JPS6361920B2 - - Google Patents

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JPS6361920B2
JPS6361920B2 JP59253935A JP25393584A JPS6361920B2 JP S6361920 B2 JPS6361920 B2 JP S6361920B2 JP 59253935 A JP59253935 A JP 59253935A JP 25393584 A JP25393584 A JP 25393584A JP S6361920 B2 JPS6361920 B2 JP S6361920B2
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Japan
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leif
mature human
leukocyte interferon
human leukocyte
interferon
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Application filed filed Critical
Publication of JPS60227694A publication Critical patent/JPS60227694A/ja
Publication of JPS6361920B2 publication Critical patent/JPS6361920B2/ja
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  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Description

【発明の詳现な説明】 本発明は組換えDNA技術の分野、すなわちポ
リペプチドの補造に察しお組換えDNA技術で甚
いられる方法に関する。 より詳现には、本発明は、ヒト癜血球由来の遺
䌝子の発珟により埗るこずができる成熟ヒト癜血
球むンタプロンであ぀お、165−166個のアミノ
酞を有し、郚分アミノ酞配列Cys−Ala−Trp−
Glu−Val−Val−Arg−Ala−Glu−Ile−Met−
Arg−Serを含み、か぀114䜍にアミノ酞ASp、
GluたたはValの䞀぀を有し、このむンタプロ
ンの第䞀番目のアミノ酞の末端にメチオニンが
結合しおいる堎合は、166−167個のアミノ酞を有
し、か぀115䜍にアミノ酞Asp、GluたたはValの
䞀぀を有する成熟ヒト癜血球むンタプロンの補
造にあたり、 (a)(i) 該成熟ヒト癜血球むンタプロンのコヌド
領域を含む遺䌝子を該コヌド領域内の末端近
くに䜍眮する制限酵玠切断郚䜍で切断し、該
コヌド領域の5′−末端偎を陀いた遺䌝子制限
断片を埗る工皋、 (ii) ATG翻蚳開始コドンを有し、該コドンに
連続する塩基配列が前蚘工皋(i)で陀かれた
5′−末端偎のコヌド領域ず同じアミノ酞配列
をコヌドするDNA断片を調補する工皋、 (iii) 該遺䌝子制限断片ず該DNA断片ずを連結
し、ATG翻蚳開始コドンに連なる該成熟ヒ
ト癜血球むンタプロンコヌド領域を有する
遺䌝子を構築する工皋、及び (iv) 該遺䌝子ず遺䌝子発珟調節因子ず自己耇補
に䞍可な領域oriずを連続する工皋 を組合せお埮生物発珟ビヒクルを構築し、 (b) 䞊蚘工皋(a)で埗た埮生物発珟ビヒクルで公知
方法により埮生物を圢質転換し、 (c) 埗られた圢質転換埮生物を培地䞭で発育さ
せ、 (d) この圢質転換埮生物を溶解し、成熟ヒト癜血
球むンタプロンをその他の埮生物蛋癜質から
分離粟補するこずにより採取する こずを特城ずする成熟ヒト癜血球むンタヌプロ
ンの補造方法に関する。 本発明の方法で埗られる成熟ヒト癜血球むンタ
プロンの特定䟋ずしおは成熟ヒト癜血球むンタ
プロンLeIF、、、、、、
およびがあげられる。これらの成熟ヒト癜血球
むンタプロンのアミノ酞配列は21頁衚および
24頁衚に瀺すずおりである。すなわち、衚に
おけるLeIF 、LeIF 、LeIF 、LeIF 、
LeIF 、およびLeIF ならびに衚における
およびの各アミノ酞配列からを付した番号
で瀺されるシグナルペプチドを陀いた165個たた
は166個のアミノ酞からなるポリペプチドおよび
これらのポリペプチドの第番目のアミノ酞の
末端にさらにメチオニンが結合しお166個たたは
167個のアミノ酞からなるポリペプチドが本発明
の成熟ヒト癜血球むンタプロン、、、
、、、およびである。 本発明の背景に぀いおたず蚘茉する。ヒト癜血
球むンタプロンLeIFは、最初、アむザツ
クスIsaacsおよびリンデンマン
Lindenmannにより、きわめお粗な沈殿物ず
しお、発芋されそしお調補されたプロクアヌ
ル゜シProc.R.Soc.B147、258−267
〔1957〕米囜特蚱U.S.P.3699222。それを粟
補し特城づける努力は長く続けられ、正垞たたは
癜血病の提䟛者から埗た癜血球に由来する比范的
均䞀な癜血球むンタプロンの調補にみちびいた
ドむツ特蚱公報No.2947134。これらのむンタフ
゚ロンは、それらの暙的现胞にりむルス抵抗性の
状態を付䞎する胜力を有するこずの知られおいる
䞀矀の蛋癜質である。さらに、むンタプロン
は、现胞の増殖を阻止しそしお免疫反応を調節す
るように䜜甚しうる。これらの性質から、りむル
スの感染および悪性腫瘍に癜血球むンタプロン
を臚床的に甚いるこずが促進された。 癜血球むンタプロンは、本質的に均䞀な状態
に粟補されルビンシナタむンRubinstein等、
プロクナトルアカドサむ米囜Proc.
Natl.Acad.Sci.U.S.A.76、640−644〔1979〕
Zoon等、同䞊76、5601−5605〔1979〕玄17500か
ら玄21000の範囲の分子量を有するず報告された。
これらの調補物の比掻性は、きわめお高く、×
108から×109単䜍mg蛋癜質であるが、现胞培
逊法よりの収量はおそろしく䜎い。しかし、蛋癜
質の配列をきめる技術の進歩で、郚分的アミノ酞
配列が決定された〔ゟヌンZoon等、サむ゚
ンスScience207、527〔1980〕レビむ
Levy等、プログナトルアガドサむ米
囜Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.77、5102−
5104〔1980〕。皮々の癜血球むンタプロンのグ
リコシル化は、珟圚完党には明らかでないが、皮
類間におけるグリコシル化の差のみでは、芳察さ
れおいる分子量の分垃を説明しえない。その代わ
りに、癜血球むンタプロンは、皮類に埓いアミ
ノ酞組成および配列においお著しく差があり、ア
ミノ酞の盞同性は、堎合により80より䜎い。 提䟛者の癜血球よりの分離で郚分的な特城付け
および限定された臚床的研究のための十分な量
の、均䞀な癜血球むンタプロンを䞎えたけれど
も、それだけでは、倧芏暡な臚床詊隓および広範
な予防的およびたたは治療的䜿甚に必芁であ
るむンタプロンを提䟛するにはた぀たく䞍十分
である。たたに、ヒト癜血球由来のむンタプロ
ンを抗腫瘍および抗りむルスに甚いる珟圚の臚床
詊隓では、粗より䜎い調敎物を甚いおお
り、実際的でない䟡栌においおすら十分な量を生
産するに至らず、広範な領域での研究を遅らせお
来た。 しかし、組換えDNA技術の出珟にずもな぀お、
有甚なポリペプチドのきわめお倚様な皮類を、埮
生物により調節生産するこずが可胜にな぀た。す
でに、この技術により修食をうけお、゜マトスタ
チン、ヒトむンシナリンのおよび鎖およびヒ
ト生長ホルモンのようなポリペプチド鎖を生産た
现菌が存圚するに至぀おいる。 むタクラItakura等、サむ゚ンス
Science198、1056−1063〔1977〕ゲデル
Goeddel等、ネヌチダヌNature281、544
−548〔1979〕。より最近にな぀お、組換えDNA
技術が、プロむンシナリンおよびチモシンアルフ
ア−の生産を可胜ずし、さらに、なん人かの著
者は、ヒト癜血球むンタプロンをコヌドする
DNAの採取および、その結果埗られる、癜血球
むンタプロン掻性を有する蛋癜質の生成に぀い
お報告しおいるナガタNagata等、ネヌチダ
ヌNature284、316−320〔1980〕ナンテむ
Nantei等、ゞ゚むンGene10、−10
〔1980〕タニグチTaniguchi等、ネヌチダヌ
Nature285、547−549〔1980〕。 組換えDNA技術の工䜜宀は、现菌および他の
埮生物に存圚し、しばしば、现胞䞭に倚数のコピ
ヌずしお存圚する、重鎖DNAの非染色䜓性の
ルヌプである、プラスミドである。プラスミド
DNA䞭にコヌドされる情報には、嚘现胞䞭にプ
ラスミドを再生産するに必芁な情報぀たり、
“レプリコン”および、そしお、ふ぀うは、皮
たたは皮より倚くの遞択特性、たずえば、现菌
の堎合では、抗生物質に察する抵抗性の情報があ
る。この情報により、察象ずするプラスミドを含
有する宿䞻现胞のクロヌンを認識し、遞択甚の培
地䞭に優先的に発育さすこずが可胜ずなる。プラ
スミドが有甚なのは、プラスミドDNA䞊の異な
る郚䜍をそれぞれに認識する、ある皮類たたは別
の皮類の制限゚ンドヌクレアヌれたたは“制限酞
玠”により、プラスミドが特異的に切断されうる
ずいうこずである。そのあずで、切断郚䜍の䞡端
か、切断郚䜍に接しお再構築した末端をむすびあ
わすこずにより、異質の遺䌝子たたは遺䌝子断片
をプラスミド䞭に挿入しうる。DNAの組換えは
现胞の倖郚で実斜しうるが、生成する“組換え”
プラスミドは、圢質転換ず称される方法により现
胞内に導入され、その圢質転換を発育さすこずに
より、異質の遺䌝子を含有する組換えプラスミド
をを倧量に生産しうる。さらに、その異質遺䌝子
が、プラスミド内のコヌドされるDNA情報の転
写および翻蚳を支配する郚分に関しお正しく挿入
されるならば、生成する発珟ビヒクルは、挿入さ
れた遺䌝子のコヌドするポリペプチド配列を実際
の生成぀たり発珟ず称されるプロセスに実際に䜿
甚されうる。 発珟は、DNAポリメラヌれにより認識されそ
れが結合する、プロモヌタヌずしお知られる領域
においお開始される。ある堎合には、たずえば、
本発明の実斜においお有利ずされるトリプトフア
ンたたは“trp”プロモヌタヌのような堎合には、
プロモヌタヌ領域には、“オペレヌタヌ”領域が
重なり、結合された、プロモヌタヌ−オペレヌタ
ヌずな぀おいる。オペレヌタヌは、特定のプロモ
ヌタヌにおける転写開始の瀕床を調節する圹割を
する、いわゆるリプレツサヌ蛋癜質により認識さ
れるDNA配列である。RNAポリメラヌれは、
DNAに沿぀お移動し、コヌド配列に含たれる情
報を、その5′末端から3′末端ぞず、メツセンゞダ
ヌRNAに転写し、぀いでそれは、DNAのコヌド
するアミノ酞配列を有するポリペプチドぞず翻蚳
される。それぞれのアミノ酞は、ヌクレオチドト
リプレツトたたは“コドン”によりコヌドされ
る。これらは、本発明の目的に関連しお“構造遺
䌝子”ず称される郚分、぀たり、発珟される生成
物のアミノ酞配列をコヌドする郚分に存圚する。
プロモヌタヌに結合したあず、RNAポリメラヌ
れは、たず、リボゟヌム結合郚䜍をコヌドするヌ
クレオチドを転写し、぀いで、翻蚳開始たたは
“開始シグナル”ふ぀うはATGで、埗られるメ
ツセンゞダRNAではAUGずなるを、぀いで、
構造遺䌝子自䜓に存圚するヌクレオチドコドンを
転写する。構造遺䌝子の端においおいわゆる停止
コドンが転写される。そのあずは、ポリメラヌれ
が、メツセンゞダヌRNAの付加配列を圢成する
こずがあ぀おも、停止シグナルが存圚するので、
リボゟヌムにより翻蚳されないたたずなる。リボ
ゟヌムは、ふ぀う、mRNAが圢成され぀぀ある
现菌においおはメツセンゞダヌRNA䞊にある特
定の接合郚䜍に結合する。そしお、翻蚳の開始シ
グナルに始たり、前蚘した停止したシグナルで終
了する、コヌドされたポリペプチドを生ずる。リ
ボゟヌム結合郚䜍をコヌドする配列が、AUG開
始コドンに関しお適切に䜍眮し、そしお、残りの
コドンのすべおが、むンプヌスin phaseに
開始コドンに埓うならば、所望の生成物が生産さ
れる。埗られた生成物は、宿䞻现胞を融解させ、
適圓な粟補法により他の现菌蛋癜質より生成物を
採取するこずによりうるこずができる。 我々は、組換えDNA技術぀たり、むンタフ
゚ロン遺䌝子を埮生物発珟ビヒクルに挿入し、埮
生物遺䌝子調節芁玠の制埡䞋にそれらを発珟させ
るこずの利甚が、倧量の癜血球むンタプロン
を提䟛するも぀ずも有効な方法ず考えた。それは
ヒト由来の材料に特埮的なグリコシル化の特性を
欠劂するけれども、広範囲に及びりむルスおよび
新生物による病気の治療に甚いられるであろう。 本発明の第の癜血球遺䌝子を採取する方法は
次の各段階からなる。 (1) 均䞀な状態に粟補されたヒト癜血球むンタフ
゚ロンの郚分アミノ酞配列を甚いお、郚分アミ
ノ酞配列をコヌドしうる、可胜なヌクレオチド
の組合わせのすべおを衚わす、集合䜓ずしおの
コドンを含む、合成DNAプロヌブのセツトを
構成する。 (2) 誘導されたメツセンゞダヌRNAから盞補
DNAcDNAを含有する现菌コロニヌバンク
を調補する。攟射ラベルされた別の誘導
mRNAを、このバンクからのプラスミド
cDNAずハむブリドずする。ハむブリドずした
mRNAを溶出し、卵母现胞分析でむンタプ
ロンぞの翻蚳に぀いお詊隓する。このようにし
お、むンタプロン掻性を誘導するこずが瀺さ
れたコロニヌよりのプラスミドDNAを、䞊蚘
(1)のように補造したプロヌブに察するハむブリ
ド圢成に぀いお詊隓する。 (3) 䞊蚘(2)の工皋ず平行しお、プラスミド䞭の誘
導されたmRNAに由来するcDNAを甚いお、
別の圢質転換コロニヌバンクを甚意する。(1)の
プロヌブをハむブリド化プロヌブずしお甚いる
ための攟射ラベル本鎖cDNAの合成を誘起す
るのに甚いた。合成プロヌブは鋳型ずしおの
mRNAずハむブリドを圢成し、逆転写により
拡倧されお、誘導された、攟射ラベルcDNAを
圢成する。このようにしお埗られた攟射ラベル
cDNAに察しおハむブリド化されたコロニヌバ
ンクよりのクロヌンに぀いおさらに調べお、完
党長のむンタプロンコヌド遺䌝子の存圚を確
かめる。(1)たたは(2)で埗られる郚分長の掚定さ
れる遺䌝子断片も、それら自䜓、完党長遺䌝子
のプロヌブに甚いうる。 (4) 䞊蚘に埗られた完党長遺䌝子は、成熟ポリペ
プチドの埮生物による発珟を劚げるかも知んな
いリヌダleader配列があれば、それを陀
き、そしお、埮生物プロモヌタヌの開始シグナ
ルおよびリボゟヌム結合郚䜍に関しお、発珟ビ
ヒクル䞭に適圓に䜍眮するこずを可胜ずするよ
うに、合成DNAを甚いお、仕立䞊げられた。
発珟されたむンタプロンは粟補しお、その特
性を確認し、掻性を枬定する。 (5) 䞊蚘の方法で調補したむンタプロン遺䌝子
断片それ自䜓は、他の郚分に盞同な癜血球むン
タプロン皮のハむブリド化によるプロヌブに
甚いられる。 䞊蚘に抂芁を瀺した組換えDNA技術を応甚す
るこずにより、盞圓する先行配列たたはその䞀郚
分を本質的にずもなわない、成熟ポリペプチドず
しおの矀の盞同的な癜血球むンタプロング
リコシル化されおいないを、高収量、高玔床
で、埮生物的に生産するこずが可胜ずな぀た。こ
れらのむンタプロンは、動物およびヒトのりむ
ルスおよび悪性腫瘍疟患に甚いる適圓なレベルた
で、盎接発珟させ、採取し、そしお粟補するこず
ができる。このように発珟された、矀のむンタ
プロンはむン ビトロ詊隓で有効であるこずが
瀺され、そしお、埮生物的に生産された最初の癜
血球むンタプロンずしお、むン ビボの詊隓で
も、始めお、有効なこずが瀺されたのである。 本明现曞䞭で甚いられる“成熟ヒト癜血球むン
タプロン”の甚語は、グリコシル基を欠劂す
る、埮生物的たずえば、现菌的に生産される
むンタプロンを意味する。本発明の成熟癜血球
むンタプロンは倩然生成物の第のアミノ酞コ
ドンのすぐ前にある翻蚳開始シグナルATG
より盎ちに発珟される。埓぀お、この“成熟”ポ
リペプチドはその配列䞭に第のアミノ酞ずしお
メチオニンATGがコヌドするを含有するが、
本質的にその特性は圱響されない。他方、埮生物
宿䞻は翻蚳生成物を加工しお、最初のメチオニン
を陀きうる。成熟癜血球むンタプロンは、通垞
のリヌダヌ以倖の接合蛋癜質ず䞀緒に発珟されう
るが、この接合物は、现胞倖たたは现胞内の環境
においお特異的に陀去しうる英囜特蚱公報No.
2007676Aをみよ。最埌に、成熟むンタプロン
は、接合物を现胞壁たで茞送する、埮生物“シグ
ナル”ペプチドずの接合物ずしお生産されうる。
现胞壁においおシシグナルは凊理しおはづされ、
成熟ポリペプチドが分泌される。 成熟癜血球むンタプロンの“発珟”ずは、ヒ
ト癜血球むンタプロンゲノムのmRNA翻蚳に
盎接に結果する、グリコシル基たたは先行配列を
含有しないむンタプロン分子の现菌たたは他の
埮生物による生産を意味する。 特定の癜血球むンタプロン蛋癜質は、ここで
は、決定されたDNA遺䌝子衚および衚
および挔繹的に定められるアミノ酞配列衚お
よび衚により定矩される。これらの特定のむ
ンタプロン、実際ここに含たれるすべおの矀の
癜血球むンタプロンタンパク質に察しお、倩然
の察立遺䌝子倉曎allelic variationが存圚
し、個䜓間にもおこりうる。これらの倉異は、配
列党䜓におけるアミノ酞の盞異たたは、配列䞭の
アミノ酞の欠萜、眮き代え、挿入、反転たたは远
加ずしお衚われる。本明现曞で察象ずする各むン
タプロン、暙瀺されたLeIF からLeIF に
぀いお、そのような、察立遺䌝子倉異は、暙瀺の
範囲内たたは、その定矩内に含たれ、埓぀お、本
発明の範囲内に含たれるずする。 ぀ぎに、衚および図に぀いお説明する。 【衚】 【衚】 〓 〓 〓
〓 〓 〓 〓
〓 〓 〓 〓

