CN1718739A - 重组人粒细胞集落刺激因子的制备方法 - Google Patents
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Abstract
一种重组人粒细胞集落刺激因子的制备方法，包括步骤：a.选用工程菌DH5α－PBV220－hGCSF菌株进行发酵培养；b.对发酵培养所得菌体进行包涵体的分离和洗涤，得到精制包涵体；c.对精制包涵体进行变性处理，得到变性所得物；d.对变性所得物进行第一次复性处理，得到第一次复性所得物；e.对第一次复性所得物进行超滤处理，得到超滤所得物；f.对超滤所得物进行进行第二次复性处理，得到第二次复性所得物；g.对第二次复性所得物进行层析处理，得到重组人粒细胞集落刺激因子，其纯度达到98％以上、比活性不低于4.0×108IU/mg。本制备方法为解决人粒细胞集落刺激因子制备上存在的表达率偏低、菌体产量偏低、包涵体复性率偏低、活性偏低以及成本偏高等问题提供了可能。
Description
技术领域
本发明涉及药用蛋白物质的制备，尤其涉及利用基因重组工程菌进行目的蛋白制备的方法，特别涉及重组人粒细胞集落刺激因子的制备方法。
背景技术
1985年Welte.K成功地从人膀胱癌细胞株5637的培养上清液中纯化并精制出人粒细胞集落刺激因子(以下简称：hG-CSF)，然后Welte.K与美国的AMGEN公司的Souza.L.M又进一步确定这种hG-CSF的N段氨基酸排列顺序，将来源于5637细胞株的hG-CSF基因克隆化，采用基因工程技术将该基因插入大肠杆菌成功地制得hG-CSF而开发出重组人粒细胞集落刺激因子(以下简称：rhG-CSF)，商品名为Filgratin(惠尔血)。该药1991年美国FDA批准上市。hG-CSF由CHO细胞(中华仓鼠卵巢细胞)产生的rhG-CSF来源于人口腔底细胞的基因Granocyte(格拉诺塞特)是一种含有174个氨基酸的糖蛋白，其氨基酸序列和糖链组分与人体G-CSF相同。
内毒素、TNF-α和IFN-γ可活化单核细胞和巨噬细胞产生G-CSF。此外，成纤维细胞、内皮细胞、星状细胞和骨髓基质细胞等在LPS、IL-1或TNF-α刺激活化后也可分泌G-CSF。某些白血病细胞以及CHu-2人口腔癌细胞、5637人膀胱癌细胞、MIAPa Ca-2胰腺癌细胞可组成性地表达G-CSF。
1986年G-CSF cDNA克隆成功，G-CSF基因全长2.5kb，包括5个外显子和4个内含子。人类有两种不同的G-CSF cDNA，分别编码含207和204氨基酸的前体蛋白，均有30个氨基酸的先导序列，成熟蛋白分子分别为177和174个氨基酸，前者除了在成熟分子N端35位处插入了3个氨基酸外，其余的序列与174氨基酸分子相同。人G-CSF分子量为19.6kDa，PI6.1，O-糖基化，对酸碱(pH2～10)、热以及变性剂等相对较稳定。G-CSF有5个半胱氨酸，Cys 36与Cys42，Cys74与Cys64之间形成两对二硫健，Cys17为不配对半胱氨酸，二硫键对于维持G-CSF生物学功能是必须的因素。
G-CSF主要作用于中性粒细胞系(lineage)造血细胞的增殖、分化和活化。在体外G-CSF刺激骨髓造血祖细胞中中性粒细胞集落的形成，延长成熟中性粒细胞的存活时间，活化中性粒细胞，促进其ADCC，超氧阴离子的产生和碱性磷酸酶的合成。最近研究表明，单独G-CSF或与SCF协同可促进多能造血干细胞的增殖、干细胞母细胞集落形成以及体内CFU-S的形成。G-CSF还具有对人粒细胞、单核细胞、成纤维细胞、平滑肌细胞以及成肌纤维细胞的趋化作用。肿瘤患者注射G-CSF后可提高血循环中中性粒细胞的水平，这种作用可能与缩短某些骨髓细胞进入S期的时间以及增加生成粒细胞的祖细胞数量有关。
