CN1061992C - 新的重组人粒细胞集落刺激因子及其药物组合物 - Google Patents
新的重组人粒细胞集落刺激因子及其药物组合物 Download PDFInfo
- Publication number
- CN1061992C CN1061992C CN97123162A CN97123162A CN1061992C CN 1061992 C CN1061992 C CN 1061992C CN 97123162 A CN97123162 A CN 97123162A CN 97123162 A CN97123162 A CN 97123162A CN 1061992 C CN1061992 C CN 1061992C
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- csf
- sequence
- csfa
- present
- amino acid
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
- 239000000203 mixture Substances 0.000 title abstract description 7
- 210000003714 granulocyte Anatomy 0.000 title abstract 2
- 102000007644 Colony-Stimulating Factors Human genes 0.000 title description 2
- 108010071942 Colony-Stimulating Factors Proteins 0.000 title description 2
- 230000006798 recombination Effects 0.000 title 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 title 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims abstract description 16
- 125000001360 methionine group Chemical group N[C@@H](CCSC)C(=O)* 0.000 claims description 18
- 101000746367 Homo sapiens Granulocyte colony-stimulating factor Proteins 0.000 claims description 17
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims description 13
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 claims description 13
- 230000008521 reorganization Effects 0.000 claims description 13
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims description 10
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 8
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 8
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims description 7
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 6
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims description 5
- 108010029961 Filgrastim Proteins 0.000 claims description 5
- 102100039619 Granulocyte colony-stimulating factor Human genes 0.000 claims description 5
- 229960004177 filgrastim Drugs 0.000 claims description 5
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 claims description 5
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 4
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 claims description 4
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 claims description 4
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 claims description 3
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims description 3
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 abstract description 25
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 abstract description 10
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 abstract description 10
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 abstract description 7
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 6
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 abstract description 5
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 5
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 5
- 125000000637 arginyl group Chemical group N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)* 0.000 abstract description 3
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 abstract 1
- 108010017080 Granulocyte Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 description 71
- 102000004269 Granulocyte Colony-Stimulating Factor Human genes 0.000 description 71
- 238000000034 method Methods 0.000 description 15
- 210000003000 inclusion body Anatomy 0.000 description 12
- 239000000047 product Substances 0.000 description 12
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 12
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 11
- 230000000857 drug effect Effects 0.000 description 9
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 7
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 7
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 6
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000013016 damping Methods 0.000 description 5