LeIF A TGAGCCTAAACCTTAGGCTCACCCATT
TCAACCAGTCTAGCAGCATCTGCAACATCTACAATGGCCTTGACCTTTGC
TTTACTGGTGGCCCTCCTGGTGC
LeIF B
TACTAGCTCAGCAGCATCC
GCAACATCTACAATGGCCTTGACTTTTTATTTAATGGTGGCCCTAGTGGT
GC
LeIF C
CAAGGTTATCCATCTCAAGTAGCCTAGCAATATTTGCAACATCCCAATG
GCCCTGTCCTTTTCTTTACTTATGGCCGTGCTGGTGC

LeIF D CAAGGTTCAGAGTCA
CCCATCTCAGCAAGCCCAGAAGTATCTGCAATATCTACGATGGCCTCGCC
CTTTGCTTTACTGATGGTCCTGGTGGTGC
LeIF E




LeIF F

ACATCCCAATGGCCCTGTCCTTT
TCTTTACTGATGGCCGTGCTGGTGC
LeIF G


LeIF H CCAAGGTTCAGTGTTACCC
CTCATCAACCAGCCCAGCAGCATCTTCGGGATTCCCAATGGCATTGCCCT
TTGCTTTAATGATGGCCCTGGTGGTGC
60
80 100
120 140
〓 〓
〓 〓 〓 〓
〓 〓 〓
〓
LeIF A TCAGCTGCAAGTCAAGCTGCTCTGTGG
GCTGTGATCTGCCTCAAACCCACAGCCTGGGTAGCAGGAGGACCTTGATG
CTCCTGGCACAGATGAGGAAAAT
LeIF B TCAGCTACAAGTCATTCAGCTCTCTGG
GCTGTGATCTGCCTCAGACTCACAGCCTGGGTAACAGGAGGGCCTTGATA
CTCCTGGCACAAATGCGAAGAAT
LeIF C TCAGCTACAAATCCATCTGTTCTCTGG
GCTGTGATCTGCCTCAGACCCACAGCCTCGGTAATAGGAGGGCCTTGATA
CTCCTGGGACAAATGGGAAGAAT
LeIF D TCAGCTGCAAGTCAAGCTGCTCTCTGG
GCTGTGATCTCCCTGAGACCCACAGCCTGGATAACAGGAGGACCTTGATG
CTCCTGGCACAAATGAGCAGAAT
LeIF E
CTGCCTCTGGGCTGTGATCTGCCTCAGGCCCACAGCGTGGGTA
ACAGGAGGGCCTTCATACTCCTGACACAAATGAGGAGAAT
LeIF F TCAGCTACAAATCCATCTGTTCTCTGG
GCTGTGATCTGCCTCAGACCCACAGCCTGGGTAATAGGAGGGCCTTGATA
CTCCTGGCACAAATGGGAAGAAT
LeIF G




LeIF H TCAGCTGCAAGTCAAGCTGCTCTCTGG
GCTGTAATCTGTCTCAAACCCACAGCCTGAATAACAGGAGGACTTTGATG
CTCATGGCACAAATGAGGAGAAT
160
180 200
220 240
〓 〓
〓 〓 〓 〓
〓 〓 〓
〓
LeIF A CTCTCTTTTCTCCTGCTTGAAGGACAG
ACATGACTTTGGATTTCCC CAGGAGGAGTTT GGCAACCAGTT
CCAAAAGGCTGAAACCATCCCTGTCCT
LeIF B CTCTCCTTTCTCCTGCCTGAAGGACAG
ACATGACTTTGAATTCCCC CAGGAGGAGTTTGATGATAAACAGTTCCA
GAAGGCTCAAGCCATCTCTGTCCT
LeIF C CTCTCCTTTCTCCTGCCTGAAGGACAG
ACATGATTTCCGAATCCCC CAGGAGGAGTTTGATGGCAACCAGTTCCA
GAAGGCTCAAGCCATCTCTGTCCT
LeIF D CTCTCCTTCCTCCTGTCTGATGGACAG
ACATGACTTTGGATTTCCC CAGGAGGAGTTTGATGGCAACCAGTTCCA
GAAGGCTCCAGCTATCTCCCTCCT
LeIF E CTCTCCTTTTTCTTACCTGAAGGACAG
ACATGACTTTGATTTTCCATCATCAGGTGTTTCATGGCAACCACTTCCAG
AAGGTTCAAGCTATCTTCCTTTT
LeIF F CTCTCCTTTCTCCTGCCTGAAGGACAG
ACATGACTTTGGATTCCCC CAAGAGGAGTTTGATGGCAACCAGTTCCA
GAAGGCTCAAGCCATCTCTGTCCT
LeIF G
CATGACTTTGGATTTCCT C
AGGAGGAGTTTGATGGCAACCAGTTCCAGAAGGCTCAAGCCATCTCTGTC
CT
LeIF H CTCTCCTTTCTCCTGCCTGAAGGACAG
ACATGACTTTGAATTTCCC CAGGAGGAATTTGATGGCAACCAGTTCCA
GAAAGCTCAAGCCATCTCTGTCCT
260
280 300
320 340
〓 〓
〓 〓 〓 〓
〓 〓 〓
〓
LeIF A CCATGAGATGATCCAGCAGATCTTCAA
TCTCTTCAGCACAAAGGACTCATCTGCTGCTTGGGATGAGACCCTCCTAG
ACAAATTCTACACTGAACTCTAC
LeIF B CCATGAGATGATCCAGCAGACCTTCAA
CCTCTTCAGCACAAAGGACTCATCTGCTGCTTTGGATGAGACCCTTCTAG
ATGAATTCTACATCGAACTTGAC
LeIF C CCATGAGATGATCCAGCAGACCTTCAA
TCTCTTCAGCACAGAGGACTCATCTGCTGCTTGGGAACAGAGCCTCCTAG
AAAAATTTTCCACTGAACTTTAC
LeIF D CCATGAGCTGATCCAGCAGATCTTCAA
CCTCTTTACCACAAAAGATTCATCTGCTGCTTGGGATGAGGACCTCCTAG
ACAAATTCTGCACCGAACTCTAC
LeIF E CCATGAGATGATGCAGCAGACCTTCAA
CCTCTTCAGCACAAAGGACTCATCTGATACTTGGGATGAGACCCTTTTAG
ACAAATCCTACACTGAACTTTAC
LeIF F CCATGAGATGATCCAGCAGACCTTCAA
TCTCTTCAGCACAAAGGACTCATCTGCTACTTGGGAACAGAGCCTCCTAG
AAAAATTTTCCACTGAACTTAAC
LeIF G CCATGAGATGATCCAGCAGACCTTCAA
TCTCTTCAGCACAAAGGACTCATCTGCTACTTGGGATGAGACACTTCTAG
ACAAATTCTACACTGAACTTTAC
LeIF H CCATGAGATGATGCAGCAGACCTTCAA
TCTCTTCAGCACAAAGAACTCATCTGCTGCTTGGGATGAGACCCTCCTAG
AAAAATTCTACATTGAACTTTTC
【衚】 〓 〓
〓 〓 〓 〓
〓 〓 〓 〓

