JP2011078421A - 封入体における高い量の正しく折りたたまれた異種タンパク質の生産方法 - Google Patents

Abstract

【課題】異種タンパク質が発現される生物において形成される非古典的封入体から異種タンパク質を得ることを含む、異種タンパク質の生産のための改善された方法を提供する。
【解決手段】異種タンパク質としてのタンパク質の発現を含み、発現後に前記異種タンパク質の正しく折りたたまれた前駆体が封入体内に蓄積される、タンパク質の生産のための方法。異種タンパク質としてのタンパク質の生合成を実施することを含み、前記異種タンパク質の前駆体が微生物の封入体内で形成され、その前駆体が非変性条件下で生物活性異種タンパク質を形成できるように生合成を実施すること；前記前駆体を非変性条件下で封入体から単離し、それによって生物活性異種タンパク質を形成すること、の工程を含む、タンパク質の生産のための方法。
【選択図】なし

Description

本発明は、異種タンパク質が発現される生物において形成される封入体から異種タンパク質を生産する新しい方法に関する。本発明の原理は、主として生物活性顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）を生産する方法を対象として説明するが、適切な発現生物から発現される広範囲の異種タンパク質に適用することができる。

ヒト顆粒球コロニー刺激因子（ｈＧ−ＣＳＦ）は、好中球の形成において決定的な役割を有する造血系増殖因子に属する。Ｇ−ＣＳＦは、血液学及び腫瘍学の分野において薬剤中で使用されている。現在、臨床使用のための２つの形態：グリコシル化されており、哺乳類細胞、特にＣＨＯ細胞系において生産されるレノグラスチム（Ｈｏｌｌｏｗａｙ ＣＪ（１９９４）Ｅｕｒ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ ３０Ａ Ｓｕｐｐｌ ３：Ｓ２−Ｓ６，欧州特許第１６９５６６号）、及びグリコシル化されておらず、大腸菌におけるその発現後に生産されるフィルグラスチム（欧州特許第２３７５４５号）、が市販されている。

細菌である大腸菌における異種Ｇ−ＣＳＦの細胞内生産のために、前記タンパク質は封入体（古典的封入体）の形態で蓄積される。大腸菌ペリプラズムへの分泌の実験では、Ｇ−ＣＳＦが古典的封入体の形態で蓄積されるか（Ｌｅｉ Ｓ．Ｐら（１９８７）Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ １６９：４３７９−４３８３；Ｃｈｕｎｇ ＢＨら（１９９８）Ｊ Ｆｅｒｍｅｎｔ Ｂｉｏｅｎｇ ８５：４４３−４４６）、又はこのようにして生産されるＧ−ＣＳＦの生物活性に関する報告は存在しない（Ｊｅｏｎｇ ＫＪ＆Ｌｅｅ ＳＹ（２００１）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ２３：３１１−３１８）。

上記より、従来技術において大腸菌からのＧ−ＣＳＦの単離について記述されているほとんどすべての実験では、Ｇ−ＣＳＦが古典的封入体内で認められることは明らかである。

古典的封入体の形成に関する同様の所見は、Ｇ−ＣＳＦ以外の異種タンパク質の生産方法にもあてはまる。

酵母において生産される古典的封入体の幾つかの例が記述されているが、Ｇ−ＣＳＦに関する報告はない。

天然条件下で水ベースの液体に不溶の封入体（古典的封入体）から正しく折りたたまれた生物活性タンパク質を生産するには、その封入体を細胞から単離し、洗浄して、可溶化し、次にインビトロでの再生を実施しなければならない。インビトロでの再生は、大規模なタンパク質分離の方法においては付加的な工程である。

古典的封入体から組換えタンパク質を生産する方法は、細胞の溶解と破壊及びそれに続く遠心分離を含む。大きな割合の古典的封入体を含むペレットを、通常は界面活性剤で洗浄する。Ｇ−ＣＳＦの単離のためには、１％デオキシコール酸塩（Ｚｓｅｂｏ ＫＭら（１９８６）Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ １７２：１７５−１８４、欧州特許第２３７５４５号；米国特許第５８４９８８３号）又は０．１％Ｔｗｅｅｎ ８０を加えた１．０Ｍ ＮａＣｌ溶液（Ｇｅｌｕｎａｉｔｅ Ｌら（２０００）Ｊ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ Ａ ９０４：１３１−１４３）による古典的封入体の洗浄が簡便であると報告されている。

組換えタンパク質を入手する場合のさらなる工程は、一般にかなり強い変性剤の使用を必要とする古典的封入体の可溶化である。Ｇ−ＣＳＦの生産に関しては、６Ｍ ＧｄＨＣｌ（Ｗｉｎｇｆｉｅｌｄ Ｐら（１９８８）Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ ２５６：２１３−２１８；Ｚｉｎｋ Ｔら（１９９２）ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ ３１４：４３５−４３９）、ｐＨ７．２での７Ｍ尿素（Ｋｕｇａ Ｔら（１９８９）Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ １５９：１０３−１１１）又はｐＨ８．０での８Ｍ尿素（Ｙａｍａｓａｋｉ Ｍら（１９９８）Ｂｉｏｓｃｉ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ ６２：１５２８−１５３４）、２０ｍＭトリス／ＨＣｌの使用及びＥＤＴＡとＤＴＴの添加が記述されている。Ｋａｎｇ Ｓ−Ｈとその共同研究者達は、約１２の強いアルカリ性ｐＨの２Ｍ尿素に古典的封入体を可溶化することに成功した（Ｋａｎｇ ＳＨら（１９９５）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｌｅｔｔ １７：６８７−６９２）。同様の方法は、短期間ｐＨを１１．５に上昇させることを伴う１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液での可溶化である（Ｇｅｌｕｎａｉｔｅ Ｌら（２０００）Ｊ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ Ａ ９０４：１３１−１４３）。変性濃度の強力な変性剤、例えば５０ｍＭトリス／ＨＣｌ ｐＨ８．５中５％エタノールを加えた１％ＳＤＳも、同様に可溶化のために有効である（Ｓｏｕｚａ ＬＭら（１９８６）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３２：６１−６５）。２％Ｎ−ラウロイルサルコシンがしばしば使用され、（Ｌｕ ＨＳら（１９９２）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２６７：８７７０−８７７７；Ｌｕ ＨＳら（１９９３）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒ Ｐｕｒｉｆ ４：４６５−４７２；Ｙｏｕｎｇ ＤＣら（１９９７）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ ６：１２２８−１２３６；欧州特許第２３７５４５号；米国特許第５８４９８８３号）又は１％Ｎ−ラウロイルサルコシンが単独で使用される（Ｚｓｅｂｏ ＫＭら（１９８６）Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ １７２：１７５−１８４）。ほとんどの場合、古典的封入体の可溶化は、毒性であり、非自然共生性で、深刻な環境汚染物質である強力な界面活性剤の使用を必要とする。それらの使用はまた、工程終了後の安全な除去のために付加的な費用と時間がかかるので、非経済的である。

例えばＣ４ ＲＰ ＨＰＬＣでの最初のクロマトグラフィー工程における（Ｓｏｕｚａ ＬＭら（１９８６）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３２：６１−６５；Ｚｓｅｂｏ ＫＭら（１９８６）Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ １７２：１７５−１８４；欧州特許第２３７５４５号）又はゲルろ過を使用することによる（Ｗｉｎｇｆｉｅｌｄ Ｐら（１９８８）Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ ２５６：２１３−２１８；米国特許第４９９９２９１号）、変性条件下でのタンパク質の分離の幾つかの例が記述されているが、大部分の例においては、予備的なインビトロ再生後にクロマトグラフィー分離を実施する。

強力な変性剤中での古典的封入体の可溶化に続いて、インビトロでのタンパク質の再生を実施する。再びＧ−ＣＳＦを例にとると、そのインビトロ再生は、より低い（非変性）濃度の変性剤を含む緩衝液に対する透析によって（Ｗｉｎｇｆｉｅｌｄ Ｐら（１９８８）Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ ２５６：２１３−２１８）、変性剤を含まない緩衝液に対する透析によって（Ｋｕｇａ Ｔら（１９８９）Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ １５９：１０３−１１１）、０．８Ｍアルギニンを加えた緩衝液中で（Ｚｉｎｋ Ｔら（１９９２）ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ ３１４：４３５−４３９）、又はゲルろ過によって（米国特許第４９９９２９１号；Ｄ．Ｃ．Ｙｏｕｎｇら（１９９７）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ ６：１２２８−１２３６）達成される。変性濃度のＮ−ラウロイルサルコシン中で可溶化した後、室温で長期間攪拌しながら低濃度のＣｕＳＯ_４を添加し、その後強塩基性イオン交換体を使用した界面活性剤の除去によって酸化的折りたたみが達成される（米国特許第５８４９８８３号）。極端なアルカリ性条件下で可溶化を実施する場合、より低いｐＨを回復することによってタンパク質は自然に再生される（Ｋａｎｇ ＳＨら（１９９５）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｌｅｔｔ １７：６８７−６９２）。インビトロ再生のために記述されている方法はすべて、複雑であり、時間がかかる。大規模な希釈は大容量の装置を必要とし、従ってより高い初期投資（より大きな場所、より大きな装置等）が必要であり、また生産のためにより高い操作費用（電力、水、緩衝剤等）がかかる。

オリゴペプチド親水性タグ及びＩｇＡプロテアーゼについての制限部位がＮ末端に付加されている融合タンパク質では、改善されたインビトロ再生が実現される（欧州特許第０５００１０８号）。

文献において細胞質内の可溶性タンパク質の割合の上昇が報告されている（Ｗｅｉｃｋｅｒｔ ＭＪら（１９９７）、Ａｐｐｌ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，６３：４３１３−４３２０；Ｂｈａｎｄａｒｉ Ｐ＆Ｇｏｗｒｉｓｈａｎｋａｒ Ｊ（１９９７）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ，１７９：４４０３−４４０６；Ｚｈａｎｇ Ｙら（１９９８）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒ Ｐｕｒｉｆ，１２：１５９−１６５；Ｔｈｏｍａｓ ＪＧとＢａｎｅｙｘ Ｆ（１９９６）Ｊ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２７１：１１１４１−１１１４７；Ｋａｐｕｓｔ ＲＢとＷａｕｇｈ ＤＳ（１９９９）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ，８：１６６８−１６７４；Ｄａｖｉｓ ＧＤら（１９９９）Ｂｉｏｔｅｃｈ ａｎｄ Ｂｉｏｅｎｇ ６５：３８２−３８８）が、封入体内での蓄積に代わる細胞質内での可溶性Ｇ−ＣＳＦの生産に関する報告はない。

本発明者らの知る限り、特許及び学術文献において、既に封入体内にある正しく折りたたまれた異種タンパク質の割合の上昇に関する報告はこれまでのところ存在しない。

Ｇ−ＣＳＦの場合は、インビトロでの再生が第一条件として、それ故生物活性タンパク質の生産のための唯一の可能な方法として報告されている（Ｒｕｄｏｌｐｈ Ｒ（１９９６）ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ（Ｃｌｅｌａｎｄ ＪＬとＣｒａｉｋ ＣＳ編集）ｐｐ．２８３−２９８，Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）。

