JPH0771506B2 - 顆粒球−マクロファージコロニ−刺激因子の精製方法 - Google Patents
顆粒球−マクロファージコロニ−刺激因子の精製方法Info
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- JPH0771506B2 JPH0771506B2 JP63105372A JP10537288A JPH0771506B2 JP H0771506 B2 JPH0771506 B2 JP H0771506B2 JP 63105372 A JP63105372 A JP 63105372A JP 10537288 A JP10537288 A JP 10537288A JP H0771506 B2 JPH0771506 B2 JP H0771506B2
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- glutathione
- microorganism
- folded
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- C07K14/53—Colony-stimulating factor [CSF]
- C07K14/535—Granulocyte CSF; Granulocyte-macrophage CSF
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
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- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、組換体源から産生された顆粒球−マクロファ
ージコロニー刺激因子（GM−CSF）を精製する方法に係
る。より特定的には、本発明は形質転換した大腸菌微生
物から産生された生物学的に活性なGM−CSFを、迅速且
つ効率的に単離及び精製する方法に係る。
ージコロニー刺激因子（GM−CSF）を精製する方法に係
る。より特定的には、本発明は形質転換した大腸菌微生
物から産生された生物学的に活性なGM−CSFを、迅速且
つ効率的に単離及び精製する方法に係る。
コロニー刺激因子は、造血系前駆体の増殖を刺激し、成
熱エフェクター細胞の機能活性を促進する糖タンパクで
ある。ヒトGM−CSFは骨髄及び赤血球前駆体の増殖をin
vitroで刺激し、生理学的刺激に対する好中球、単球、
及び好酸球の応答性を増大させる22−kDaの糖タンパク
である。
熱エフェクター細胞の機能活性を促進する糖タンパクで
ある。ヒトGM−CSFは骨髄及び赤血球前駆体の増殖をin
vitroで刺激し、生理学的刺激に対する好中球、単球、
及び好酸球の応答性を増大させる22−kDaの糖タンパク
である。
Wong他、Science Vol.228,p.810−815（1985）及びKaus
hasky他、Proc.Natl.Acad.Sci.USA,Vol.83,p.3101−310
5（1986）は哺乳動物細胞における組換体GM−CSFの産生
について記載している。Burgess他、Blood,Vol.69,p.43
−51（1987）は大腸菌で産生されたGM−CSFの精製につ
いて記載している。
hasky他、Proc.Natl.Acad.Sci.USA,Vol.83,p.3101−310
5（1986）は哺乳動物細胞における組換体GM−CSFの産生
について記載している。Burgess他、Blood,Vol.69,p.43
−51（1987）は大腸菌で産生されたGM−CSFの精製につ
いて記載している。
組換技術を真核細胞タンパクの大規模な製造に応用する
ことにより、所望の分子を大量に得る可能性が実質的に
増し、場合によっては簡便な精製手順で生物学的に活性
な物質を得ることができるようになる。ちなみに、所望
の組換体タンパクが生物活性を得るためにグルコシル化
を必要としない場合には、多くの場合、タンパク性汚染
物質及びプロテアーゼ等をほとんど含まない不溶性「封
入体」の形態で大腸菌組換体宿主中に大量のタンパクを
産生することができる。宿主細胞溶解物は、簡単には分
離し難い程（組換体タンパクに）類似した分子量、電
荷、極性及び溶解度特性を有するタンパク性構成成分を
しばしば含んでいる。更に、宿主に内在するタンパク分
解酵素によって、所望のタンパクの生物学的活性が比較
的長期にわたって損なわれる。
