TW201738264A - 一種重組人粒細胞刺激因子的復性及純化方法 - Google Patents

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Abstract

本發明公開了一種重組人粒細胞刺激因子的復性及純化方法。具體而言，本發明藉由在復性前以緩衝液置換方式去除還原劑，提高了復性工藝的可控性和復性率。另外，本發明的復性純化方法還優化了復性緩衝液的組成。同現有技術相比較，本發明更加適合大規模工業化放大生產，對設備要求低，操作簡單，得到的蛋白純度高，穩定性好，可降低最終產品在臨床中的副作用，提高藥品的安全性和有效性。

Description

一種重組人粒細胞刺激因子的復性及純化方法
本發明涉及的是生物醫藥及生物工程下游蛋白純化領域，具體的涉及一種重組人粒細胞刺激因子(recombinant human granulocyte colony stimulating factor，rhG-CSF)的復性及純化方法，本發明復性率高，操作簡單，適合於工業化放大生產。
人粒細胞集落刺激因子(human granulocyte colony stimulating factor，hG-CSF)屬於造血生長因子家族。hG-CSF是由單核巨噬細胞、血管內皮細胞及成纖維細胞合成的蛋白，由174個胺基酸組成，分子量為19KD，其序列是公知的，如序列1所示。hG-CSF的主要作用機理有：(1)特異地作用於骨髓粒細胞和巨噬細胞的前驅細胞，促進其向成熟粒細胞分化、增殖；(2)作用於骨髓成熟中性粒細胞，促進其從骨髓向外周血釋放；(3)啟動成熟粒細胞的功能，增強其遊走、吞噬及殺菌能力，延長其存活時間；(4)刺激骨髓造血幹細胞向外周血釋放。
hG-CSF在臨床上有非常廣泛的用途，治療各種原因引起的中性粒細胞減少症，目前主要用於防治化療及放療後引起的骨髓抑制；此外還用於自身骨髓移植、某些類型的白血病、愛滋病的白血球減少和再生障礙性貧血等，均顯示具有顯著的療效。
hG-CSF的天然來源有限，產量甚微，不能滿足臨床應用的需要。同時聚乙二醇修飾的hG-CSF實現了長效增加外周血中性粒細胞數的目的，其規模化生產同樣需要大量的hG-CSF原液，因此hG-CSF原液的大規模生產有重大的經濟意義和社會意義。
大腸桿菌是目前最為廣泛用來表達外源蛋白的表達系統，然而rhG-CSF在大腸桿菌系統中基本以包涵體形式表達，表達產物沒有生物活性，欲利用其生物活性，必須先經變性劑充分溶解，然後經復性過程恢復其天然構象，才能得到高活性的蛋白樣品，爾後藉由純化步驟得到高純度，有功能的產品。利用rhG-CSF不依賴於糖基化修飾即可發揮天然分子相應的生物學活性的特點，選擇在大腸桿菌中表達該蛋白是最為簡便可行而且產率較高的方法。
工藝研發過程中，影響得率的主要步驟在於復性，復性效果好，得率必然高。復性完全是自發和隨機的，因此復性速度慢，回收率低。目前國內外所用的蛋白質復性方法均是依據排除使蛋白變性的環境，具體方法有透析法、超濾復性、管柱復性、稀釋法等。
透析法需要時間長，且需要多次更換透析溶液，同時 透析袋內部溶液在透析過程中是不均一的，靠近透析膜的溶液變性劑濃度下降快而內部下降慢，只有部分蛋白處於適於復性的環境，其他蛋白很容易聚集、絮凝、沉澱，使復性回收率下降，更主要的是受透析袋規格的限制，透析法難以放大至生產規模。
Amgen公司的美國專利5,849,883在1998年公開了一種G-CSF純化方法，其中rhG-CSF的復性採用了在攪拌條件下加入硫酸銅，藉由金屬離子氧化的方式進行蛋白復性。該方法缺點是有痕量金屬離子殘留的風險，進而影響藥品相關檢測及藥品安全性，目前在工業化生產中已很少採用。