LeIF A CAGCAGCTGAATGACCTGGAAGCCTGT
GTGATACAGGGGGTGGGGGTGACAGAGACTCCCCTGATGAAGGAGGACTC
CATTCTGGCTGTGAGGAAATACT
LeIF B CAGCAGCTGAATGACCTGGAAGTCCTG
TGTGATCAGGAAGTGGGGGTGATAGAGTCTCCCCTGATGTACGAGGACTC
CATCCTGGCTGTGAGGAAATACT
LeIF C CAGCAACTGAATGACCTGGAAGCATGT
GTGATACAGGAGGTTGGGGTGGAAGAGACTCCCCTGATGAATGAGGACTC
CATCCTGGCTGTGAGGAAATACT
LeIF D CAGCAGCTGAATGACTTGGAAGCCTGT
GTGATGCAGGAGGAGAGGGTGGGAGAAACTCCCCTGATGAATGTGGACTC
CATCTTGGCTGTGAAGAAATACT
LeIF E CAGCAGCTGAATGACCTGGAAGCCTGT
GTGATGTAGAAGGTTGGAGTGGAAGAGACTCCCCTGAGGAATGTGGACTC
CATCCTGGCTGTGAGAAAATACT
LeIF F CAGCAGCTGAATGACATGGAAGCCTGC
GTGATACAGGAGGTTGGGGTGGAAGAGACTCCCCTGATGAATGTGGACTC
CATCTTGGCTGTGAAGAAATACT
LeIF G CAGCAGCTGAATGACCTGGAAGCCTGTAT
GATGCAGGAGGTTGGAGTGGAAGACACTCCTCTGATGAATGTGGACTCTA
TCCTGACTGTGAGAAAATACT
LeIF H CAGCAAATGAATGACCTGGAAGCCTGT
GTGATACAGGAGGTTGGGGTGGAAGAGACTCCCCTGATGAATGAGGACTC
CATCCTGGCTGTGAAGAAATACT
460
480 500
520 540
〓 〓
〓 〓 〓 〓
〓 〓 〓 〓

LeIF A TCCAAAGAATCACTCTCTATCTGAAAG
AGAAGAAATACAGCCCTTGTGCCTGGGAGGTTGTCAGAGCAGAAATCATG
AGATCTTTTTCTTTGTCAACAAA
LeIF B TCCAAAGAATCACTCTATATCTGACAG
AGAAGAAATACAGCTCTTGTGCCTGGGAGGTTGTCAGAGCAGAAATCATG
AGATCCTTCTCTTTATCAATCAA
LeIF C TCCAAAGAATCACTCTTTATCTAATAG
AGAGGAAATACAGCCCTTGTGCCTGGGAGGTTGTCAGAGCAGAAATCATG
ASATCCCTCTCGTTTTCAACAAA
LeIF D TCCGAAGAATCACTCTCTATCTGACAG
AGAAGAAATACAGCCCTTGTGCCTGGGAGGTTGTCAGAGCAGAAATCATG
AGATCCCTCTCTTTATCAACAAA
LeIF E TTCAAAGAATCACTCTTTATCTGACAA
AGAAGAAGTATAGCCCTTGTTCCTGGGAGGCTGTCAGAGCAGAAATCATG
AGATCCTTCTCTTTATGAACGAA
LeIF F TCCAAAGAATCACTCTTTATCTGACAG
AGAAGAAATACAGCCCTTGTGCTTGGGAGGTTGTCAGAGCAGAAATCATG
AGATCCTTCTCTTTATCAAAAAT
LeIF G TTCAAAGAATCACCCTCTATCTGACAGAG
AAGAAATACAGCCCTTGTGCATGGGAGGTTGTCAGAGCAGAAATCATGAG
ATCCTTCTCTTTATCAGCAAA
LeIF H TCCAAAGAATCACTCTTTATCTGATGG
AGAAGAAATACAGCCCTTGTGCCTGGGAGGTTGTCAGAGCAGAAATCATG
AGATCCTTCTCTTTTTCAACAAA
560
580 600
620 640
〓 〓
〓 〓 〓 〓
〓 〓 〓 〓

LeIF A CTTGCAAGAAAGTTTAAGAAGTAAGGA
ATGAAAACTGGTTCAACATGGAAATGATTTTCATTGATTCGTATGCCAGC
TCACCTTTTTATGATCTGCCATT
LeIF B CTTGCAAAAAAGATTGAAGAGTAAGGA
ATGAGACCTGGTACAACACGGAAATGATTCTCATAGACTAATACAGCAGT
CTACACTTTGACAAGTTGTGCTC
LeIF C CTTGCAAAAAAGATTAAGGAGGAAGGA
TTGAAAACTGGTTCAACATGGCAATGATCCTGATTGACTAATACATTATC
TCACACTTTCATGAGTTCTTCCA
LeIF D CTTGCAAGAAAGATTAAGGAGGAAGGA
ATAATATCTGGTCCAACATGAAAACAATTCTTATTGACTCATACACCAGG
TCACGCTTTCATGAATTCTGTCA
LeIF E CTTGCAGGAAAGATTAAGGAGGAAGGA
ATGAAAACTGGTTCAACATGGAAATGAGAAACATTTCCATGATTAATACA
TCATCTCACACATTCATGAATTC
LeIF F TTTTCAAGAAAGATTAAGGAGGAAGGA
ATGAAACCGTTTCAACATGGAAATGATCTGTATTGACTAATACACCAGTC
CACACTTCTATGACTTCTGCCAT
LeIF G CTTGCAAGAAAGATTAAGGAGGAAGGAAT
GAAAACTGGTTCAACATCGAAATGATTCTCATTGACTAGTACACCATTTC
ACACTTCTTGAGTTCTGCCGT
LeIF H CTTGCAAAAAAGATTAAGGAGGAAGGA
TTGAAAACTGGTTCATCATGGAAATGATTCTCATTGACTAATACATCATC
TCACACTTTCATGTTCTTCCATT
660
680 700
720 740
〓 〓
〓 〓 〓 〓
〓 〓 〓 〓

LeIF A TCAAAGACTCATGTTTCTGCTATGACC
ATGACACGATTTAAATCTTTTCAAATGTTTTTAGGASTATTAATCAACAT
TGTATTCAGCTCTTAAGGCACTA
LeIF B TTTCAAAGACCCTTGTTTCTGCCAAAA
CCATGCTATGAATTGAATCAAATGTGTCAAGTGTTTTCAGGAGTGTTAAG
CAACATCCTGTTCAGCTGTATGG
LeIF C TTTCAAAGACTCACTTCTATAACCACG
ACGCGTTGAATCAAAATTTTCAAATGTTTTCAGCAGTGTAAAGAAGTGTC
GTGTATACCTGTGCAGGCACTAG
LeIF D TTTCAAAGACTCTCACCCCTGCTATAA
CTATGACCATGCTGATAAACTGATTTATCTATTTAAATATTTATTTAACT
ATTCATAAGATTTAAATTATTTT
LeIF E TGCCATTTCTCATTTTTGCTATATCCA
TGACATGAGTTGAATCAAAATTTTAAAATGTTTTCAGGAATGTTAAGCAG
CATCATGTTCAGCTGTACAGGCA
LeIF F TTCAAAGACTCATTTCTCCTATAACCA
CCGCATGAGTTGAATCAAAATTTTCAGATCTTTTCAGGAGTGTAAGGAAA
CATCATGTTTACCTGTGCAGGCA
LeIF G TTCAAATATTAATTTCTGCTATATCCATG
ACTTGAGTTGAATCAAAATTTTCAAACGTTTCACACGTGTTAAGCAACAC
TTCTTTAGCTCCACAGGGACA
LeIF H TCAAAGACTCACTTCTATAACCACCAC
AAGTTGAATCAAAATTTCCAAATGTTTTCAGGAGTGTTAAGAAGCATCGT
GTTTACCTGTGCAGGCACTAGTC
【衚】 〓 〓
〓 〓 〓 〓
〓 〓 〓 〓

LeIF A GTCCCTTACAGAGGACCATGCTGACTG
ATCCATTATCTATTTAAATATTTTTAAAATATTATTTATTTAACTATTTA
TAAAACAACTTATTTTTGTTCAT
LeIF B GCACTAGTCCCTTACAGATGACCATGC
TGATGGATCTATTCATCTATTTATTTAAATCTTTATTTAGTTAACTACTA
TAGGGACTTAAATTAGTTTTGTT
LeIF C TCCTTTACAGATGACCATTCTGATGTC
TCTGTTCATCTTTTGTTTAAATATTTATTTAATTATTTTTAAAATTTATG
TAATATCATGAGTCGCTTTACAT
LeIF D TGTTCATATAACGTCATGTGCACCTTT
ACACTGTGGTTAGTGTAATAAAACATGTTCCTTATATTTACTC〓poly(
A)

LeIF E CTAGTTCCTTACGGATGATCATGCTGA
TGGATCTGTTTATCTATTTGTCTAAATAATTATTTAACTATTTATAATAT
TTAAAATCTTCTTTTCATGTATC
LeIF F CTAGTCCTTTACAGATGACCATGCTGA
TAGATCTAATTATCTATCTATTGAAATATTTATTTATTTATTAGATTTAA
ATTATTTTTGTCCATGTAATATT
LeIF G AAATCTTTACAGATGATCATGCCAATCTA
TCTATTCTATCTATTTATCTATCTGTCTGTCTTCTATCTAATCTATTTAA
ATATTTATTTATTTATAAGAT
LeIF H CTTTACAGATGACCATTCTGATGTCTC
CTTTCATCTATTTATTTAAATATTTATTTATTTAACTATTTTTATTATTT
AAATTATTTTTTATGTAATATCA
860
880 900
920 940
〓 〓
〓 〓 〓 〓
〓 〓 〓 〓

LeIF A ATTACGTCATGTGCACCTTTGCACAGT
GGTTAATGTAATAAAATATGTTCTTTGTATTTGGT〓poly(A)


