CN101830977A - 一种重组人粒细胞刺激因子的纯化方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种重组人粒细胞刺激因子的纯化方法，采用的大肠杆菌表达重组人粒细胞刺激因子rhG-CSF为包涵体形式，包括下述纯化步骤：(1)采用优化的包涵体洗涤液配方进行洗涤，获得高纯度的包涵体；(2)对洗涤后的包涵体样品进行超滤复性；(3)复性后样品通过Capto ViralQ柱层析；(4)然后通过Superdex 75凝胶过滤柱层析，得到纯化后的重组人粒细胞刺激因子rhG-CSF原液。本发明具有工艺简便快速，步骤少，收率高，纯度高，样品各项指标均符合欧洲药典要求，在兼顾环保的同时，提高药品的安全性、可控性和有效性的特点。

Description

一种重组人粒细胞刺激因子的纯化方法

技术领域

本发明涉及一种重组人粒细胞刺激因子的纯化方法。属于蛋白质纯化领域，是简单高效地制备高纯度，高收率的药用rhG-CSF原液的方法。

背景技术

rhG-CSF是调节骨髓中粒系造血的主要细胞因子之一，选择性作用于粒系造血祖细胞，促进其增殖、分化，并可增加粒系终末分化细胞的功能。人G-CSF的氨基酸序列为：TPLGPASSLP QSFLLKCLEQVRKIQGDGAA LQEKLCATYK LCHPEELVLL GHSLGIPWAP LSSCPSQALQLAGCLSQLHS GLFLYQGLLQ ALEGISPELG PTLDTLQLDV ADFATTIWQQMEELGMAPAL QPTQGAMPAF ASAFQRRAGG VLVASHLQSF LEVSYRVLRHLAQP

1991年，第一个通过大肠杆菌表达系统生产的rhG-CSF药物Filgrastim(Neupogen，r-metHuG-CSF，Amgen Inc)在美国上市，1993年，通过CHO表达系统生产的无N-端甲硫氨酸的rhG-CSF药物Lenograstim(Granocyte，Chugai Pharmaceutical Co.Ltd.)在欧洲上市。此后，国内外又有多家公司的rhG-CSF药物上市。

目前报道的关于G-CSF的专利，其主要的研究方向以下几种情况：(1)通过改变表达体系，提高表达量：如中国专利申请200810113138.7报道了G-CSF连接信号肽，目的蛋白在工程菌周质腔表达；(2)改进发酵工艺，如通过高密培养，改变培养基配方，培养条件等手段，实现工程菌的高表达，但这些方面目前并无实质性的突破，而只是作为与生产工艺的一部分被提及；(3)优化复性工艺、纯化步骤，如中国专利96106418.8报道了使用中空纤维超滤透析复性方法，中国专利申请200410027943.x报道了通过2次复性以及超滤处理样品对纯化过程进行优化；中国专利申请200410007171.3报道了一步法纯化rhG-CSF，纯化产物纯度达到95％以上，可用于G-CSF的进一步修饰；中国专利申请200510045388.8报道了先对G-CSF进行初步纯化，再进行复性，使原液细菌内毒素残留量水平明显降低，复性率提高。中国专利申请200810064653报道了使用反相色谱法精细纯化G-CSF的专利。

以上专利报道中对于检测方法的描述往往比较含糊或不提及，这样就很难对纯化后样品的纯度究竟达到何程度有明确的认识，给评价不同专利中提到的纯化方法带来了困难。以达到95％的纯度为例，电泳纯度与液相色谱纯度可能有极大的区别；基于不同分离原理的液相色谱纯度检测方法来评价同一样品，得到的结果也大相径庭；同一种型号的柱子，当检测条件不同时，对杂质的检出率也有明显区别。

发明内容

为了解决上述问题，本发明的目的在于提供了一种重组人粒细胞刺激因子的纯化方法，本发明具有工艺简便快速，步骤少，收率高，纯度高，样品各项指标均符合欧洲药典要求，在兼顾环保的同时，提高药品的安全性、可控性和有效性的特点。