ことにより、所望の分子を大量に得る可能性が実質的に
増し、場合によっては簡便な精製手順で生物学的に活性
な物質を得ることができるようになる。ちなみに、所望
の組換体タンパクが生物活性を得るためにグルコシル化
を必要としない場合には、多くの場合、タンパク性汚染
物質及びプロテアーゼ等をほとんど含まない不溶性「封
入体」の形態で大腸菌組換体宿主中に大量のタンパクを
産生することができる。宿主細胞溶解物は、簡単には分
離し難い程（組換体タンパクに）類似した分子量、電
荷、極性及び溶解度特性を有するタンパク性構成成分を
しばしば含んでいる。更に、宿主に内在するタンパク分
解酵素によって、所望のタンパクの生物学的活性が比較
的長期にわたって損なわれる。
Burgess他により記載されている手順によると、細菌か
ら産生されたGM−CSFを該細菌から溶解させ、塩酸グア
ニジニウム及びメルカプトエタノール中に懸濁し、Ｇ−
100 Sephadexクロマトグラフィで処理した。フラクショ
ンを合わせ、変性剤及び還元剤を中性Tris緩衝液中での
透析によって除去した。最終精製段階として、pH2.1の
逆相支持体から勾配溶出した。
ら産生されたGM−CSFを該細菌から溶解させ、塩酸グア
ニジニウム及びメルカプトエタノール中に懸濁し、Ｇ−
100 Sephadexクロマトグラフィで処理した。フラクショ
ンを合わせ、変性剤及び還元剤を中性Tris緩衝液中での
透析によって除去した。最終精製段階として、pH2.1の
逆相支持体から勾配溶出した。
本発明は、GM−CSF産生微生物からGM−CSFを単離及び精
製する為の新規方法を提供するものであって、該方法
は、 １）微生物を溶解させ、GM−CSFを含有する不溶性物質
を可溶性タンパク性物質から分離し、 ２）不溶性物質中に存在しているGM−CSFを可溶化し、 ３）還元剤の存在下でGM−CSFを酸化し、 ４）不正に折り畳まれたGM−CSFを沈降させて正しく折
り畳まれたGM−CSFを溶液中に保持することにより、不
正に折り畳まれたGM−CSFから正しく折り畳まれたGM−C
SFを選択的に分離し、 ５）精製したGM−CSFを溶液から回収する ことから成る。
製する為の新規方法を提供するものであって、該方法
は、 １）微生物を溶解させ、GM−CSFを含有する不溶性物質
を可溶性タンパク性物質から分離し、 ２）不溶性物質中に存在しているGM−CSFを可溶化し、 ３）還元剤の存在下でGM−CSFを酸化し、 ４）不正に折り畳まれたGM−CSFを沈降させて正しく折
り畳まれたGM−CSFを溶液中に保持することにより、不
正に折り畳まれたGM−CSFから正しく折り畳まれたGM−C
SFを選択的に分離し、 ５）精製したGM−CSFを溶液から回収する ことから成る。
本明細書中に於いて、“GM−CSF"なる用語は、（１）天
然のGM−CSFのアミノ酸配列と少なくとも実質的に同一
のアミノ酸配列及び（２）天然のGM−CSFと共通の生物
学的活性を有するタンパクをコードするGM−CSF遺伝子
又はその修飾遺伝子で形質転換された微生物により産生
されるタンパク質を意味する。ここで、「実質的に同一
のアミノ酸配列」とは、配列が同一であるか、又は天然
と合成GM−CSFタンパクとの間に、有害な機能的非類似
性を生じないような１以上のアミノ酸変化（即ち欠失、
付加、置換）を含むことを意味する。
然のGM−CSFのアミノ酸配列と少なくとも実質的に同一
のアミノ酸配列及び（２）天然のGM−CSFと共通の生物
学的活性を有するタンパクをコードするGM−CSF遺伝子
又はその修飾遺伝子で形質転換された微生物により産生
されるタンパク質を意味する。ここで、「実質的に同一
のアミノ酸配列」とは、配列が同一であるか、又は天然
と合成GM−CSFタンパクとの間に、有害な機能的非類似
性を生じないような１以上のアミノ酸変化（即ち欠失、
付加、置換）を含むことを意味する。
本明細書中、「GM−CSF産生微生物」なる用語は、GM−C
SFに関連する生物学的活性を有するタンパクを産生する
ように、遺伝子工学的に作成された微生物を意味する。
本明細書中で使用する「GM−CSFの生物学的活性」なる
用語は、GM−CSFの治療活性を含む。微生物は好適な増
殖培地で増殖させ、その培地組成は該当する特定の微生
物によって決まる。細胞を培地から収集し、必要に応じ
て過、遠心分離、及び他の従来方法により濃縮するこ
とができる。
SFに関連する生物学的活性を有するタンパクを産生する
ように、遺伝子工学的に作成された微生物を意味する。