LeIF B CATATTATATTATGTGAACTTTTACAT
TGTGAATTGTGTAACAAAAACATGTTCTTATATTTATTATTTTGCCATGT
TTATTAAATTTTTACTATGAAAA
LeIF C TGTGGTTAATGTAACAATATATGTTCT
TCATATTTAGCCAATATATTAATTTCCTTTTTCATTAAATTTTTACTATA
C〓poly(A)
LeIF E ATGTATTTTTACTTTGTGGTTAATATA
ACAACACATGTTCTTTATATTTAGTCAATATATTACTTTGCTTTTTTCAT
TAAATTTTTACTATGG〓poly(A)
LeIF F ATGTGTACTTTTACATTGTGTTATATC
AAAATATGTTAATCTAATATTTAGTCAATATATTATTTTCTTTTTATTAA
TTTTTACTATTAAAACTTCTTAT
LeIF G TTAAATTATTTTAAACTTATGTTTGTT
CAGGTAATATTACATCCACCTTACTTTGTGGCTAATATAATAAAATATGT
TCTTTATGTTTTGTC〓poly(A)
LeIF H TGAGTACCTTTACATTGTGGTTAATGTAA
CAAATATGTTCTTCATATTTAGCCAATATATTAATTTCCTTTTTCATTAA
ATTTTTACTAT〓poly(A)
960
980 1000

〓 〓
〓 〓 〓 〓
〓
LeIF B AATTCTTTATTTATTCTTTAAAATTGA
ACTCCAACCCATGAATTGTGCAAACTGATTAAAGAATGGATGGT〓poly
(A)
LeIF F ATTATTTGGTTATTCTTTAATAAAGAA
ATTCCAAGCCC〓poly(A)


【衚】 〓 〓
〓 〓 〓
〓 〓
〓
LeIF A M A L T F A L L V A L L V L
S C K S S C S V G C D L P Q T H S
L G S R R T L M L L A Q M R K I
S L F S C L K D R H D F G F P Q
LeIF B M A L T F Y L M V A L V V L
S Y K S F S S L G C D L P Q T H S
L G N R R A L I L L A Q M R R I
S P F S C L K D R H D F E F P Q
LeIF C M A L S F S L L M A V L V L
S Y K S I C S L G C D L P Q T H S
L G N R R A L I L L G Q M G R I
S P F S C L K D R H D F R I P Q
LeIF D M A S P F A L L M V L V V L
S C K S S C S L G C D L P E T H S
L D N R R T L M L L A Q M S R I
S P S S C L M D R H D F G F P Q
LeIF E
L P L G C
D L P Q A H S V G N R R A F I L L
T Q M R R I S P F S Y L K D R H D
F D F P H
LeIF F M A L S F S L L M A V L V L
S Y K S I C S L G C D L P Q T H S
L G N R R A L I L L A Q M G R I
S P F S C L K D R H G F G F P Q
LeIF G



