2-4mol/L Urea，pH 7-9)，缓冲液B(5-100mmol/L Tris-HCl，2-20mmol/L EDTA，pH 8-10)；洗涤方式为缓冲液A→缓冲液B依次洗涤。
所述步骤b的变性溶解条件可以是：包涵体按1:20～1:25(W/V)加入变性液(6-10mol/L Urea，2-20mmol/L DTT，2-20mmol/L EDTA，5-100mmol/L Tris-HCl，pH 7-9)中，搅拌裂解10-18h。
所述步骤b的变性溶解条件优选：包涵体按1:20～1:25(W/V)加入变性液(8mol/L Urea，10mmol/L DTT，5mmol/L EDTA，20mmol/L Tris-HCl，pH 8.2)中，搅拌裂解10-18h。
所述步骤c中置换用的缓冲液可包含6-10mol/L Urea，2-20mmol/L EDTA，5-100mmol/L Tris-HCl，pH 7-9，优选8mol/L Urea，5mmol/L EDTA，20mmol/L Tris-HCl，pH 8.2；置换用的缓冲液温度控制为2～30℃，更优选为10～20℃；缓冲液置换的方式包括但不限于超滤、脱盐柱层析；其中超滤包括但不限于中空纤维超滤和膜包超滤；如若采用超滤进行缓冲液置换，超滤膜孔径包括但不限于3KD，5KD和10KD，更优选为5KD；如若采用GE Healthcare公司的中空纤维 柱进行超滤缓冲液置换，剪切速率可以控制在16000sec-1以下，更优选为约8000sec-1；
如若采用中空纤维超滤进行缓冲液置换，超滤条件可以是：①变性蛋白液在超滤系统中适当浓缩；②采用恒体积置换，在超滤系统内保持样品体积恒定，使流加的洗滤液速度与透出液速度相同；③跨膜压力(TMP)不大于50PSI，更优选为10-18PSI；④共超滤置换样品体积的3倍以上，考虑到合理的工艺用时，更优选为7倍体积，即共流加洗滤液体积为置换起始样品体积的3倍以上，更优选为7倍体积。
所述步骤d中的复性缓冲液可包含GSSG，所述GSSG的浓度可以是0.1-1mmol/L。优选地，所述复性缓冲液可以是0.5mmol/L GSSG，20mmol/L Tris-HCl，pH8.2，置换后变性液加入复性缓冲液前控制复性缓冲液温度可为2～8℃；
所述步骤d中稀释复性的条件可以是：复性液蛋白终浓度0.1-0.4g/L，优选地，所述复性液蛋白终浓度0.3g/L，置换后变性液缓慢加入复性缓冲液，继续搅拌30min后停止搅拌，2～8℃静置复性10-18小时；
所述步骤e中对rhG-CSF复性液可采用依次进行盐析、疏水柱层析、脱盐柱层析进行纯化，其中盐析可采用硫酸铵沉淀或氯化钠沉淀，更优选为硫酸铵沉淀；如若采用硫酸铵沉淀的方式，条件可为：搅拌条件下，缓慢加入(NH4)2SO4使其终浓度为0.9mol/L，并补加EDTA使其终浓度为5mmol/L，停止搅拌并静置30min；
盐析过程中的膜过滤可采用中空纤维切向流过滤、膜包过滤或死端过滤，更优选为中空纤维切向流过滤；如若采用中空纤维切向流过滤，优化后的条件为：膜孔径0.2μm，跨膜压(TMP)为3-8PSI，剪切速率约8000sec-1；
所述步骤e中的柱层析如若采用GE Healthcare公司的层析介质，优化后的层析纯化策略是：先由苯基琼脂糖凝胶Phenyl Sepharose FF柱层析再到低吸附的葡聚糖凝胶Sephadex(如Sephadex G-25)柱层析。
使用本发明所提供的重组人粒细胞刺激因子的制备方法得到的重组人粒细胞刺激因子原液可用于制备相应的制剂产品，也可用于制备聚乙二醇修饰的重组人粒细胞刺激因子，如WO9611953以及CN101172161A中描述的聚乙二醇修饰的重组人粒细胞刺激因子，其制备方法可包括本发明所述的重组人粒细胞刺激因子的制备方法制备重组人粒细胞刺激因子的步骤，以及将重组人粒细胞刺激因子与聚乙二醇偶联的步骤。其中，聚乙二醇修饰的重组人粒细胞刺激因子的结构可以是如式Ⅰ所示，
其中m选自 50-2500的整数，优选自400-500的整数，G为Met-G-CSF。
本发明的有益效果是：