本明細書中で使用する「GM−CSFの生物学的活性」なる
用語は、GM−CSFの治療活性を含む。微生物は好適な増
殖培地で増殖させ、その培地組成は該当する特定の微生
物によって決まる。細胞を培地から収集し、必要に応じ
て過、遠心分離、及び他の従来方法により濃縮するこ
とができる。
本発明の方法に於いては、ホモジネート化、音波処理又
は圧力サイクルのような従来技術を使用して微生物の細
胞膜を溶解させる。好適な方法としては、音波処理又は
Manton−Gaulinホモジナイザーを用いる方法が挙げられ
る。細胞の溶解後、GM−CSFを含有する粒状物質を溶解
物の液相から分離し、水に再懸濁させる。場合によって
は粒状物質を洗浄し、水溶性の大腸菌タンパクを除去し
てもよい。好ましくは塩基性pH条件の可溶化剤の存在下
で、粒状物質中のGM−CSFを可溶化する。可溶化剤は一
般に、カオトロピック剤（即ち、水素結合を解離しタン
パク質の三次構造に影響を与えるタンパク質変性剤）の
水溶液である。代表的なカオトロピック剤には尿素及び
塩酸グアニジニウムがある。尿素が好適である。カオト
ロピック剤の濃度は、使用する特定の該剤及び存在する
細胞物質量に依存する。好ましくは６〜8Mの濃度を有す
る尿素溶液を使用し、最も好ましくは8Mの尿素溶液を使
用する。pHは好適な緩衝液を加えることにより調整され
得、好ましくはpHは約８〜約9.0である。
は圧力サイクルのような従来技術を使用して微生物の細
胞膜を溶解させる。好適な方法としては、音波処理又は
Manton−Gaulinホモジナイザーを用いる方法が挙げられ
る。細胞の溶解後、GM−CSFを含有する粒状物質を溶解
物の液相から分離し、水に再懸濁させる。場合によって
は粒状物質を洗浄し、水溶性の大腸菌タンパクを除去し
てもよい。好ましくは塩基性pH条件の可溶化剤の存在下
で、粒状物質中のGM−CSFを可溶化する。可溶化剤は一
般に、カオトロピック剤（即ち、水素結合を解離しタン
パク質の三次構造に影響を与えるタンパク質変性剤）の
水溶液である。代表的なカオトロピック剤には尿素及び
塩酸グアニジニウムがある。尿素が好適である。カオト
ロピック剤の濃度は、使用する特定の該剤及び存在する
細胞物質量に依存する。好ましくは６〜8Mの濃度を有す
る尿素溶液を使用し、最も好ましくは8Mの尿素溶液を使
用する。pHは好適な緩衝液を加えることにより調整され
得、好ましくはpHは約８〜約9.0である。
GM−CSFの可溶化後、不活性粒状物質を分離及び廃棄す
る。可溶性GM−CSFを還元剤の存在下で酸化する。正し
く折り畳まれたGM−CSF、即ちジスルフィド結合の正し
い天然のコンフォーメーションを有する酸化GM−CSFの
収率は、グルタチオン酸化還元緩衝液（グルタチオン及
び酸化グルタチオン）を使用してジスルフィド結合の転
位を助長することにより増加することが判明した。GM−
CSFは酸化グルタチオンにより酸化され、酸化還元緩衝
剤中に還元剤、即ちグルタチオンを存在させることによ
り、不正に折り畳まれたGM−CSF、即ち不正なジスルフ
ィド結合を有するGM−CSFの形成を実質的に減少させる
ことができる。酸化還元緩衝液中のグルタチオン：酸化
グルタチオンの比は当業者により容易に確定されよう。
好ましくは過剰のグルタチオンを使用し、より好ましく
は2:1〜10:1のグルタチオン：酸化グルタチオン重量比
を用いる。最も好ましくは5:1のグルタチオン：酸化グ
ルタチオン重量比を用いる。
る。可溶性GM−CSFを還元剤の存在下で酸化する。正し
く折り畳まれたGM−CSF、即ちジスルフィド結合の正し
い天然のコンフォーメーションを有する酸化GM−CSFの
収率は、グルタチオン酸化還元緩衝液（グルタチオン及
び酸化グルタチオン）を使用してジスルフィド結合の転
位を助長することにより増加することが判明した。GM−
CSFは酸化グルタチオンにより酸化され、酸化還元緩衝
剤中に還元剤、即ちグルタチオンを存在させることによ
り、不正に折り畳まれたGM−CSF、即ち不正なジスルフ
ィド結合を有するGM−CSFの形成を実質的に減少させる
ことができる。酸化還元緩衝液中のグルタチオン：酸化
グルタチオンの比は当業者により容易に確定されよう。
好ましくは過剰のグルタチオンを使用し、より好ましく
は2:1〜10:1のグルタチオン：酸化グルタチオン重量比
を用いる。最も好ましくは5:1のグルタチオン：酸化グ
ルタチオン重量比を用いる。
得られた溶液を濃縮し、残留している粒状物質を除去す
る。好ましくは、濃縮溶液を緩衝液と交換し、残留尿素