欧州特許第１６９５６６号 欧州特許第２３７５４５号 米国特許第５８４９８８３号 米国特許第４９９９２９１号

Ｈｏｌｌｏｗａｙ ＣＪ（１９９４）Ｅｕｒ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ ３０Ａ Ｓｕｐｐｌ ３：Ｓ２−Ｓ６ Ｌｅｉ Ｓ．Ｐら（１９８７）Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ １６９：４３７９−４３８３ Ｃｈｕｎｇ ＢＨら（１９９８）Ｊ Ｆｅｒｍｅｎｔ Ｂｉｏｅｎｇ ８５：４４３−４４６ Ｊｅｏｎｇ ＫＪ＆Ｌｅｅ ＳＹ（２００１）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ２３：３１１−３１８ Ｚｓｅｂｏ ＫＭら（１９８６）Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ １７２：１７５−１８４ Ｇｅｌｕｎａｉｔｅ Ｌら（２０００）Ｊ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ Ａ ９０４：１３１−１４３ Ｗｉｎｇｆｉｅｌｄ Ｐら（１９８８）Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ ２５６：２１３−２１８ Ｚｉｎｋ Ｔら（１９９２）ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ ３１４：４３５−４３９ Ｋｕｇａ Ｔら（１９８９）Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ １５９：１０３−１１１ Ｙａｍａｓａｋｉ Ｍら（１９９８）Ｂｉｏｓｃｉ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ ６２：１５２８−１５３４ Ｋａｎｇ ＳＨら（１９９５）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｌｅｔｔ １７：６８７−６９２ Ｓｏｕｚａ ＬＭら（１９８６）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３２：６１−６５ Ｌｕ ＨＳら（１９９２）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２６７：８７７０−８７７７ Ｌｕ ＨＳら（１９９３）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒ Ｐｕｒｉｆ ４：４６５−４７２ Ｙｏｕｎｇ ＤＣら（１９９７）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ ６：１２２８−１２３６ Ｗｅｉｃｋｅｒｔ ＭＪら（１９９７）、Ａｐｐｌ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，６３：４３１３−４３２０ Ｂｈａｎｄａｒｉ Ｐ＆Ｇｏｗｒｉｓｈａｎｋａｒ Ｊ（１９９７）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ，１７９：４４０３−４４０６ Ｚｈａｎｇ Ｙら（１９９８）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒ Ｐｕｒｉｆ，１２：１５９−１６５ Ｔｈｏｍａｓ ＪＧとＢａｎｅｙｘ Ｆ（１９９６）Ｊ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２７１：１１１４１−１１１４７ Ｋａｐｕｓｔ ＲＢとＷａｕｇｈ ＤＳ（１９９９）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ，８：１６６８−１６７４ Ｄａｖｉｓ ＧＤら（１９９９）Ｂｉｏｔｅｃｈ ａｎｄ Ｂｉｏｅｎｇ ６５：３８２−３８８ Ｒｕｄｏｌｐｈ Ｒ（１９９６）ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ（Ｃｌｅｌａｎｄ ＪＬとＣｒａｉｋ ＣＳ編集）ｐｐ．２８３−２９８，Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ

異種タンパク質が発現される生物において形成される非古典的封入体から異種タンパク質を得ることを含む、異種タンパク質の生産のための改善された方法を提供することが本発明の目的である。

その目的は、請求項１、２、２７及び３３に規定する選択的方法のいずれかによって解決される。本発明に従った方法の好ましく且つ有益なさらなる開発を従属する請求項の中で述べる。本発明はまた、請求項３６に記載の使用を提供する。

本発明の概念は、細菌及び酵母のような微生物などの適切な宿主細胞系において発現させうる多様な異種タンパク質に適用することができる。本発明は特にＧ−ＣＳＦの生産に関して開発された。本発明の概念は、中でも特に、比較的疎水性のタンパク質から形成される封入体の形成を含むので、本発明は、他の異種タンパク質の生産、特にあまり多すぎるジスルフィド結合は持たないタンパク質の生産にも容易に適用できる。本発明は、それ故、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、ＥＧＦ、ＨＳＡ、デオキシリボヌクレアーゼ、ＦＧＦ、ＴＮＦ−α、ＴＮＦ−β、インターフェロン及びインターロイキンから成る群の異種タンパク質の生産に特に適する。

本発明に従った方法の基礎として、驚くべきことに、Ｇ−ＣＳＦが、古典的封入体よりも高い量の正しく折りたたまれた前駆体を有する封入体において正しく折りたたまれた前駆体の形態で蓄積されうることが認められた。あるいは、Ｇ−ＣＳＦの生合成の調節は、直接封入体において、非変性条件下で又は変性／再生工程なしで、生物活性Ｇ−ＣＳＦを生成できる実質的な割合の異種タンパク質の前駆体を生産可能にする。また前述したような他の異種タンパク質の場合にも、やはり本発明に従った方法において封入体中のそのような他の異種タンパク質の蓄積が可能であると期待される。

本発明の１つの特定局面では、既に、生合成、すなわち発酵及びタンパク質発現工程の間の条件又はパラメータは、異種タンパク質の正しく折りたたまれた前駆体の形成を制御し、好都合に促進又は増強するように調整される。生合成を実施する方法を考慮に入れた工程は、既に封入体内にあるＧ−ＣＳＦ、すなわち異種タンパク質の正しく折りたたまれた前駆体の蓄積を可能にすると想定される。前記工程のそのような実施方法、すなわち封入体内で異種タンパク質の正しく折りたたまれた前駆体を形成し、増加させるという見地から生合成を調節し、有益に制御することは、培養温度、培地の組成、誘導様式、発酵の実施原理、ストレスを生じさせることができる物質の添加、及び補助タンパク質の同時発現を含む群より選択される１つ以上の条件を含む。生合成の制御は、従来の生合成条件と比較したとき、より低い温度、発酵培地及び発酵のタイプの選択、誘導物質及び誘導様式の選択、及びストレスの誘発などの調整及び／又は変更を含む。

本発明のもう１つの特定局面では、封入体内に認められる異種タンパク質の前駆体を、封入体からの異種タンパク質の単離及び精製の工程中、前記異種タンパク質にとっての非変性条件下に保持する。本発明の生物活性異種タンパク質の生産のための方法の特に好ましい実施態様は、従って、好ましくは洗浄工程に続く、非変性条件、好ましくは天然条件下での封入体の可溶化をさらに含み、変性剤を使用する必要なしに又は変性／再生工程を適用する必要なしに、生物活性タンパク質の直接の単離を可能にする。本発明は異種タンパク質の正しく折りたたまれた前駆体の実質的な割合を有する封入体（非古典的封入体）の生産を可能にするので、本発明のこの特定局面は、変性／再生工程を必要としない、前記タンパク質の生産の非常に効率的な方法を提供する。

図１は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びタンパク質染色による、本発明に従った様々な条件に依存して得られた封入体内のタンパク質組成の分析を示す。 図２は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びタンパク質染色によって分析したときの、本発明に従った培養温度（２５℃又は３７℃）に依存する封入体の可溶化の比較を示す。 図３は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びタンパク質染色による、本発明に従った様々な条件に依存する封入体内のタンパク質組成の分析を示す。 図４は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びタンパク質染色によって分析したときの、本発明に従った種々の溶液による洗浄／可溶化に依存する封入体の可溶化の比較を示す。

本発明を、本発明の基本的概念と好ましい実施態様の両方に関して以下でさらに詳細に説明する。本発明は、しかしながら、特定して述べる実施態様に限定されず、当業者は添付の特許請求の範囲内で多様性及び改変が存在することを了解するである。

驚くべきことに、異種タンパク質を発現する生物の培養又は発酵に影響することにより、特に前記生物によって行われる生合成に影響することにより、生物活性Ｇ−ＣＳＦの生産、及びそれに対応して他の異種タンパク質の生産を、Ｇ−ＣＳＦの正しく折りたたまれた前駆体が封入体内に蓄積されるように実施することができることが見出された。このようにして非古典的封入体を形成することができる。

特許及び学術文献に述べられている封入体は、不正確に折りたたまれた又は部分的に正しく折りたたまれたタンパク質の不溶性の緻密な凝集物（古典的封入体）を提供するが、本発明ではＧ−ＣＳＦの正しく折りたたまれた前駆体が封入体内に蓄積され、非古典的封入体を形成しうることが実現された。以下で述べる、生合成に有益な影響を及ぼす２つ以上の条件、好ましくは多数の条件の組合せを遵守することにより、封入体内に認められるＧ−ＣＳＦの正しく折りたたまれた前駆体の量が著明に上昇する。Ｇ−ＣＳＦの正しく折りたたまれた前駆体を含む封入体（非古典的封入体）は、当技術分野で認められる封入体（古典的封入体）よりも可溶性である。より高い溶解度は、より容易でより時間のかからない封入体からのＧ−ＣＳＦの生産を可能にする。それ故、その大規模生産においては収率が高く、有用で、実用的且つ経済的である。

ここで使用する古典的封入体という用語は、従来技術において記述されている、主として誤って折りたたまれたタンパク質を含む不溶性又はわずかに可溶性の（非変性水溶液などの非変性条件下での媒質中）封入体を指す。

ここで使用する非古典的封入体という用語は、古典的封入体よりも可溶性であり（非変性水溶液などの非変性条件下での媒質中）、ある程度の量の異種タンパク質の正しく折りたたまれた前駆体を含む封入体を指す。

ここで使用する異種タンパク質（Ｇ−ＣＳＦなど）の「正しく折りたたまれた前駆体」という用語は、ジスルフィド結合がまだ形成されていないか又は完全には形成されていない、正しいコンフォメーションを有する（天然コンフォメーションが存在するか又は固有に生成されうる）タンパク質（例えばＧ−ＣＳＦ）を指す。あるいは、「正しく折りたたまれた前駆体」という用語は、封入体内に存在し、その形態が変性剤又は強力なアルカリ溶液なしでも直接可溶化されて、生物活性タンパク質を提供することができる異種タンパク質の形態とすることができる。これは、例示的な異種タンパク質Ｇ−ＣＳＦを説明する実施例において明らかにされる。

本発明者らは、Ｇ−ＣＳＦの正しく折りたたまれた前駆体は、非古典的封入体内に存在する不溶性凝集物の中に幾分か捕獲されており、それ故これらの凝集物からの単離だけが必要であると考える。その単離は封入体の可溶化によって実施され、好ましくは可溶化に先立って洗浄工程を実施する。そのような単離のためには穏やかな可溶化剤だけを使用すべきであり、古典的封入体の可溶化のために慣例的に使用される強力な変性剤は回避することができる。可溶化に先立つ洗浄工程は、好ましくは正しく折りたたまれた前駆体が洗浄液によって溶解しない条件下で実施すべきである。Ｇ−ＣＳＦ前駆体の単離の工程は、自然酸化を可能にし（例えば空気中の酸素の存在によって）、分子内ジスルフィド架橋の自然形成を許容すると推定される。所望する場合は、洗浄及び／又は可溶化の間に、ＣｕＳＯ_４又は他の金属塩などの小量の触媒で適切に処理することによってジスルフィド結合の形成を促進することができる。それによって生物活性Ｇ−ＣＳＦを入手し、直接単離して、適切な精製手法によって精製することができる。

発現後に、古典的封入体内に認められる異種タンパク質の生産の他の既知の手法と比較して、本発明の手順は経済的見地からより優れる。強力な界面活性剤で洗浄する代りに水又は緩衝液による洗浄しか必要とせず、また可溶化は、穏やかな条件下で、強力な変性剤、強アルカリ溶液又は高濃度の界面活性剤の存在なしで実施する。さらに、通常はリフォールディングのために必要なインビトロでの再生手順を必要としない。

既に封入体内に存在する異種タンパク質（特にＧ−ＣＳＦ）の正しく折りたたまれた前駆体の形成と蓄積が特に有効であり、生物活性タンパク質（例えばＧ−ＣＳＦ）が封入体から直接入手できる、本発明の特に好ましい実施態様では、生物活性タンパク質（例えばＧ−ＣＳＦ）の生産のための方法は、
・培養温度、
・誘導様式、
・発酵のタイプ、
・培地の選択、
・ストレスを生じさせることができる物質の添加、及び
・補助タンパク質の同時発現
から成る群より選択される幾つかのパラメータ又は条件の１つ又は組合せによって生合成を実施する方法を調節することを含む。