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 5
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 5
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 5
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 5
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 5
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 5
- 238000004153 renaturation Methods 0.000 description 5
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 4
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 4
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 4
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 4
- PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N guanidinium chloride Chemical compound [Cl-].NC(N)=[NH2+] PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000009655 industrial fermentation Methods 0.000 description 4
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 4
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 4
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 4
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 4
- 230000008569 process Effects 0.000 description 4
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 4
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 4
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 4
- 229960004249 sodium acetate Drugs 0.000 description 4
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 4
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 4
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 4
- FRXSZNDVFUDTIR-UHFFFAOYSA-N 6-methoxy-1,2,3,4-tetrahydroquinoline Chemical compound N1CCCC2=CC(OC)=CC=C21 FRXSZNDVFUDTIR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 3
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 3
- LRQKBLKVPFOOQJ-YFKPBYRVSA-N L-norleucine Chemical compound CCCC[C@H]([NH3+])C([O-])=O LRQKBLKVPFOOQJ-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 3
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 3
- 230000008859 change Effects 0.000 description 3
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 3
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 3
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 3
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 3
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 3
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 2
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000007651 Macrophage Colony-Stimulating Factor Human genes 0.000 description 2
- 108010046938 Macrophage Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 description 2
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 2
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- DPDMMXDBJGCCQC-UHFFFAOYSA-N [Na].[Cl] Chemical compound [Na].[Cl] DPDMMXDBJGCCQC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 2
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 2
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 description 2
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 2
- 238000005336 cracking Methods 0.000 description 2
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 2
- 238000013461 design Methods 0.000 description 2
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 2
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 2
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 2
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 2
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 2
- 210000001616 monocyte Anatomy 0.000 description 2
- 210000004493 neutrocyte Anatomy 0.000 description 2
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 2
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 2
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 2
- 238000012856 packing Methods 0.000 description 2
- 229920000136 polysorbate Polymers 0.000 description 2
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 2