中國專利CN1167150A報導了使用中空纖維超濾的方式進行rhG-CSF的復性，雖然可以用於大規模生產，但存在以下缺點：①受濃差極化現象影響，復性蛋白溶液在中空纖維柱內濃度並不均一，容易出現蛋白絮集、沉澱甚至堵塞中空纖維柱的情況；②大規模生產中往往需要長度超過90cm的中空纖維柱提供足夠的膜面積，研發階段的中空纖維柱長度都是在30-60cm範圍內，因此中空纖維超濾的操作無法線性放大，對於複雜的復性過程難以進行細緻的工藝研究來保障工藝的穩定性。
中國專利CN102344931A提供了一種鎳親和層析管柱復性的方法，該方法操作繁瑣，難以放大。中國專利CN104120159 A提供了一種Sephadex G-25管柱層析復性的方式，層析管柱直徑在5-20cm，管柱床高度60-100cm，層析 上樣蛋白濃度1.0-2.0mg/ml，上樣體積小於管柱床體積的20%，上樣和洗脫流速為5-10cm/h；按其報導的規模計算，批量約為10-20g，難以滿足商業化生產的需要。
稀釋復性同其他方法相比而言具有設備要求簡單、操作方便、成本低、容易放大的優點，但是也存在大量錯誤的折疊和聚合，以至蛋白沉澱，使復性收率大大降低，平均只有20%左右。
中國專利CN1718739 A報導的rhG-CSF的復性方法是：第一次稀釋復性20小時以上→超濾濃縮→第二次稀釋復性96小時以上→超濾濃縮，即進行兩次稀釋復性操作和兩次超濾處理，該方法雖然結合使用了稀釋復性和超濾處理，復性率較高，但是存在復性步驟多、復性時間過長、效率低的缺點，這勢必影響整體收率並增加工藝放大的難度。
針對上述問題，從包涵體變性溶解及復性的整個過程考慮，在包涵體蛋白變性溶解過程中需加入還原劑對其進行還原，通常使用二硫蘇糖醇(DL-Dithiotheitol,DTT)，然而，由於DTT容易被氧化，穩定性較差，而且容易揮發，作用易受環境影響，難以控制，因此在包涵體溶解後增加去除DTT的步驟再稀釋復性是穩妥的做法。
中國專利CN101045742A提供了一種重組人粒細胞刺激因子的復性純化方法，在復性前增加了將裂解液進行Sephadex G-25分離，去除多餘的還原劑DTT的步驟，復性品質收率高於50%，純化後rhG-CSF的RP-HPLC純度高於 97%，該方法藉由Sephadex G-25層析雖然可以達到除去裂解液中過量還原劑的目的，但是含有Urea的裂解液鹽濃度極高，進行Sephadex G-25層析時存在反壓大，存在層析流速慢，處理時間長，工業化放大難度大的缺點。
同時，在復性過程中需要為蛋白分子內二硫鍵的正確形成提供適當的氧化還原環境，通常所用的氧化還原劑為GSH/GSSG，其中GSH和GSSG的比例也會影響蛋白的復性效率。藉由研究不同GSH和GSSG的添加比例對復性效果的影響，本發明創新性地開發了僅添加GSSG進行rhG-CSF稀釋復性的方法，開發了一種rhG-CSF更簡單、高效的復性和純化工藝。
本發明提供了一種重組人粒細胞刺激因子的製備方法，包括以下步驟：a)對rhG-CSF基因工程菌進行發酵培養，經分離和洗滌，獲得精製的包涵體；b)包涵體經變性液溶解得變性蛋白液；c)對變性蛋白液進行緩衝液置換，得置換後變性液；d)將置換後變性液進行稀釋復性；e)對復性後的rhG-CSF進行純化，獲得rhG-CSF原液。
其中，該步驟a中rhG-CSF基因工程菌係由帶有rhG-CSF基因的重組質粒轉化的大腸桿菌，如重組質粒pBV220/G-CSF轉化的大腸桿菌DH5α菌株。