これらのパラメータの調節は、非古典的封入体が形成されるように実施することができる。

本発明の生物活性異種タンパク質（Ｇ−ＣＳＦなど）の生産のための方法は、好ましくは封入体の洗浄及び／又は可溶化をさらに含み、変性剤の使用又はインビトロでの再生工程を伴わない生物活性異種タンパク質（Ｇ−ＣＳＦなど）の単離を可能にする。それ故、前記異種タンパク質の生産のための工程及び異種タンパク質のその後の単離及び／又は精製は、工程の間ずっと天然条件下で好都合に実施することができ、これは収率のために有益であって、経済的で環境に優しい方法を提供する。

本発明の方法の１つの特徴は、生合成を実施する方法が、正しく折りたたまれたタンパク質分子（特にＧ−ＣＳＦの分子、中でもＧ−ＣＳＦの前駆体）の割合が上昇するように、封入体の組成の調節を可能にするパラメータ又は条件の少なくとも１つを調整することを含む。異種タンパク質の高い蓄積は、その異種タンパク質の正しく折りたたまれた前駆体の高い比率を自動的に意味するわけではない。本発明の生物活性異種タンパク質の生産のための方法はまた、異種タンパク質の蓄積とその異種タンパク質の正しく折りたたまれた前駆体の割合の間で最適の比率を見出すことを可能にする（特に異種タンパク質がＧ−ＣＳＦである場合）。

生物活性Ｇ−ＣＳＦの高い収率の大規模生産がそれによって達成され、他の異種タンパク質についても同様に期待される。

ここで使用する「生物活性Ｇ−ＣＳＦ」という用語は、造血前駆細胞の分化と増殖及び造血系の成熟細胞の活性化を促進することができるＧ−ＣＳＦを指す。本発明の方法により、有益には少なくとも１×１０^７ＩＵ／ｍｇの範囲、より好ましくは４×１０^７ＩＵ／ｍｇ以上の範囲にあるＧ−ＣＳＦの比活性を得ることが可能になる。その後に適切な精製工程を適用するとき、前記比活性を少なくとも７−８×１０^７ＩＵ／ｍｇの範囲、最も好ましくは少なくとも１×１０^８ＩＵ／ｍｇの範囲に上昇させることができる。前記比活性は、実施例１２で述べるように細胞増殖の刺激に基づく方法によって測定される。

ここで使用する「異種タンパク質」という用語は、発現を実施する生物にとって外来性であるタンパク質を指す。

ここで使用する「再生」という用語は、変性タンパク質が、それらのタンパク質がそれらの天然コンフォメーションにおいて有するコンフォメーションへと転換することを指す。

ここで使用する「インビトロでの再生」という用語は、生物の体外で実施される再生を指す。

ここで使用する「変性」という用語は、タンパク質の天然コンフォメーション（三次元構造）は変化するが、前記タンパク質の一次構造（アミノ酸鎖、ペプチド結合）は不変のままである過程を指す。

ここで使用する「変性剤」という用語は、（通常は溶液中で）その存在下ではタンパク質の天然コンフォメーションが保存されない物質を指す。変性剤の存在下ではタンパク質の生物活性が変化し、保存されない。

ここで使用する「凝集物」という用語は、主として疎水性結合によってならびに他の結合によって（例えばジスルフィド結合など）相互に連結された分子のクラスターを指す。これらの分子は生物学的に活性ではない。

ここで使用する「非変性条件」という用語は、所望タンパク質の変性が起こらない条件を指す。この条件は、例えば、変性剤が存在しないか又は変性濃度未満で存在する条件を指す。

ここで使用する「天然条件」という用語は、タンパク質分子がその天然コンフォメーションと生物活性を保存することができる条件を指す。

ここで使用する「生合成」という用語は、微生物を使用することによる異種タンパク質の生産を指す。

ここで使用する「培養」という用語は、微生物が、その微生物の増殖のために必要な基質の提供ソースと共に液中にあるか（ｓｕｂｍｅｒｓｅｄ）又は固体支持体上に存在する、制御された条件下での微生物の増殖を指す。

ここで使用する「発酵」という用語は、バイオリアクター（発酵槽）又は振とうフラスコにおける液中条件下での微生物の培養を指す。

ここで使用する「異種タンパク質の蓄積」及び「Ｇ−ＣＳＦの蓄積」という用語は、総タンパク質に関して、異種タンパク質又はＧ−ＣＳＦについての遺伝子の異種発現を使用することによってそれぞれ得られる異種タンパク質及びＧ−ＣＳＦの割合を指す。所望する場合は、本発明に従って、発現系において生産される所望の正しく折りたたまれた異種タンパク質を、発現系において使用する宿主細胞の総タンパク質量に対して少なくとも約２０％、より好ましくは少なくとも約２５％、特に少なくとも約３０％及びそれ以上の割合に蓄積することが可能である。ここで使用する「異種発現」という用語は、発現を実施する生物にとって外来性である遺伝子の発現を指す。

ここで使用する「異種タンパク質（Ｇ−ＣＳＦなど）の正しく折りたたまれた前駆体の割合」という用語は、正しく、部分的に正しく、不正確に折りたたまれた形態を含む、異種タンパク質形態（例えばＧ−ＣＳＦタンパク質）の総量に対する、異種タンパク質（例えばＧ−ＣＳＦ）の正しく折りたたまれた前駆体の割合を指す。

ここで使用する「生物活性異種タンパク質（Ｇ−ＣＳＦなど）の割合」という用語は、（非古典的）封入体の洗浄と可溶化後の異種タンパク質（例えばＧ−ＣＳＦ）の正しく折りたたまれた前駆体の割合を指す。本発明の方法の間、特に洗浄及び／又は可溶化の間及びその後、異種タンパク質（例えばＧ−ＣＳＦ）の正しく折りたたまれた前駆体は、自然酸化、及びそれ故ジスルフィド結合の自然形成によって生物学的に活性にすることができる。

本発明のＧ−ＣＳＦなどの生物活性異種タンパク質の生産のための方法は、ヒト及び獣医学における臨床使用に適したＧ−ＣＳＦなどの異種タンパク質の製造を可能にする。

前記方法は、ヒトＧ−ＣＳＦ及び他の哺乳類Ｇ−ＣＳＦの製造のため、ならびにメチオニルＧ−ＣＳＦ（Ｍｅｔ−Ｇ−ＣＳＦ）、酵素的及び化学的に修飾された（例えばペグ化、スクシニル化など）Ｇ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ類似体及びＧ−ＣＳＦを含む融合タンパク質などのＧ−ＣＳＦ誘導体の製造のために使用できる。

本発明の上記説明は特に生物活性Ｇ−ＣＳＦの生産を対象とするが、本発明の方法はまた、非古典的封入体の形態で蓄積される他の生物活性な異種タンパク質の生産のためにも使用できる。これらのタンパク質は、ＩＦＮ−β１ｂ、ＩＦＮ−β２ｂ、ＩＦＮ−γ１ｂなどのインターフェロン（ＩＦＮ）、ＩＬ−２及びＩＬ−４などのインターロイキン（ＩＬ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、表皮増殖因子（ＥＧＦ）、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、デオキシリボヌクレアーゼ（ＤＮＡｓｅ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）及び腫瘍壊死因子β（ＴＮＦβ）を含む群から選択され、及びさらに、（少なくとも一部、好ましくは実質的な割合が）自発的に正しい三次元構造に折りたたまれうる、あまり多すぎるジスルフィド結合は持たない融合タンパク質を含む、他のタンパク質を包含する。

本発明のＧ−ＣＳＦなどの生物活性異種タンパク質の生産のための方法は、発現のための宿主として使用される生物に関わりなく非古典的封入体の形成の場合に使用できる。適切な宿主生物として、主として細菌及び酵母を含む群から選択されるものが使用できる。細菌系では大腸菌及びストレプトミセス属、酵母系ではＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅなどの従来の酵母菌株及びＰｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ、Ｃａｎｄｉｄａ ｕｔｉｌｉｓその他のような非従来型酵母菌株が使用できる。

本発明のＧ−ＣＳＦなどの異種タンパク質の生合成を実施する方法は、培養温度、培地の組成物、誘導様式、発酵の実施原理又はタイプ、ストレスを生じさせる物質の添加、及び補助タンパク質の同時発現の群から選択される条件又はパラメータを調節することを含む。前記パラメータの個々のパラメータを最適化することにより、Ｇ−ＣＳＦに関して認められるように、異種タンパク質の正しく折りたたまれた前駆体の割合を実質的に上昇させることが可能であり、前記パラメータの組合せはさらより高い割合を可能にする。生合成によってＧ−ＣＳＦを生産する好ましい実施態様に言及して、前記条件又はパラメータを以下でより詳細に説明する。

（培養温度）
驚くべきことに、培養温度を低下させると、既に非古典的封入体内に存在するＧ−ＣＳＦの正しく折りたたまれた前駆体の蓄積を可能にすることが認められた。例えば大腸菌細胞の通常の最適培養温度は３７℃である。本発明では、既に非古典的封入体内に存在するＧ−ＣＳＦの正しく折りたたまれた前駆体の蓄積のための好ましい温度は、３７℃より有意に低いこと、すなわち約２０℃から約３０℃であることを認めた。最も好ましい温度は約２５℃である。

（誘導様式）
驚くべきことに、封入体（非古典的）内のＧ−ＣＳＦの正しく折りたたまれた前駆体の割合はまた、誘導様式にも依存することが認められた。誘導は、好ましくはＩＰＴＧ、ラクトース及びＮａＣｌから成る群より選択される誘導物質の添加によって実施できる。特に好ましい誘導はＩＰＴＧによるものである。非古典的封入体内のＧ−ＣＳＦの正しく折りたたまれた前駆体の割合はまた、誘導物質の濃度にも依存する。ＩＰＴＧを添加するとき、その選択濃度は、好ましくは約０．１ｍＭから約１ｍＭの範囲内である。より好ましい濃度は約０．３から０．６ｍＭ、特に約０．４ｍＭである。ＮａＣｌを使用するときは、その選択濃度は、好ましくは約０．３Ｍから１．３Ｍの範囲内である。より好ましい濃度は約１．０から１．３ｍＭ、特に約１．２Ｍである。ラクトースを使用するときは、その選択濃度は、好ましくは約１から約１０ｇ／ｌの範囲内であり、最も好ましい濃度は約２から約４ｇ／ｌである。封入体内のＧ−ＣＳＦの正しく折りたたまれた前駆体の割合はまた、誘導様式（培養時間）にも依存する。発酵の開始時に（前培養工程を実施するときは：その前培養工程の直後に）誘導物質を添加することができ、これはＩＰＴＧ、ＮａＣｌ又はラクトースの場合に好ましい。ＩＰＴＧ及びＮａＣｌは発酵のより後の段階で、適切には約６．０のＯＤ_{６００ｎｍ}で（ＯＤは細菌数の尺度である）添加することもできる。

（発酵を実施する原理又はタイプ）
驚くべきことに、非古典的封入体内のＧ−ＣＳＦの正しく折りたたまれた前駆体の割合はまた、発酵を実施するタイプにも依存することが認められた。これは、バイオリアクターでの発酵及び振とうフラスコにおいて発酵を実施することを含む群から選択される。バッチ方式で発酵を行うこと及びフェドバッチ方式で発酵を行うことを含む、バイオリアクターの発酵の実施が好ましい。発酵を実施することの好ましい原理又はタイプは、封入体の高い可溶化と共にバイオマスの高い生産性が得られるバッチ方式である。