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 2
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 2
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 2
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 2
- UDPGUMQDCGORJQ-UHFFFAOYSA-N (2-chloroethyl)phosphonic acid Chemical compound OP(O)(=O)CCCl UDPGUMQDCGORJQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 1,2-bis(ethenyl)benzene;1-ethenyl-2-ethylbenzene;styrene Chemical compound C=CC1=CC=CC=C1.CCC1=CC=CC=C1C=C.C=CC1=CC=CC=C1C=C NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101100230376 Acetivibrio thermocellus (strain ATCC 27405 / DSM 1237 / JCM 9322 / NBRC 103400 / NCIMB 10682 / NRRL B-4536 / VPI 7372) celI gene Proteins 0.000 description 1
- WQVFQXXBNHHPLX-ZKWXMUAHSA-N Ala-Ala-His Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](Cc1cnc[nH]1)C(O)=O WQVFQXXBNHHPLX-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 1
- YYSWCHMLFJLLBJ-ZLUOBGJFSA-N Ala-Ala-Ser Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O YYSWCHMLFJLLBJ-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 1
- 206010002198 Anaphylactic reaction Diseases 0.000 description 1
- 208000032467 Aplastic anaemia Diseases 0.000 description 1
- BHSYMWWMVRPCPA-CYDGBPFRSA-N Arg-Arg-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@@H](N)CCCN=C(N)N BHSYMWWMVRPCPA-CYDGBPFRSA-N 0.000 description 1
- PTVGLOCPAVYPFG-CIUDSAMLSA-N Arg-Gln-Asp Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O PTVGLOCPAVYPFG-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- PTNFNTOBUDWHNZ-GUBZILKMSA-N Asn-Arg-Met Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(O)=O PTNFNTOBUDWHNZ-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- LJUOLNXOWSWGKF-ACZMJKKPSA-N Asn-Asn-Glu Chemical compound C(CC(=O)O)[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)N)NC(=O)[C@H](CC(=O)N)N LJUOLNXOWSWGKF-ACZMJKKPSA-N 0.000 description 1
- KHCNTVRVAYCPQE-CIUDSAMLSA-N Asn-Lys-Asn Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O KHCNTVRVAYCPQE-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- FANQWNCPNFEPGZ-WHFBIAKZSA-N Asp-Asp-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)NCC(O)=O FANQWNCPNFEPGZ-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 description 1
- 241000699802 Cricetulus griseus Species 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 1
- BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N Dihydrogen disulfide Chemical compound SS BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001596967 Escherichia coli M15 Species 0.000 description 1
- 241000206602 Eukaryota Species 0.000 description 1
- NUSWUSKZRCGFEX-FXQIFTODSA-N Glu-Glu-Cys Chemical compound OC(=O)CC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CS)C(O)=O NUSWUSKZRCGFEX-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- 101000911390 Homo sapiens Coagulation factor VIII Proteins 0.000 description 1
- IOVUXUSIGXCREV-DKIMLUQUSA-N Ile-Leu-Phe Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 IOVUXUSIGXCREV-DKIMLUQUSA-N 0.000 description 1
- IPFKIGNDTUOFAF-CYDGBPFRSA-N Ile-Val-Arg Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCN=C(N)N IPFKIGNDTUOFAF-CYDGBPFRSA-N 0.000 description 1
- LCPYQJIKPJDLLB-UWVGGRQHSA-N Leu-Leu Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(C)C LCPYQJIKPJDLLB-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 1
- 102000004317 Lyases Human genes 0.000 description 1
- 108090000856 Lyases Proteins 0.000 description 1
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 1
- DSWOTZCVCBEPOU-IUCAKERBSA-N Met-Arg-Gly Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(=O)NCC(O)=O)CCCNC(N)=N DSWOTZCVCBEPOU-IUCAKERBSA-N 0.000 description 1
- 102000016943 Muramidase Human genes 0.000 description 1
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 description 1
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 1