(1)优化的包涵体洗涤工艺，为后续的纯化步骤奠定了基础。
(2)稀释复性前增加去除还原剂的步骤，提高了复性率。
(3)通过确定复性之前变性液中DTT的可接受残留量，在保证复性率不受影响的前提下，显著缩短了工艺操作时间，且有利于蛋白活性的维持。
(4)复性蛋白浓度高于一般的稀释复性，降低了样品处理体积。
(5)复性效率大幅提高至70％以上。
(6)本发明涉及的复性方法，优化了复性条件，大大降低了生产成本，且易于控制，提高了工艺操作的稳定性。
(7)复性后蛋白纯度即达到85％以上，降低了后续纯化步骤的压力。
(8)复性液保持澄清，未出现沉淀现象。
(9)工艺流程中没有离心、透析等难以放大的方法，工艺放大的可行性好，成功放大至生产规模。
(10)整体工艺成本低，纯化周期短。
(11)可获得高纯度，高活性的rhG-CSF蛋白原液，经检测其SDS-PAGE电泳纯度达到99％以上，RP-HPLC纯度达到98％以上，比活性范围在(10.0±4.0)×107IU/mg，高于《中华人民共和国药典2015版》第三部“重组人粒细胞刺激因子注射液”项下原液检定的要求。
附图说明
图1：实施例一中洗涤后包涵体的SDS-PAGE电泳纯度检测图谱，其中泳道1：洗涤后的包涵体，泳道2：rhG-CSF对照品(自制)；
图2：实施例一中rhG‐CSF原液的SDS‐PAGE电泳纯度检测图谱，其中泳道1：分子量标准蛋白Mark 12，泳道2：rhG-CSF原液。
具体实施方式
下面通过具体实施例，对本发明的技术方案进行清晰、完整的描述，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例，基于本发明的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例一
重组人粒细胞刺激因子包涵体的复性及纯化方法，主要包括以下步骤：
步骤1制备高纯度的rhG-CSF包涵体
1)工艺步骤：
pBV220/G-CSF转化的大肠杆菌DH5α菌株接入一级种子培养基(蛋白 胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl 5g/L)，30℃220rpm培养7小时；
一级种子接入二级种子培养基(蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl 5g/L，葡萄糖5g/L)，30℃220rpm培养17小时；
二级种子接入发酵培养基(蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl 5g/L，葡萄糖5g/L，KH2PO4 2.7g/L，Na2HPO4 11g/L，MgSO4 0.3g/L)，30℃培养至pH、溶氧双反弹(pH 7.0、溶氧≥30％)后启动补料：补料培养基1(蛋白胨20％，酵母粉10％)30-40g/min，补料培养基2(葡萄糖50％)20-60g/min；当OD600≥30，升温至42℃开始诱导，诱导4小时后，降温至15-20℃，发酵结束。
发酵后，取湿菌体1kg，用5倍体积菌体重量TE缓冲液(20mmol/L Tris-HCl,5mmol/L EDTA,pH8.2)悬浮菌体，混合均匀，泵入高压匀质机进行匀浆破碎。之后，离心分离获得湿的包涵体粗品500g。
将上述得到的粗包涵体用缓冲液A(20mmol/L Tris-HCl,5mmol/L EDTA,4mol/L Urea,0.25mol/L NaCl,pH8.2)和缓冲液B(20mmol/L Tris-HCl,5mmol/L EDTA,pH8.2)依次洗涤，获得高纯度的包涵体。
2)样品检测：
对包涵体进行SDS-PAGE电泳纯度检测，电泳检测的条件和结果如下：
SDS聚丙烯酰胺凝胶：4-12％Bis-Tris Gel，Life technologies样品缓冲液：LDS Sample Buffer(4×)，Life technologies电泳缓冲液：MOPS SDS Running Buffer(20×)，Life technologies