（補助タンパク質の同時発現又はストレスを生じさせる物質の添加）
さらに、封入体内のＧ−ＣＳＦの正しく折りたたまれた前駆体の割合はまた、ストレスを引き起こすことができる物質の添加にも依存することが認められた。これらの添加物はストレスタンパク質の同時発現の引き金となり、好ましくはエタノール及びプロパノールを含む群から選択され、これらの物質は１％から５％（ｖ／ｖ）の範囲内の様々な濃度で使用することができる。約３％（ｖ／ｖ）の濃度でのエタノール及びプロパノールの使用が最も好ましい。

（培地の組成）
さらに、驚くべきことに、非古典的封入体内のＧ−ＣＳＦの正しく折りたたまれた前駆体の割合はまた、培地の組成にも依存することが認められた。好ましい培地は、抗生物質、例えば１００ｍｇ／ｌアンピシリンを補足したＧＹＳＴ（２０ｇ／ｌトリプトン、５ｇ／ｌ酵母抽出物、１０ｇ／ｌ ＮａＣｌ、１０ｇ／ｌグルコース、極微量の金属）、抗生物質、例えば１００ｍｇ／ｌアンピシリンを補足したＧＹＳＰ（２０ｇ／ｌファイトン、５ｇ／ｌ酵母抽出物、１０ｇ／ｌ ＮａＣｌ、１０ｇ／ｌグルコース、極微量の金属）、及び抗生物質、例えば１００ｍｇ／ｌアンピシリンを補足したＬＹＳＰ（２０ｇ／ｌファイトン、５ｇ／ｌ酵母抽出物、１０ｇ／ｌ ＮａＣｌ、６ｇ／ｌグリセロール、２ｇ／ｌ又は４ｇ／ｌラクトース、極微量の金属）、抗生物質、例えば１００ｍｇ／ｌアンピシリンを補足したＬＹＳＴ（２０ｇ／ｌトリプトン、５ｇ／ｌ酵母抽出物、１０ｇ／ｌ ＮａＣｌ、６ｇ／ｌグリセロール、２ｇ／ｌ又は４ｇ／ｌラクトース、極微量の金属）、抗生物質、例えば１００ｍｇ／ｍｌアンピシリンを補足したＬＢＯＮ（１０ｇ／ｌファイトン、５ｇ／ｌ酵母抽出物）、抗生物質、例えば１００ｍｇ／ｌアンピシリンを補足したＧＹＳＰＯＮ（２０ｇ／ｌファイトン、５ｇ／ｌ酵母抽出物、１０ｇ／ｌグルコース、極微量の金属）を含む群から選択される（極微量の金属：ＦｅＳＯ_４×７Ｈ_２Ｏ：４０ｍｇ／ｌ、ＣａＣｌ_２×２Ｈ_２Ｏ：４０ｍｇ／ｌ、ＭｎＳＯ_４×ｎＨ_２Ｏ：１０ｍｇ／ｌ、ＡｌＣｌ_３×６Ｈ_２Ｏ：１０ｍｇ／ｌ、ＣｏＣｌ_２×６Ｈ_２Ｏ：４ｍｇ／ｌ、ＺｎＳＯ_４×７Ｈ_２Ｏ：２ｍｇ／ｌ、ＮａＭｏＯ_４×２Ｈ_２Ｏ：２ｍｇ／ｌ、ＣｕＳＯ_４×５Ｈ_２Ｏ：１ｍｇ／ｌ、Ｈ_３ＢＯ_３：０．５ｍｇ／ｌ））。好ましくは１００ｍｇ／ｍｌアンピシリンを補足したＧＹＳＴ及びＧＹＳＰ培地を使用する。

（封入体の洗浄）
封入体内の生物活性タンパク質のより高い割合は、封入体のより高い溶解度を導く。封入体を界面活性剤で洗浄した場合、Ｇ−ＣＳＦの正しく折りたたまれた前駆体の高い割合が洗浄液と共に洗い流される。それ故、洗浄は、好ましくは水及び非常に低い濃度（１ｍＭから１０ｍＭ）の様々な緩衝液、例えばトリス／ＨＣｌ緩衝液、リン酸緩衝液、酢酸緩衝液、クエン酸緩衝液から成る群より選択される洗浄液で実施する。水による洗浄が最も好ましい。洗浄液は、好ましくは低い温度、適切には４℃付近に調節する。洗浄は１回又は複数回実施することができる。

（封入体の可溶化）
封入体内の異種タンパク質の正しく折りたたまれた前駆体のより高い溶解度の故に生じる非古典的封入体のより高い溶解度は、可溶化が、強力な変性剤、強アルカリ溶液又は変性濃度の界面活性剤を添加せずに、穏やかな条件下で好都合に実施できることを示す。封入体の可溶化のために、使用する溶媒は、非変性濃度（１−２Ｍ、好ましくは１０以下のｐＨ、より好ましくは約８．０のｐＨの緩衝液中）の尿素、非変性濃度（０．０５−０．２５％（ｍ／ｖ））のＮ−ラウロイルサルコシン、低濃度の両性界面活性剤、種々の非界面活性スルホベタイン（ＮＤＳＢ）、ベタイン、サルコシン、カルバモイルサルコシン、タウリン、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、及びより高い濃度の緩衝液（好ましくは１０以下、より好ましくは約８．０に維持されるｐＨの）、例えばＨＥＰＥＳ、ＨＥＰＰＳ、ＭＥＳ、ＡＣＥＳ及びＭＥＳから成る群より選択することができる。好ましくはＮ−ラウロイルサルコシン、ＮＤＳＢ及びＤＭＳＯを使用する。最も好ましくは０．１％から０．２５％（ｍ／ｖ）の濃度範囲のＮ−ラウロイルサルコシンを使用する。

約２０から３０℃、特に約２５℃の培養温度；バッチ方式での発酵の実施；各々抗生物質、例えば１００ｍｇ／ｍｌアンピシリンを補足したＧＹＳＴ又はＧＹＳＰ培地；発酵の開始時に、場合により前培養工程を実施する場合はその前培養工程の後に、約０．３−０．６ｍＭ、好ましくは約０．４ｍＭの濃度でＩＰＴＧを添加することによる誘導様式；場合により水による洗浄及び約０．１から０．２５％、好ましくは約０．２％の濃度のＮ−ラウロイルサルコシン中での封入体の可溶化が、Ｇ−ＣＳＦの正しく折りたたまれた前駆体の割合（及びその結果として生物活性Ｇ−ＣＳＦの割合）及びＧ−ＣＳＦの蓄積が特に高い最適化パラメータである。これらのパラメータにより、生じるタンパク質の組成物は、このようにして得られたＧ−ＣＳＦを、抽出、慣用的又は流動床クロマトグラフィー工程、例えばイオン交換、疎水性相互作用、サイズ排除又はアフィニティーなどのさらなる単離手順において、好ましくは固定化金属アフィニティークロマトグラフィー−ＩＭＡＣ用の充填溶液として、直接使用することを可能にする。この方法は、高い収率でＧ−ＣＳＦの大規模生産において使用できる。

上述したように、生物活性異種タンパク質の形成は、変性及び／又は再生のための処理を必要とせず、所望の異種タンパク質の単離及び精製を含む全工程を非変性条件、好ましくは天然条件下で実施する、本発明の方法の好ましい実施態様によって達成することができる。所望の異種タンパク質の単離及び／又は精製のための適切な手法は当業者に既知であり、例えば、周知の原理のいずれか、例えばイオン交換、疎水性相互作用、アフィニティー又はサイズ排除のいずれかを用いた古典的又は流動床クロマトグラフィー、ならびに適切なマトリックス又は溶液を用いた連続的バッチ方式抽出が使用できる。好ましい手法は固定化金属アフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）であり、これは、高い収率及び天然条件下で純粋な生物活性タンパク質の極めて効率的な製造を可能にする。

（実施例１）
封入体内のＧ−ＣＳＦの正しく折りたたまれた前駆体の割合及び封入体の可溶化後の総タンパク質の濃度への培養温度の影響
Ｇ−ＣＳＦについてのヒト遺伝子を、大腸菌（Ｆｏｐｔ５）における高発現のために改変した。プラスミドｐＥＴ３ａを含む発現系、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）では、すべての細胞タンパク質の５０％以上を占めるＧ−ＣＳＦの蓄積レベルが達成される。−７０℃の菌株バンクからの大腸菌培養物ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＥＴ３ａ／Ｐ−Ｆｏｐｔ５を、１００ｍｇ／ｌアンピシリンを補足したＬＢＧ培地（１０ｇ／ｌトリプトン、５ｇ／ｌ酵母抽出物、１０ｇ／ｌ ＮａＣｌ、２．５ｇ／ｌグルコース）に１：１００の比率で接種し、その培養物を振とう装置において２５℃、１６０ｒｐｍで１０時間培養した。この培養物２から４ｍｌを、１００ｍｇ／ｍｌアンピシリンを補足したＧＹＳＴ培地４０ｍｌに接種し、そこに、最終濃度０．４ｍＭとなるＩＰＴＧ誘導物質を発酵の開始時に添加した（培養物の初期ＯＤ_{λ６００ｎｍ}は０．３８５であった）。次にその培養物を振とう装置（振とうフラスコ）で、３つの異なる温度にて１６０ｒｐｍで指数的増殖期まで培養した：
２５℃：２２時間、培養物の最終ＯＤ_{λ６００ｎｍ}は１５．２±０．５であった；
３７℃：１５時間、培養物の最終ＯＤ_{λ６００ｎｍ}は１２．２±０．４であった；
４２℃：１５時間、培養物の最終ＯＤ_{λ６００ｎｍ}は６．７５±０．２であった。

培養の完了後、生じた培養物を５０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、４−５倍容量の１０ｍＭトリスＨＣｌ／ｐＨ＝８．０で洗浄し、バイオマスを新しい遠心分離管に移して、再び５０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。そのバイオマスを５倍容量の１０ｍＭトリスＨＣｌ／ｐＨ＝８．０緩衝液に再懸濁し、液中プローブと共に１２×で１分間超音波処理した（負荷サイクル：６０％、仕事率：７、パルス：２／秒）。超音波処理後、破壊された細胞を再び５０００ｒｐｍで３０分間遠心分離した。封入体を含むペレットを、非変性条件下で５０倍容量の４０ｍＭトリスＨＣｌ／ｐＨ＝８．０中の０．２％Ｎ−ラウロイルサルコシンに可溶化し、５０ｒｐｍで振とうしながら室温で一晩、１６から１８時間放置して可溶化を進行させた。可溶化後、純粋なｈＭｅｔ−Ｇ−ＣＳＦを標準品として使用して、ブラッドフォード法に従ってタンパク質濃度を定量した。濃度は４２℃及び３７℃については約１ｍｇ／ｍｌ、２５℃については２〜３ｍｇ／ｍｌであった。０．２％Ｎ−ラウロイルサルコシンへの封入体の可溶化後の総タンパク質の濃度、及びそれぞれ種々の温度で培養したバイオマスから調製したＧ−ＣＳＦの正しく折りたたまれた前駆体及び生物活性Ｇ−ＣＳＦの割合を表１に示す。Ｇ−ＣＳＦの正しく折りたたまれた前駆体及び生物活性Ｇ−ＣＳＦの割合は、それぞれ、（封入体からの抽出後）Ｎ−ラウロイルサルコシンを除去せずに（この希釈でＮ−ラウロイルサルコシンは生物活性測定に干渉しない）可溶化した封入体の生物活性を測定することによって定量した。

表１に示すデータから明らかなように、封入体内の正しく折りたたまれた前駆体の割合は、低い温度での培養によって著明に上昇した。さらに、０．２％Ｎ−ラウロイルサルコシン中での封入体の可溶化後に２．５倍までの高い濃度の総タンパク質が得られ、このようにして調製した封入体が基本的により可溶性であることを示唆した。非古典的封入体がこのようにして形成された。