及びグルタチオンを除去する。酢酸のような適当な酸を
使用して濃縮溶液のpHを約4.5〜6.0、好ましくは5.0〜
5.5のpH範囲に調整することにより、正しく折り畳まれ
たGM−CSFを不正に折り畳まれたGM−CSFから選択的に分
離する。このpH範囲（即ち4.5〜6.0）では不正に折り畳
まれたGM−CSFは沈降し、正しく折り畳まれたGM−CSFは
溶液中に溶解して残ることが判明した。得られた混合物
を遠心分離し、不溶性粒状物質を除去し、可溶性の正し
く折り畳まれたGM−CSFを残留溶液から回収する。好ま
しくは、クロマトグラフィ操作により、精製GM−CSF
（即ち正しく折り畳まれたGM−CSF）を残留汚染物質か
ら分離する。好適にはイオン交換あるいは逆相高圧液相
クロマトグラフィ又はそれらの組み合わせを使用して精
製GM−CSFを回収する。本発明の好適実施態様による
と、CM−Sepharoseイオン交換カラムに通した後、約60
％の水性エタノールを含有するTris緩衝液中のC4シリカ
ゲルカラムを使用して分離することにより、高収率で精
製GM−CSFが回収される。クロマトグラフィ処理前に、
好ましくは培養物上清を濃縮し、適当な手段を実施して
GM−CSFを含む収集溶離液フラクションからエタノール
を除去する。イオン交換クロマトグラフィを使用してエ
タノールを除去することができる。こうして分離したGM
−CSFを医薬上許容可能なアジュバント、好ましくはリ
ン酸緩衝生理食塩溶液（pH7.5）と調合すると、患者に
投与可能な最終製品が得られる。
る。好ましくは、濃縮溶液を緩衝液と交換し、残留尿素
及びグルタチオンを除去する。酢酸のような適当な酸を
使用して濃縮溶液のpHを約4.5〜6.0、好ましくは5.0〜
5.5のpH範囲に調整することにより、正しく折り畳まれ
たGM−CSFを不正に折り畳まれたGM−CSFから選択的に分
離する。このpH範囲（即ち4.5〜6.0）では不正に折り畳
まれたGM−CSFは沈降し、正しく折り畳まれたGM−CSFは
溶液中に溶解して残ることが判明した。得られた混合物
を遠心分離し、不溶性粒状物質を除去し、可溶性の正し
く折り畳まれたGM−CSFを残留溶液から回収する。好ま
しくは、クロマトグラフィ操作により、精製GM−CSF
（即ち正しく折り畳まれたGM−CSF）を残留汚染物質か
ら分離する。好適にはイオン交換あるいは逆相高圧液相
クロマトグラフィ又はそれらの組み合わせを使用して精
製GM−CSFを回収する。本発明の好適実施態様による
と、CM−Sepharoseイオン交換カラムに通した後、約60
％の水性エタノールを含有するTris緩衝液中のC4シリカ
ゲルカラムを使用して分離することにより、高収率で精
製GM−CSFが回収される。クロマトグラフィ処理前に、
好ましくは培養物上清を濃縮し、適当な手段を実施して
GM−CSFを含む収集溶離液フラクションからエタノール
を除去する。イオン交換クロマトグラフィを使用してエ
タノールを除去することができる。こうして分離したGM
−CSFを医薬上許容可能なアジュバント、好ましくはリ
ン酸緩衝生理食塩溶液（pH7.5）と調合すると、患者に
投与可能な最終製品が得られる。
以下の実施例により、本発明の態様を更に詳しく説明す
る。
る。
実施例１ GM−CSFの発現 膀胱癌細胞系5637（西ドイツ、エアランゲン−ニュルン
ベルク大学のPlatzer博士から入手した（サブクローン1
A6））から得られるRNAから構成されたcDNAライブラリ
ーを、オリゴヌクレオチド:GGC−ACT−GTG−GCC−TGC−
AGC−ATC−TCT−GCA−CCC−GCC−CGCをプローブとして
用いて検討し、Norandler他、Gene,Vol.26,p.101−106
（1983）の手順に従ってGM−CSFの陽性クローンを得
た。pBR GM−CSFであると同定された、これらのクロー
ンの１つをジデオキシ法により配列決定した処、コード
配列は、成熟タンパクの100位のアミノ酸以外はWong
他、Science,Vol.228,p812（1985）に記載の配列と同一
であった。Wong他の配列はスレオニンをコードするコド
ンACTを有していたが、ここで得られた陽性クローンの
配列はイソロイシンをコードするコドンATTを有してい
た。
ベルク大学のPlatzer博士から入手した（サブクローン1
A6））から得られるRNAから構成されたcDNAライブラリ
ーを、オリゴヌクレオチド:GGC−ACT−GTG−GCC−TGC−