申请人深圳新鹏生物工程有限公司生产的rhG-CSF，商品名为瑞血新，采用工程菌DH5α-PBV220-hGCSF制备而成，含有175个氨基酸，分子量为18.8kDa，等电点6.2±0.4，除了第一个氨基酸外，其他174个氨基酸排列顺序与天然人体的G-CSF序列完全相同，在中国获得批准上市，可适用于癌症放、化疗等原因引起的白细胞减少症，是肿瘤放、化疗过程中重要的辅助用药。
目前，国内外生产的各种rhG-CSF商品都已经应用到临床，并取得了很好的效果。人们也在寻求简化rhG-CSF制备工艺，增加制品的活性，降低成本的各种各样的方法。这些方法可以分化为三类：第一种方法是从能够分泌rhG-CSF的重组基因工程菌菌株入手，以期获得获得产量高的、便于后期提取处理的菌种，如中国专利ZL98103011.4和中国专利申请01800753.8各公开了一种分泌rhG-CSF的大肠杆菌菌株；第二种方法是能够从对重组基因工程菌菌株进行高密度、快速培育入手，虽然大量文献提到菌株的培养，但大多是轻描淡写，没有对该种方法予以深入研究和分析，换句话来说，就是在该领域一直以来没有好的突破；第三种方法则是从rhG-CSF的提取、纯化入手，如中国专利ZL96106418.8中公开了一种采用外压式中空纤维超滤透析复性，以离子交换柱层析、疏水柱层析和分子筛柱层析顺序组合纯化以制备高纯度药用rhG-CSF蛋白方法。
现有技术如何解决rhG-CSF的制备上始终存在包涵体复性率偏低、活性偏低以及成本偏高等问题方面，一直以来没有好的解决方案。
发明内容
本发明要解决的技术问题在于克服现有技术的不足，从对重组基因工程菌菌株进行高密度、快速培育入手，来解决rhG-CSF的制备上存在的表达率偏低、菌体产量偏低、包涵体复性率偏低、活性偏低以及成本偏高等问题。
本发明解决上述技术问题所采用的技术方案是，提出一种重组人粒细胞集落刺激因子的制备方法，包括步骤：a.选用工程菌DH5α-PBV220-hGCSF做菌株进行发酵培养；b.对发酵培养所得菌体进行包涵体的分离和洗涤，得到精制包涵体；c.对精制包涵体进行变性处理，得到变性所得物；d.对变性所得物进行第一次复性处理，得到第一次复性所得物；e.对第一次复性所得物进行超滤处理，得到超滤所得物；f.对超滤所得物进行第二次复性处理，得到第二次复性所得物；g.对第二次复性所得物进行层析处理，得到重组人粒细胞集落刺激因子。
同现有技术相比较，采用本发明的重组人粒细胞集落刺激因子的制备方法，为解决rhG-CSF的制备上存在的包涵体复性率偏低、活性偏低以及成本偏高等问题提供了可能。
具体实施方式
以下对本发明予以进一步详尽说明。
本发明的重组人粒细胞集落刺激因子的制备方法，包括步骤：a.选用工程菌DH5α-PBV220-hGCSF菌株进行发酵培养；b.对发酵培养所得菌体进行包涵体的分离和洗涤，得到精制包涵体；c.对精制包涵体进行变性处理，得到变性所得物；d.对变性所得物进行第一次复性处理，得到第一次复性所得物；e.对第一次复性所得物进行超滤处理，得到超滤所得物；f.对超滤所得物进行第二次复性处理，得到第二次复性所得物；g.对第二次复性所得物进行层析处理，得到重组人粒细胞集落刺激因子。
选用工程菌DH5α-PBV220-hGCSF做菌株的好处是：其rhG-CSF蛋白占菌体总蛋白的40％以上。
其中，步骤a又包括步骤种子液培养和分批补料发酵，所述种子液培养包括以下子步骤：
①.菌种的筛选：从菌种保存库中取出所述工程菌，划LB平板30℃培养过夜，挑取单菌落接种于含100μg/ml氨苄青霉素的5ml LB试管中培养，至OD600值为0.4-0.6，再于42℃培养4小时，离心收集菌体，SDS-PAGE分析，用重组人粒细胞集落刺激因子表达量最高的克隆作为发酵用种子，分装甘油保存，每批发酵取用一支；