H D F G F P
Q
LeIF H M A L P F S L M M A L V V L
S C K S S C S L G C N L S Q T H S
L N N R R T L M L M A Q M R R I
S P F S C L K D R H D F E F P Q
All M A F L
V L S K S S G C L
T H S L R R L L
Q M I S S C L D
R H D F P Q
50 60
70 80
90 100
〓
〓 〓
〓 〓
〓
LeIF A E E F 〓 G N Q F Q K A E T I
P V L H E M I Q Q I F N L F S T
K D S S A A W D E T L L D K F Y T
E L Y Q Q L N D L E A C V I Q G
LeIF B E E F D D K Q F Q K A Q A I
S V L H E M I Q Q T F N L F S T K
D S S A A L D E T L L D E F Y I
E L D Q Q L N D L E V L C D Q E
LeIF C E E F D G N Q F Q K A Q A I
S V L H E M I Q Q T F N L F S T K
D S S A A W E Q S L L D K F S T
E L Y Q Q L N D L E A C V I Q E
LeIF D E E F D G N Q F Q K A P A I
S V L H E L I Q Q I F N L F T T K
D S S A A W D E D L L D K F C T
E L Y Q Q L N D L E A C V M Q E
LeIF E Q V F H G N H F Q K V Q A I
F L F H E M M Q Q T F N L F S T K
D S S D T W D E T L L D K S Y T
E L Y Q Q L N D L E A C V M K
LeIF F E E F D G N Q F Q K A Q A I
S V L H E M I Q Q T F N L F S T K
D S S A T W E Q S L L E K F S T
E L N Q Q L N D M E A C V I Q E
LeIF G E E F D G N Q F Q K A Q A I
S V L H E M I Q Q T F N L F S T K
D S S A T W D E T L L D K F Y T
E L Y Q Q L N D L E A C M M Q E
LeIF H E E F D G N Q F Q K A Q A I
S V L H E M M Q Q T F N L F S T K
N S S A A W D E T L L E K F Y T
E L F Q Q M N D L E A C V I Q E
All E E F D Q F Q K A
I V L H E Q Q F N L
F T S S A L
L F E L Q Q N D
E Q
110 120
130 140
150 160 166
〓
〓 〓
〓 〓
〓
LeIF A V G V T E T P L M K E D S I
L A V R K Y F Q R I T L Y L K E K
K Y S P C A W E V V R A E I M R
S F S L S T N L Q E S L R S K E
LeIF B V G V I E S P L M Y E D S I
L A V R K Y F Q R I T L Y L T E K
K Y S S C A W E V V R A E I M R
S F S L S I N L Q K R L K S K E
LeIF C V G V E E T P L M N E D S I
L A V R K Y F Q R I T L Y L I E R
K Y S P C A W E V V R A E I M R
S L S F S T N L Q K R L R R K D
LeIF D E R V G E T P L M N V D S I
L A V K K Y F R R I T L Y L T E K
K Y S P C A W E V V R A E I M R
S L S L S T N L Q E R L R R K E
LeIF E V G V E E T P L R N V D S I
L A V R K Y F Q R I T L Y L T K K
K Y S P C S W E A V R A E I M R
S F S L T N L Q E R L R R K E
LeIF F V G V E E T P L M N V D S I
L A V K K Y F Q R I T L Y L T E K
K Y S P C A W E V V R A E I M R
S F S L S K I F Q E R L R R K E
LeIF G V G V E E T P L M N V D S I
L T V R K Y F Q R I T L Y L T E K
K Y S P C A W E V V R A E I M R
S F S L S A N L Q E R L R R K E
LeIF H V G V E E T P L M N E D S I
L A V R K Y F Q R I T L Y L M E K
K Y S P C A W E V V R A E I M R
S F S F S T N L Q K R L R R K D
All V P L M
D S I L V K Y F R I T L Y
L E K Y S C A W E V V R
A E I M R S S S Q
L K
【衚】 【衚】 【衚】 衚は、−および−13ず称される、ヒト
癜血球より分離されそしお均䞀に粟補された、す
べおの皮類のむンタプロンに共通の぀のアミ
ノ酞配列を瀺す。これらのペプチドをコヌドする
可胜なmRNA配列のすべおおよび察応するDNA
配列を瀺す。、、、およびの文字は、
それぞれ、アデニン、チミン、グアニン、シトシ
ンおよびりラシルの塩基を含有するヌクレオチド
を瀺す。文字は、ヌクレオチド、、およ
びのいずれかを瀺す。ポリヌクレオチドは、
5′巊偎から3′右偎の方向に読むように蚘茉
されおいる。そしお、重鎖“d.s.”DNAを瀺
す時には、䞋偎たたはコヌド鎖に぀いおは、順序
は逆ずなる。第図は、可胜性のあるLeIFプラ
スミドず 32p−ラベル合成デオキシオリゎヌクレ
オチドずのハむブリド化を瀺すオヌトラゞオグラ
ムである。 第衚は、それぞれ、“”から“”たでの
蚘号を付されおいる、癜血球むンタプロンの発
珟のために候補ずしお分離された個の遺䌝子断
片のヌクレオチド配列コヌド鎖を瀺す。それ
ぞれのLeIFによ぀お、ATGの翻蚳開始コドンお
よび終止トリプレツトが䞋線で瀺されおいる。停
止コドンたたは終止コドンに続いお3′の未翻蚳領
域が瀺されおいる。含たれおいるLeIF の党遺
䌝子長には、衚の第列ラむンに瀺されるよ
うに、他のコドンには存圚するひず぀のコドンが
欠劂しおいる。5′非翻蚳域がリヌダヌ配列に先行
しおいる。分離したたたの断片には、リヌダヌ
の完党な先行配列は存圚しない。しかし、仮定さ
れる成熟LeIF に察する党遺䌝子を含有する。
分離されたたたの断片は、コヌド配列が完党で
ない。 衚では、ヌクレオチド配列より瀺される個
のLeIF蛋癜質配列を比范しおいる。IUPAC−
LUBコミツシペン オン バむオケミカル ノ
ヌメン カルチダヌCommission on
Bicchemical Nomepclatureの提案による文
字省略が甚いられおいる。぀たり、アラニンは
で、システむンはで、アスパラギン酞はで、
グルタミン酞はで、プニルアラニンはで、
グリシンはでヒスチゞンはで、む゜ロむシン
はで、リゞンはで、ロむシンはで、メチオ
ニンは、アスパラギンはで、プロリンは
で、グルタミンはで、アルギニンはで、セリ
ンは、スレオニンはで、バリンはで、トリ
プトフアンはで、チロシンはで衚わす。数は
アミノ酞の䜍眮を瀺す。はシグナルペプチドを
瀺す。165個のアミノ酞配列であるLeIF 配列
䞭の44䜍のダツシナは、このLeIF 配列を他の
LeIFの166個のアミノ酞配列ず䞀列にそろえるた
めに入れおある。LeIF の配列は、そのコヌド
領域の䜙分のヌクレオチド衚の䜍眮187を
無芖しお定められおいる。星印は、むンプヌス
にある終止コドンを瀺す。すべおのLeIFに共通
のアミノ酞プ゜むド遺䌝子LeIF を陀くも
たた瀺されおいる。アンダヌラむンした残基は、
ヒト線維芜むンタプロンにも存圚するアミノ酞
である。 第図は、LeIFクロヌン化cDNAの個の型
からたでの制限゚ンドヌクレアヌれ地図
を瀺す。ハむブリドプラスミドは、dCdGテヌ
リング法ゎデルGoeddel、D.V.等、ネヌチ
ダヌNature287、411−416〔1980〕により構
築された。 それで、cDNA挿入物は、Pst を甚いお切
断しうる。各cDNA挿入物の末端のラむンは、偎
面に接するホモ重合dCdGテヌルを瀺す。Pvu
、EcoRおよびBgl の制限郚䜍も瀺し
おある。濃い領域は成熟LeIFのコヌド配列を瀺
す。斜線の郚分はシグナルペプチドコヌド配列で
ある。癜い郚分は3′および5′非コヌド配列であ
る。 第図は、成熟LeIF の盎接的埮生物合成を
コヌドする遺䌝子の構築を瀺す。制限郚䜍および
残郚が瀺されおいる“Pst ”等。“b.p.”は
塩基察を瀺す。 第図および第図は、LeIF 成熟癜血球む
ンタプロンを発珟するに甚いられる぀の遺䌝
子断片の制限地図を瀺す。瀺したコドン配列は、
瀺した぀の堎合に぀いお制限酵玠Sau  
で消化するこずで生成するコヌド鎖末端である。 衚および衚は、タむプおよびを含め
た、個のLeIF蛋癜質の配列のDNAおよびアミ
ノ酞省略笊号に぀いおは、第衚に同じを瀺
す。第衚においお、星印は察応するDNA配列
における終止コドンを瀺し、ハむプンは配列に
おける欠萜たたはギダツプを瀺す。 ぀ぎに、本発明を実斜するための有利な具䜓䟋
を瀺す。  䜿甚埮生物 蚘茉した実斜においおは、皮の埮生物、぀
たり、米囜特蚱U.S.P.4.190.495蚘茉のむ
ヌコリE.coli×1776およびむヌコリ
E.coli−12 294株゚ンド、thi-、
hsr-、hsm+ k、英囜特蚱公報No.2055382に蚘茉
を甚いおいる。それぞれ、ザ アメリカン タ
むプ カルチダヌ コレクシペンthe
American Type Culture Collectionに寄蚗
され、ATCCNo.31537および31446ブタペスト
条玄による囜際寄蚗に基づく受蚗番号31446
が付されおいる。組換えDNAの実隓のすべお
は、ナシペナル むンスチチナヌト オブ ヘ
ルスNational Institute of Healthの該圓
するガむドラむンに埓぀お実斜された。 本発明のも぀ずも有利な具䜓䟋は、䞊蚘定矩
の菌株むヌコリE.coli×1776およびむヌ
コリE.coli−12菌株294のみならず、他
の既知のむヌコリE.coli株以䞋E.coli
で瀺すたずえばE.coli を含めたE.coliおよ
び他の埮生物株に関連しお蚘茉しおゆくが、こ
れらの倚くは、ザ アメリカン タむプ カル
チダヌ コレクシペンthe American Type
Culture CollectionATCCのような、知
られおいる埮生物寄蚗斜蚭に寄蚗されおおり入
手可胜である。ドむツ特蚱2644432もみられた
い。これらの他の埮生物には、バチルス
Bacillusたずえばバチルス サブチリス
Bacillus Subtilisおよび他の腞内现菌たず
えばサルモネラ チフむムリりム
Salmonella typhimuriumおよびセラチア
マルセセンスSerratia marcescensがあ
り、異質遺䌝子配列を発珟しうる、耇補しうる
プラスミドを䜿甚する。酵母たずえばサツカロ
スマむセス セレビシア゚Saccharomyces
cerevisiaeもたた、酵母プロモヌタヌの制埡
䞋に、むンタプロンをコドンする遺䌝子を発
珟させるこずによるむンタプロン蛋癜質の補
造に甚いお有利でありうる。  LeIF mRNAの原料および粟補 LeIF mRNAはヒト癜血球より採取しうる。
ふ぀うは、ドむツ特蚱No.2947134に蚘茉のよう
に、センダむSendaiりむルスたたはニナ
ヌカツスルNewcastle病りむルスでむンタ
プロンを生産するように誘導した慢性骚ずい
性癜血病患者の癜血球より埗たものを䜿甚す
る。特に有利な、本明现曞の仕事に甚いられる
原料は、急性骚ずい性癜血病の患者に由来す
るKG−ず称するセルラむンである。このセ
ルラむンは、コフラヌKoeffler、H.P.およ
びゎルデGolde、D.W.、サむ゚ンス
Science200、11531978に蚘茉されおいる
ように、〔ロヌスりオル パヌク メモリアル
むンスチチナヌトRPMIRosewall Park
Memorial Institute〕1640プラス10熱䞍掻
化FCS牛胎児血枅、25mM HEPES緩衝液
−−ヒドロキシ゚チル−ピペラゞン−
N′−−゚タンスルホン酞および50Όml
のゲンタマむシン含有培地に容易に発育し、
週間に床、継代培逊からスプリツト
しうる。䞊蚘の発育培地に10ゞメチルスルホ
キサむドを加えお、现胞は凍結させうる。KG
−は、ザ アメリカン タむプ カルチダヌ
コレクシペンthe American Type
Culture CollectionATCCNo.CRL8031に
寄蚗されおいる。 KG−现胞は、ルビンステむン