包涵體洗滌緩衝液可以是：緩衝液A(5-100mmol/L Tris-HCl，2-20mmol/L EDTA，100-500mmol/L NaCl，2-4mol/L Urea，pH 7-9)，緩衝液B(5-100mmol/L Tris-HCl，2-20mmol/L EDTA，pH 8-10)；洗滌方式為緩衝液A→緩衝液B依次洗滌。
該步驟b的變性溶解條件可以是：包涵體按1：20至1：25(W/V)加入變性液(6-10mol/L Urea，2-20mmol/L DTT，2-20mmol/L EDTA，5-100mmol/L Tris-HCl，pH 7-9)中，攪拌裂解10-18h。
該步驟b的變性溶解條件較佳為：包涵體按1：20至1：25(W/V)加入變性液(8mol/L Urea，10mmol/L DTT，5mmol/L EDTA，20mmol/L Tris-HCl，pH 8.2)中，攪拌裂解10-18h。
該步驟c中置換用的緩衝液可包含6-10mol/L Urea，2-20mmol/L EDTA，5-100mmol/L Tris-HCl，pH 7-9，較佳為8mol/L Urea，5mmol/L EDTA，20mmol/L Tris-HCl，pH 8.2；置換用的緩衝液溫度控制為2至30℃，更佳為10至20℃；緩衝液置換的方式包括但不限於超濾、脫鹽管柱層析；其中超濾包括但不限於中空纖維超濾和膜包超濾；如若採用超濾進行緩衝液置換，超濾膜孔徑包括但不限於3KD，5KD和10KD，更佳為5KD；如若採用GE Healthcare公司的中空纖維柱進行超濾緩衝液置換，剪切速率可以控制在16000sec-1以下，更佳為約8000sec-1； 如若採用中空纖維超濾進行緩衝液置換，超濾條件可以是：①變性蛋白液在超濾系統中適當濃縮；②採用恒體 積置換，在超濾系統內保持樣品體積恒定，使流加的洗濾液速度與透出液速度相同；③跨膜壓力(TMP)不大於50PSI，更佳為10-18PSI；④共超濾置換樣品體積的3倍以上，考慮到合理的工藝用時，更佳為7倍體積，即共流加洗濾液體積為置換起始樣品體積的3倍以上，更佳為7倍體積。
該步驟d中的復性緩衝液可包含GSSG，所述GSSG的濃度可以是0.1-1mmol/L。較佳地，該復性緩衝液可以是0.5mmol/L GSSG，20mmol/L Tris-HCl，pH8.2，置換後變性液加入復性緩衝液前控制復性緩衝液溫度可為2至8℃； 該步驟d中稀釋復性的條件可以是：復性液蛋白終濃度0.1-0.4g/L，較佳地，該復性液蛋白終濃度0.3g/L，置換後變性液緩慢加入復性緩衝液，繼續攪拌30min後停止攪拌，2至8℃靜置復性10-18小時； 該步驟e中對rhG-CSF復性液可採用依次進行鹽析、疏水管柱層析、脫鹽管柱層析進行純化，其中鹽析可採用硫酸銨沉澱或氯化鈉沉澱，更較佳為硫酸銨沉澱；如若採用硫酸銨沉澱的方式，條件可為：攪拌條件下，緩慢加入(NH4)2SO4使其終濃度為0.9mol/L，並補加EDTA使其終濃度為5mmol/L，停止攪拌並靜置30min； 鹽析過程中的膜過濾可採用中空纖維切向流過濾、膜包過濾或死端過濾，更佳為中空纖維切向流過濾；如若採用中空纖維切向流過濾，優化後的條件為：膜孔徑0.2μm，跨膜壓(TMP)為3-8PSI，剪切速率約8000sec-1； 該步驟e中的管柱層析如若採用GE Healthcare公司的層析介質，優化後的層析純化策略是：先由苯基瓊脂糖凝膠Phenyl Sepharose FF管柱層析再到低吸附的葡聚糖凝膠Sephadex(如Sephadex G-25)管柱層析。