染色液：GelcodeTM Blue safe protein Stain，Thermo scientific
脱色液：纯化水，自制
上样后150V恒压电泳至溴酚蓝迁移胶底处，考马斯亮蓝快速染色法染色，凝胶成像仪进行纯度分析。
从说明书图1泳道1可以看出获得的包涵体SDS-PAGE电泳纯度为72.5％。
步骤2rhG-CSF包涵体的变性溶解
取20g初步纯化的包涵体，以固液比1:20的比例用变性液(20mmol/L Tris-HCl,5mmol/L EDTA,8mol/L Urea,10mmol/L DTT,pH8.2)变性溶解，室温搅拌14～16小时，得变性蛋白液400ml。
步骤3变性蛋白液的缓冲液置换
1)工艺步骤：
样品澄清过滤：上述步骤2的变性蛋白液经10μm和0.45μm两级过滤澄清；
平衡中空纤维：选用5KD中空纤维柱，用平衡液(20mmol/L Tris-HCl,5mmol/L EDTA,8mol/L Urea,pH8.2)平衡中空纤维及系统；
浓缩：将澄清后样品加入中空纤维系统，以8000sec-1的剪切速率运行系统，控制跨膜压(TMP)为10-18PSI，浓缩至300ml；
恒体积置换：向中空纤维系统中连续流加置换缓冲液(20mmol/L Tris-HCl,5mmol/L EDTA,8mol/L Urea,pH 8.2)，控制流加速度与透出端流速相同，保持变性蛋白液体积恒定，超滤过程中共向变性蛋白液中连续补加2100ml置换缓冲液(20mmol/L Tris-HCl,5mmol/L EDTA,8mol/L Urea,pH 8.2)，期间控制跨膜压(TMP)为10-18PSI，置换缓冲液温度在10～20℃。
样品收集：从中空纤维系统底阀处收集样品，用100ml置换缓冲液冲洗中空纤维系统，冲洗液并入样品中，得置换后变性蛋白液400ml。
2)样品检测：
取置换后变性蛋白液20μl用RP-HPLC法检测样品中rhG-CSF蛋白浓度，RP-HPLC条件如下：
rhG-CSF对照品：自制，蛋白浓度为0.85mg/ml
色谱柱：Symmetry ShieldTM RP18，3.5μm，100mm×4.6mm
A相：三氟乙酸－水溶液(取1.0ml三氟乙酸加水至1000ml，充分混匀超声脱气20min)
B相：三氟乙酸－乙腈溶液(取1.0ml三氟乙酸加入色谱纯乙腈至1000ml，超声脱气20min)
室温条件下，按下表进行梯度洗脱，检测波长214nm。
[根据细则26改正31.05.2017]
[根据细则26改正31.05.2017]根据检测样品及对照品中rhG-CSF的峰面积，用面积归一化法计算得置换后变性蛋白液中rhG-CSF的浓度为7.5mg/ml。
步骤4 rhG-CSF的稀释复性
1)工艺步骤
配制缓冲液(20mmol/L Tris-HCl,pH8.2)9.6L，控制其温度在2～8℃， 将置换后变性蛋白液缓慢加入缓冲液中，即蛋白终浓度为0.3g/L，同时加入GSSG至终浓度为0.5mmol/L，搅拌30min混匀后停止搅拌，2～8℃静置复性16～18小时。
2)样品检测：
取复性液50μl用RP-HPLC法检测样品中rhG-CSF蛋白浓度(条件同步骤3中的RP-HPLC条件)，根据检测样品及对照品中rhG-CSF的峰面积，用面积归一化法计算得复性液中rhG-CSF的浓度为0.23mg/ml。
步骤5 rhG-CSF的柱层析纯化
1)工艺步骤：
复性后的rhG-CSF溶液中加入硫酸铵至终浓度为0.9mol/L，加入EDTA至终浓度为5mmol/L，搅拌混匀后静置30min，0.2μm中空纤维切向流澄清过滤后进行柱层析纯化。
Phenyl Sepharose FF柱层析：
⑴以含0.9mol/L(NH4)2SO4，pH8.2的20mmol/L Tris-HCl缓冲液平衡层析柱，流速150cm/小时，平衡3倍柱体积；
⑵澄清液样品上样，流速150cm/小时；
⑶以含0.65mol/L(NH4)2SO4，pH8.2的20mmol/L Tris-HCl冲洗层析柱，流速150cm/小时，冲洗5倍柱体积；
⑷用含0.1mol/L(NH4)2SO4，pH8.2的20mmol/L Tris-HCl洗脱，流速150cm/小时，收集目标蛋白峰。