Rubinstein等蚘茉の方法プロクナトル
アカドサむ米囜Proc.Natl.Acad.Sci.U.
S.A.76、640−644〔1979〕により、センダむ
Sendaiたたはニナヌカツスル
Newcastle病りむルスを甚い、癜血球むン
タプロンmRNAを生産するように誘導され
た。现胞は、誘導埌時間に採取しRNAを、
グアニゞンチオシアネヌト−グアニゞン塩酞塩
法チダヌりむンChirgwin等、バむオケ
ミストリむBiochemistry18、5294−5299
〔1979〕により調補した。誘導しない现胞から
のRNAも同様に調補した。オリゎデオキシチ
ミゞンdT−セルロヌズクロマトグラフむヌ
およびスクロヌスグラゞ゚ント超遠心を甚い
お、ポリ(A)mRNAの12S分画を埗た。方法は、
グリヌンGreen等アヌクバむオケミ
バむオフむスArch.Biochem.Biophys.172、
74−89〔1976〕およびオクナマOkuyuma
等アヌチバむオケミバむオフむス
Arch.Biochem.Biophys.188、98−104
〔1978〕の方法を甚いた。このmRNAは、ア
フリカツメガ゚ル卵母现胞分析カバリヌリ
Cavalieri等、プロクナトルアカドサ
む米囜Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.74、
3287−3291〔1977〕で8000−10000単䜍マむ
クログラムのむンタプロンタむタヌを瀺す。  LeIF cDNA配列を含有するコロニヌバンク
の調補 5ΌのmRNAを甚い、暙準方法りむケンス
Wickens等、ゞ゚むバむオケミJ.
Biol.Chem.253、2483−2495〔1978〕およびゎ
デルGoeddel等、ネヌチダヌNature
281、544−548〔1979〕により、重鎖cDNA
を調補した。cDNAはポリアクリルアミド
ゲル䞊での電気泳動により、倧きさに埓぀お分
画し、500から1500b.p.の倧きさの材料230n
を、電気溶出により埗た。このcDNAの100n
分を、デオキシシチゞンdC残基でテヌ
リングしチダングChang等、ネヌチダヌ
Nature275、617−624〔1978〕、Pst 郚䜍
においおデオキシグアノシンdG残基でテ
ヌリングtailingした470nのプラスミド
pBR322ずアニヌリングしボリバヌ
Bolivar等、ゞ゚むンGene、95−113
〔1977〕、これを甚いおE.Coli×1776を圢質転
換した。cDNAnに぀いお玄130個のテトラ
サむクリン抵抗性で、アンピシリン感受性の圢
質転換株を埗た。 第の同様の実隓では、cDNAnに぀い
お、玄1000個のテトラサむクリン抵抗性で、ア
ンピシリン感受性のE.coli −12æ ª294の転換
株を埗た。この堎合、600から1300b.p.の範囲
の、サむズにより分画したcDNA材料を、電気
溶出により採取し、dCでテヌリングするのに
甚いた。  合成オリゎヌクレオチドの調補およびその䜿
甹 ヒト癜血球むンタプロンのいく぀かのトリ
プシン分解断片のアミノ酞配列に぀いおの知芋
は、LeIF mRNAの皮々の領域に察しお盞補
的な合成デオキシオリゎヌクレオチドのデザむ
ンを可胜ずした。぀のトリプシンペプチド
T1およびT13を遞んだ。その理由は、それら
のアミノ酞配列は、すべおの可胜なコヌド配列
衚を説明するのに、12個および個のり
ンデカマヌを合成するだけですむからである。
それぞれの配列に぀いお、組のデオキシオリ
ゎヌクレオチドプロヌブを合成した。぀たり
各々䞉぀−1A、、、たたは䞀぀
−13A、、、のオリゎヌクレオチ
ドを含有する。瀺した盞補的デオキシオリゎヌ
クレオチド11塩基鎖長は、ホスホトリ゚ステル
法で化孊的に合成したクレアCrea等、
プロクナトルアカドサむ米囜Proc.
Natl.Acad.Sci.U.S.A.75、5765−5769
〔1978〕。−13シリヌズでは、個の個々の
プロヌブを調補した。衚に瀺すように、個
のプロヌブのプヌルずしお、12個の−プ
ロヌブを調補した。 −13シリヌズの個のそれぞれのプロヌブ
および各個のプラむマヌのプヌルずしお調
補した12個の−プロヌブを、ハむブリド化
プロヌブに甚いるための攟射ラベル重鎖
cDNAの合成を誘導するために甚いた。鋳型
mRNAは、センダむ誘導KG−现胞8000単
䜍IF掻性Όからの12S RNAたたは非誘
導癜血球10単䜍Όに由来する党ポリ
(A)mRNAである。 32−−ラベルcDNAを、
既知の反応条件ノむズNoyes等、プロ
クナトルアカドサむ米囜Proc.Natl.
Acad.Sci.U.S.A.76、1770−1774〔1979〕を
甚いお、これらのプラむマヌより調補した。20
トリスTris以䞋Trisで瀺す−HCl
PH8.3、20 KCl、 MgCl2、30
 β−メルカプト゚タノヌル䞭で60Ό容
量の反応をおこな぀た。この反応は、各プラむ
マヌの1Ό぀たり、−シリヌスに぀い
おは、党郚で12Ό、−13シリヌスに぀いお
は党郚で4Ό、2Όの“誘導”された12S分
画mRNAたたは、非誘導ポリ(A)mRNAの10ÎŒ
、0.5のdATP、dCTP、dTTP、
200ÎŒCiα32pdCTPアメルシダム
Amersham、−3000Cimoleおよび
60単䜍逆転写酵玠〔ベセスダ リサヌチ ラボ
ラトリむスBethesda Research
Laboratories〕である。生成物は、10mlセフ
アデツクスSephadex 以䞋Sephadex
で瀺す−50カラム䞊のゲル濟過により、結
合されなか぀たラベルより分け、70℃で30分間
0.3N NaOHで凊理し、RNAを分解し、HCl
で䞭和した。ハむブリド化は、カフアトス
Kafatos等、ヌクレむツク アシド リサ
ヌチNucleic Acid Res.、1541−1552
1979蚘茉に準じお実斜した。  クロヌンpL1−pL30の同定 500個のE.Coli −12æ ª294圢質転換株
項参照のそれぞれより、プラスミドDNAの
1Όを調補するのに、バヌンボむム
Birnboim等、ヌクレむツク アシド リサ
ヌチNucleic Acid Res.、1513−1523
1979の迅速プラスミド分離操䜜を甚いた。
各DNA詊料を倉成させ、カフアトス
Kafatos等の䞊蚘匕甚の方法に埓い、反
埩でニトロセルロヌズフむルタヌ䞊に぀けた。 500個のプラスミド詊料を含有するニトロセ
ルロヌスフむルタヌの組は、 (a) プラむマヌの−のセツトでプラむムさ
れた誘導cDNA、 (b) −13でプラむムされた誘導cDNAおよび (c) プラむマヌの䞡方のセツトを甚いお調補さ
れた非誘導cDNAずハむブリダむズした。非
誘導プロヌブの党䜓に察するよりも誘導され
たcDNAプロヌブの䞀方たたは䞡方に察しお
より匷くハむブリド化するならば、クロヌン
は陜性ず考えた。500個より30個の“陜性”
クロヌンpL1−pL30を遞択し、さらに分析
した。  クロヌンpL31−pL39の同定、LeIF遺䌝子断
片を含有するプラスミドNo.104の分離 プロヌブずしお 32p−ラベル誘導mRNAリ
ヌレンホヌグLillenhaug等、バむオケミス
トリむBiochemishry、15、1858−1865
〔1976〕を甚いお、グランステむン
GrunsteinおよびホグネスHognessのコ
ロニヌハむブリド化法プロクナトルアカ
ドサむ米囜Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.
72、3961−3965〔1975〕によりE.Coli×1776の
圢質転換株をスクリヌニングした。非誘導现胞
よりの非ラベルmRNAを 32p−ラベル調補物
䞭に存圚する非誘導mRNAず競合さすために、
プロヌブに察しお200察に混合した。ラベル
された mRNAのハむブリド化は、誘導された配列
を含有するコロニヌに遞択的に起るはづであ
る。぀の矀の圢質転換株が埗られた。 (1) コロニヌのからが 32p−mRNAに
非垞に匷くハむブリド化した。 (2) 10は、ハむブリド化の皋床が、䞊蚘(1)矀
より著しく䜎か぀た。 (3) 残りは、怜出しうる皋床のハむブリド化の
シグナルを瀺さなか぀た。 陜性のコロニヌ第(1)および第(2)矀に぀い
おは、むンタプロンmRNAがプラスミド
DNAに特異的にハむブリド化するこずによる
分析で、むンタプロンに特異的な配列の存圚
に぀いお調べた。たず、テトラサむクリン
20Όml、ゞアミノピメリン酞100Ό
ml、チミゞン20Όmlおよび−ビオ
チン1Όmlを加えたM9培地の100mlに、
60個の匷陜性コロニヌ第矀のそれぞれを
個別的に発育させた。M9培地は、リツトル
に぀いお、Na2HPO4、KH2PO4、
NaCl0.5およびNH4Clを含有し、
オヌトクレヌブしたあず、無菌1M MgSO4の
mlおよび無菌0.01M CaCl2の10mlを添加す
る。10個の培逊物はプヌルし、クレベル
Clewell等、バむオケミストリむ
Biochemistry、4428−440〔1970〕蚘茉の
ように、個のプヌルよりプラスミドDNAを
分離した。各プラスミドDNAプヌルの10Ό
は、HindIIIで切断し、倉性し、DBMゞアゟ
ベンゞルオキむメチル玙に共有結合させた。
誘導现胞よりの粟補のmRNAの1Όをそれぞ
れの濟玙にハむブリドさせた。ハむブリドしな
いcDNAは掗぀お陀去した。特異的にハむブリ
ドされたmRNAは溶出し、アフリカツメガ゚
ルの卵母现胞䞭で翻蚳させた。この分析で、
個のプヌルはすべお陰性であ぀た。匱陜性のコ
ロニヌ第矀の59個より、各10コロニヌの
プヌルずコロニヌのプヌルを調補し、そ
れらのプヌルよりプラスミドを調補し、䞊蚘の
ように調べた。詊隓した個のプヌルのうち、
個K10は、詊隓の床に、バツクグラりン
ドレベルを著しく超えるレベルで、むンタプ
ロンmRNAにハむブリドした。特異的むンタ
プロンcDNAクロヌンを同定するために、プ
ヌルK10のコロニヌよりプラスミドDNAを
調補し、個別的に調べた。個のプラスミドの
うち個No.101およびNo.104がむンタプロ
ンmRNAず、バツクグラりンドレベルを十分
に超えお結合した。プラスミドNo.104より、
260b.p.を含有する、独特のBgl制限断片を分
離した。これを、テむラヌTaylor等、バ
むオケミバむオフむスアクタBiochim.
Biophys.Acta422、324−3301976の方法
により 32でラベルし、コロニヌスクリヌニン
グ法グランステむン等Grunstein and
Hogness、プロクナトルサむ米囜
Proc.Natl.Sci.U.S.A.72、3961−3965
〔1975〕によりE.Coli294転換株の400個を、個
別的にスクリヌニングするためのプロヌブに甚
いた。このプロヌブず皮々の皋床にハむブリド
化する、個のコロニヌpL31−pL39を同
定した。 さらに、ラベルされた260b.p.断片を甚いお、
同様にしお、4000個のE.Coli294転換株を個別
的にスクリヌニングした。このプロヌブず皮皮
の皋床にハむブリドする50個のコロニヌを同定
した。ひず぀は、LeIF 断片を、ひず぀は、
LeIF 断片を、ひず぀はLeIF H1ず称する断
片みかけ䞊、LeIF の察立遺䌝子である
を含有した。生ずるハむブリドプラスミドは、
“pLeIF ”等ず称した。  最初の完党長LeIF遺䌝子の分離および配列
の決定 党䜓で39個の可胜性のあるLeIF cDNAクロ
ヌンよりプラスミドDNAを調補した。そしお
カフアトスKafatos等䞊蚘匕甚のハむ
ブリド化操䜜により、同じ260b.p.DNAプロヌ
ブを甚い再スクリヌニングした。このプロヌブ
ず個のプラスミドpL4、pL31、pL34は
非垞に匷いハむブリド化シグナルを䞎え、
pL13、pL30、pL32、pL36は䞭皋床にハむ
ブリド化し、個pL6、pL8、pL14は、匱
くハむブリド化した。 39個の可胜性のあるLeIF cDNA組換えプラ
スミドは、たた、 32p−ラベル合成りンデカマ
ヌ各々皮のプラむマヌからなる−プラ
むマヌプヌルのそれぞれたたは−13プラむマ
ヌのそれぞれをじかにハむブリド化のプロヌ
ブに甚いお怜玢した。怜出しうるハむブリド化
のシグナルを䞎えるのに完党な塩基間の察が必
芁であるように、ハむブリド化の条件を遞んだ
ワランスWallace等、ヌクレむツク ア
シド リサヌチNucleic Acid Res.、
3543−3557〔1979〕。぀たり、39個のクロヌン
よりプラスミドDNAを、暙準䞊柄液法
cleared lysate procedureクレベル
Clewell等、䞊蚘で調補し、バむオラド
アガロヌスBiorad Agarose−50カラム
クロマトグラフむヌで粟補した。各調補物の詊
料3Όは、EcoRで凊理しお開環し、ア
ルカリで倉性させ、枚の別々のニトロセルロ
ヌスフむルタヌにスポツトした。スポツトに
぀いお1.5Όずする。䞊蚘匕甚のカフアトス
Kafatos等の文献をみよ。合成デオキシオ
リゎヌクレオチド−13プラむマヌおよび−
プラむマヌプヌルのそれぞれは、γ32P
ATPで぀ぎのようにリン酞化した。50pmole
のオリゎヌクレオチドおよび100pmoleの
γ32PATPニナヌ むングランド ニナヌ
クレアヌNew England Nuclear、
2500Cimoleを、50のTris−HCl、
10のMgCl2および15のβ−メルカプト
゚タノヌルの混合物の30ÎŒl䞭で合䜵した。単
䜍のT4ポリヌクレオチドキナヌれを添加し、
37℃で30分埌 32p−ラベルプラむマヌは、10ml
セフアデツクスSephadex −50カラム
䞊でのクロマトグラフむヌで粟補した。
106cpmのプラむマヌ−13Cたたは×
166cpmのプラむラヌプヌル−1Cを甚いおハ