使用本發明所提供的重組人粒細胞刺激因子的製備方法得到的重組人粒細胞刺激因子原液可用於製備相應的製劑產品，也可用於製備聚乙二醇修飾的重組人粒細胞刺激因子，如WO9611953以及CN101172161A中描述的聚乙二醇修飾的重組人粒細胞刺激因子，其製備方法可包括本發明所述的重組人粒細胞刺激因子的製備方法製備重組人粒細胞刺激因子的步驟，以及將重組人粒細胞刺激因子與聚乙二醇偶聯的步驟。其中，聚乙二醇修飾的重組人粒細胞刺激因子的結構可以是如式I所示， ，其中m選自 50-2500的整數，較佳自400-500的整數，G為Met-G-CSF。
本發明的有益效果是：
(1)優化的包涵體洗滌工藝，為後續的純化步驟奠定了基礎。
(2)稀釋復性前增加去除還原劑的步驟，提高了復性率。
(3)藉由確定復性之前變性液中DTT的可接受殘留量，在保證復性率不受影響的前提下，顯著縮短了工藝操 作時間，且有利於蛋白活性的維持。
(4)復性蛋白濃度高於一般的稀釋復性，降低了樣品處理體積。
(5)復性效率大幅提高至70%以上。
(6)本發明涉及的復性方法，優化了復性條件，大大降低了生產成本，且易於控制，提高了工藝操作的穩定性。
(7)復性後蛋白純度即達到85%以上，降低了後續純化步驟的壓力。
(8)復性液保持澄清，未出現沉澱現象。
(9)工藝流程中沒有離心、透析等難以放大的方法，工藝放大的可行性好，成功放大至生產規模。
(10)整體工藝成本低，純化週期短。
(11)可獲得高純度，高活性的rhG-CSF蛋白原液，經檢測其SDS-PAGE電泳純度達到99%以上，RP-HPLC純度達到98%以上，比活性範圍在(10.0±4.0)×107IU/mg，高於《中華人民共和國藥典2015版》第三部“重組人粒細胞刺激因子注射液”項下原液檢定的要求。
第1圖為實施例一中洗滌後包涵體的SDS-PAGE電泳純度檢測圖譜，其中電泳道1：洗滌後的包涵體，電泳道2：rhG-CSF對照品(自製)。
第2圖為實施例一中rhG-CSF原液的SDS-PAGE電泳純度檢測圖譜，其中電泳道1：分子量標準蛋白Mark 12，電泳道2：rhG-CSF原液。
下面藉由具體實施例，對本發明的技術方案進行清晰、完整的描述，所描述的實施例僅僅是本發明的一部分實施例，而不是全部的實施例，基於本發明的實施例，本領域普通技術人員在沒有作出創造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例，都屬於本發明保護的範圍。
實施例一
重組人粒細胞刺激因子包涵體的復性及純化方法，主要包括以下步驟：
步驟1 製備高純度的rhG-CSF包涵體 1)工藝步驟：
pBV220/G-CSF轉化的大腸桿菌DH5α菌株接入一級種子培養基(蛋白腖10g/L，酵母粉5g/L，NaCl 5g/L)，30℃ 220rpm培養7小時；一級種子接入二級種子培養基(蛋白腖10g/L，酵母粉5g/L，NaCl 5g/L，葡萄糖5g/L)，30℃ 220rpm培養17小時；二級種子接入發酵培養基(蛋白腖10g/L，酵母粉5g/L，NaCl 5g/L，葡萄糖5g/L，KH2PO4 2.7g/L，Na2HPO4 11g/L，MgSO4 0.3g/L)，30℃培養至pH、溶氧雙反彈(pH 7.0、溶氧30%)後啟動補料：補料培養基1(蛋白腖20%，酵母粉10%)30-40g/min，補料培養基2(葡萄糖50%)20-60g/min；當OD60030，升溫至42℃開始誘導，誘導4小時後，降溫至15-20℃，發酵結束。