- WEMYTDDMDBLPMI-DKIMLUQUSA-N Phe-Ile-Lys Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC1=CC=CC=C1)N WEMYTDDMDBLPMI-DKIMLUQUSA-N 0.000 description 1
- KIQUCMUULDXTAZ-HJOGWXRNSA-N Phe-Tyr-Tyr Chemical compound N[C@@H](Cc1ccccc1)C(=O)N[C@@H](Cc1ccc(O)cc1)C(=O)N[C@@H](Cc1ccc(O)cc1)C(O)=O KIQUCMUULDXTAZ-HJOGWXRNSA-N 0.000 description 1
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010040201 Polymyxins Proteins 0.000 description 1
- QMCDMHWAKMUGJE-IHRRRGAJSA-N Ser-Phe-Val Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O QMCDMHWAKMUGJE-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 1
- FZXOPYUEQGDGMS-ACZMJKKPSA-N Ser-Ser-Gln Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(O)=O FZXOPYUEQGDGMS-ACZMJKKPSA-N 0.000 description 1
- DKGRNFUXVTYRAS-UBHSHLNASA-N Ser-Ser-Trp Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC1=CNC2=C1C=CC=C2)C(O)=O DKGRNFUXVTYRAS-UBHSHLNASA-N 0.000 description 1
- 108020005038 Terminator Codon Proteins 0.000 description 1
- COYHRQWNJDJCNA-NUJDXYNKSA-N Thr-Thr-Thr Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O COYHRQWNJDJCNA-NUJDXYNKSA-N 0.000 description 1
- ARJASMXQBRNAGI-YESZJQIVSA-N Tyr-Leu-Pro Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC2=CC=C(C=C2)O)N ARJASMXQBRNAGI-YESZJQIVSA-N 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 1
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 1
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000006229 amino acid addition Effects 0.000 description 1
- 235000011114 ammonium hydroxide Nutrition 0.000 description 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 239000003708 ampul Substances 0.000 description 1
- 230000036783 anaphylactic response Effects 0.000 description 1
- 208000003455 anaphylaxis Diseases 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 239000002518 antifoaming agent Substances 0.000 description 1
- 108010069926 arginyl-glycyl-serine Proteins 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 210000003995 blood forming stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 1
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 1
- 238000010322 bone marrow transplantation Methods 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 238000012219 cassette mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 239000003729 cation exchange resin Substances 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 238000005352 clarification Methods 0.000 description 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 1
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 1
- 239000012050 conventional carrier Substances 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 238000004690 coupled electron pair approximation Methods 0.000 description 1
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000013530 defoamer Substances 0.000 description 1
- ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L dipotassium hydrogen phosphate Chemical class [K+].[K+].OP([O-])([O-])=O ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 230000008034 disappearance Effects 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 210000003725 endotheliocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000001976 enzyme digestion Methods 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 238000012239 gene modification Methods 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 230000005017 genetic modification Effects 0.000 description 1
- 235000013617 genetically modified food Nutrition 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 210000000224 granular leucocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000003958 hematopoietic stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000002607 hemopoietic effect Effects 0.000 description 1
- 102000057593 human F8 Human genes 0.000 description 1
- 230000036737 immune function Effects 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000005304 joining Methods 0.000 description 1