②.一级种子液培养：将种子按2％的体积比接种到含2YT种子培养基的50ml三角瓶中，30℃，200r/min摇床培养，至OD600值为0.6-1.0；
③.二级种子液培养：将一级种子液以1％的体积比接种到含200ml 2YT种子培养基的500ml三角瓶中，30℃，250r/min，摇床培养12-16小时，至OD600值为3.5-6.5，镜检无杂菌，菌种形态正常，即为发酵用种子；
所述分批补料发酵包括以下子步骤：
①.发酵前的准备：采用NBS 20L发酵罐，将pH电极、溶氧电极校正和安装好；将8L发酵培养基接入发酵罐，设定灭菌温度115℃，30min，发酵罐自动在线灭菌；
②.基本发酵：灭菌后，待培养基温度降到30℃时，按接种量10％体积比接入二级种子液，30℃，培养8小时，开始诱导表达；
③.诱导发酵：诱导温度为42℃，诱导4小时，结束发酵；
上述分批补料发酵子步骤②和③中，通过补加4mol/L NaOH(氢氧化钠)控制pH为7.0-7.1，通过调节发酵罐的空气流速和转速，控制溶氧值为50％；并且当OD600值为2时，开始补料，补料方式为每小时补加补料I和II各100ml。
所述LB的配方为：蛋白胨10g，酵母粉5g，氯化钠10g，加纯化水定容至1L。
所述2YT培养基的配方为：蛋白胨16g，酵母粉10g，氯化钠5g，加纯化水定容至1L。
上述经4小时诱导发酵后，经离心收集，平均湿菌收率可达80-100g/L。
本发明发酵过程的难点在于根据所选用工程菌的生长特性，而提供相应的发酵条件，具体包括温度、PH值控制，溶氧量控制，比如：本发明之所以溶氧量控制采用50％，而不是采用一般发酵工艺中的30％左右，就是经过反复分析、实验得出的优选数据。
本发明发酵过程的难点还在于适合工程菌的生长特性的培养基配方的选择，以及分时分批补料时补料本身配方的选择。
本发明选用的发酵培养基配方为：蛋白胨20g，酵母粉120g，甘油40ml，硫酸铵50g，葡萄糖100g，氯化钠5g，磷酸氢二钾100g，磷酸二氢钾20g，加纯化水定容至8L。
本发明选用的补料I的配方为：葡萄糖300g，硫酸铵50g，加纯化水定容至1L。
本发明选用的补料II的配方为：酵母粉300g，酪蛋白水解物20g，维生素B10.1g，加纯化水定容至1L。
采用本发明发酵方法，可以从对重组基因工程菌菌株进行高密度、快速培育入手，解决rhG-CSF的制备上存在的表达率偏低、菌体产量偏低、活性偏低以及成本偏高等问题。
收集到的发酵过程后菌体可以在-20℃的冷藏设备中进行保藏、转运，也可以立即进行包涵体的分离与洗涤、复性、超滤和层析等提取、纯化工艺过程以制备高纯度药用rhG-CSF蛋白。
本发明所述步骤b包括：将所述工程菌菌体按1∶5的g/ml比，加入菌体破碎缓冲液中，超声破碎至菌体破碎率为98％以上，10000r/min，离心40min，保留沉淀；将沉淀用洗涤液洗涤三次；第3次添加1％的去氧胆酸钠，再用去离子水洗涤2次，10000r/min，离心40min，收集沉淀，即为精制包涵体；
其中所述破碎缓冲液的配方为：1mmol/L EDTANa2(乙二胺四乙酸二钠)，80mmol/L NaCl(氯化钠)，50mmol/L Tris-HCl(三羟甲基氨基甲烷-盐酸)，pH8.0；
所述洗涤液的配方为：5mmol/L EDTANa2，80mmol/L NaCl，3mmol/L Urea，50mmol/LTris-HCl，pH8.0。
本发明所述步骤c包括：以1∶20的g/ml比，将精制包涵体用变性液混匀，搅拌2小时以上，即为变性所得物；所述变性液的配方为：1mmol/L EDTANa2，10mmol/L DTT(二巯基苏糖醇)，8mol/L Urea(尿素)，50mmol/L Tris-HCl，pH8.0。