發酵後，取濕菌體1kg，用5倍體積菌體重量TE緩衝 液(20mmol/L Tris-HCl,5mmol/L EDTA,pH8.2)懸浮菌體，混合均勻，泵入高壓勻質機進行勻漿破碎。之後，離心分離獲得濕的包涵體粗品500g。
將上述得到的粗包涵體用緩衝液A(20mmol/L Tris-HCl,5mmol/L EDTA,4mol/L Urea,0.25mol/L NaCl,pH8.2)和緩衝液B(20mmol/L Tris-HCl,5mmol/L EDTA,pH8.2)依次洗滌，獲得高純度的包涵體。
2)樣品檢測：
對包涵體進行SDS-PAGE電泳純度檢測，電泳檢測的條件和結果如下：
SDS聚丙烯醯胺凝膠：NuPAGE® 4-12% Bis-Tris Gel，Life technologies
樣品緩衝液：NuPAGE® LDS Sample Buffer(4×)，Life technologies
電泳緩衝液：NuPAGE® MOPS SDS Running Buffer(20×)，Life technologies
染色液：GelcodeTM Blue safe protein Stain，Thermo scientific
脫色液：純化水，自製
上樣後150V恒壓電泳至溴酚藍遷移膠底處，考馬斯亮藍快速染色法染色，凝膠成像儀進行純度分析。
從說明書第1圖電泳道1可以看出獲得的包涵體SDS-PAGE電泳純度為72.5%。
步驟2 rhG-CSF包涵體的變性溶解
取20g初步純化的包涵體，以固液比1：20的比例用變性液(20mmol/L Tris-HCl,5mmol/L EDTA,8mol/L Urea,10mmol/L DTT,pH8.2)變性溶解，室溫攪拌14至16小時，得變性蛋白液400ml。
步驟3 變性蛋白液的緩衝液置換 1)工藝步驟：
樣品澄清過濾：上述步驟2的變性蛋白液經10μm和0.45μm兩級過濾澄清；平衡中空纖維：選用5KD中空纖維柱，用平衡液(20mmol/L Tris-HCl,5mmol/L EDTA,8mol/L Urea,pH8.2)平衡中空纖維及系統；濃縮：將澄清後樣品加入中空纖維系統，以8000sec-1的剪切速率運行系統，控制跨膜壓(TMP)為10-18PSI，濃縮至300ml；恒體積置換：向中空纖維系統中連續流加置換緩衝液(20mmol/L Tris-HCl,5mmol/L EDTA,8mol/L Urea,pH 8.2)，控制流加速度與透出端流速相同，保持變性蛋白液體積恒定，超濾過程中共向變性蛋白液中連續補加2100ml置換緩衝液(20mmol/L Tris-HCl,5mmol/L EDTA,8mol/L Urea,pH 8.2)，期間控制跨膜壓(TMP)為10-18PSI，置換緩衝液溫度在10至20℃。
樣品收集：從中空纖維系統底閥處收集樣品，用100ml置換緩衝液沖洗中空纖維系統，沖洗液併入樣品中，得置換後變性蛋白液400ml。
2)樣品檢測：
取置換後變性蛋白液20μl用RP-HPLC法檢測樣品中rhG-CSF蛋白濃度，RP-HPLC條件如下：
rhG-CSF對照品：自製，蛋白濃度為0.85mg/ml
色譜管柱：Symmetry ShieldTM RP18，3.5μm，100mm×4.6mm
A相：三氟乙酸-水溶液(取1.0ml三氟乙酸加水至1000ml，充分混勻超聲脫氣20min)
B相：三氟乙酸-乙腈溶液(取1.0ml三氟乙酸加入色譜純乙腈至1000ml，超聲脫氣20min)
室溫條件下，按下表進行梯度洗脫，檢測波長214nm。
根據檢測樣品及對照品中rhG-CSF的峰面積，用面積歸一化法計算得置換後變性蛋白液中rhG-CSF的濃度為7.5mg/ml。