- 108010091798 leucylleucine Proteins 0.000 description 1
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 1
- 230000002934 lysing effect Effects 0.000 description 1
- 229960000274 lysozyme Drugs 0.000 description 1
- 239000004325 lysozyme Substances 0.000 description 1
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 description 1
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 1
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 1
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 239000012452 mother liquor Substances 0.000 description 1
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 1
- 229940038504 oxygen 100 % Drugs 0.000 description 1
- 230000000242 pagocytic effect Effects 0.000 description 1
- 229940066779 peptones Drugs 0.000 description 1
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 1
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 1
- 230000003285 pharmacodynamic effect Effects 0.000 description 1
- 235000010482 polyoxyethylene sorbitan monooleate Nutrition 0.000 description 1
- 229920000053 polysorbate 80 Polymers 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 1
- 238000012797 qualification Methods 0.000 description 1
- 239000002516 radical scavenger Substances 0.000 description 1
- 238000001959 radiotherapy Methods 0.000 description 1
- 229940047431 recombinate Drugs 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 1
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 239000012064 sodium phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 230000005477 standard model Effects 0.000 description 1
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 1
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 231100000027 toxicology Toxicity 0.000 description 1
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 1
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 1
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 1
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 1
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 1
Images
Landscapes
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明公开了新的重组人粒细胞集落刺激因子(rhG-CSF)，它在序列的N端添加了3-6个氨基酸残基，且其中至少一个氨基酸残基是精氨酸；更佳地，在N端添加包含序列为甲硫氨酸-精氨酸-谷氨酸-丝氨酸在内的4-6个氨基酸；最佳地，在N端添加序列为甲硫氨酸-精氨酸-谷氨酸-丝氨酸的4个氨基酸。本发明的新型重组蛋白的活性有显著提高，而且稳定性明显提高。还提供了有关序列、表达载体、宿主细胞和药物组合物。
Description
本发明涉及蛋白质重组领域。更具体地，涉及对人粒细胞集落刺激因子(hG-CSF)的重组改造。此外，本发明还涉及有关的表达载体、生产重组人粒细胞集落刺激因子的工程菌和含有该重组人粒细胞集落刺激因子的药物组合物等方面。
集落刺激因子(CSF)是一类生物体内产生的蛋白质分子，它们能刺激体内造血细胞的增殖分化，提高造血功能和免疫功能。已发现有多种类型的CSF，主要包括巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)等。
人粒细胞集落刺激因子(Human Granulocyte Colony Stimulating Factor，hG-CSF)是由人体的内皮细胞、单核细胞、巨噬细胞和成纤维细胞等所分泌的一种糖蛋白。它由174个氨基酸组成，并在133位氨基酸上连有一糖链。其主要功能是：促进造血干细胞向中性粒细胞分化、成熟，并增强其吞噬功能。
在中国专利申请CN 86106234(申请人为柯瑞英-艾格公司，又译为安进(Amgen)公司)中，公开了粒细胞集落刺激因子的核苷酸序列和氨基酸序列，以及有关的载体、转化细胞和多肽。该申请还对G-CSF的17、36、42、64和74位上的半胱氨酸残基进行置换，公开了突变体[Ala1]G-CSF、[Ser17]G-CSF、[Ser36]G-CSF、[Ser42]G-CSF、[Ser64]G-CSF、[Ser74]G-CSF等突变形式。该文献在此引用作为参考。
此外，在中国专利申请CN 86106815(申请人为日本中外制药株式会社)中，公开了具有人G-CSF活性多肽的基因、插入该基因的重组载体、含该载体的转化体、由转化体产生的具有G-CSF活性的多肽和糖蛋白，以及生产具有人G-CSF活性的多肽和糖蛋白的方法。该文献在此引用作为参考。
在安进公司的中国专利申请CN 94191031中，发明名称为“G-CSF类似物组合物及其制备方法”，公开了编码多种G-CSF类似物的核酸序列、宿主细胞、载体。还公开了设计G-CSF类似物及相关组合物的方法。该文献在此引用作为参考。
自发现G-CSF以来，安进公司和日本中外制药株式会社等公司分别利用重组技术，开发出了多种G-CSF产品。其产品具有与天然G-CSF相同的生物活性，已广泛应用于治疗各种原因尤其是肿瘤化疗和放疗引起的中性粒细胞减少、再生障碍性贫血等症状，并在提高骨髓移植及外周血干细胞移植成功率等方面起到了极其重要的作用。
但是，已有技术中的G-CSF的生物活性较低，或者虽然生物活性有所提高，但仍难以满足要求。因此迫切需要一种活性高的G-CSF重组蛋白。
此外，已有技术中的G-CSF稳定性较差。因为G-CSF样品的药效不稳定，所以目前只有水剂型，其运输、储存都要求在4℃进行。
因此，本发明的目的是克服已有技术中上述缺点，提供一种生物活性高和/或稳定性好的重组人粒细胞集落刺激因子。
本发明的目的之一是提供一种新的G-CSF突变体，其活性更高。
本发明的目的之二是提供一种新的G-CSF突变体，它不仅活性更高，而且稳定性更好，从而可以被制成冻干粉剂。
本发明的目的之三是提供一种含有编码该G-CSF突变体的核酸序列的表达载体。
本发明的目的之四是提供一种产生新型G-CSF突变体的宿主细胞，它所产生的G-CSF具有更高的活性和/或更高的稳定性。
本发明的目的之五是提供一种含有该新型G-CSF的药物组合物。
图1是本发明的G-CSF突变体以及天然G-CSF的cDNA序列。其中上行是与天然G-CSF不同的、突变体的cDNA序列；下行是与天然G-CSF相同的cDNA序列。其中在天然G-CSF核苷酸序列5′端ATG前添加了ATG AGA GGA TCC。