Sephadex G-25柱层析：
⑴以pH 5.0的50mmol/L醋酸盐缓冲液平衡层析柱，流速150cm/小时，平衡2倍柱体积。
⑵Phenyl Sepharose FF柱层析洗脱收集液上样，单次上样体积不超过柱体积的1/4，流速150cm/小时。
⑶pH 5.0的50mmol/L醋酸盐缓冲液洗脱，流速150cm/小时，收集目标蛋白峰。
蛋白收样除菌过滤后即为重组人粒细胞刺激因子原液。
2)样品检测：
rhG-CSF原液用SDS-PAGE电泳、RP-HPLC方法进行纯度分析。
⑴SDS-PAGE法检测rhG-CSF原液纯度的条件同步骤1中的SDS-PAGE电泳分析条件
SDS-PAGE法进行rhG-CSF原液纯度的检测分析结果如图2示，从分析结果可以看出，最终所得rhG-CSF原液的SDS-PAGE电泳纯度为100％。
⑵RP-HPLC法检测rhG-CSF原液纯度的条件和结果如下：
色谱柱：Symmetry ShieldTM RP18，3.5μm，100mm×4.6mm
A相：三氟乙酸－水溶液(取1.0ml三氟乙酸加水至1000ml，充分混匀超声脱气20min)
B相：三氟乙酸－乙腈溶液(取1.0ml三氟乙酸加入色谱纯乙腈至1000ml，超声脱气20min)
室温条件下，按下表进行梯度洗脱，检测波长280nm。
时间(min) A(％) B(％)
0 100 0
15 30 70
25 30 70
26 100 0
RP-HPLC法进行rhG-CSF原液纯度的检测，从结果分析可以看出，最终所得rhG-CSF原液的RP-HPLC纯度为99.14％。
从说明书图2泳道2可以看出获得的rhG-CSF原液电泳纯度为100％。以重组人粒细胞集落刺激因子活性测定国家标准品为活性标准品，用NFS-60细胞/MTT比色法测定rhG-CSF原液的生物学活性，并根据样品蛋白浓度计算rhG-CSF原液比活性为1.35×108IU/mg。
实施例二
重组人粒细胞刺激因子包涵体的复性及纯化方法，主要包括以下步骤：
步骤1、2、3同实施例一的步骤1、2、3。
步骤4rhG-CSF的稀释复性
1)工艺步骤
配制缓冲液(20mmol/L Tris-HCl,pH8.2)9.6L，控制其温度在2～8℃，将置换后变性蛋白液缓慢加入缓冲液中，即蛋白终浓度为0.3g/L，同时加入GSSG至终浓度为0.3mmol/L，加入GSH至终浓度为0.1mmol/L，搅拌30min混匀后停止搅拌，2～8℃静置复性16～18小时。
2)样品检测：
取复性液50μl用RP-HPLC法检测样品中rhG-CSF蛋白浓度(条件同步骤3中的RP-HPLC条件)，根据检测样品及对照品中rhG-CSF的峰面积，用面积归一化法计算得复性液中rhG-CSF的浓度为0.20mg/ml。
步骤5rhG-CSF的柱层析纯化
1)工艺步骤
同实施例一步骤5的工艺步骤。
2)样品检测：
rhG-CSF原液用SDS-PAGE电泳、RP-HPLC方法进行纯度分析，检测方法同实施例一步骤5的样品检测方法，用NFS-60细胞/MTT比色法测定rhG-CSF的活性，所得rhG-CSF原液的SDS-PAGE电泳纯度为100％，RP-HPLC纯度为98.61％，比活性为1.26×108IU/mg。
比较例一
采用实施例一、实施例二所述的方法进行重组人粒细胞刺激因子的复性及纯化，制备rhG-CSF原液，同时采用现有技术CN101045742A公开的方法进行对比，对比结果如下：
可见，采用本发明所述的rhG-CSF复性和纯化方法，简化了操作步骤，工艺过程简单，易于控制，复性蛋白浓度高于现有技术，降低了样品处理体积，同时目的蛋白损失少，蛋白收率和质量明显提高，适合于大规模工业生产。
虽然本发明已将较佳实施例揭示如上，但是这并非用以限制本发明的内容，本发明的保护范围以申请专利的实际权利要求范围为准。

Claims (16)

  1. 一种重组人粒细胞刺激因子的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