为达到上述的目的，本发明采用如下技术方案：

一种重组人粒细胞刺激因子的纯化方法，采用的大肠杆菌表达重组人粒细胞刺激因子rhG-CSF为包涵体形式，包括下述纯化步骤：

(1)采用优化的包涵体洗涤液配方进行洗涤，获得高纯度的包涵体；

(2)对洗涤后的包涵体样品进行超滤复性；

(3)复性后样品通过Capto Vira1Q柱层析；

(4)然后通过Superdex 75凝胶过滤柱层析，得到纯化后的重组人粒细胞刺激因子rhG-CSF原液。

所述的步骤(1)中包涵体洗涤液配制如下：EDTA 1mM；盐酸胍2M；pH8.5±0.05的Tris-HCl 50mM；Nacl 50mM。

所述的步骤(2)中超滤复性条件为：包涵体溶于包涵体溶解液中，溶解后的包涵体样品，采用10mM/L的DTT还原剂，充氮避光2小时后，加入复性液中混匀后开始超滤，采用恒体积透析，在超滤系统内保持体积和浓度恒定，跨膜压力(TMP)不大于50psig，使流加的洗滤液速度与透出液速度相同，共稀释复性45～80分钟。

所述的包涵体溶解液配方为：盐酸胍6M；pH8.5±0.05的Tris-HCl50mM；Nacl40mM。

所述的复性液配方为：盐酸胍4M；pH8.5±0.05Tris-HCl50mM；Nacl20mM。

所述的步骤(3)中的Capto ViralQ柱层析采用的洗脱液为：pH7.5±0.05的50mM磷酸盐和0.23M Nacl。

所述的步骤(4)中的Superdex 75凝胶过滤层析采用的洗脱液为：50mM醋酸盐缓冲液。

本发明的有益效果是：

(1)独特的包涵体洗涤步骤，为后续的纯化奠定了基础。

(2)工艺简单，步骤少。复性后样品的纯度已达到90％以上；1步柱层析将样品纯化至药用要求；样品只经过2步纯化，即可得到原液。

(3)原液质量超过中国药典要求，符合欧洲药典EP6.3版的标准，反相色谱纯度(CP法)达到99％以上，排阻色谱纯度达到99％以上，反相色谱纯度(EP)法达到98％以上，残余工程菌蛋白含量低于0.005％，低于国家标准的10分之1，细菌内毒素每毫克低于0.25EU，仅相当于国家标准的120分之1(标准为10EU/300μg)。

(4)高载量、高流速处理大体积样品，大大缩短工艺时间，可进行大规模生产：工艺单批规模可达到100g以上。

本发明紧密结合先进的质量检测手段，确证纯化效果达到要求。包涵体洗涤前后进行了电泳考察对比；2步层析柱后样品均进行了电泳和液相双检测；对于原液的检测不仅使用了电泳和液相色谱法同时检测，而且仅针对反相色谱，就同时使用了欧洲药典方法和中国药典方法的同时检测。本工艺实现了以下几个目的：独特的样品预处理；柱层析步骤少；工艺收率高，规模大；样品质量高，用目前已知的最严格的药用国际标准来控制样品质量。

本发明的另一个明显优势是：完全避免了强有机溶剂在生产工艺中的使用。乙腈和甲醇是一种常见的纯化用试剂，以达到蛋白质精细纯化，获得高纯度的目的。当在规模化生产中使用反相色谱方法进行蛋白的纯化时，乙腈和甲醇等有机溶剂的用量很大，它们都属于有毒性的溶剂，大量使用有机溶剂带来一系列的问题：不仅价格昂贵，生产成本过高；样品中的残余溶剂可能带来安全性隐患；废水的处理会产生大量的环保处理费用；如排放到环境中，将对环境带来污染。本工艺在不降低任何收率和纯度指标的情况下，避免使用有机溶剂，优点突出。