图2是本发明的一种G-CSF突变体的氨基酸序列以及天然G-CSF的氨基酸序列。其中在上行粗体部分是与天然G-CSF不同的、突变体的氨基酸序列；下行是与天然G-CSF相同的氨基酸序列。其中在天然G-CSF氨基酸序列N端添加了Met Arg Gly Ser和/或在17位用Ala替换Cys。
图3是重组G-CSFa的PCR克隆及表达载体构建过程的示意图。
图4是本发明的一种重组蛋白G-CSFa与国外产品的活性比较图
本发明的发明人经过多年研究发现，通过在G-CSF的N端添加包含精氨酸在内的氨基酸残基，可以提高重组人粒细胞集落刺激因子的活性和/或稳定性。这是因为精氨酸是带有正电荷的氨基酸，将其添加在G-CSF的N端，可提高重组G-CSF与细胞上相关受体(或细胞因子)的结合。
在这一发现的基础上，本发明人完成了本发明。
因而，本发明提供了一种重组的人粒细胞集落刺激因子，它在序列的N端添加了3-6个氨基酸残基，且其中至少一个氨基酸残基是精氨酸。更佳地，在序列N端添加4-6个氨基酸，且该4-6个氨基酸含有序列：甲硫氨酸-精氨酸-谷氨酸-丝氨酸。
在本发明的一个最佳实施例中，所提供的重组重组人粒细胞集落刺激因子在N端添加甲硫氨酸-精氨酸-谷氨酸-丝氨酸，和/或第17位上的半胱氨酸被丙氨酸所取代。
本发明还提供了含有编码上述重组人粒细胞集落刺激因子的核酸序列的表达载体，以及含有该表达载体的宿主细胞。
本发明还提供了一种药物组合物，它包括有效量的上述的重组人粒细胞集落刺激因子和药学上可接受的载体或赋形剂。更佳地，该组合物是冻干粉剂或水剂；最佳地，该组合物是冻干粉剂。
经本发明人的研究表明，尽管确切的机制还不清楚，但是通过在G-CSF的N端添加带正电荷的精氨酸残基，可以提高重组G-CSF与相关的细胞受体的结合和/或作用，从而提高重组G-CSF的药效。
在此基础上，本发明对天然和或重组的G-CSF的N端进行了修饰，即在G-CSF序列的N端添加了3-6个氨基酸残基，且其中至少一个氨基酸残基是精氨酸。更佳地，在序列N端添加4-6个氨基酸，且该序列含有甲硫氨酸-精氨酸-谷氨酸-丝氨酸。
又根据本发明人及本领域其他研究人员的研究表明，G-CSF的稳定性与半胱氨酸残基有关系。对于原序列中不参与形成二硫键的半胱氨酸，如17位的半胱氨酸，用其他氨基酸加以替换，尤其是用丙氨酸加以替换，可进一步提供重组G-CSF的稳定性。
因此，在本发明的一个最佳实施例中，所提供的重组人粒细胞集落刺激因子，它在N端添加了甲硫氨酸-精氨酸-谷氨酸-丝氨酸，而且第17位上的半胱氨酸被丙氨酸所取代。
除了在N端进行上述的氨基酸添加和/或17位氨基酸的替换之外，本领域的技术人员知道，还可对其他位置的氨基酸进行修饰，如取代、插入或缺失。对于取代，可用性质相近的氨基酸加以取代。较佳地，这种氨基酸取代是在下表1中同一组别(代表性的取代)中进行，最佳地这种取代是下表1中优选的取代。
表1
| 最初的残基 | 代表性的取代 | 优选的取代 |
| Ala(A) | val；leu；ile | val |
| Arg(R) | lys；gln；asn | lys |
| Asn(N) | gln；his；lys；arg | gln |
| Asp(D) | glu | glu |
| Cys(C) | ser | ser |
| Gln(Q) | asn | asn |
| Glu(E) | asp | asp |
| Gly(G) | pro；ala | ala |
| His(H) | asn；gln；lys；arg | arg |
| Ile(I) | leu；val；met；ala；phe；正亮氨酸 | leu |
| Leu(L) | 正亮氨酸；ile；val；met；ala；phe | ile |
| Lys(K) | arg；gln；asn | arg |
| Met(M) | leu；phe；ile | leu |
| Phe(F) | leu；val；ile；ala；tyr | leu |
| Pro(P) | ala | ala |
| Ser(S) | thr | thr |
| Thr(T) | ser | ser |
| Trp(W) | tyr；phe | tyr |
| Tyr(Y) | trp；phe；thr；ser | phe |
| Val(V) | ile；leu；met；phe；ala；正亮氨酸 | leu |
对DNA进行遗传修饰的技术总结于诱变：一种实用方法(Mutagenesis：aPractical Approach)，M.J.McPherson，Ed.，(IRL Press，Oxford，UK.(1991)，例如包括定点诱变、盒式诱变和聚合酶链反应(PCR)诱变。该文献在此引用作为参考。
可以通过PCR法等方法，获得天然的和/或重组的G-CSF核苷酸序列，然后用各种本领域中熟知的诱变方法进行本发明所述的突变。本发明的一种G-CSF突变体的DNA序列在图1中列出。但是由于遗传密码的简并性，所以可以制备许多种核苷酸，它们都是能够指导合成本发明的重组G-CSF。因此，功能上与上述序列等价的DNA序列，或者功能上与指导合成本发明重组G-CSF蛋白质类似物(按照氨基酸序列产生的)的序列相等价的序列，都被包括在本发明之内。
对于本发明的编码新型重组G-CSF的核酸，通过限制性酶切，然后与质粒片段连接，可以被克隆入合适的载体如质粒中。对于选用的质粒，没有特别的限制，只要它能在选用的宿主细胞中复制和表达重组的G-CSF。
当然，该重组蛋白的编码序列也可整合如宿主细胞的基因组中。
含有编码新型重组G-CSF的核酸的质粒，一般含有合适的启动子、增强子等调控元件，以及合适的选择基因(如抗生素抗性基因，比如氨苄青霉素抗性基因；或营养缺陷型基因)，这些都是本领域中熟知的。可参见Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)。
携带本发明的重组G-CSF编码序列的表达载体，可用本领域熟知的方法，如电穿孔、共转染法等，转入合适的宿主细胞。宿主细胞可以是原核生物或真核生物，如大肠杆菌、枯草杆菌、昆虫细胞、CHO细胞等。但是较佳地是大肠杆菌。
在转化之后，用常规方法筛选出转化子。并根据所用的宿主细胞和表达载体，用本领域常规使用的培养基和培养条件来培养转化的细胞，从而表达重组的G-CSF。
在转化的宿主细胞表达本发明的重组G-CSF之后，如果重组蛋白被分泌入培养基中，可以直接从培养基中分离纯化出重组蛋白。如果重组蛋白是以包涵体形式被表达，那么可从培养物中，通过裂解细胞、分离、提纯等步骤获得所需的重组蛋白。这些步骤和方法都是本领域中熟知的，可参见例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)。
本发明还提供了一种药物组合物，它包括有效量的本发明的重组人粒细胞集落刺激因子和药学上可接受的载体或赋形剂。至于载体和/或赋形剂，可以在制备G-CSF药品中所采用的常规载体和/或赋形剂中加以选择。例如与水等制成水剂。
但是，如上所述，本发明的重组G-CSF不仅药效显著提高，而且稳定性也有明显提高，因此本发明的药物组合物除了被制成本领域中常见的水剂之外，还可被制成冻干粉剂，从而便于运输和储存。
下面结合实施例进一步阐述本发明。在本申请中，所用的术语和缩写是本领域中技术人员通用的术语和缩写。
实施例1
G-CSF突变体cDNA的制备
从中国人体单核细胞中提取mRNA，用标准RT-PCR技术制备G-CSF的cDNA。PCR中所用引物为：
上游引物：5’TGG ATC CAT GAC CCC CCT GGG CCC 3
下游引物：5’TAA GAT CTC AAG CTT TCA GGG CTG CGC AAG GTG GCGTA 3′
这对引物有如下特点：上游引物含BamHⅠ内切酶位点(GGATCC)，下游引物含有HindⅢ位点(AAGCTT)和BglⅡ位点(AGA TCT)。引入这些内切酶位点(粗体部分)是为了便于随后的克隆操作。
扩增出的序列与原序列相比，在5′端增加了ATG AGA GGA TTC 12个碱基，而3′端序列中以TGA为终止密码子。再利用诱变技术将原序列第49-51位碱基由TGC改为GCC。
实施例2
转化大肠杆菌
将560bp的PCR扩增产物，用Genclean System洗脱。然后用Bam HⅠ和HindⅢ在37℃消化2小时。消化产物用苯酚/氯仿抽提，用100％酒精沉淀，沉淀物用70％酒精洗涤一次。然后将此消化产物与事先用Bam HⅠ和HindⅢ消化的pQE3载体在16℃进行连接反应过夜。将连接产物pQE3-G-CSF转染大肠杆菌M15和JM109感受菌。然后接种于含抗生素的LB平板上。M15大肠杆菌宿主细胞用于rhG-CSF的高表达，而JM109宿主细胞用于对克隆的G-CSF cDNA结构进行特征鉴定。
通过对转化后JM109宿主细胞中G-CSF序列的鉴定，证实与设计是一致的。
同时，从转化的M15大肠杆菌中筛选出一种转化的大肠杆菌E.coli M15(G-CSFa)，该菌株于1997年10月18日保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC，中国武汉市)，保藏号为No.M97022。