本发明所述步骤d包括：将变性所得物以13000r/min离心40min，弃去沉淀，将上清缓慢倒入复性液中，控制蛋白浓度在0.05mg/ml，搅拌20小时以上，即为第一次复性所得物；所述复性液的配方为1mol/L Urea，0.1mmol/L GSH(还原型谷胱甘肽)，0.01mmol/L GSSG(氧化型谷胱甘肽)，30mmol/L Tris-HCl，pH8.5。
本发明所述步骤e包括：用Millipore超滤仪，超滤膜截留分子量10KDa，使用前先用纯化水和蒸馏水充分清洗系统，将第一次复性所得物超滤浓缩，终体积为原体积的1/15，即为超滤所得物。
本发明所述步骤f包括：将超滤所得物放置于2-8℃环境，继续复性96小时以上，复性率达到92％以上，即为第二次复性所得物。
本发明所述步骤g包括：用10％的冰醋酸调节第二次复性所得物pH为5.4，离心10000r/min，30min，保留上清液；将SP Sepharose High Performance层析柱用pH为5.4的30mmol/mol NaAC(醋酸钠)平衡，将上清液上柱，用pH为5.4的含120mmol/L NaCl的30mmol/LNaAC洗脱，收集SP Sepharose High Performance层析柱的主峰物质；将Sephadex G25柱以pH为4.0的10mmol/L NaAC平衡，将收集到的SP Sepharose High Performance层析柱的主峰物质上SephadexG25柱，收集主峰，即为重组人粒细胞集落刺激因子。
采用本发明的重组人粒细胞集落刺激因子的制备方法的一个具体实施结果就是：瑞血新，其经SDS-PAGE电泳扫描，纯度达到99％以上，HPLC显示单峰，rhG-CSF比活性不低于4.0×108IU/mg。
Claims (10)
1、一种重组人粒细胞集落刺激因子的制备方法，其特征在于，包括步骤：
a.选用工程菌DH5α-PBV220-hGCSF菌株进行发酵培养；
b.对发酵培养所得菌体进行包涵体的分离和洗涤，得到精制包涵体；
c.对精制包涵体进行变性处理，得到变性所得物；
d.对变性所得物进行第一次复性处理，得到第一次复性所得物；
e.对第一次复性所得物进行超滤处理，得到超滤所得物；
f.对超滤所得物进行第二次复性处理，得到第二次复性所得物；
g.对第二次复性所得物进行层析处理，得到重组人粒细胞集落刺激因子。
2、如权利要求1所述的重组人粒细胞集落刺激因子的制备方法，其特征在于：所述步骤a包括种子液培养和分批补料发酵，所述种子液培养包括以下子步骤：
①.菌种的筛选：从菌种保存库中取出所述工程菌，划LB平板30℃培养过夜，挑取单菌落接种于含100μg/ml氨苄青霉素的5ml LB试管中培养，至OD600值为0.4-0.6，再于42℃培养4小时，离心收集菌体，SDS-PAGE分析，用重组人粒细胞集落刺激因子表达量最高的克隆作为发酵用种子，分装甘油保存，每批发酵取用一支；
②.一级种子液培养：将种子按2％的体积比接种到含2YT种子培养基的50ml三角瓶中，30℃，200r/min摇床培养，至OD500值为0.6-1.0；
③.二级种子液培养：将一级种子液以1％的体积比接种到含200ml 2YT种子培养基的500ml三角瓶中，30℃，250r/min，摇床培养12-16小时，至OD600值为3.5-6.5，镜检无杂菌，菌种形态正常，即为发酵用种子；
所述分批补料发酵包括以下子步骤：
①.发酵前的准备：将8L发酵培养基接入20L的发酵罐中，115℃灭菌30分钟；
②.基本发酵：灭菌后，待培养基温度降到30℃时，按接种量10％体积比接入二级种子液，30℃，培养8小时，开始诱导表达；
③.诱导发酵：诱导温度为42℃，诱导4小时，结束发酵；