步驟4 rhG-CSF的稀釋復性 1)工藝步驟
配製緩衝液(20mmol/L Tris-HCl,pH8.2)9.6L，控制其溫度在2至8℃，將置換後變性蛋白液緩慢加入緩衝液中，即蛋白終濃度為0.3g/L，同時加入GSSG至終濃度為0.5mmol/L，攪拌30min混勻後停止攪拌，2至8℃靜置復性16至18小時。
2)樣品檢測：
取復性液50μl用RP-HPLC法檢測樣品中rhG-CSF蛋白濃度(條件同步驟3中的RP-HPLC條件)，根據檢測樣品及對照品中rhG-CSF的峰面積，用面積歸一化法計算得復性液中rhG-CSF的濃度為0.23mg/ml。
步驟5 rhG-CSF的管柱層析純化 1)工藝步驟：
復性後的rhG-CSF溶液中加入硫酸銨至終濃度為0.9mol/L，加入EDTA至終濃度為5mmol/L，攪拌混勻後靜置30min，0.2μm中空纖維切向流澄清過濾後進行管柱層析純化。
Phenyl Sepharose FF管柱層析：
(1)以含0.9mol/L(NH4)2SO4，pH8.2的20mmol/L Tris-HCl緩衝液平衡層析管柱，流速150cm/小時，平衡3倍柱體積；(2)澄清液樣品上樣，流速150cm/小時；(3)以含0.65mol/L(NH4)2SO4，pH8.2的20mmol/L Tris-HCl沖洗層析管柱，流速150cm/小時，沖洗5倍管柱體積；(4)用含0.1mol/L(NH4)2SO4，pH8.2的20mmol/L Tris-HCl 洗脫，流速150cm/小時，收集目標蛋白峰。
Sephadex G-25管柱層析：
(1)以pH 5.0的50mmol/L醋酸鹽緩衝液平衡層析管柱，流速150cm/小時，平衡2倍管柱體積。
(2)Phenyl Sepharose FF管柱層析洗脫收集液上樣，單次上樣體積不超過管柱體積的1/4，流速150cm/小時。
(3)pH 5.0的50mmol/L醋酸鹽緩衝液洗脫，流速150cm/小時，收集目標蛋白峰。
蛋白收樣除菌過濾後即為重組人粒細胞刺激因子原液。
2)樣品檢測：
rhG-CSF原液用SDS-PAGE電泳、RP-HPLC方法進行純度分析。
(1)SDS-PAGE法檢測rhG-CSF原液純度的條件同步驟1中的SDS-PAGE電泳分析條件
SDS-PAGE法進行rhG-CSF原液純度的檢測分析結果如第2圖所示，從分析結果可以看出，最終所得rhG-CSF原液的SDS-PAGE電泳純度為100%。
(2)RP-HPLC法檢測rhG-CSF原液純度的條件和結果如下：
色譜管柱：Symmetry ShieldTM RP18，3.5μm，100mm×4.6mm
A相：三氟乙酸-水溶液(取1.0ml三氟乙酸加水至1000ml，充分混勻超聲脫氣20min)
B相：三氟乙酸-乙腈溶液(取1.0ml三氟乙酸加入色譜純乙腈至1000ml，超聲脫氣20min)
室溫條件下，按下表進行梯度洗脫，檢測波長280nm。
RP-HPLC法進行rhG-CSF原液純度的檢測，從結果分析可以看出，最終所得rhG-CSF原液的RP-HPLC純度為99.14%。
從說明書第2圖電泳道2可以看出獲得的rhG-CSF原液電泳純度為100%。
以重組人粒細胞集落刺激因子活性測定國家標準品為活性標準品，用NFS-60細胞/MTT比色法測定rhG-CSF原液的生物學活性，並根據樣品蛋白濃度計算rhG-CSF原液比活性為1.35×108IU/mg。
實施例二
重組人粒細胞刺激因子包涵體的復性及純化方法，主要包括以下步驟：
步驟1、2、3同實施例一的步驟1、2、3。
步驟4 rhG-CSF的稀釋復性