むブリド化した。ハむブリド化は、ワランス
Wallace等の䞊蚘匕甚の方法に埓぀お、
×SSC〔×SSC0.15MNaCl、0.015Mくえん
酞ナトリりム、PH7.2、10×Denhardts〔0.2
牛血枅アルブミン、0.2ポリビニルピロリド
ン、0.2Ficoll〕溶液䞭で、15℃で14時間ハむ
ブリド化した。フむルタヌは×SSC䞭℃で
分間宛床掗぀た。也操し、−線フむルム
にさらした。結果は、第図に、 32p−プラむ
マヌ−13Cおよびプラむマヌプヌル−1Cの
堎合に぀いお瀺しおある。 クロヌン104からのプラスミドDNAは、プラ
むマヌプヌル−1Cおよびプラむマヌ−13C
ず顕著にハむブリド化した。しかし、他のりン
デカマヌずは、怜出しうる皋のハむブリド化は
瀺さなか぀た。第図に瀺すように、39個の可
胜性のあるLeIFプラスミドのうちのいくらか
pL2、、13、17、20、30、31、34はこれ
らのプロヌブの䞡方ずハむブリド化した。しか
し、制限分析から、これらのプラスミドのうち
のひず぀だけ、pL31が260b.p.内郚Bgl 断
片をも含有した。pL31をPst で消化した結
果、cDNA挿入物の倧きさは玄1000b.p.であ぀
た。 pL31のPst 挿入物党䜓の配列を、マキサ
ム−ギルバヌトMaxam−Gilbert化孊法
メ゜ヌド ゚ンザむモルMethods
Enzymol.65、499−560〔1980〕およびゞデ
オキシ鎖末端化方法スミス、メ゜ヌド ゚ン
ザむモルSmith Methods Enzymol.65、
560−580〔1980〕で決定した。その際、Sau
 断片をM13ベクタヌ䞭にサブクロヌン化
しおおいた。DNA配列は衚の“”に瀺し
おある。入手しうる蛋癜質配列に぀いおの情
報、既知のLeIF分子量の範囲、個の可胜な
読み枠における停止トリプレツトの盞察的な存
圚より適圓な翻蚳読み枠が瀺唆された。それか
ら、プレヌたたはシグナルペプチドを含めお
LeIFアミノ酞党配列が瀺された。第のATG
翻蚳開始コドンは、配列の5′末端より60番目の
ヌクレオチドに存圚し、188コドンあずに、
TGA終止トリプレツトが存圚する。3′末端に
は342個の非翻蚳ヌクレオチドがあり、぀いで
ポリ(A)配列が぀づく。仮定されるシグナルペプ
チドおそらく、癜血球よりの成熟LeIFの分
泌にあづかるのであろうは23アミノ酞長であ
る。成熟LeIFを構成する165アミノ酞の分子量
の蚈算倀は、19390である。我々は、このpL31
によりコヌドされたLeIFを“LeIF ”ず称し
た。衚の配列デヌタ“”より、のトリプ
シンペプチドT1およびT13は、LeIF の146
−150および58−62にそれぞれ盞圓するこずが
分る。これらの぀の領域に芋出される実際の
DNAコヌド配列は、プラむマヌプヌルT1−
およびプラむマヌT13−に衚されるものであ
る衚をみよ。  成熟癜血球むンタプロンLeIFAの盎
接発珟  䞀般的既述 LeIF を成熟むンタプロンポリペプチ
ドずしお盎接に発珟させるための操䜜は、合
成−末端および盞補的DNAの組合せ
を包含する点でヒト生長ホルモンに甚いられ
た方法ゎデル Goeddel等、ネヌチダ
Nature281、544−548〔1979〕の䞀倉圢で
ある。 第図に瀺すように、Sau  制勀゚
ンドヌクレアヌれ郚䜍は、䟿宜なこずに、
LeIF のコドンおよびずのあいだに存
圚する。ATG翻蚳開始コドンを含有し、ア
ミノ酞システむンに察するコドンを修
埩し、EcoR粘着末端を新しく䜜補するこ
ずを包含する、぀の合成デオキシオリゎヌ
クレオチドをデザむンした。これらのオリゎ
マヌは、pL31の34b.p.Sau 3a−Ava断片
に連結した。生ずる45b.p.生成物は぀の远
加のDNA断片に連結させ、865b.p.合成−倩
然雑皮遺䌝子ずした。これは、LeIF をコ
ヌドし、EcoRおよびPst 制限郚䜍によ
りはさたれおいる。この遺䌝子は、EcoR
およびPst 郚䜍のあいだにおいお、
PBR322に挿入し、プラスミドpLeIF Alず
した。  トリプトフアン調節芁玠E.Coli trpプロ
モヌタヌ、オペレヌタヌおよびtrpリヌダヌ
リボゟヌム結合郚䜍を含有するが翻蚳開始の
ためのATG配列を欠劂するの構築 プラスミドpGMIATCC 31622は、欠
倱ΔLE 1413を含有するE.Coliトリプトフア
ンオペロンを担うミオザリMiozzari
等、ゞ゚むバクテリオロゞむJ.
Bacteriology133、1457−1466〔1978〕。
それゆえに、trpリヌダヌの最初の個のア
ミノ酞そしおtrp ポリペプチドのおよそ最
埌の1/3以降、あわせおLE′ず称するな
らびにtrp ポリペプチドの党䜓を含有する
融合蛋癜質を発珟する。これはすべおtrpプ
ロモヌタヌ−オペレヌタヌシステムの調節䞋
にある。プラスミドpGM1の代りに容易に入
手可胜なその他の同等のtrpプロモヌタヌ
たずえば、Bennett.J.Mol.Biol1978121、
113−137の135頁Fig.10参照を甚いおもよ
い。このプラスミド20Όを制限酵玠Pvu
で消化した。これは、プラスミドを個の
郚䜍においお切断する。この遺䌝子断片は぀
いでEcoRリンカヌ
pCATGAATTCATGの自己盞補性のオリ
ゎヌクレオチドより成立぀ず結合させ、あ
ずから、EcoR郚䜍含有プラスミド䞭にク
ロヌン化するためのEcoR切断郚䜍ずする。
pGMlより埗られるDNA断片の20Όを、
200pmoleの5′−リン酞化合成オリゎヌクレ
オチドpCATGAATTCATGの存圚で、
20ÎŒlT4DNAリガヌれ緩衝液20 Tris
PH7.6、0.5 ATP、10 MgCl2、
ゞチオスレむトヌル䞭で10単䜍
T4DNAリガヌれで℃䞀倜凊理した。溶液
は぀いで70℃で10分間加熱し、連結を停止さ
せた。リンカヌはEcoR消化で切断し、
EcoR末端を有する断片をパヌセントポ
リアクリルアミドゲル電気泳動以降PAGE
ず称するを甚いお分け、倧きい方の個の
断片を、゚チゞりムブロマむドでたず染色
し、玫倖線で断片の䜍眮を定め、ゲルより察
象ずなる郚分を切り取る方法で分離した。各
ゲル断片300ÎŒl0.1×TBEを透析バツグに
入れ、そしお、0.1×TBE緩衝液TBE緩衝
液は10.8のTris塩基、5.5のホり酞、0.09
のNa2EDTAをリツトルのH2O䞭に含
有䞭で100V1時間電気泳動した。透析バツ
グより氎溶液を採取し、プノヌル抜出、ク
ロロホルム抜出、0.2M塩化ナトリりム濃床
ずし、゚タノヌル沈殿埌氎䞭にDNAを採取
した。EcoR粘着末端を有するtrpプロモヌ
タヌ−オペレヌタヌ含有遺䌝子は、぀ぎに蚘
茉する操䜜で同定した。぀たり、テトラサむ
クリン感受性プラスミドに断片を挿入し、こ
れは、プロモヌタヌ−オペレヌタヌの挿入
で、テトラサむクリン抵抗性ずした。 プラスミドpBRHIATCC37070ロドリ
ゲズRodriguez等、ヌクレむツク アシ
ド リサヌチNucleic Acid Res.、
3267−3287〔1979〕は、アンピシリン抵抗性
を発珟しそしお、テトラサむクリン抵抗性遺
䌝子を含有する。しかし、それに組合わされ
たプロモヌタヌが存圚しないので、その抵抗
性を発珟しない。このプラスミドは埓぀おテ
トラサむクリン感受性である。このEcoR
郚䜍にプロモヌタヌ−オペレヌタヌシステム
を導入するこずにより、プラスミドをテトラ
サむクリン抵抗性ずなしうる。 pBRHIをEcoRで消化し、酵玠はプノ
ヌル抜出クロロホルム抜出で陀去し、゚タノ
ヌル沈殿させお氎䞭にうる。別々の反応混合
物䞭に存圚する生成DNA分子は、䞊蚘に埗
られた個のDNA断片のそれぞれず合䜵し、
そしお、前蚘のように、T4DNAリガヌれで
連結させた。反応混合物䞭に存圚するDNA
を甚いお、暙準方法ハヌシナフむヌルド
Hershfield等、プロクナトルアカド
サむ米囜Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.
71、3455−3459〔1974〕によりDNAずり蟌
み胜のあるE.coli −12æ ª294を圢質転換
し、この现菌を、20Όmlのアンピシリン
および5Όmlのテトラサむクリンを含有
するLBLuria−Bertaniプレヌトに接皮
した。いく぀かのテトラサむクリン抵抗性コ
ロニヌを遞び、プラスミドDNAを分離しそ
しお、望む断片の存圚を制限酵玠分析で確か
めた。生ずるプラスミドをpBRH trpず称す
る。 肝炎のりむルスゲノムのEcoRおよび
BamH消化生成物を垞法により採取し、
プラスミドpGH6ATCC31539のEcoR
およびBamH郚䜍にクロヌン化しこの
プラスミドpGH6は、GoeddelらのNature
281、5441979に瀺されおいるように、プ
ラスミドpKB268から単離された285塩基察
のEcoR断片同断片は、95塩基察の異皮
DNA断片を介圚させた぀のUV− lac
プロモヌタヌからなり、その構築方法は、
JohnsrudのProc.Natl.Acad.sic.USA、75
115314−53181978に蚘茉されおいる
を、プラスミドpBR322のEcoR郚䜍に挿
入するこずより構築される。なお、UV−
lacプロモヌタの塩基配列は、Dicksonら
のScience187、27−351975、Simpsonら
のCell18、277−2851979、Siebenlistらの
Cell20、269−2811980等に蚘茉されおお
り、公知である。〕、プラスミドpHS32ずす
る。プラスミドpHS32をXba で切断し、
プノヌル抜出し、クロロホルム抜出し、゚
タノヌル沈殿させた。沈殿は、0.1
dTTPおよび0.1 dCIPを含有する30ÎŒ
ポリメラヌれ緩衝液50リン酞カリりム
PH7.4、 MgCl2、 β−メル
カプト゚タノヌル䞭で、1ÎŒ E.coli
DNAポリメラヌれ、クレノヌKlenow断
片〔ベヌリンガヌ−マンハむム
Boehringer−Mannheim〕で、℃で30
分、぀いで37分で時間凊理した。この凊理
でXba 切断郚䜍の5′突出末端に盞補的な
44個のヌクレオチドのうちの個がみたされ
る。 5′ CTAGA− 5′ CTAGA− 3′ − TCT− ぀のヌクレオチドdCおよびdTが組蟌た
れお぀の突出する5′ヌクレオチドを有する
末端を䞎える。プラスミドpHS32プノヌ
ルおよびクロロホルム抜出埌゚タノヌル沈殿
させお氎に取るのこの盎鎖残基を、EcoR
で切断した。倧型プラスミド断片を、
PAGEで、より小さいEcoR−Xba 断
片より分け、電気溶出により分離した。
pHS320.2ΌよりのこのDNA断片は、䞊
蚘に類䌌の条件で、pBRH trpに由来するト
リプトフアンオペロン玄0.01ΌのEcoR
−Taq 断片に連結した。 䞊蚘のpHS32の断片をEcoR−Taq
断片に連結するこの方法においお、完党なワ
ト゜ン−クリツク塩基察ではないけれども、
Taq の突出する末端をXba の残存す
る突出末端に連結する。 − CTAGA− −TCTAGA−  → −AGC TCT− −ASCTCT− この連結反応混合物の郚はE.coli294现
胞の倉換に甚い、熱凊理し、アンピシリン含
有LBプレヌト䞭に塗垃した。24個のコロニ
ヌを遞択し、mlLBLuria−Bertani䞭
で発育させ、プラスミドを分離した。これら
のコロニヌのうちの個が、E.coliによる
DNA修埩および耇補により再生されたXba
郚䜍を有するこずが分぀た。 −TCHAGA− −TCTAGA− → −AGCTCT− −AGATCT− これらのプラスミドは、EcoRおよび
Hpa の䞡方で切断されお、期埅される制
限断片を䞎えるこずも分぀た。PTrp14ず称
するひず぀のプラスミドを、぀ぎに論議する
ように異質のポリペプチドを発珟さすのに甚
いた。 プラスミドpHGH107ATCC31538この
プラスミドpHGH107は、Goeddelらの
Nature281、5441979に蚘茉の方法䟋え
ば同文献のFig.4参照により、前述のpGH
のlacプロモヌタヌの䞋流にヒト成長ホル
モンをコヌドするDNA断片を挿入しお構築
される。は、合成DNA断片より生成された
23個のアミノ酞コドンおよびヒト生長ホルモ
ンメツセンゞダヌRNAの逆転写で生成され
る盞補的DNAより埗られる163個のアミノ酞
コドンより成立぀ヒト生長ホルモンに察する
遺䌝子を含んでいる。この遺䌝子は、ヒト生
長ホルモンの“先行”配列のコドンを欠劂す
るけれども、ATG翻蚳開始コドンを含有す
る。この遺䌝子は、10ÎŒpHGH107より、
EcoR凊理、それに続く、䞊蚘のようなE.
coli DNAポリメラヌれクレノヌ
Klenow以䞋Klenowで瀺す断片およ
びdTTPおよびdATP凊理を経お分離した。
プノヌルおよびクロロホルム抜出のあず゚
タノヌル沈殿させたプラスミドをBamHIで
凊理した。 ヒト生長ホルモンHGH遺䌝子含有断
片は、PAGE、぀づいお電気溶出により分離
した。生ずるDNA断片は、テトラサむクリ
ンプロモヌタヌ−オペレヌタヌシステムを欠
劂するが、テトラサむクリン抵抗性構造遺䌝
子の最初の350個のヌクレオチドをも含有す
るので、匕き぀づき発珟プラスミド䞭にクロ
ヌン化したずきに、その挿入物を含有するプ
ラスミドは、テトラサむクリン抵抗性の回埩
により芋定め埗る。断片のEcoR末端は、
Klenowポリメラヌれ法でみたされおある
ので、この断片は、ひず぀の平滑末端
blunt endおよびひず぀の粘着末端を有す
る。それで、あずから発珟プラスミドに挿入
されおも正しい配向が確実になる。 発珟プラスミドpTrp14を、぀いで、䞊蚘
調補のHGH遺䌝子含有断片を受け入れるよ
うに調補した。すなわち、pTrp14をXba
消化し、生ずる粘着性末端を、dATP、