所述分批补料发酵子步骤②和③中，通过补加4mol/L氢氧化钠控制pH为7.0-7.1，通过调节发酵罐的空气流速和转速，控制溶氧值为50％；并且当OD600值为2时，开始补料，补料方式为每小时补加补料I和II各100ml；
所述发酵培养基的配方为：蛋白胨20g，酵母粉120g，甘油40ml，硫酸铵50g，葡萄糖100g，氯化钠5g，磷酸氢二钾100g，磷酸二氢钾20g，加纯化水定容至8L；
所述补料I的配方为：葡萄糖300g，硫酸铵50g，加纯化水定容至1L；
所述补料II的配方为：酵母粉300g，酪蛋白水解物20g，维生素B1 0.1g，加纯化水定容至1L。
3、如权利要求1所述的重组人粒细胞集落刺激因子的制备方法，其特征在于，所述步骤b包括：将所述工程菌菌体按1∶5的g/ml比例，加入菌体破碎缓冲液中，超声破碎至菌体破碎率为98％以上，10000r/min，离心40min，保留沉淀；将沉淀用洗涤液洗涤三次；第3次添加1％的去氧胆酸钠，再用去离子水洗涤2次，10000r/min，离心40min，收集沉淀，即为精制包涵体；其中所述破碎缓冲液的配方为：1mmol/L乙二胺四乙酸二钠，80mmol/L氯化钠，50mmol/L三羟甲基氨基甲烷-盐酸，pH8.0；所述洗涤液的配方为：5mmol/L乙二胺四乙酸二钠，80mmol/L氯化钠，3mmol/L尿素，50mmol/L三羟甲基氨基甲烷-盐酸，pH8.0。
4、如权利要求1所述的重组人粒细胞集落刺激因子的制备方法，其特征在于，所述步骤c包括：以1∶20的g/ml比例，将精制包涵体用变性液混匀，搅拌2小时以上，即为变性所得物。
5、如权利要求4所述的重组人粒细胞集落刺激因子的制备方法，其特征在于，所述变性液的配方为：1mmol/L乙二胺四乙酸二钠，10mmol/L二巯基苏糖醇，8mol/L尿素，50mmol/L三羟甲基氨基甲烷-盐酸，pH8.0。
6、如权利要求1所述的重组人粒细胞集落刺激因子的制备方法，其特征在于，所述步骤d包括：将变性所得物以13000r/min离心40min，弃去沉淀，将上清缓慢倒入复性液中，控制蛋白浓度在0.05mg/ml，搅拌20小时以上，即为第一次复性所得物。
7、如权利要求6所述的重组人粒细胞集落刺激因子的制备方法，其特征在于，所述复性液的配方为：1mol/L尿素，0.1mmol/L还原型谷胱甘肽，0.01mmol/L氧化型谷胱甘肽，30mmol/L三羟甲基氨基甲烷-盐酸，pH8.5。
8、如权利要求1所述的重组人粒细胞集落刺激因子的制备方法，其特征在于，所述步骤e包括：选择超滤膜截留分子量10KDa，超滤仪使用前先用水充分清洗，将第一次复性所得物超滤浓缩，终体积为原体积的1/15，即为超滤所得物。
9、如权利要求1所述的重组人粒细胞集落刺激因子的制备方法，其特征在于，所述步骤f包括：将超滤所得物放置于2-8℃环境，96小时以上，即为第二次复性所得物。
10、如权利要求1所述的重组人粒细胞集落刺激因子的制备方法，其特征在于，所述步骤g包括：用10％的冰醋酸调节第二次复性所得物pH为5.4，离心10000r/min，30min，保留上清液；将SP Sepharose High Performance层析柱用pH为5.4的30mmol/mol醋酸钠平衡，将上清液上柱，用pH为5.4的含120mmol/L氯化钠的30mmol/L醋酸钠洗脱，收集SP Sepharose High Performance层析柱的主峰物质；将Sephadex G25柱以pH为4.0的10mmol/L醋酸钠平衡，将收集到的SP Sepharose High Performance层析柱的主峰物质上Sephadex G25柱，收集主峰，即为重组人粒细胞集落刺激因子。
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