AGC−ATC−TCT−GCA−CCC−GCC−CGCをプローブとして
用いて検討し、Norandler他、Gene,Vol.26,p.101−106
（1983）の手順に従ってGM−CSFの陽性クローンを得
た。pBR GM−CSFであると同定された、これらのクロー
ンの１つをジデオキシ法により配列決定した処、コード
配列は、成熟タンパクの100位のアミノ酸以外はWong
他、Science,Vol.228,p812（1985）に記載の配列と同一
であった。Wong他の配列はスレオニンをコードするコド
ンACTを有していたが、ここで得られた陽性クローンの
配列はイソロイシンをコードするコドンATTを有してい
た。
カルボキシ末端の102個のアミノ酸及び終結コドンを含
むcDNAクローンの部分と共に、リボソーム結合部位、ア
ミノ末端メチオニン及び成熟タンパクの最初の25個のア
ミノ酸を含む合成配列を使用して、GM−CSF遺伝子を大
腸菌発現ベクターpCFM1156中にクローニングした。
むcDNAクローンの部分と共に、リボソーム結合部位、ア
ミノ末端メチオニン及び成熟タンパクの最初の25個のア
ミノ酸を含む合成配列を使用して、GM−CSF遺伝子を大
腸菌発現ベクターpCFM1156中にクローニングした。
このDNAを発現させるためには、適当なものであればど
のようなベクターを使用してもよいが、発現プラスミド
pCFM1156は、公開ヨーロッパ特許出願第136490号に記載
されているプラスミドpCFM836から容易に構成すること
ができる。まずNde IでpCFM836を切断し、次にPol Iで
ブラント末端を形成して２つのNde I部位を破壊する。
次に、該ベクターをCla I及びSac IIで消化し、存在す
るポリリンカーを除去した後に、第１表に示すような代
替ポリリンカーに連結する。この代替ポリリンカーはAl
ton他名義のPCT公開第W083/04053号の手順に従って構成
できる。発現pCFM1156プラスミドにおける発現を制御す
るにはλPLプロモーターを使用し、該プロモータ自体は
C1857リプレッサー遺伝子（例えば大腸菌株K12ΔHtrpか
ら得られる）により制御され得る。
のようなベクターを使用してもよいが、発現プラスミド
pCFM1156は、公開ヨーロッパ特許出願第136490号に記載
されているプラスミドpCFM836から容易に構成すること
ができる。まずNde IでpCFM836を切断し、次にPol Iで
ブラント末端を形成して２つのNde I部位を破壊する。
次に、該ベクターをCla I及びSac IIで消化し、存在す
るポリリンカーを除去した後に、第１表に示すような代
替ポリリンカーに連結する。この代替ポリリンカーはAl
ton他名義のPCT公開第W083/04053号の手順に従って構成
できる。発現pCFM1156プラスミドにおける発現を制御す
るにはλPLプロモーターを使用し、該プロモータ自体は
C1857リプレッサー遺伝子（例えば大腸菌株K12ΔHtrpか
ら得られる）により制御され得る。
プラスミドpCFM1156をXba I及びNco Iで切断し、大きい
DNAフラグメントを単離した。合成フラグメントＡはXba
I末端、Hae II末端及び内部Hpa I及びNde I部位を含ん
でおり、次の配列を有していた。
DNAフラグメントを単離した。合成フラグメントＡはXba
I末端、Hae II末端及び内部Hpa I及びNde I部位を含ん
でおり、次の配列を有していた。
GM−CSF cDNAクローン、pBR GM−CSFをHae II及びNco I
で切断し、DNAフラグメントをゲル精製した。３つのDNA
フラグメントを相互に連結し、プラスミドpCFM1156 GM
−CSF1を生成した。
で切断し、DNAフラグメントをゲル精製した。３つのDNA
フラグメントを相互に連結し、プラスミドpCFM1156 GM
−CSF1を生成した。
GM−CSFの発現を増加させるために、Nde I−Hpa Iの領
域を次の配列を有する合成フラグメントＢで置換した。
域を次の配列を有する合成フラグメントＢで置換した。
プラスミドpCFM1156 GM−CSF1をNde I及びHpa Iで切断
し、ホスファターゼ処理した。次に合成フラグメントＢ
と連結してpCFM1156 GM−CSF2を生成した。
し、ホスファターゼ処理した。次に合成フラグメントＢ
と連結してpCFM1156 GM−CSF2を生成した。
更に、GM−CSFの発現を更に増加させるために25位のロ