1)工藝步驟
配製緩衝液(20mmol/L Tris-HCl,pH8.2)9.6L，控制其溫度在2至8℃，將置換後變性蛋白液緩慢加入緩衝液中，即蛋白終濃度為0.3g/L，同時加入GSSG至終濃度為0.3mmol/L，加入GSH至終濃度為0.1mmol/L，攪拌30min混勻後停止攪拌，2至8℃靜置復性16至18小時。
2)樣品檢測：
取復性液50μl用RP-HPLC法檢測樣品中rhG-CSF蛋白濃度(條件同步驟3中的RP-HPLC條件)，根據檢測樣品及對照品中rhG-CSF的峰面積，用面積歸一化法計算得復性液中rhG-CSF的濃度為0.20mg/ml。
步驟5 rhG-CSF的管柱層析純化 1)工藝步驟
同實施例一步驟5的工藝步驟。
2)樣品檢測：
rhG-CSF原液用SDS-PAGE電泳、RP-HPLC方法進行純度分析，檢測方法同實施例一步驟5的樣品檢測方法，用NFS-60細胞/MTT比色法測定rhG-CSF的活性，所得rhG-CSF原液的SDS-PAGE電泳純度為100%，RP-HPLC純度為98.61%，比活性為1.26×108IU/mg。
比較例一
採用實施例一、實施例二所述的方法進行重組人粒細胞刺激因子的復性及純化，製備rhG-CSF原液，同時採用現有技術CN101045742A公開的方法進行對比，對比結果如下：
可見，採用本發明所述的rhG-CSF復性和純化方法，簡化了操作步驟，工藝過程簡單，易於控制，復性蛋白濃度高於現有技術，降低了樣品處理體積，同時目的蛋白損失少，蛋白收率和品質明顯提高，適合於大規模工業生產。
雖然本發明已將較佳實施例揭示如上，但是這並非用以限制本發明的內容，本發明的保護範圍以申請專利的實際申請專利範圍為准。
<110> 江蘇恆瑞醫藥股份有限公司
<120> 一種重組人粒細胞刺激因子的復性及純化方法
<130> 770026CPCT
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<210> 1
<211> 175
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 1
由於本案的圖為實驗數據，並非本案的代表圖。故本案無指定代表圖。

Claims (23)

  1. 一種重組人粒細胞刺激因子的製備方法，包括以下步驟：a)對rhG-CSF基因工程菌進行發酵培養，經分離和洗滌，獲得精製的包涵體；b)包涵體經變性液溶解得變性蛋白液；c)對變性蛋白液進行緩衝液置換，得置換後變性液；d)將置換後變性液進行稀釋復性；e)對復性後的rhG-CSF進行純化，獲得rhG-CSF原液。
  2. 如申請專利範圍第1項所述的重組人粒細胞刺激因子的製備方法，其中，步驟a中包涵體洗滌所使用的緩衝液為：緩衝液A(5至100mmol/L Tris-HCl，2至20mmol/L EDTA，100至500mmol/L NaCl，2至4mol/L Urea，pH 7至9)，緩衝液B(5至100mmol/L Tris-HCl，2至20mmol/L EDTA，pH 8至10)；洗滌方式為緩衝液A→緩衝液B依次洗滌。
  3. 如申請專利範圍第1項所述的重組人粒細胞刺激因子的製備方法，其中，步驟b中的變性液含有DTT。
  4. 如申請專利範圍第3項所述的重組人粒細胞刺激因子的製備方法，其中，該DTT濃度為2至20mmol/L。
  5. 如申請專利範圍第3項所述的重組人粒細胞刺激因子的製備方法，其中，步驟b中包涵體變性液還含有5 至100mmol/L Tris-HCl(pH 7-9)，6至10mol/L Urea以及2至20mmol/L EDTA。