附图说明

图1是本发明包涵体洗涤前后SDS-PAGE电泳图谱；

图2是本发明复性样品和纯化中间体SDS-PAGE电泳图谱；

图3是本发明复性后样品的HPLC图谱；

图4是本发明样品通过Capto Vira1Q柱后样品的HPLC图谱；

图5是本发明样品通过Superdex 75凝胶过滤后样品的HPLC图谱；

图6是本发明rhG-CSF原液SDS-PAGE电泳图谱；

图7是本发明rhG-CSF原液HPLC-RPC图谱(中国药典法)；

图8是本发明rhG-CSF原液HPLC-RPC图谱(欧洲药典法)。

具体实施方式

下面通过具体实施例，对本发明作进一步的描述。

本实施例采用的大肠杆菌表达重组人粒细胞刺激因子rhG-CSF为包涵体形式，首先采用优化的包涵体洗涤液配方进行洗涤，获得高纯度的包涵体；包涵体洗涤液采用：1mM EDTA；2M盐酸胍；50mM Tris-HClpH8.5±0.05；50mM  Nacl。然后对洗涤前后的包涵体取样做电泳(SDS-PAGE0)，得到如图1所示的电泳图谱，如图1所示，洗涤后包涵体的杂质量显著减少，尤其高分子区的杂质大大减少，经严格控制复性中采用的还原和氧化条件后可使复性后样品的纯度提高。高分子区的杂带明显减少。

然后对洗涤后的包涵体样品进行超滤复性，包括以下步骤：①取洗涤后的包涵体(1000g左右)溶于包涵体溶解液(盐酸胍6M；pH8.5±0.05的Tris-HCl50mM；Nacl40mM)中，加10mM/L的DTT还原剂，充氮避光2小时后备用。用0.5N NaOH溶液清洗MaxCell UFP-5-C-85超滤系统30min，清洗后用注射水冲洗至中性。

②稀释复性：将①中备用的包涵体溶解液加入复性液(盐酸胍4M；pH8.5±0.05Tris-HCl50mM；Nacl20mM)中混匀后，泵入超滤系统储罐中开始超滤，采用恒体积透析，在超滤系统内保持体积和浓度恒定，跨膜压力(TMP)不大于50psig，使流加的洗滤液速度与透出液速度相同，(洗滤液为pH 8.5±0.05Tris-HCl 50mM；恒体积透析：一边超滤流出超滤透出液，一边往复性罐中流加等体积的洗滤液，目的是缓慢地降低复性液中盐酸胍、DTT还原剂等的浓度)共稀释复性45～80分钟。

③收样：稀释完毕浓缩收样，按10ml/L加5M醋酸盐调pH4.0～4.8。10000rpm、10℃离心30min，收集上清，取样送检扫描，电泳(SDS-PAGE)和液相色谱检测。如图2，图3所示，复性样电泳图谱中的4条杂质带均小于2％的控制带，液相纯度为91.68％。本步骤得到的复性液电泳纯度已达到90％以上。反相色谱纯度达到90％以上。复性液收率：蛋白总量(扫描计)已不低于包涵体重量的10％，以包涵体干重计算，复性率不低于60％。

再是通过G I层析柱层析

①φ100G I柱层析：用0.5NNaOH按200±10％cm/h流速清洗30min，用注射用水按相同流速洗至中性，后用50mM磷酸盐缓冲液(pH 7.5±0.05)，按350±10％cm/h流速平衡I柱约10倍柱体积。

②复性液中加Tris-HCl缓冲液调pH7.5±0.05，并按350±10％cm/h流速上样，上样完毕，用50mM磷酸盐+0.23M Nacl(pH7.5±0.05)液按相同流速洗脱，收集目标峰，按4ml/L加5M醋酸盐调pH4.0～4.8后，超滤浓缩，取样送检：扫描，电泳(SDS-PAGE)和液相色谱检测，如图2，图4所示，I柱后样电泳图谱中的杂质量小于2％的控制带，液相纯度为97.12％。得出本步骤得到的I柱后样，电泳及液相色谱纯度均达到95％以上。

最后是进行GII柱层析

①φ200GII柱层析：用0.5NNaOH按20±10％cm/h流速清洗30min，用50mM醋酸盐缓冲液按20±10％cm/h流速平衡II柱4倍柱体积。以相同流速上样。

②上样完毕，用50mM醋酸盐缓冲液按相同流速洗脱，收集目标峰，取样并送检。扫描，电泳(SDS-PAGE)和液相色谱检测，如图2，图5所示，II柱后样电泳图谱中的杂质量小于2％的控制带，液相纯度为98.54％。得出本步骤得到的II柱后样，电泳及液相色谱纯度均达到98％以上。