イシンのコドンをCTCからCTGに変えた。この修飾はRNA
の二次構造を減少させ、部位特異的突然変異により行っ
た。プラスミドpCFM1156 GM−CSF2のGM−CSF含有領域を
M13mp10のXba I−BamH I部位に挿入し、M13mp10 GM−CS
F2を生成した。部位特異的突然変異はオリゴヌクレオチ
ドTCGGCGCCTGCTGAACCTGAを使用して行い、32Pでリン酸
化したこのオリゴヌクレオチドとハイブリダイズするこ
とにより陽性クローン（M13mp10 GM−CSF3）を同定し
た。ジデオキシ配列決定法により配列を確認し、GM−CS
Fを含む領域をpCFM1156のXba I−EcoR I部位に挿入し、
pCFM1156 GM−CSF3を生成した。pCFM1156 GM−CSF3を適
当な発現宿主に形質転換し、GM−CSF産生微生物を得
た。
イシンのコドンをCTCからCTGに変えた。この修飾はRNA
の二次構造を減少させ、部位特異的突然変異により行っ
た。プラスミドpCFM1156 GM−CSF2のGM−CSF含有領域を
M13mp10のXba I−BamH I部位に挿入し、M13mp10 GM−CS
F2を生成した。部位特異的突然変異はオリゴヌクレオチ
ドTCGGCGCCTGCTGAACCTGAを使用して行い、32Pでリン酸
化したこのオリゴヌクレオチドとハイブリダイズするこ
とにより陽性クローン（M13mp10 GM−CSF3）を同定し
た。ジデオキシ配列決定法により配列を確認し、GM−CS
Fを含む領域をpCFM1156のXba I−EcoR I部位に挿入し、
pCFM1156 GM−CSF3を生成した。pCFM1156 GM−CSF3を適
当な発現宿主に形質転換し、GM−CSF産生微生物を得
た。
実施例２ 夫々Luria培地（Luria培地:Bactotryptone 10g/L、酵母
エキス5g/L、NaCl 5g/L）の入ったFernbachフラスコにG
M−CSF産生微生物を層状気流フード下に接種した。
エキス5g/L、NaCl 5g/L）の入ったFernbachフラスコにG
M−CSF産生微生物を層状気流フード下に接種した。
接種したフラスコを約28℃で振蕩し、細胞密度を約0.50
D単位にした。次にフラスコを急速に42℃にし、42℃で
３時間維持し、細胞ペーストを遠心分離により収集し
た。
D単位にした。次にフラスコを急速に42℃にし、42℃で
３時間維持し、細胞ペーストを遠心分離により収集し
た。
実施例３ 実施例２で得られた、GM−CSFを含む形質転換大腸菌細
胞のペーストを約３℃の温度でBrinkmanホモジナイザー
で完全に分散させた。懸濁液をGau−linホモジナイザー
に３回通した。ホモジネートを18℃以下の温度に維持し
た。ホモジネートを６倍量になるように水で希釈し、得
られた混合物を３℃の温度で遠心分離した。上清をデカ
ントし、残渣を水で再懸濁し、最終容量６部の水を有す
る混合物を得た。得られた混合物を３℃の温度で遠心分
離し、上清をデカントし、残渣を水で懸濁して最終容量
0.9部の水を有する混合物を得た。得られた混合物に0.3
部の1M Tris（pH8.5）及び4.8部の10M尿素を加えた。得
られた混合物を14℃の温度で遠心分離し、上清を収集し
た。54部の20mM Tris（pH8.5）中に0.04部のグルタチオ
ンと0.008部の酸化グルタチオンを含む溶液を上清に加
えた。形成された混合物を約５℃の温度で20時間維持し
た。10,000MW膜に通すことにより混合物を濃縮した。保
持物を少なくとも30部の20mM Tris（pH8.5）中で５℃で
10,000MW膜を通して透析過した。50％の酢酸で保持物
のpHをpH5.3に調整した。混合物を３℃の温度で遠心分
離した。上清を取り出し、CM−Sepharoseカラムに充填
し、20mM酢酸ナトリウム、45mM NaCl（pH5.4）で溶離し
た。溶離液のpHを1M Tris（pH8.5）でpH7.7に調整し
た。CM−Sepharoseカラムからの溶離液を、まず20％エ
タノール、50mM Tris（pH7.7）、次に40％エタノール、
50mM Tris（pH7.7）を使用して、５℃でC4シリカカラム
でクロマトグラフィ処理した。生物学的に活性なGM−CS
Fは40％エタノール、50mM Tris−HCl（pH7.7）から60％
エタノール、50mM Tris−HCl（pH7.7）の勾配でカラム
から溶離された。溶離液を合わせ、20mM Tris（pH7.