实施例3
重组人粒细胞集落刺激因子突变体(G-CSFa)的生产
1、生产菌程(工业菌株)的制备检定从菌种库(-80℃的超低温冰箱内)中取G-CSFa生产菌种E.coli M15(G-CSFa)，划LB平板(在无菌超净工作台内进行)二块。接种后在37℃的恒温箱中培养18小时，挑选4个菌落，分别接种在含有3ml LB培养液的试管里，在自动摇床(G-25KC，New Brunswick Scientific，Inc.U.S.A)摇动培养14个小时(37℃)。此时测得该菌液在600nm吸收峰为0.8，然后每试管中加IPTG，使最终浓度为0.5mM继续培养3小时，从每试管中取等量1ml菌液离心，用15％SDS-PAGE检测G-CSFa的表达量。
2、种子液的准备
选上述G-CSF表达最高的为种子液培养。培养基选用TYP，该配方是每升含16克Bacto-胨，16克Bacto-酵母提取物、5克氯化钠、2.5克磷酸氢二钾和5克葡萄糖。在250毫升的TYP接种上述单一菌落的G-CSFa菌种，250转/分钟，37℃培养12个小时，该种子液共500毫升作进一步发酵使用。
3、工业化发酵
供工业发酵的发酵装置购自美国New Brunswick Scientific公司，型号Bio-Fol5000，40升。
工业发酵液：上述的种子液是进一步工业发酵液的母液。配制35升TYP培养液于Bio-Flo5000的发酵罐内，同时加入20ml的消泡剂(anti-foam M-10，HodagChemical Corp Skokie，Illinois，U.S.A.)，然后进行自身高温(121℃和1.2kg/cm2的压力下)灭菌30分钟。当冷却到37℃后，在37℃中过夜，第二天检查培养液为澄清，无污染。
将准备好的500毫升G-CSFa种子液接种到35升的培养液中，发酵条件温度为37℃，转速500rpm，pH7.0，空压0.14kg／cm2，通氧量15L/min，溶氧100％。4小时后加入7克IPTG，再加入10毫升消泡剂，pH值用氨水调节。
4、收菌
用工业化连续性自动离心机(CEPA A14/)收集菌体，10，000g，4℃，测定菌体重量。
5、G-CSFa包涵体的提取与粗纯化
(1)细胞的裂解
将约40克的菌体悬浮在0.8升的提取液A(50mM T-HCl 5mM EDTA pH8.0)中，然后再加200毫升含有250毫克的裂解酶(Lysozyme)的提取液A，在室温下搅拌10分钟，此时，提取液的粘度大大增加，表明细菌已裂解。
(2)离心和清洗
裂解液离心条件为10，000g×10分钟，4℃，收取沉淀的包涵体，均匀地悬浮于50mM的磷酸缓冲液(含0.15M的氯化钠和4M尿素，pH7.0)，离心后的沉淀加10ml上述缓冲液(W/V=1/10)，收集包涵体，计算回收率。
用不同浓度的尿素洗涤包涵体。使包涵体滤液浮于尿素中，离心10分钟，结果表明用4M尿素洗涤可最大提高包涵体样品中G-CSFa的纯度，而且包涵体丢失少。
此外，优选采用的裂介酶是水溶性的，因为包涵体是不溶性的。这样，用此方法得到G-CSFa包涵体及以后在精制过程中G-CSFa便可最大限度地降低该酶造成残余污染的可能性。
6、G-CSFa蛋白的复性、粗纯与精纯化
(1)G-CSFa蛋白的复性
经过上述纯化的G-CSFa是一种无生物学活性和非水溶性的蛋白。该蛋白需要经过一系列构象转化的处理，使之成为可溶性且具有生物活性的G-CSFa蛋白，这一过程为GCSFa蛋白复性。
具体方法步骤为：取上述纯化的包涵体10克，溶于2000毫升含有6M盐酸胍，20ml DTT，20mm EDTA的0.1M Tris-HCl缓冲液，pH7.5，在室温中搅拌1小时，然后离心30分钟(10，000g)。取上清液，超滤浓缩，将含有G-CSFa的上清液通往直径4cm，柱长1.2米(床体积1.5升)的Sephadex G-25层析柱。该柱用盐酸胍，20mM EDTA(pH7.0)溶液平衡。整个层析过程在Bio-Pilot纯化系统(Pharmacia Biotech，INC，U.S.A.)上进行，流速为40毫升/小时，用UV-280NM分光光度计和SDS-PAGF(15％)检测G-CSF蛋白峰，收集G-CSFa蛋白。然后将该溶液用1M的盐酸胍稀释到蛋白浓度为0.3mg/ml，并透析于含0.5M盐酸胍、20mM EDTA、0.01％吐温80和40mM醋酸钠(pH5.4)缓冲溶液中，每隔8小时换一次新配的磷酸钠缓冲液，总共清换三次，上述透析过程都在4℃的活动冷库中进行。
将透析后的G-CSFa粗纯溶液4℃离心30分钟(10，000g)并取上清液。检测复性蛋白，并计算复性率，复性率=复性蛋白/包涵体湿重。
(2)浓缩与精纯化
在活动冷库(4℃)中，用浓缩超滤器(Minnitan，Millipore Corp.MA，U.S.A.)将上述的G-CSFa上清液进行浓缩，浓缩到300ml，浓缩的G-CSFa进一步用60毫升CM-Sephadex的正离子交换树脂纯化。该柱在20mM的醋酸钠(pH5.4)缓冲液中平衡，然后用0.125M的氯化钠溶液洗脱G-CSFa，浓缩后上样于柱直径6厘米。柱长1.0米(床体积约1.7升)的Superdex75层析柱。该柱在10mM的醋酸钠，pH4.00.004％吐温的溶液中平衡。整个柱层析纯化过程在Pharmacia Biotech的Biopilot纯化装置上进行，流速500ml/小时。用UV-280nm分光光度计检测G-CSFa的峰值，并结合SDS-PAGE(15％)分析法测定每管的G-CSFa的纯度。
实施例4
含G-CSFa的药物组合物
(1)去内毒素与除菌
将实施例4中获得的G-CSFa精制品通过20ml的polymyxin柱(Bio-Rad)，缓冲液为10mM NaAc，pH4.0，收集过滤液，在pH4的10mM NaAc缓冲液中透析，然后用0.22u滤膜除菌。
(2)成品制剂的配制与分装
(ⅰ)水剂：每75ug G-CSFa蛋白与10mM乙酸钠、0.004％吐温80、5％D-甘露醇混合，配制成注射用成品，每支安瓿分装0.3ml。
(ⅱ)冻于粉剂：按常规方法，将G-CSFa制成冻干粉剂，剂量为100微克/剂。
实施例5
G-CSFa的药效和稳定性测定
对于实施例4中获得的G-CSFa，委托美国哈佛大学及辛辛那提医学院，用G-CSF鉴定细胞株NFS60，对该变异体进行鉴定。结果示于图4，图中ED50是半数有效浓度，即50％细胞增长的药物浓度。ED50数值越小，则药物作用越强。结果表明，本发明的突变体G-CSFa，与市售的国外产品G-CSF(惠尔血)相比，药效提高10倍以上(即本发明的突变体的ED50是惠尔血的1/10)。
根据中国科学院上海药物研究所和上海医科大学药物研究中心完成的药代动力学、药效学及急性毒理等鉴定结果表明：本发明的G-CSFa水剂和市场上的标准水剂型(惠尔血)相比，对人体骨髓细胞和小鼠粒细胞的提升分别提高8倍和6倍。对于化疗后的猴子试验中所采用的3个浓度(2、10和50微克/千克)，本发明的G-CSFa水剂比标准样品(惠尔血)高得多。
在小鼠身上，使用600倍正常剂量的本发明G-CSFa，结果无一小鼠发生过敏反应或死亡。
因此，这些结果表明，本发明的G-CSFa比已有技术中的相同产品具有更显著的疗效。
此外，本发明的G-CSFa的稳定性也有进一步显著提高。由于G-CSF药品的药效不稳定，所以目前国际市场上只有水剂型，且运输和储存均要求在4℃进行。而本发明的G-CSFa可制成冻干粉剂，从而大大有利于G-CSF药物组合物的运输和储存，并延长了药物的保质有效期。
用细胞株上进行鉴定，该冻干粉剂的药效比标准G-CSF的水剂型高4倍，在猴子身上的药效与标准G-CSF相当。
尽管本发明是结合本发明的最佳实施例进行描述的，但是本领域的技术人员知道，可在所附权利要求限定的范围内对本发明进行各种改动或修饰，这些改动或修饰形式同样落于本发明范围内。
Claims (8)
1．一种重组的人粒细胞集落刺激因子，其特征在于，它在序列N端添加4-6个氨基酸，且该4-6个氨基酸包含序列：甲硫氨酸-精氨酸-谷氨酸-丝氨酸。
2．如权利要求1所述的重组人粒细胞集落刺激因子，其特征在于，该因子在N端添加的氨基酸序列是甲硫氨酸-精氨酸-谷氨酸-丝氨酸。
3．如权利要求1或2所述的重组人粒细胞集落刺激因子，其特征在于，该因子第17位上的半胱氨酸被丙氨酸所取代。
4．一种表达载体，其特征在于，它含有编码权利要求1所述的重组人粒细胞集落刺激因子的核酸序列。
5．一种表达如权利要求1所述的人粒细胞集落刺激因子的宿主细胞，其特征在于，它是大肠杆菌。
6．如权利要求5所述的宿主细胞，其特征在于，它是E.coli M15(G-CSFa)，CCTCC No.M97022。
7．一种药物组合物，其特征在于，它包括有效量的权利要求1所述的重组人粒细胞集落刺激因子和药学上可接受的载体或赋形剂。