（実施例１）
Ｇ−ＣＳＦの蓄積へのＩＰＴＧによる誘導様式の影響
発酵開始時のＩＰＴＧによる誘導
種々の濃度のＩＰＴＧ（０．０５ｍＭから０．４ｍＭ）による予備実験は、最終ＯＤ_{λ６００ｎｍ}＝２０−３０のバイオマスについて０．１−０．４ｍＭの範囲内でＧ−ＣＳＦの十分に高い、ほぼ同じ蓄積が達成されることを示した。−７０℃の菌株バンクからの大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＥＴ３ａ／Ｐ−Ｆｏｐｔ５を、ＬＢＧ／アンピシリン培地に１：５００の比率で接種し、振とう装置において２５℃、１５０ｒｐｍで１４−１８時間培養した。この培養物を、１００ｍｇ／ｍｌアンピシリンを補足したＧＹＳＴ生産培地に１：２０の比率で発酵槽培養物を接種するための接種培養物として使用し、前記培地に、最終濃度０．４ｍＭになるＩＰＴＧ誘導物質を発酵の開始時に添加した。発酵は、２５℃、５００ｒｐｍ及び気流１ｖｖｍで２０−２３時間、バッチ方式で実施した（７Ｌ実験用発酵槽）。工程の終了時に、培養物のＯＤ_{λ６００ｎｍ}は約２５であった。

前記バイオマスを５０００ｒｐｍで５分間遠心分離し（Ｂｅｃｋｍａｎ遠心分離機）、さらなる処理のために凍結した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びクマシー染色後、デンシトメトリー分析を使用して総タンパク質中のＧ−ＣＳＦの割合を測定した。それは３０％〜４０％の範囲であった。

ＯＤ_{６００ｎｍ}≒６．０でのＩＰＴＧによる誘導
培養物がＯＤ_{６００ｎｍ}≒６．０に達したときに最終濃度０．４ｍＭになるＩＰＴＧ誘導物質を添加したことを除いて、工程の開始時の０．４ｍＭ ＩＰＴＧによる誘導の場合と同様にして発酵を実施した。発酵は、２５℃、５００ｒｐｍ及び気流１ｖｖｍで１８−２０時間、バッチ方式で実施した（７Ｌ実験用発酵槽）。工程の終了時に、培養物のＯＤ_{λ６００ｎｍ}は約３０であった。バイオマスを５０００ｒｐｍで５分間遠心分離し（Ｂｅｃｋｍａｎ遠心分離機）、さらなる処理のために凍結した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びクマシー染色後、プロフィールデンシトメトリー分析を使用して総タンパク質中のＧ−ＣＳＦの割合を測定し、３０％〜４０％の範囲であった。実施例３で述べるように封入体をバイオマスから単離した。次に、封入体を含むペレットを冷水又は低温１０ｍＭトリスＨＣｌ／ｐＨ＝８緩衝液で洗浄し、１００００ｒｐｍで３０分間再び遠心分離して、非変性条件下で５０倍容量の４０ｍＭトリスＨＣｌ／ｐＨ＝８．０中の０．２％Ｎ−ラウロイルサルコシンで可溶化した。１００−１５０ｒｐｍで振とうしながら室温で一晩、１６〜１８時間放置して可溶化を進行させた。可溶化後、純粋なｈＭｅｔ−Ｇ−ＣＳＦを標準品として使用するブラッドフォード法によってタンパク質の濃度を測定した。

総可溶化タンパク質の濃度は、両方の誘導方式後に２〜４ｍｇ／ｍｌの範囲であった。

発酵の開始時にＩＰＴＧを添加したとき（即時誘導）又は培養物のＯＤ_{６００ｎｍ}が約６．０のときの封入体内のｈＧ−ＣＳＦの割合の比較
図１は、封入体中のタンパク質組成の結果を示す。

方法：ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（４％濃縮用ゲル、１５％分離用ゲル、クマシーブリリアントブルーで染色）。

封入体の調製のための条件：培養温度２５℃、バッチ方式での発酵の実施、ＯＤ_{６００ｎｍ}≒６．０又は開始時の０．４ｍＭ ＩＰＴＧによる誘導、冷水又は低温１０ｍＭトリスＨＣｌ／ｐＨ＝８．０緩衝液による洗浄、０．２％Ｎ−ラウロイルサルコシンでの可溶化。

レーン１：ｈＧ−ＣＳＦ標準品０．６μｇ
レーン２：ＯＤ_{６００ｎｍ}≒６．０での誘導、水による封入体洗浄
レーン３：ＯＤ_{６００ｎｍ}≒６．０での誘導、１０ｍＭトリスＨＣｌ／ｐＨ＝８．０緩衝液による封入体洗浄
レーン４：分子量標準品（ＬＭＷ−ＢｉｏＲａｄ）
レーン５：開始時の誘導、水による封入体洗浄
レーン６：開始時の誘導、１０ｍＭトリスＨＣｌ／ｐＨ＝８．０緩衝液による封入体洗浄。

結果は、開始時にＩＰＴＧを培地に添加したとき、Ｇ−ＣＳＦの非常に高い含量を有する封入体及び他の大腸菌タンパク質の重要でない不純物が得られることを明らかにしている。ＯＤ_{６００ｎｍ}≒６．０での誘導の場合は、封入体内のＧ−ＣＳＦの含量はまだ非常に高いが、他の大腸菌タンパク質の含量がより高く、その後の単離工程に影響を及ぼす可能性がある。

（実施例２）
封入体の溶解度への温度の影響
細胞を２５℃で培養するとき、封入体の溶解度がはるかに高い。界面活性剤による洗浄は、それ故、洗浄液中へのＧ−ＣＳＦの正しく折りたたまれた前駆体の損失を導く。しかし、洗浄は、さもなければクロマトグラフィーなどのその後の精製工程を妨げる可能性がある一部のタンパク質又は宿主細胞生物から生じる他の成分が封入体内に付着又は捕獲されたままであり、その後同時溶解しうるので、少なくとも水で実施すべきである。

バイオマスの生成：−７０℃の菌株バンクからの大腸菌培養物ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＥＴ３ａ／Ｐ−Ｆｏｐｔ５を、１００ｍｇ／ｍｌアンピシリンを補足したＬＢＧ培地に１：５００の比率で接種し、その培養物を振とう装置において２５℃、１５０ｒｐｍで１４−１８時間培養した。この培養物を、１００ｍｇ／ｍｌアンピシリンを補足したＧＹＳＴ生産培地に１：２０の比率で発酵槽培養物を接種するための接種培養物として使用し、前記培地に、最終濃度０．４ｍＭになるＩＰＴＧ誘導物質を発酵の開始時に添加した。発酵は、２つの異なる温度で、５００ｒｐｍ及び気流１ｖｖｍでバッチ方式として（７Ｌ実験用発酵槽）実施した：
２５℃、１８−２５時間、工程の終了時に培養物のＯＤ_{λ６００ｎｍ}は約２５であった；
３７℃、８−２５時間、工程の終了時に培養物のＯＤ_{λ６００ｎｍ}は約２８であった。

非古典的封入体の単離：発酵の完了後、細菌ペレットを＋４℃、５０００ｒｐｍでの遠心分離によって上清から分離した。湿性細菌ペレットを４倍容量の緩衝液Ｘ（１０ｍＭトリス／ＨＣｌ、ｐＨ＝８．０）に再懸濁した。Ｕｌｔｒａｔｕｒａｘを使用して試料の均質化を実施した。次にホモジナイザーＥｍｕｌｓｉＦｌｅｘ Ｃ−５（ＡＶＥＳＴＩＮ）を使用して１００００から１５０００ｐｓｉ（７０−１１０ＭＰａ）の圧差での１回通過によって細胞を破壊した。１００００ｒｐｍで３０分間遠心分離した後、可溶性大腸菌タンパク質を含む上清を廃棄し、ペレット（非古典的封入体を含む）を−２０℃で凍結して、非古典的封入体の洗浄及び可溶化実験のために使用した。

非古典的封入体洗浄の以下の実験を実施した（図２）：
Ａ．水による封入体の洗浄
所定量の非古典的封入体を１０倍容量の冷水（＋４℃）に再懸濁し、＋４℃、１００００ｒｐｍで１０分間遠心分離して、この工程を同じ容量の冷水に関して反復した。両方の洗浄後の上清においてブラッドフォード法（ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を標準品として使用する）に従ってタンパク質の量を定量した。タンパク質組成物をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。

水の品質：水はＭｉｌｌｉ−Ｑ ＲＧ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）装置を使用して調製した。

Ｂ．緩衝液Ｘ（１０ｍＭトリス／ＨＣｌ、ｐＨ８．０）による封入体の洗浄
所定量の非古典的封入体を１０倍容量の低温緩衝液Ｘ（１０ｍＭトリス／ＨＣｌ、ｐＨ８．０）（＋４℃）に再懸濁し、＋４℃、１００００ｒｐｍで１０分間遠心分離して、この工程を同じ容量の低温緩衝液Ｘに関して反復した。両方の洗浄後の上清においてブラッドフォード法（ＢＳＡを標準品として使用する）に従ってタンパク質の量を定量した。タンパク質組成物をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。

Ｃ．１％デオキシコール酸ナトリウムによる封入体の洗浄
所定量の非古典的封入体を１０倍容量の低温（＋４℃）緩衝液Ｗ（１％デオキシコール酸ナトリウム、５ｍＭジチオトレイトール（ＤＴＴ）及び５ｍＭ ＥＤＴＡを加えた５０ｍＭトリス／ＨＣｌ、ｐＨ９．０）に再懸濁し、氷上で３０分間放置して、＋４℃、１００００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。その上清においてブラッドフォード法（ＢＳＡを標準品として使用する）に従ってタンパク質の量を定量した。タンパク質組成物をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。

Ｄ．１％トリトンＸ−１００による封入体の洗浄
所定量の非古典的封入体を、１％トリトンＸ−１００を加えた１０倍容量の低温（＋４℃）緩衝液Ｘ（１０ｍＭトリス／ＨＣｌ、ｐＨ＝８．０）に再懸濁し、氷上で３０分間放置して、＋４℃、１００００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。その上清においてブラッドフォード法（ＢＳＡを標準品として使用する）に従ってタンパク質の量を定量した。タンパク質組成物をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。

Ｅ．２Ｍ尿素による封入体の洗浄
所定量の非古典的封入体を、２Ｍ尿素を加えた１０倍容量の低温（＋４℃）緩衝液Ｘ（１０ｍＭトリス／ＨＣｌ、ｐＨ＝８．０）に再懸濁し、氷上で３０分間放置して、＋４℃、１００００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。その上清においてブラッドフォード法（ＢＳＡを標準品として使用する）に従ってタンパク質の量を定量した。タンパク質組成物をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。

Ｆ．８Ｍ尿素による封入体の洗浄
所定量の非古典的封入体を、８Ｍ尿素を加えた１０倍容量の低温（＋４℃）緩衝液Ｘ（１０ｍＭトリス／ＨＣｌ、ｐＨ＝８．０）に再懸濁し、氷上で３０分間放置して、＋４℃、１００００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。その上清においてブラッドフォード法（ＢＳＡを標準品として使用する）に従ってタンパク質の量を定量した。

タンパク質組成物をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。図２は、培養温度（２５℃又は３７℃）に関する封入体の可溶化の比較を示す。

方法：ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（４％濃縮用ゲル、１５％分離用ゲル、クマシーブリリアントブルーで染色）。

非古典的封入体の作製のための条件：培養温度：２５℃（レーン４−１０）及び３７℃（レーン１２−１８、２０）、バッチ方式での発酵の実施、開始時に０．４ｍＭ ＩＰＴＧによる誘導、冷水又は低温１０ｍＭトリスＨＣｌ／ｐＨ＝８．０緩衝液又は１％デオキシコール酸ナトリウム又は１％トリトンＸ−１００又は２Ｍ尿素又は８Ｍ尿素による洗浄。