7）、次に10mM NaPO4（pH7.5）、次いで10mM NaPO4、15
mM NaCl（pH7.5）を使用して、５℃でDEAE−Sepharose
カラムでクロマトグラフィ処理した。10mM NaPO4、60mM
NaCl pH7.5でGM−CSFを溶離した。精製したGM−CSFを
含む溶離液を10mM NaPO4、60mM NaCl水溶液 pH7.5で希
釈し、最終濃度を0.5mg/mlとした。形成された溶液に1/
62.5容量の5M NaClを加えて最終生成物を得た。
胞のペーストを約３℃の温度でBrinkmanホモジナイザー
で完全に分散させた。懸濁液をGau−linホモジナイザー
に３回通した。ホモジネートを18℃以下の温度に維持し
た。ホモジネートを６倍量になるように水で希釈し、得
られた混合物を３℃の温度で遠心分離した。上清をデカ
ントし、残渣を水で再懸濁し、最終容量６部の水を有す
る混合物を得た。得られた混合物を３℃の温度で遠心分
離し、上清をデカントし、残渣を水で懸濁して最終容量
0.9部の水を有する混合物を得た。得られた混合物に0.3
部の1M Tris（pH8.5）及び4.8部の10M尿素を加えた。得
られた混合物を14℃の温度で遠心分離し、上清を収集し
た。54部の20mM Tris（pH8.5）中に0.04部のグルタチオ
ンと0.008部の酸化グルタチオンを含む溶液を上清に加
えた。形成された混合物を約５℃の温度で20時間維持し
た。10,000MW膜に通すことにより混合物を濃縮した。保
持物を少なくとも30部の20mM Tris（pH8.5）中で５℃で
10,000MW膜を通して透析過した。50％の酢酸で保持物
のpHをpH5.3に調整した。混合物を３℃の温度で遠心分
離した。上清を取り出し、CM−Sepharoseカラムに充填
し、20mM酢酸ナトリウム、45mM NaCl（pH5.4）で溶離し
た。溶離液のpHを1M Tris（pH8.5）でpH7.7に調整し
た。CM−Sepharoseカラムからの溶離液を、まず20％エ
タノール、50mM Tris（pH7.7）、次に40％エタノール、
50mM Tris（pH7.7）を使用して、５℃でC4シリカカラム
でクロマトグラフィ処理した。生物学的に活性なGM−CS
Fは40％エタノール、50mM Tris−HCl（pH7.7）から60％
エタノール、50mM Tris−HCl（pH7.7）の勾配でカラム
から溶離された。溶離液を合わせ、20mM Tris（pH7.