    a)对rhG-CSF基因工程菌进行发酵培养，经分离和洗涤，获得精制的包涵体；
    b)包涵体经变性液溶解得变性蛋白液；
    c)对变性蛋白液进行缓冲液置换，得置换后变性液；
    d)将置换后变性液进行稀释复性；
    e)对复性后的rhG-CSF进行纯化，获得rhG-CSF原液。
  2. 根据权利要求1所述的重组人粒细胞刺激因子的制备方法，其特征在于步骤a中包涵体洗涤所使用的缓冲液为：缓冲液A(5-100mmol/L Tris-HCl，2-20mmol/L EDTA，100-500mmol/L NaCl，2-4mol/L Urea，pH 7-9)，缓冲液B(5-100mmol/L Tris-HCl，2-20mmol/L EDTA，pH 8-10)；洗涤方式为缓冲液A→缓冲液B依次洗涤。
  3. 根据权利要求1所述的重组人粒细胞刺激因子的制备方法，其特征在于步骤b中的变性液含有DTT，浓度优选2-20mmol/L。
  4. 根据权利要求3所述的重组人粒细胞刺激因子的制备方法，其特征在于步骤b中包涵体变性液还含有5-100mmol/L Tris-HCl(pH 7-9)，6-10mol/L Urea以及2-20mmol/L EDTA。
  5. 根据权利要求3所述的重组人粒细胞刺激因子的制备方法，其特征在于步骤b中包涵体变性液含有20mmol/L Tris-HCl(pH 8.2)，8mol/L Urea，5mmol/L EDTA，10mmol/L DTT。
  6. 根据权利要求1所述的重组人粒细胞刺激因子的制备方法，其特征在于步骤c中所述缓冲液置换的方式选自超滤或脱盐柱层析，优选超滤，所述超滤优选中空纤维超滤。
  7. 根据权利要求6所述的重组人粒细胞刺激因子的制备方法，其特征在于所述的中空纤维超滤的中空纤维材质选自聚砜、改良型聚砜、醋酸纤维素酯或硝酸纤维素酯中的一种或多种，中空纤维截留分子量优选3000-10000，更优选5000。
  8. 根据权利要求1所述的重组人粒细胞刺激因子的制备方法，其特征在于步骤c中所述缓冲液置换使用的缓冲液包含6-10mol/L Urea，2-20mmol/L EDTA， 5-100mmol/L Tris-HCl，pH 7-9；优选8mol/L Urea，5mmol/L EDTA，20mmol/L Tris-HCl，pH 8.2。
  9. 根据权利要求1所述的重组人粒细胞刺激因子的制备方法，其特征在于步骤d中稀释复性过程使用的缓冲液包含GSSG。
  10. 根据权利要求1所述的重组人粒细胞刺激因子的制备方法，其特征在于步骤d中稀释复性过程使用的缓冲液不包含GSH。
  11. 根据权利要求9所述的重组人粒细胞刺激因子的制备方法，其特征在于所述GSSG浓度为0.1-1mmol/L。
  12. 根据权利要求1所述的重组人粒细胞刺激因子的制备方法，其特征在于步骤d中稀释复性过程使用的缓冲液包含0.5mmol/L GSSG，20mmol/L Tris-HCl，pH8.2。
  13. 根据权利要求1所述的重组人粒细胞刺激因子的制备方法，其特征在于步骤e中对rhG-CSF复性液依次进行盐析、疏水柱层析、脱盐柱层析。
  14. 根据权利要求13所述的重组人粒细胞刺激因子的制备方法，其特征在于所述盐析优选硫酸铵沉淀的方式，所述疏水柱层析的疏水柱填料优选Phenyl-基的疏水介质，所述脱盐柱层析的填料优选低吸附的Sephadex系列层析介质。
  15. 一种聚乙二醇修饰的重组人粒细胞刺激因子的制备方法，其特征在于包括权利要求1-14任一项所述的重组人粒细胞刺激因子的制备方法制备重组人粒细胞刺激因子的步骤，以及将重组人粒细胞刺激因子与水溶性聚合物偶联的步骤。
  16. 根据权利要求15所述的聚乙二醇修饰的重组人粒细胞刺激因子的制备方法，其特征在于所述的聚乙二醇修饰的重组人粒细胞刺激因子的结构如式Ⅰ所示
    其中m选自50-2500的整数，优选自400-500的整数，G为Met-G-CSF。
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