レーン１：分子量標準品（ＬＭＷ−ＢｉｏＲａｄ）
レーン２：タンパク質の可溶性分画（ホモジネート上清）
レーン３：総タンパク質
レーン４：水による非古典的封入体の１回目の洗浄後の可溶化タンパク質
レーン５：水による非古典的封入体の２回目の洗浄後の可溶化タンパク質
レーン６：１０ｍＭトリスＨＣｌ／ｐＨ＝８．０による非古典的封入体の１回目の洗浄後の可溶化タンパク質
レーン７：１０ｍＭトリスＨＣｌ／ｐＨ＝８．０による非古典的封入体の２回目の洗浄後の可溶化タンパク質
レーン８：１％デオキシコール酸ナトリウムによる非古典的封入体の洗浄後の可溶化タンパク質
レーン９：２Ｍ尿素による非古典的封入体の洗浄後の可溶化タンパク質
レーン１０：１％トリトンＸ−１００による非古典的封入体の洗浄後の可溶化タンパク質
レーン１１：分子量標準品（ＬＭＷ−ＢｉｏＲａｄ）
レーン１２：水による非古典的封入体の１回目の洗浄後の可溶化タンパク質
レーン１３：水による非古典的封入体の２回目の洗浄後の可溶化タンパク質
レーン１４：１０ｍＭトリスＨＣｌ／ｐＨ＝８．０による非古典的封入体の１回目の洗浄後の可溶化タンパク質
レーン１５：１０ｍＭトリスＨＣｌ／ｐＨ＝８．０による非古典的封入体の２回目の洗浄後の可溶化タンパク質
レーン１６：１％デオキシコール酸ナトリウムによる非古典的封入体の洗浄後の可溶化タンパク質
レーン１７：２Ｍ尿素による非古典的封入体の洗浄後の可溶化タンパク質
レーン１８：１％トリトンＸ−１００による非古典的封入体の洗浄後の可溶化タンパク質
レーン１９：標準ｈＧ−ＣＳＦ、０．６μｇ
レーン２０：８Ｍ尿素による非古典的封入体の洗浄後の可溶化タンパク質。

図２に示すように、細胞を３７℃で培養したとき（レーン１２−１８、２０）よりも細胞を２５℃で培養したとき（レーン４−１０）の方が非古典的封入体の溶解度が上昇した。細胞を２５℃で培養したとき、界面活性剤（１％デオキシコール酸塩又は１％トリトンＸ−１００）及び２Ｍ尿素による洗浄は、異種タンパク質の大部分が洗浄液と共に失われたため、もはや不可能であり（レーン８、９、１０）、細胞を３７℃で培養した場合は、界面活性剤（１％デオキシコール酸塩、レーン１６）、２Ｍ尿素（レーン１７）及び１％トリトンＸ−１００（レーン１８）による洗浄がまだ可能であった。図からわかるように、３７℃の培養温度で得られた非古典的封入体は８Ｍ尿素でのみ可溶化することができた（レーン２０）。

（実施例４）
封入体内のＧ−ＣＳＦの蓄積及びＧ−ＣＳＦの正しく折りたたまれた前駆体の割合への発酵の実施の影響
バッチ方式又はフェドバッチ方式で発酵を実施することにより、非古典的封入体におけるＧ−ＣＳＦの正しく折りたたまれた前駆体の高い割合を得ることができる。

バッチ方式での発酵の実施
−７０℃の菌株バンクからの大腸菌培養物ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＥＴ３ａ／Ｐ−Ｆｏｐｔ５を、１００ｍｇ／ｍｌアンピシリンを補足したＬＢＧ培地に１：５００の比率で接種し、その培養物を振とう装置において２５℃、１５０ｒｐｍで１４−１８時間培養した。この培養物を、１００ｍｇ／ｍｌアンピシリンを補足したＧＹＳＴ生産培地に１：２０の比率で発酵槽培養物を接種するための接種培養物として使用し、前記培地に、最終濃度０．４ｍＭとなるＩＰＴＧ誘導物質を発酵の開始時又は培養物のＯＤ_{λ６００ｎｍ}が６である指数的増殖期初期に添加した。発酵は、２５℃、５００ｒｐｍ及び気流１ｖｖｍ（７Ｌ実験用発酵槽）で１８−２５時間、バッチ方式で実施した。工程の終了時、培養物のＯＤ_{λ６００ｎｍ}は、誘導の開始時には約２５、遅い方の誘導の場合には３０であった。バイオマスを５０００ｒｐｍで５分間遠心分離し（Ｂｅｃｋｍａｎ遠心分離機）、さらなる処理のために凍結した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びクマシー染色後、デンシトメトリー分析を使用して総タンパク質中のＧ−ＣＳＦの割合を測定した。前記割合は３０％から４０％の範囲であった。

フェドバッチ方式での発酵の実施
２５℃、５００ｒｐｍ及び気流１ｖｖｍ（７Ｌ実験用発酵槽）で２５．５−３０時間、フェドバッチ方式で発酵を実施した。ひとたび培地中のグルコースが消費され、すなわちバッチ工程（前記のように実施）が終了し、及び培地のｐＨが上昇すれば、０．０５−０．１μ／時の比増殖速度を提供するように１００ｍｇ／ｌアンピシリンを加えた２０％グルコース溶液の供給を開始した。７−７．５時間の供給後（合計２５．５−３０時間）、培養物のＯＤ_{λ６００ｎｍ}が約４２になったときに工程を終了した。バイオマスを５０００ｒｐｍで５分間遠心分離し（Ｂｅｃｋｍａｎ遠心分離機）、さらなる処理のために凍結した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びクマシー染色後、バッチ方式で発酵を実施する場合と同様の高いレベルに維持されるＧ−ＣＳＦの蓄積をデンシトメトリー分析によって測定した。前記蓄積は３０％から４０％の範囲であった。非古典的封入体を実施例３で述べたようにバイオマスから単離した。非古典的封入体を含むペレットを冷水で洗い、再び１００００ｒｐｍで３０分間遠心分離して、非変性条件下で５０倍容量の４０ｍＭトリスＨＣｌ／ｐＨ＝８．０中の０．２％Ｎ−ラウロイルサルコシンに可溶化した。１００−１５０ｒｐｍで振とうしながら室温で一晩、１６から１８時間放置して可溶化を進行させた。可溶化後、純粋なｈＭｅｔ−Ｇ−ＣＳＦを標準品として使用するブラッドフォード法によってタンパク質濃度を定量した。

タンパク質の濃度は、どちらの発酵実施原理後も、２から４ｍｇ／ｍｌの範囲であった。Ｇ−ＣＳＦの正しく折りたたまれた前駆体又は生物活性Ｇ−ＣＳＦの割合を、Ｎ−ラウロイルサルコシンを除去せずに（この希釈でＮ−ラウロイルサルコシンは生物活性測定に干渉しない）可溶化した比古典的封入体の生物活性を測定することによって定量した。

以下の表２は、発酵の実施方法及び誘導様式に依存したＧ−ＣＳＦの正しく折りたたまれた前駆体の割合を示す。

表２に示すデータから明らかなように、すべての場合に生物活性時の高い割合が得られ、バッチ方式で発酵を実施することによって最も高い割合が得られた。

（実施例５）
Ｇ−ＣＳＦの蓄積及びＧ−ＣＳＦの正しく折りたたまれた前駆体の割合へのラクトースによる誘導の影響
−７０℃の菌株バンクからの大腸菌培養物ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＥＴ３ａ／Ｐ−Ｆｏｐｔ５を、１００ｍｇ／ｍｌアンピシリンを補足したＬＢＧ培地に１：５００の比率で接種し、その培養物を振とう装置において２５℃、１５０ｒｐｍで１４−１８時間培養した。この培養物を、１００ｍｇ／ｍｌアンピシリンを補足したＬＹＳＴ改変生産培地に１：２０の比率で発酵槽培養物を接種するための接種培養物として使用し、但し、グルコースの代わりにグリセロール（６ｇ／ｌ）及びラクトース（２ｇ／ｌ又は４ｇ／ｌ）を炭素ソースとして使用し、これらは同時に、ＩＰＴＧに代わる発現誘導物質でもあった。発酵は、２５℃、５００ｒｐｍ及び気流１ｖｖｍ（７Ｌ実験用発酵槽）で１７−２１時間、バッチ方式で実施した。工程の終了時に培養物のＯＤ_{λ６００ｎｍ}は約２０であった。バイオマスを５０００ｒｐｍで５分間遠心分離し（Ｂｅｃｋｍａｎ遠心分離機）、１０ｍＭトリス／ＨＣｌ、ｐＨ＝８緩衝液で１回洗浄して、さらなる処理のために凍結した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びクマシー染色後、デンシトメトリー分析を使用してＧ−ＣＳＦの蓄積を測定し、２ｇ／ｌラクトースによる誘導については２７％及び４ｇ／ｌによる誘導では３３％であった。非古典的封入体を実施例３で述べたようにバイオマスから単離した。非古典的封入体を含むペレットを冷水で洗い、再び１００００ｒｐｍで３０分間遠心分離して、非変性条件下で５０倍容量の４０ｍＭトリスＨＣｌ／ｐＨ＝８．０中の０．２％Ｎ−ラウロイルサルコシンに可溶化した。１００−１５０ｒｐｍで振とうしながら室温で一晩、１６から１８時間放置して可溶化を進行させた。

表３は、ラクトースによる生産菌株、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＥＴ３ａ／Ｐ−Ｆｏｐｔ５の誘導によって得られた非古典的封入体中のＧ−ＣＳＦの正しく折りたたまれた前駆体又は生物活性Ｇ−ＣＳＦの割合（％）を示す。

表３から明らかなように、ラクトースによる誘導の使用により、２５℃で培養したとき、少なくとも２３％という封入体中のＧ−ＣＳＦの正しく折りたたまれた前駆体の割合が得られた。

（実施例６）
Ｇ−ＣＳＦの蓄積及びＧ−ＣＳＦの正しく折りたたまれた前駆体の割合へのＮａＣｌによる誘導の影響
−７０℃の菌株バンクからの大腸菌培養物ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＥＴ３ａ／Ｐ−Ｆｏｐｔ５を、１００ｍｇ／ｍｌアンピシリンを補足したＬＢＯＮ培地に１：２０の比率で接種し、その日に振とう装置において２５℃、１６０ｒｐｍで８時間培養した。この培養物１ｍｌを、１００ｍｇ／ｍｌアンピシリンを補足したＧＹＳＰＯＮ培地２０ｍｌに接種するための接種培養物として使用し、前記培地に、開始時又はＯＤ_{λ６００ｎｍ}≒０．５の時点、すなわち培養の約３時間後に最終濃度１．２ＭになるＮａＣｌ誘導物質を添加した。どちらの場合も、培養物を振とう装置において２５℃、１６０ｒｐｍで２０−２４時間培養した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析のために、培養が完了した後この培養物５ｍｌを５０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。次にペレットを１０ｍＭトリスＨＣｌ／ｐＨ＝８．０ １５ｍｌに再懸濁した。試料を、４×ＳＤＳ−ＤＴＴを含む試料緩衝液（ｐＨ＝８．７）と３：１の比率で混合し、９５℃で１０分間加熱して、遠心分離し、その上清をゲルに負荷した。Ｇ−ＣＳＦの蓄積を表４に提示しており、表４は、種々の培地及び誘導方式での生産菌株ＢＬ２１−ＳＩ ｐＥＴ３ａ／Ｐ−Ｆｏｐｔ５のＧ−ＣＳＦの蓄積の比較を示している。表に示すように、１．２Ｍ ＮａＣｌを開始時に、すなわち製造者（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）によって推奨されている従来のＯＤ_{λ６００ｎｍ}≒０．５の時点ではなく接種時に培地に添加したときにより高いＧ−ＣＳＦの蓄積が得られた。