通过本步骤后得到纯化后的重组人粒细胞刺激因子rhG-CSF原液，对其进行扫描，电泳(SDS-PAGE)和液相色谱检测，如图6所示，原液电泳(SDS-PAGE)的杂质小于1％控制带，原液的电泳(SDS-PAGE)纯度达到99％以上。然后将纯化后的重组人粒细胞刺激因子rhG-CSF原液进行反相色谱纯度检测，如图7所示，(中国药典CP法)达到99％以上，排阻色谱纯度达到99％以上，再将纯化后的重组人粒细胞刺激因子rhG-CSF原液进行反相色谱纯度检测，如图8所示，(欧洲药典EP)法达到98％以上，残余工程菌蛋白含量低于0.005％，低于国家标准的10分之1，细菌内毒素每毫克低于0.25EU，仅相当于国家标准的120分之1。

本实施例旨在建立一种优化的rhG-CSF的纯化工艺，工艺简便快速，步骤少，收率高，纯度高。尤其重要的是，本发明改进了包涵体的洗涤方法，使包涵体中的杂质，尤其是高分子区的杂质大大减少；严格控制复性中采用的还原和氧化条件，使复性后样品的纯度达到90％以上；样品经过第一步柱层析(Capto ViralQ柱)后，电泳纯度和HPLC纯度已经达到95％以上，残余菌体蛋白和残余细菌内毒素含量大大低于药典标准要求，也就是说，一步柱层析即可符合中国药典规定的药用要求；经过第二步层析(Superdex 75凝胶过滤)，样品各项指标均符合欧洲药典要求。

本实施例优化柱层析前的样品处理，仅通过2步层析步骤即可获得收率和纯度均极高的原液，特别适合用于rhG-CSF相关药品的规模化生产及作为进一步进行PEG化等修饰的rhG-CSF原料制备工艺。由于产品的纯度显著提高，制备工艺得到简化，用到的有机溶剂量减少，极大提高药品的安全性、可控性和有效性，同时兼顾了环境保护。

Claims (7)

1.一种重组人粒细胞刺激因子的纯化方法，采用的大肠杆菌表达重组人粒细胞刺激因子rhG-CSF为包涵体形式，其特征在于包括下述纯化步骤：

(1)采用优化的包涵体洗涤液配方进行洗涤，获得高纯度的包涵体；

(2)对洗涤后的包涵体样品进行超滤复性；

(3)复性后样品通过Capto ViralQ柱层析；

(4)然后通过Superdex 75凝胶过滤柱层析，得到纯化后的重组人粒细胞刺激因子rhG-CSF原液。

2.如权利要求1所述的一种重组人粒细胞刺激因子的纯化方法，其特征在于：所述的步骤(1)中包涵体洗涤液配制如下：EDTA 1mM；盐酸胍2M；pH8.5±0.05的Tris-HCl 50mM；Nacl 50mM。

3.如权利要求1所述的一种重组人粒细胞刺激因子的纯化方法，其特征在于：所述的步骤(2)中超滤复性条件为：包涵体溶于包涵体溶解液中，溶解后的包涵体样品，采用10mM/L的DTT还原剂，充氮避光2小时后，加入复性液中混匀后开始超滤，采用恒体积透析，跨膜压力不大于50psig，使流加的洗滤液速度与透出液速度相同，稀释复性45～80分钟。

4.如权利要求3所述的一种重组人粒细胞刺激因子的纯化方法，其特征在于：所述的包涵体溶解液配方为：盐酸胍6M；pH8.5±0.05的Tris-HCl 50mM；Nacl 40mM。

5.如权利要求3所述的一种重组人粒细胞刺激因子的纯化方法，其特征在于：所述的复性液配方为：盐酸胍4M；pH8.5±0.05Tris-HCl 50mM；Nacl 20mM。

6.如权利要求1所述的一种重组人粒细胞刺激因子的纯化方法，其特征在于：所述的步骤(3)中的Capto ViralQ柱层析采用的洗脱液为：pH7.5±0.05的50mM磷酸盐和0.23M Nacl。

7.如权利要求1所述的一种重组人粒细胞刺激因子的纯化方法，其特征在于：所述的步骤(4)中的Superdex 75凝胶过滤层析采用的洗脱液为：50mM醋酸盐缓冲液。

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