8．如权利要求7所述的药物组合物，其特征在于，它是冻干粉剂或水剂。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN97123162A CN1061992C (zh) | 1997-11-19 | 1997-11-19 | 新的重组人粒细胞集落刺激因子及其药物组合物 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN97123162A CN1061992C (zh) | 1997-11-19 | 1997-11-19 | 新的重组人粒细胞集落刺激因子及其药物组合物 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN1217342A CN1217342A (zh) | 1999-05-26 |
| CN1061992C true CN1061992C (zh) | 2001-02-14 |
Family
ID=5176978
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN97123162A Expired - Fee Related CN1061992C (zh) | 1997-11-19 | 1997-11-19 | 新的重组人粒细胞集落刺激因子及其药物组合物 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN1061992C (zh) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104906053B (zh) * | 2015-06-12 | 2018-01-16 | 北京四环生物制药有限公司 | 注射用重组人粒细胞刺激因子冻干粉针剂 |
| IL247369B (en) * | 2016-08-18 | 2018-08-30 | B G Negev Tech And Applications Ltd | Polypeptides derived from CSF-m and their uses |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN86106815A (zh) * | 1985-09-17 | 1987-09-09 | 中外制药株式会社 | 人粒性白细胞集落刺激因子 |
| CN1132527A (zh) * | 1993-01-28 | 1996-10-02 | 安姆根有限公司 | G-csf类似物组合物及其制备方法 |
-
1997
- 1997-11-19 CN CN97123162A patent/CN1061992C/zh not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN86106815A (zh) * | 1985-09-17 | 1987-09-09 | 中外制药株式会社 | 人粒性白细胞集落刺激因子 |
| CN1132527A (zh) * | 1993-01-28 | 1996-10-02 | 安姆根有限公司 | G-csf类似物组合物及其制备方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN1217342A (zh) | 1999-05-26 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN87104963A (zh) | 含有粒性的白细胞集落刺激因子的稳定药剂及其生产方法 | |
| US9193761B2 (en) | Method for purifying human granulocyte-colony stimulating factor from recombinant E. coli | |
| CN103079586B (zh) | G‑csf二聚体在治疗嗜中性粒细胞减少症中的应用 | |
| US20070293660A1 (en) | Method for purifying granulocyte-colony stimulating factor | |
| KR970005042B1 (ko) | 종양괴사인자-알파 뮤테인 | |
| CN101514229B (zh) | 人干扰素α衍生物及其聚乙二醇化修饰物 | |
| CN1061992C (zh) | 新的重组人粒细胞集落刺激因子及其药物组合物 | |
| CN1313612C (zh) | 一种重组人粒细胞集落刺激因子的生产方法 | |
| HU194316B (en) | Process for preparing alpha-l human leukocyte interferone | |
| CN104152515A (zh) | 一种制备重组人粒细胞集落刺激因子的培养基及发酵方法 | |
| CN108484749B (zh) | 一种重组可溶性人源骨靶向干扰素γ-1b及其制备方法 | |
| CN114539426B (zh) | 一种含干扰素α的融合蛋白、表达该融合蛋白的重组菌株及其制备方法 | |
| EP0591605A2 (en) | Method for suppressing coloring of human serum albumin | |
| CN1125081C (zh) | 重组天然和新型人胰岛素及其制备方法 | |
| CN100363500C (zh) | 重组人粒细胞集落刺激因子的制备方法 | |
| CN1088107C (zh) | 人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子制备方法及其表达载体和工程菌 | |
| EA015498B1 (ru) | Способ получения г-ксф человека | |
| CN102807619A (zh) | 含有免疫球蛋白Fc片段和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子的复合物及其药物组合物 | |
| CA2044468C (en) | Canine granulocyte macrophage colony stimulating factor | |
| RU2321424C1 (ru) | ПРЕПАРАТ, РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК pSX70, КОДИРУЮЩАЯ СИНТЕЗ РЕКОМБИНАНТНОГО ЧЕЛОВЕЧЕСКОГО ГРАНУЛОЦИТ-КОЛОНИЙСТИМУЛИРУЮЩЕГО ФАКТОРА (Г-КСФ), ШТАММ Escherichia coli SX70-ПРОМЫШЛЕННЫЙ ШТАММ ПРОДУЦЕНТ РЕКОМБИНАНТНОГО ЧЕЛОВЕЧЕСКОГО Г-КСФ И СПОСОБ ПРОМЫШЛЕННОГО ПОЛУЧЕНИЯ Г-КСФ | |
| CN1142281C (zh) | 重组人红细胞生成素制剂的制备生产方法 | |
| CN117304344B (zh) | 一种融合蛋白、表达该融合蛋白的重组菌株及其应用 | |
| CN1224759A (zh) | 人内皮细胞抑制素基因及其表达产物的生产和应用 | |
| CN1101403C (zh) | 粒细胞集落刺激因子的制备 | |
| CN1100464A (zh) | 一种人肿瘤坏死因子α衍生物及其制备方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| C56 | Change in the name or address of the patentee |
Owner name: SUZHOU FANGZHOU GENE PHARMACEUTICAL CO., LTD. Free format text: FORMER NAME: SUZHOU JIQI FANGZHOU GENE PHARMACEUTICAL CO., LTD. |
|
| CP03 | Change of name, title or address |
Address after: 215126 No. 277, green hill street, Suzhou Industrial Park, Jiangsu Patentee after: Suzhou Fangzhou Gene Pharmaceutical Co., Ltd. Address before: 215000, Suzhou Industrial Park, three District, Jiangsu Patentee before: Suzhou Jiqifangzhou gene Pharmaceutical Co. Ltd. |
|
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20010214 Termination date: 20151119 |
|
| EXPY | Termination of patent right or utility model |