Ｇ−ＣＳＦアッセイに関して報告した数値は、図３に示すクマシーブリリアントブルーで染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルのデンシトメトリー分析によって得た。相対的割合は、Ｉｍａｇｉｎｇ ｄｅｎｓｉｔｏｍｅｔｅｒ ＧＳ６７０型装置（ＢｉｏＲａｄ）でのゲルのプロフィール分析（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎａｌｙｓｔプログラム；ＢｉｏＲａｄ）によって決定した。

図３は、非古典的封入体中のタンパク質の組成物を示す。

方法：ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（４％濃縮用ゲル、１５％分離用ゲル、クマシーブリリアントブルーで染色）。

非古典的封入体の作製のための条件：生産菌株ＢＬ２１−ＳＩ ｐＥＴ３ａ／Ｐ−Ｆｏｐｔ５、培養温度２５℃、振とうフラスコでの発酵、非誘導培養又はＯＤ_{λ６００ｎｍ}≒０．５の時点で又は開始時に１．２Ｍ ＮａＣｌによる誘導。

レーン１：ＢＬ２１−ＳＩ ｐＥＴ３ａ／Ｐ−Ｆｏｐｔ５、非誘導培養
レーン２：ＢＬ２１−ＳＩ ｐＥＴ３ａ／Ｐ−Ｆｏｐｔ５、ＯＤ_{λ６００ｎｍ}≒０．５の時点で１．２Ｍ ＮａＣｌによる誘導
レーン３：ＢＬ２１−ＳＩ ｐＥＴ３ａ／Ｐ−Ｆｏｐｔ５、ＯＤ_{λ６００ｎｍ}≒０．５の時点で１．２Ｍ ＮａＣｌによる誘導
レーン４：ＢＬ２１−ＳＩ ｐＥＴ３ａ／Ｐ−Ｆｏｐｔ５、開始時に１．２Ｍ ＮａＣｌによる誘導
レーン５：ＢＬ２１−ＳＩ ｐＥＴ３ａ／Ｐ−Ｆｏｐｔ５、開始時に１．２Ｍ ＮａＣｌによる誘導
レーン６：ｒｈＧ−ＣＳＦ ０．６μｇ
生物活性の定量及び非古典的封入体洗浄実験のための試料の調製
生物活性の分析及び非古典的封入体洗浄実験のために、より多量のバイオマスを調製した。−７０℃の菌株バンクからの大腸菌培養物ＢＬ２１−ＳＩ ｐＥＴ３ａ／Ｐ−Ｆｏｐｔ５を、１００ｍｇ／ｍｌアンピシリンを補足したＬＢＯＮ培地に１：２０の比率で接種し、その日に振とう装置において２５℃、１６０ｒｐｍで８時間培養した。この培養物の１０ｍｌアリコートを、１００ｍｇ／ｍｌアンピシリンを補足したＧＹＳＰＯＮ培地８×２００ｍｌに接種し、前記培地に、開始時に最終濃度１．２ＭとなるＮａＣｌ誘導物質を添加した。前記培養物を振とう装置において２５℃、１６０ｒｐｍで２４時間培養した。非古典的封入体を実施例３で述べたようにバイオマスから単離した。次に、非古典的封入体を含むペレットを冷水で洗い、実施例９で述べるように０．２％Ｎ−ラウロイルサルコシンで可溶化した。可溶化後、純粋なｈＭｅｔ−Ｇ−ＣＳＦを標準品として使用するブラッドフォード法に従ってタンパク質濃度を測定した。総可溶化タンパク質の濃度は２−３ｍｇ／ｍｌの範囲であった。

従って、表５は、１．２Ｍ ＮａＣｌによる生産菌株、大腸菌ＢＬ２１−ＳＩ ｐＥＴ３ａ／Ｐ−Ｆｏｐｔ５の誘導によって得た非古典的封入体中のＧ−ＣＳＦの正しく折りたたまれた前駆体又は生物活性Ｇ−ＣＳＦの割合を示す。

表５から明らかなように、２５℃で培養したとき１．２Ｍ ＮａＣｌによる異種遺伝子の発現の誘導により、生産菌株、大腸菌ＢＬ２１−ＳＩ ｐＥＴ３ａ／Ｐ−Ｆｏｐｔ５に関してＧ−ＣＳＦの正しく折りたたまれた前駆体（又は生物活性Ｇ−ＣＳＦ）の高い割合が得られた。

非古典的封入体の溶解度
２５℃で培養したとき１．２Ｍ ＮａＣｌによる異種遺伝子の発現の誘導により、生産菌株、大腸菌ＢＬ２１−ＳＩ ｐＥＴ３ａ／Ｐ−Ｆｏｐｔ５に関して封入体の溶解度が大きく上昇した。ここでも、界面活性剤による非古典的封入体の洗浄は、Ｇ−ＣＳＦの正しく折りたたまれた前駆体の洗浄液への損失を導く。これは、種々の溶媒での洗浄に関する非古典的封入体の溶解度の比較を示す図４によって明らかにされる。

方法：ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（４％濃縮用ゲル、１５％分離用ゲル、クマシーブリリアントブルーで染色）。

非古典的封入体の作製のための条件：菌株ＢＬ２１（ＳＩ）ｐＥＴ３ａ／Ｐ−Ｆｏｐｔ５、培養温度２５℃、振とうフラスコでの発酵、１．２Ｍ ＮａＣｌによる誘導、水又は１０ｍＭトリスＨＣｌ／ｐＨ＝８．０又は１％デオキシコール酸ナトリウム又は１％トリトンＸ−１００又は２Ｍ尿素による洗浄。

非古典的封入体を２５℃で振とうフラスコにおいて作製し、開始時に培地に添加した１．２ｍＭ ＮａＣｌで誘導した。

レーン１：タンパク質の可溶性分画（ホモジネート上清）
レーン２：分子量標準品（ＬＭＷ−ＢｉｏＲａｄ）
レーン３：総タンパク質
レーン４：水による非古典的封入体の１回目の洗浄後の可溶化タンパク質
レーン５：水による非古典的封入体の２回目の洗浄後の可溶化タンパク質
レーン６：１０ｍＭトリスＨＣｌ／ｐＨ＝８．０による非古典的封入体の１回目の洗浄後の可溶化タンパク質
レーン７：１％デオキシコール酸ナトリウムによる非古典的封入体の洗浄後の可溶化タンパク質
レーン８：２Ｍ尿素による非古典的封入体の洗浄後の可溶化タンパク質
レーン９：１％トリトンＸ−１００による非古典的封入体の洗浄後の可溶化タンパク質。

（実施例７）
封入体中のＧ−ＣＳＦの正しく折りたたまれた前駆体の割合への、ストレスを生じさせることができる添加物、例えばエタノール又はプロパノールの影響
−７０℃の菌株バンクからの大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＥＴ３ａ／Ｐ−Ｆｏｐｔ５を、１００ｍｇ／ｍｌアンピシリンを補足したＬＢＰＧ培地（１０ｇ／ｌファイトン、５ｇ／ｌ酵母抽出物、１０ｇ／ｌ ＮａＣｌ）に１：５００の比率で接種し、振とう装置において２５℃、１６０ｒｐｍで１７時間培養した。この培養物１０ｍｌを、最終濃度０．４ｍＭになるＩＰＴＧ誘導物質を即時添加した培地２００ｍｌに接種した；
−１００ｍｇ／ｍｌアンピシリンを補足したＧＹＳＰ培地（対照）；
−エタノール（培地中の最終エタノール濃度３％）を添加した１００ｍｇ／ｍｌアンピシリン補足ＧＹＳＰ培地；
−イソプロパノール（培地中の最終イソプロパノール濃度３％）を添加した１００ｍｇ／ｍｌアンピシリン補足ＧＹＳＰ培地。

次に、対照（１００ｍｇ／ｍｌアンピシリンを補足したＧＹＳＰ培地）の場合は培養物を振とう装置において２５℃、１６０ｒｐｍで２４時間培養した。エタノール又はイソプロパノールを添加した１００ｍｇ／ｍｌアンピシリン補足ＧＹＳＰ培地の場合は、どちらの物質の添加も増殖を緩慢化するので、同じ条件下で３４時間培養した。非古典的封入体を実施例３で述べたようにバイオマスから単離した。次に、非古典的封入体を含むペレットを冷水で洗い、実施例９で述べるように０．２％Ｎ−ラウロイルサルコシンの添加によって可溶化した。

従って、表６は、０．４ｍＭ ＩＰＴＧ及びストレスを生じさせることができるエタノール又はプロパノールの添加による、１００ｍｇ／ｍｌアンピシリン補足ＧＹＳＰ培地中の生産菌株、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＥＴ３ａ／Ｐ−Ｆｏｐｔ５の誘導によって得た非古典的封入体中のＧ−ＣＳＦの正しく折りたたまれた前駆体の割合（％）を示す。

表６から明らかなように、ストレスタンパク質の引き金となるエタノール又はプロパノールの添加は、非古典的封入体中のＧ−ＣＳＦの正しく折りたたまれた前駆体又は生物活性Ｇ−ＣＳＦの割合を上昇させる。

（実施例８）
緩衝液中の尿素による非古典的封入体の可溶化
２Ｍ尿素を含む緩衝液Ｚ（４０ｍＭトリス／ＨＣｌ ｐＨ＝８．０）１２ｍｌを、あらかじめ冷水で洗浄した湿性非古典的封入体０．３０ｇに加えた（実施例３参照）。均質化後、非古典的封入体を、８０ｒｐｍで穏やかに振とうしながら２０℃で１６時間可溶化した。その溶液を１４０００ｒｐｍ、＋１０℃で１０分間遠心分離し、ペレットを廃棄した。可溶化非古典的封入体を含む上清を、総タンパク質含量の定量、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析及び生物活性の測定のために使用した。

ブラッドフォード法（ｈＭｅｔＧ−ＣＳＦを標準品として使用する）に従ったタンパク質濃度：２．６ｍｇ／ｍｌ、総可溶化タンパク質：３１ｍｇ（可溶化タンパク質の量：湿性非古典的封入体の量に対して約１０％）。

Ｇ−ＣＳＦの生物活性：約１．５×１０^７ＩＵ／ｍｇ。

（実施例９）
緩衝液中のＮ−ラウロイルサルコシンによる非古典的封入体の可溶化
０．２％Ｎ−ラウロイルサルコシンを含む緩衝液Ｚ（４０ｍＭトリス／ＨＣｌ ｐＨ＝８．０）１５．６ｍｌを、あらかじめ冷水で洗浄した湿性非古典的封入体０．３１ｇに加えた（実施例３参照）。均質化後、非古典的封入体を、１００−５０ｒｐｍで振とうしながら室温（２０−２２℃）で１時間可溶化し、最終濃度４０μＭとなるように０．１Ｍ ＣｕＳＯ_４×５Ｈ_２Ｏを添加して酸化（すなわちジスルフィド結合形成）を促進した。８０ｒｐｍ、２０℃で一晩（１６時間）、振とうを継続した。翌日その溶液を１４０００ｒｐｍ、＋１０℃で１０分間遠心分離し、ペレットを廃棄した。ＤＯＷＥＸ０．３９ｇが添加されるようにＤＯＷＥＸ（ＤＯＷＥＸ１×４ Ｓｉｇｍａ）を使用することにより、可溶化非古典的封入体を含む上清からＮ−ラウロイルサルコシンを除去し、その溶液を１００−１５０ｒｐｍ、室温（２０−２２℃）で１時間振とうした。ペレットを廃棄した。可溶化非古典的封入体の溶液を、総タンパク質含量の測定、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析及び生物活性の測定のために使用した。ブラッドフォード法（ｈＭｅｔＧ−ＣＳＦを標準品として使用する）に従ったタンパク質濃度：４．４ｍｇ／ｍｌ、総可溶化タンパク質含量：６８ｍｇ（可溶化タンパク質の量：湿性非古典的封入体の量に対して約２０％）。