  6. 如申請專利範圍第3項所述的重組人粒細胞刺激因子的製備方法，其中，步驟b中包涵體變性液含有20mmol/L Tris-HCl(pH 8.2)，8mol/L Urea，5mmol/L EDTA，10mmol/L DTT。
  7. 如申請專利範圍第1項所述的重組人粒細胞刺激因子的製備方法，其中，步驟c中該緩衝液置換的方式選自超濾或脫鹽管柱層析。
  8. 如申請專利範圍第7項所述的重組人粒細胞刺激因子的製備方法，其中，步驟c中該緩衝液置換的方式為超濾。
  9. 如申請專利範圍第8項所述的重組人粒細胞刺激因子的製備方法，其中，該超濾為中空纖維超濾。
  10. 如申請專利範圍第9項所述的重組人粒細胞刺激因子的製備方法，其中，該中空纖維超濾的中空纖維材質選自聚碸、改良型聚碸、醋酸纖維素酯或硝酸纖維素酯中的一種或多種。
  11. 如申請專利範圍第10項所述的重組人粒細胞刺激因子的製備方法，其中，該中空纖維截留分子量3000至10000。
  12. 如申請專利範圍第10項所述的重組人粒細胞刺激因子的製備方法，其中，該中空纖維截留分子量5000。
  13. 如申請專利範圍第1項所述的重組人粒細胞刺激因子 的製備方法，其中，步驟c中該緩衝液置換使用的緩衝液包含6至10mol/L Urea，2至20mmol/L EDTA，5至100mmol/L Tris-HCl，pH 7至9。
  14. 如申請專利範圍第13項所述的重組人粒細胞刺激因子的製備方法，其中，步驟c中該緩衝液置換使用的緩衝液包含8mol/L Urea，5mmol/L EDTA，20mmol/L Tris-HCl，pH 8.2。
  15. 如申請專利範圍第1項所述的重組人粒細胞刺激因子的製備方法，其中，步驟d中稀釋復性過程使用的緩衝液包含GSSG。
  16. 如申請專利範圍第1項所述的重組人粒細胞刺激因子的製備方法，其中，步驟d中稀釋復性過程使用的緩衝液不包含GSH。
  17. 如申請專利範圍第15項所述的重組人粒細胞刺激因子的製備方法，其中，該GSSG濃度為0.1至1mmol/L。
  18. 如申請專利範圍第1項所述的重組人粒細胞刺激因子的製備方法，其中，步驟d中稀釋復性過程使用的緩衝液包含0.5mmol/L GSSG，20mmol/L Tris-HCl，pH8.2。
  19. 如申請專利範圍第1項所述的重組人粒細胞刺激因子的製備方法，其中，步驟e中對rhG-CSF復性液依次進行鹽析、疏水管柱層析、脫鹽管柱層析。
  20. 如申請專利範圍第19項所述的重組人粒細胞刺激因子的製備方法，其中，該鹽析為硫酸銨沉澱的方式，該疏水管柱層析的疏水柱填料為Phenyl-基的疏水介質，該 脫鹽管柱層析的填料為低吸附的Sephadex系列層析介質。
  21. 一種聚乙二醇修飾的重組人粒細胞刺激因子的製備方法，包括申請專利範圍第1至20項中任一項所述的重組人粒細胞刺激因子的製備方法製備重組人粒細胞刺激因子的步驟，以及將重組人粒細胞刺激因子與水溶性聚合物偶聯的步驟。
  22. 如申請專利範圍第21項所述的聚乙二醇修飾的重組人粒細胞刺激因子的製備方法，其中，該聚乙二醇修飾的重組人粒細胞刺激因子的結構如式I所示 ，其中m選自50 至2500的整數，G為Met-G-CSF。
  23. 如申請專利範圍第22項所述的聚乙二醇修飾的重組人粒細胞刺激因子的製備方法，其中，m選自400至500的整數。
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