7）、次に10mM NaPO4（pH7.5）、次いで10mM NaPO4、15
mM NaCl（pH7.5）を使用して、５℃でDEAE−Sepharose
カラムでクロマトグラフィ処理した。10mM NaPO4、60mM
NaCl pH7.5でGM−CSFを溶離した。精製したGM−CSFを
含む溶離液を10mM NaPO4、60mM NaCl水溶液 pH7.5で希
釈し、最終濃度を0.5mg/mlとした。形成された溶液に1/
62.5容量の5M NaClを加えて最終生成物を得た。
第１図はプラスミドpCFM1156 GM−CSF3の製造の概略図
である。
である。
フロントページの続き (56)参考文献 特開 昭59−161321（ＪＰ，Ａ) 西独国特許公開3537708（ＤＥ，Ａ) Ｂｌｏｏｄ，Ｖｏｌ．69，Ｎｏ．１ （1987．１）Ｐ．43−51
Claims (11)
- 【請求項１】GM−CSF産生微生物からGM−CSFを単離及び
精製する方法であって、 １）該微生物を溶解させ、GM−CSFを含有する不溶性物
質を可溶性タンパク性物質から分離し、 ２）不溶性物質中に存在しているGM−CSFを可溶化し、 ３）還元剤の存在下でGM−CSFを酸化し、 ４）混合物のpHを4.5〜6.0の範囲に調整して、不正に折
り畳まれたGM−CSFを沈降させ正しく折り畳まれたGM−C
SFを溶液中に保持することにより、不正に折り畳まれた
GM−CSFから正しく折り畳まれたGM−CSFを選択的に分離
し、 ５）精製したGM−CSFを溶液から回収する ことから成る前記方法。 - 【請求項２】カオトロピック剤を使用して不溶性物質中
のGM−CSFを可溶化することを特徴とする請求項１に記
載の方法。 - 【請求項３】グルタチオンの存在下で酸化グルタチオン
を使用してGM−CSFを酸化することを特徴とする請求項
２に記載の方法。 - 【請求項４】pHを5.0〜5.5の範囲に調整することを特徴
とする請求項３に記載の方法。 - 【請求項５】段階５）でイオン交換クロマトグラフィあ
るいは逆相高圧液相クロマトグラフィ又はそれらの組み
合わせにより、精製したGM−CSFを回収することを特徴
とする請求項４に記載の方法。 - 【請求項６】段階２）で尿素を使用してGM−CSFを可溶
化することを特徴とする請求項３に記載の方法。 - 【請求項７】段階４）で酢酸を使用してpHを調整するこ
とを特徴とする請求項６に記載の方法。 - 【請求項８】塩基性pHで段階２）を実施することを特徴
とする請求項７に記載の方法。 - 【請求項９】8.0〜9.0のpH及び６〜8Mの尿素濃度で段階
２）を実施することを特徴とする請求項８に記載の方
法。 - 【請求項１０】段階４）でpHを約5.0〜5.5の範囲に調整
することを特徴とする請求項９に記載の方法。 - 【請求項１１】GM−CSFを産生する微生物が大腸菌であ
ることを特徴とする請求項３に記載の方法。
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|---|---|---|---|
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| US43331 | 1987-04-28 |
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|---|---|
| JPS6427492A JPS6427492A (en) | 1989-01-30 |
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|---|---|---|---|
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|---|---|
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| JP (1) | JPH0771506B2 (ja) |
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| AT (1) | ATE83780T1 (ja) |
| AU (1) | AU621051B2 (ja) |
| CA (1) | CA1302652C (ja) |
| DE (1) | DE3876843T2 (ja) |
| ES (1) | ES2036680T3 (ja) |
| FI (1) | FI94867C (ja) |
| GR (1) | GR3006984T3 (ja) |
| IL (1) | IL86163A (ja) |
| NO (1) | NO175638C (ja) |
| NZ (1) | NZ224371A (ja) |
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| US4929700A (en) * | 1987-04-16 | 1990-05-29 | Cetus Corporation | Production of purified, biologically active, bacterially produced recombinant human CSF-1 |
| DE68929566D1 (de) * | 1988-05-13 | 2010-01-28 | Amgen Inc | Verfahren zur Isolierung und Reinigung von G-CSF |
| JP2517100B2 (ja) * | 1989-03-08 | 1996-07-24 | 協和醗酵工業株式会社 | ヒト顆粒球コロニ―刺激因子活性を有する蛋白質の精製法 |
| GB9107846D0 (en) * | 1990-04-30 | 1991-05-29 | Ici Plc | Polypeptides |
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| US8161889B2 (en) | 2006-11-16 | 2012-04-24 | Mitsubishi Heavy Industries, Ltd. | Bogie structure for a track vehicle |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE3537708C2 (ja) | 1985-10-23 | 1993-07-08 | Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim, De |
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-
1988
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- 1988-04-19 WO PCT/US1988/001228 patent/WO1988008428A1/en active IP Right Grant
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- 1988-12-28 KR KR88701747A patent/KR960001740B1/ko not_active IP Right Cessation
-
1993
- 1993-02-04 GR GR930400234T patent/GR3006984T3/el unknown
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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|---|
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| DE3876843D1 (de) | 1993-02-04 |
| KR890701616A (ko) | 1989-12-21 |
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