Ｇ−ＣＳＦの生物活性：約４．０−４．５×１０^７ＩＵ／ｍｇ−ＣｕＳＯ_４×５Ｈ_２Ｏの添加とは無関係。

（実施例１０）
緩衝液中のＮＤＳＢによる非古典的封入体の可溶化
０．２％の濃度の種々のＮＤＳＢ（非界面活性スルホベタイン）を添加した、４０倍過剰の緩衝液Ｚ（４０ｍＭトリス／ＨＣｌ ｐＨ＝８．０）を、あらかじめ冷水で洗浄した湿性非古典的封入体の０．１６ｇアリコートに加えた（実施例３参照）。ＮＤＳＢ１９５、ＮＤＳＢ２０１、ＮＤＳＢ２１１及びＮＤＳＢ２５６を使用した。均質化後、非古典的封入体の試料を、８０ｒｐｍで振とうしながら２０℃で一晩可溶化した。平行実験において、最初の３０分間の可溶化期間後、酸化を促進するため、最終濃度４０μＭになるように０．１Ｍ ＣｕＳＯ_４×５Ｈ_２Ｏを添加した。翌日遠心分離した後、非溶解ペレットを廃棄し、上清を、事前の処理を行わずに、総タンパク質含量の測定、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析及び生物活性の測定のために使用した。ブラッドフォード法（ｈＭｅｔＧ−ＣＳＦを標準品として使用する）に従ったタンパク質濃度：すべての場合に約３．６ｍｇ／ｍｌ、それ故総タンパク質含量：約２４ｍｇ（可溶化タンパク質の量：湿性非古典的封入体の量に対して約１５％）。

Ｇ−ＣＳＦの生物活性：約３−４×１０^７ＩＵ／ｍｇ−ＣｕＳＯ_４×５Ｈ_２Ｏの添加とは無関係。

（実施例１１）
緩衝液中のＤＭＳＯによる非古典的封入体の可溶化
５％ＤＭＳＯを添加した、４０倍過剰の緩衝液Ｚ（４０ｍＭトリス／ＨＣｌ ｐＨ＝８．０）を、あらかじめ冷水で洗浄した非古典的封入体０．１６ｇに加えた（実施例３参照）。均質化後、非古典的封入体を、８０ｒｐｍで振とうしながら２０℃で一晩可溶化した。平行実験において、最初の３０分間の可溶化期間後、酸化を促進するため、最終濃度４０μＭになるように０．１Ｍ ＣｕＳＯ_４×５Ｈ_２Ｏを添加した。翌日遠心分離した後、沈殿物を廃棄し、上清を、事前の処理を行わずに、総タンパク質含量の測定、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析及び生物活性の測定のために使用した。ブラッドフォード法（ｈＭｅｔＧ−ＣＳＦを標準品として使用する）に従ったタンパク質濃度：約３．６ｍｇ／ｍｌ、それ故総タンパク質含量：約２４ｍｇ（可溶化タンパク質の量：湿性非古典的封入体の量に対して約１５％）。

Ｇ−ＣＳＦの生物活性：約４×１０^７ＩＵ／ｍｇ−ＣｕＳＯ_４×５Ｈ_２Ｏの添加とは無関係。

（実施例１２）
インビトロでのＧ−ＣＳＦの生物活性の試験
既知の方法（Ｈａｍｍｅｒｌｉｎｇ Ｕら、Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｂｉｏｍｅｄ Ａｎａｌ １３，９−２０（１９９５））に従った細胞系ＮＦＳ−６０に関する増殖アッセイの使用及び国際標準ヒト組換えＧ−ＣＳＦ（８８／５０２、酵母細胞由来；ＮＩＢＳＣ Ｐｏｔｔｅｒｓ Ｂａｒ，Ｈｅｒｔｆｏｒｄｓｈｉｒｅ，ＵＫ）；（Ｍｉｒｅ−Ｓｌｕｉｓ Ａ Ｒら、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ １７９，１１７−１２６（１９９５））の使用によってＧ−ＣＳＦの生物活性を測定した。

Claims (37)

1. 異種タンパク質としてのタンパク質の発現を含み、発現後に前記異種タンパク質の正しく折りたたまれた前駆体が封入体内に蓄積される、タンパク質の生産のための方法。
2. 異種タンパク質としてのタンパク質の生合成を実施することを含み、
   前記異種タンパク質の前駆体が微生物の封入体内で形成され、その前駆体が非変性条件下で生物活性異種タンパク質を形成できるように生合成を実施すること；
   前記前駆体を非変性条件下で封入体から単離し、それによって生物活性異種タンパク質を形成すること、
   の工程を含む、タンパク質の生産のための方法。
3. 前記異種タンパク質が、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、ＥＧＦ、ＨＳＡ、デオキシリボヌクレアーゼ、ＦＧＦ、ＴＮＦ−α、ＴＮＦ−β、インターフェン及びインターロイキンを含む群から選択される、請求項１又は２に記載のタンパク質の生産のための方法。
4. 前記選択された異種タンパク質がＧ−ＣＳＦである、請求項１又は２に記載のタンパク質の生産のための方法。
5. 前記発現を細菌及び酵母から成る群より選択される生物において実施する、先行請求項のいずれかに記載のタンパク質の生産のための方法。
6. 前記発現を大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）において実施する、請求項５に記載のタンパク質の生産のための方法。
7. 前記異種タンパク質が、発現系において使用する宿主細胞の総タンパク質量に対して少なくとも約１０％、好ましくは少なくとも約２０％、特に少なくとも約３０％の割合で封入体内に蓄積する、先行請求項のいずれかに記載のタンパク質の生産のための方法。
8. 前記封入体が主として非変性条件下で溶解されうる、先行請求項のいずれかに記載のタンパク質の生産のための方法。
9. 前記方法が、培養温度、培地の組成、誘導様式、発酵の実施原理、ストレスを生じさせることができる物質の添加、及び補助タンパク質の同時発現から成る群より選択される１以上のパラメータを調節することを含む生合成の実施方法を含む、先行請求項のいずれかに記載のタンパク質の生産のための方法。
10. 前記培養温度が約２０℃〜３０℃である、請求項９に記載の方法。
11. 前記培養温度が約２５℃である、請求項１０に記載の方法。
12. 前記誘導様式の調節が、ＩＰＴＧ、ラクトース及びＮａＣｌから成る群より誘導物質を選択することを含む、請求項９から１１のいずれかに記載の方法。
13. 前記選択された誘導物質がＩＰＴＧである、請求項１２に記載の方法。
14. ＩＰＴＧの濃度が０．１ｍＭ〜１ｍＭの範囲内である、請求項１３に記載の方法。
15. ＩＰＴＧの濃度が約０．４ｍＭである、請求項１４に記載の方法。
16. 前記誘導様式の調節が、発酵の開始時に誘導物質を添加することを含む、請求項９から１５のいずれかに記載の方法。
17. 前記生合成の実施原理が、バッチ方式での発酵の実施、フェドバッチ方式での発酵の実施及び振とうフラスコでの発酵を含む群から選択される、請求項９から１６のいずれかに記載の方法。
18. 前記選択された発酵実施原理がバッチ方式である、請求項１７に記載の方法。
19. 前記培地が、ＧＹＳＴ、ＧＹＳＰ、ＬＹＳＰ、ＬＹＳＴ、ＬＢＯＮ及びＧＹＳＰＯＮを含む群から選択される、請求項９から１８のいずれかに記載の方法。
20. 前記選択された培地がＧＹＳＴ又はＧＹＳＰである、請求項１８に記載の方法。
21. ストレスを生じさせることができる前記添加物が、エタノール及びプロパノールから成る群より選択される、請求項９から２０のいずれかに記載の方法。
22. 前記封入体の洗浄をさらに含む、先行請求項のいずれかに記載の方法。
23. 前記洗浄を、トリス／ＨＣｌ緩衝液、リン酸緩衝液、酢酸緩衝液、クエン酸緩衝液及び水から成る群より選択される溶液を用いて実施する、請求項２２に記載の方法。
24. 前記選択された緩衝液の濃度が約１ｍＭ〜１０ｍＭの範囲内である、請求項２３に記載の方法。
25. 前記選択された溶液が水である、請求項２３に記載の方法。
26. 前記封入体の可溶化をさらに含む、先行請求項のいずれかに記載のタンパク質の生産のための方法。
27. 封入体を単離すること；
    場合により前記封入体を洗浄すること；及び
    前記封入体を非変性条件下で可溶化処理に供すること
    の工程を含む、タンパク質が異種タンパク質として発現され、微生物の封入体内で形成される、微生物を使用したタンパク質の生産のための方法。
28. 封入体における前記異種タンパク質の形成を請求項１から２５のいずれかに従って実施する、請求項２７に記載の方法。
29. 非変性濃度（１−２Ｍ）の尿素、非変性濃度（０．０５−０．２５％（ｍ／ｖ））のＮ−ラウロイルサルコシン、低い非変性濃度の両性界面活性剤、非界面活性スルホベタイン（ＮＤＳＢ）、ベタイン、サルコシン、カルバモイルサルコシン、タウリン、ＤＭＳＯから成る群より選択される可溶化剤、並びにＨＥＰＥＳ、ＨＥＰＰＳ、ＭＥＳ、ＡＣＥＳ及びＭＥＳから成る群より選択される、高い可溶化濃度の緩衝液を用いて可溶化を実施する、請求項２６又は２７に記載の方法。
30. 選択された溶媒がＮ−ラウロイルサルコシンである、請求項２９に記載の方法。
31. Ｎ−ラウロイルサルコシンの濃度が約０．１％〜０．２５％の範囲内である、請求項３０に記載の方法。
32. Ｎ−ラウロイルサルコシンの濃度が約０．２％である、請求項３０に記載の方法。
33. 生合成を実施する方法についてのパラメータが以下のように：
    ・培養温度：約２０−３０℃、好ましくは約２５℃
    ・培地の組成：ＧＹＳＴ、ＧＹＳＰ、ＬＹＳＰ、ＬＹＳＴ、ＬＢＯＮ及びＧＹＳＰＯＮ、好ましくはＧＹＳＴ及びＧＹＳＰから成る群から選択される
    ・発酵のタイプ：バッチ方式
    ・誘導様式：発酵の開始時に、任意に予備培養工程を実施する場合はその予備培養工程後に、ＩＰＴＧを添加して、最終ＩＰＴＧ濃度を約０．３〜０．６ｍＭ、好ましくは約０．４ｍＭに調整する
    選択される、生合成による生物活性Ｇ−ＣＳＦの生産のための方法。
34. 前記方法が、封入体を単離すること及び単離した封入体を水で洗浄することをさらに含む、請求項３３に記載の生物活性Ｇ−ＣＳＦの生産のための方法。
35. 前記方法が、約０．１〜０．２５％、好ましくは約０．２％の濃度のＮ−ラウロイルサルコシンによる封入体の可溶化をさらに含む、請求項３３又は３４に記載の生物活性Ｇ−ＣＳＦの生産のための方法。
36. 生産される生物活性異種タンパク質、例えばＧ−ＣＳＦを、非変性条件下で実施する精製工程によって最終的に精製する、先行請求項のいずれかに記載の方法。
37. 薬剤の製造のための、請求項１から３５のいずれかに従って生産され、好ましくは請求項３６に従って精製される、生物活性異種タンパク質、例えばＧ−ＣＳＦの使用。

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