dTTP、dGTPおよびdCTPを甚いる
Klenowポリメラヌれ法でみたした。プ
ノヌルおよびクロロホルム抜出および゚タノ
ヌル沈殿のあず、生ずるDNAはBam HIで
凊理し、生ずる倧型プラスミド断片をPAGE
および電気溶出で分離した。pTrp14由来の
断片は個の平滑末端および個の粘着末端
を有し、前蚘したHGH遺䌝子含有断片ず正
しい配向で再結合するこずを可胜ずした。 HGH遺䌝子断片ずpTrp14ΔXba−Bam
HI断片ずは、䞊蚘ず類䌌の条件で、合䜵し
盞互に連結した。みたされたXba および
EcoR末端は、平滑末端による連結で、
Xba 郚䜍およびEcoR郚䜍の䞡方を再
構成した。 【衚】 この構築はたたテトラサむクリン抵抗性遺
䌝子をも創出する。プラスミドpHGH107
は、HGH遺䌝子より䞊流に存圚するプロモ
ヌタヌlacプロモヌタヌよりテトラサむ
クリン抵抗性を発珟するので、pHGH207ず
称するこの構築は、トリプトフアンプロモヌ
タヌ−オペレヌタヌの調節䞋でのテトラサむ
クリン抵抗性遺䌝子の発珟を可胜ずする。぀
いで、連結混合物でE.coli294を転換し、5ÎŒ
mlのテトラサむクリンを含有するLBプ
レヌト䞊でコロニヌを遞択した。 プラスミドpHGH207はEcoR消化し、
trpプロモヌタヌ−オペレヌタヌおよびtrpリ
ヌダヌリボゟヌム結合郚䜍を含有するが翻蚳
開始のためのATG配列を欠劂する300b.p.断
片を、PAGEそれに぀づく電気溶出で採取し
た。このDNA断片はpLeIF のEcoR郚
䜍にクロヌン化した。䞊蚘の倉型trpレギナ
ロンregulon発珟レベルを高めるように
調節するためにアテニナ゚ヌタ配列を欠倱さ
せたE.coli trpオペロンを含有する発珟プ
ラスミドは、プロモヌタヌ−オペレヌタヌシ
ステムを抑制するのに十分量のトリプトフア
ン添加培地にあらかじめ定めたレベルたで発
育させうる。぀いで、トリプトフアンを陀去
しシステムの抑制を陀けば、目的ずする生成
物が発珟されうる。 より具䜓的に瀺すず、第図を参照にし
お、250Όのプラスミドpl31をPst で消
化し、1000b.p.の挿入物をポリアクリル
アミドゲル䞊のゲル電気泳動で分離した。玄
40Όの挿入物をゲルより電気溶出し、぀
に分けお、぀ぎのようにさらに消化した。(a)
この断片の16Ό詊料を、37℃で45分間Bgl
の40単䜍で郚分的に消化し、反応混合物
はポリアクリルアミドゲル䞊で粟補し
た。望む670b.p.の断片玄2Όを採取した。
(b)1000b.p.Pst 挿入物の別の詊料8Ό
をAva およびBgl で消化した。ゲル
電気泳動のあずに、䞊蚘の150b.p.の断片1ÎŒ
を埗た。(c)1000b.p.片の16ΌををSau 3a
およびAva で凊理した。10ポリアクリ
ルアミドゲル䞊で電気泳動したあず、玄
0.25Ό10pmoleの34b.p.断片を埗た。
぀の瀺したデオキシオリゎヌクレオチド、
5′−dAATTCATGTGT断片および
5′−dGATCACACATG断片はホスホ
トリ゚ステル法で合成した。断片は぀ぎの
ようにリン酞化した。200Ό玄40pmole
のγ32PATPアメルシダム
Amershem、5000Cimoleを也燥し、
60のTris−HClPH、10の
MgCl2、15Mβ−メリカプト゚タノヌルよ
り成立぀、100pmoleのDNA断片および単
䜍のTdポリヌクレオチドキナヌれ含有液30ÎŒ
に再懞濁した。37℃で15分埌、1Όの10
のATPを添加し、反応はさらに15分進
行させた。混合物は぀いで70℃で15分加熱
し、100pmoleの5′−OH断片および
10pmoleの34b.p.Sau 3a Ava 断片を合
䜵した。20 Tris−HClPH7.5、10
 MgCl2、10ゞチオスレむトヌル、
0.5 ATPおよび10単䜍T4DNAリガヌ
れの50Ό䞭で時間℃で連結させた。混
合物はポリアクリルアミドゲル䞊で電気
泳動し、45b.p.生成物を電気溶出で採取し
た。45b.p.生成物の30n1pmoleを、
150b.p.Ava −Bgl 断片の0.5Ό
5pmoleおよび670b.p.Bgl −Pst
断片の1Ό2pmoleず合䜵した。20単䜍
のT4DNAリガヌれを甚いお20℃16時間連結
凊理した。65℃で10分間加熱しおリガヌれを
䞍掻化した。混合物はEcoRおよびPst
で消化しお遺䌝子の重合䜓を陀去した。混合
物はPAGEで粟補した。玄20n
0.04pmoleの865b.p.生成物を分離した。
これの半分10nを、pBR3220.3Ό
のEcoRおよびPst 郚䜍のあいだに挿入
した。E.coli294を圢質転換するず70個のテ
トラサむクリン抵抗性、アンビシリン感受性
の転換株を䞎えた。これらのうちの18個から
プラスミドDNAを分離し、EcoRおよび
Pst で消化した。18個のプラスミドのう
ち、16個が865b.p.長のEcoR−Pst 断
片を有した。これらのうちのひず぀pLeIF
Alの1ΌをEcoRで消化し、E.coli trpプ
ロモヌタヌおよびtrpリヌダヌリボゟヌム結
合郚䜍を有する、䞊蚘補造のような300b.p.
EcoR断片0.1Όに連結させた。trpプ
ロモヌタヌを含有する転換物は、グラステむ
ン−ホグネスGrunstein−Hognessコロ
ニヌスクリヌニング法ず組合わせお、 32P−
trpプロヌブを甚いお同定した。trp断片䞭の
非察称的に䜍眮しおいるXba 郚䜍は、
trpプロモヌタヌが、LeIF 遺䌝子の方向
に配向しおいる、組換え生成物の同定を可胜
ずした。  LeIF のむンビトロおよびむンビボ掻性 IF分析のための抜出物を぀ぎのように調補
した。培逊物のmlを5Όmlのテトラサむ
クリンを含有するブロス䞭で発育させ、A550
倀を玄1.0ずし、぀いで、5Όmlのテトラサ
むクリンを含有するM9培地25ml䞭に垌釈した。
A550が1.0に達した時に10mlの詊料を遠心採取
し、现胞塊を、15スクロヌス、50
Tris−HClPH8.0、50 EDTAのmläž­
に懞濁させた。mgのリゟチヌムを添加し、
℃分のあず、现胞は超音波凊理で砎壊した。
詊料は10分間15000rpmで遠心し、䞊枅䞭
のむンタプロ掻性を、现胞倉性効果CPE
の阻止分析により、暙準LeIFず比范しお枬定
した。现胞あたりのIF分子数を枬定するため
には、×108単䜍mgのLeIF比掻性を甚い
た。 衚に瀺すように、trpプロモヌタヌを望む
配向に挿入したクロヌンpLeIF  trp25は高
い掻性2.5×108単䜍を瀺した。衚に
瀺すように、E.coli −12æ ª294pLeIF 
trp25の生成するIFは、ヒトLeIF暙品ず同様に
挙動した。PHでの凊理に察し安定で、りサギ
抗ヒト癜血球抗䜓により䞭和される。このむン
タプロンの芋かけの分子量は玄20000である。
クロヌンpLeIF  trp25はアメリカンタむプ
カルチダヌコレクシペンATCCに寄蚗され
おいる。 むンタプロンのむンビボでの効果には、マ
クロフアヌゞおよびナチナラルキラヌNK
现胞が必芁である。そしおむンビボでの䜜甚
は、これらの现胞の刺激を含むようにみえる。
それで、E.coli294pLeIF A25により生産さ
れるむンタプロンは、现胞培逊の分析では抗
りむルス掻性を有するが、感染動物では無効で
ある可胜性がある。さらに、现菌より生産され
た、非グリコシレヌト化LeIF のむンビボ・
抗りむルス䜜甚は、ヒト“バフむヌコヌト
buffy coat”癜血球に由来するグリコシレヌ
ト化LeIFずは異なるこずがありうる。それで
现菌により合成されたLeIF 玔床の
生物掻性を、スクむレルモンキヌリスザル
ぞの臎死量の脳心筋炎りむルスEMC感染
においお、バフむヌコヌトLeIF玔床ず
比范しおみた衚。 【衚】 【衚】 衚に蚘茉のE.coli294pLeIF  trp25
の抜出物mlあたり250000単䜍を、最小必須培地
で500倍垌釈し、500単䜍mlの比掻性ずした。
癜血球むンタプロン暙準〔ワドレむンスチチ
ナヌトWadley institute〕をあらかじめ
NIH癜血球むンタプロン暙準に察しお、タ
むタヌを求めお、やはり500Umlの最終濃床
に垌釈した。ml量を1NHClでPHずし、
℃で52時間むンキナベヌトし、NaOHを添加
䞭和し、IF掻性を暙準CPE阻止分析で枬定し
た。500単䜍ml詊料未凊理の25Ό分を
25Όのりサギ抗−ヒト癜血球むンタプロン
ず37℃で60分むンキナベヌトし、12000×で
分遠心し、䞊枅を分析した。 【衚】 サルはすべお雄平均䜓重713で、感染
前には、EMCりむルス抗䜓は有しない。サル
には、100×LD50EMCりむルスマりスで枬
定を筋肉内感染させた。察照感染サルは、感
染埌134、158、164時間に死亡した。106単䜍む
ンタプロン凊理は、感染前時間、感染埌
、23、29、48、72、168および240時間目に静
脈内投䞎した。现菌性癜血球むンタプロン
は、E.coli294pLeIF A25の融解物よりのカ
ラムクロマト分画で、比掻性7.4×106単䜍mg
蛋癜質であ぀た。察照现菌蛋癜質は、E.
coli294pBR322融解物よりの盞圓するカラム
分画で、倍の党蛋癜質量ずした。癜血球むン
タプロン暙準は、クロマトグラフむヌで、32
×106単䜍mg蛋癜質の比掻性に粟補した、正
垞のヒト“バツフむヌコヌト”现胞よりのセン
ダむSendaiりむルス誘導むンタプロン
であ぀た。 察照のサルは、序々に進行する昏睡、バラン
スの消倱、埌肢の匛緩、たひそしお死亡前時
間頃より開始する涙の流出を瀺した。むンタフ
゚ロン凊理サルは、これらの異垞はた぀たく瀺
さず、垞時掻動的で、りむルス血症による症状
を瀺さなか぀た。日たでりむルス血症を瀺さ
なか぀た察照䞭の頭のサルは、も぀ずも遅れ
お死んだ感染160時間埌、しかし、死埌、心
臓および脳に高タむタヌでりむルスを怜出し
た。むンタプロン投䞎サルは、感染埌14およ
び21日の怜査でEMCりむルスに察する抗䜓を
生成しなか぀た。これらの結果は、感染動物に
おけるLeIF調補物の抗りむルス効果は、むン
タプロンのみに垰せられうるこずを瀺す。理
由は、爜雑する蛋癜質は、现菌ずバツフむヌコ
ヌト調補物ではた぀たく異なるからである。さ
らに、これらの結果は、LeIF のむンビボ抗
りむルス掻性にグリコシル化が䞍芁であるこず
を瀺す。  その他の癜血球むンタプロンに察する
cDNAの分離 完党に特城づけられたLeIF  cDNA含有
プラスミドよりのDNAをPst で切断し、電
気泳動により分離し、 32pでラベルした。生ず
る攟射ラベルDNAをプロヌブに甚い、䞊蚘の
グランステむンGrunsteinおよびホグネス
Hognessのむンゞトり−コロニヌスクリヌ
ニング法により、䞊蚘項におけるず同様に埗
られた、远加のE.coli294の転換株をスクリヌ
ニングした。皮々の皋床にプロヌブにハむブリ
ド化したコロニヌを単離した。これらのコロニ
ヌからのプラスミドDNAおよび䞊蚘項に瀺
した10個のハむブリド化コロニヌからのプラス
ミドDNAを、Pst 切断により分離し、぀
の方法で特城づけた。第に、これらのPst断
片を、酵玠Bgl 、Pvu およびEcoRを
甚いる制限゚ンドヌクレアヌれ消化パタヌンで
特城づけた。この分析は、第図に瀺した、少
なくずも皮の異なる型LeIF 、LeIF 、
LeIF 、LeIF 、LeIF 、LeIF 、
LeIF およびLeIF の分類を可胜ずした。
これは、これたでに知られおいるLeIF の先
行配列およびコヌド配列に関する、皮々の制限
切断点のおおよその䜍眮を瀺しおいる。これら
のうちのひず぀LeIF は、ナガタNagata
等がネヌチダヌNature284、316−320
1980に報告したのず同じず信ぜられる。 第に、それらDNAのいく぀かに぀いお、
ポリ−含有KG−现胞RNAより、LeIF
mRNAを遞択的に陀去する胜力に぀いお、ク
リヌブランドCleveland等がセルCell
20、95−1051980に蚘茉したハむブリツド化
遞択分析により調べた。LeIF 、、およ
びはこの分析で陜性であ぀た。第に、これ
らのPst断片を発珟プラスミドに挿入し、E.
coli294をそのプラスミドで圢質転換し、断片
を発珟させた。プレむンタプロンず信ぜられ
る発珟生成物は、LeIF 断片がかろうじお陜
性以倖は、むンタプロン掻性に察するCPE
分析ですべお陜性であ぀た。䞊蚘に加えお、䞊
蚘のLeIF型のすべおに぀いお配列を定めた。  第の成熟癜血球むンタプロンLeIF
の盎接発珟 成熟LeIF に察する遺䌝子を含有する分離
断片の配列は、型およびの最初の14個のヌ
クレオチドが同じであるこずを瀺す。それで、
trp−プロモヌタヌ−オペレヌタヌ、リボゟヌ
ム結合郚䜍およびLeIF 遺䌝子の第
コドンを有する断片をpLeIF A25より分離
し、LeIF の発珟プラスミドを構築するため
に配列の残りの郚分ず結合させた。この堎
合、前蚘配列の残りの郚分はLeIF の第
のコドンから始たる。pL 第図に瀺した
LeIF  Pst末端遺䌝子を含有するプラスミ
ドのPst断片およびpLeIF A25の郚に察す
る顕著な制限地図を、第図および第図にそ
れぞれ瀺す。 第図の配列によりPst 断片に察しおお
およそ950b.p.のsau  −Pst 断片をう
るには、個たたは個より倚くの介圚する
Sau  制限郚䜍が存圚するので、単にPst
ずSau3aずを甚いお切断する方法は適甚でき
ずいく぀かの段階が必芁である。぀たり、぀ぎ
のようになる。 LeIF 発珟ベクタヌおよびこれを含む圢質
転換䜓の補造方法を以䞋に蚘茉する。  ぀ぎの断片を分離した。 (a) Sau  からEcoRたでの110bb.
p. (b) EcoRからXbaたでの132b.p. (c) XbaからPstたでの700b.p.  断片1aおよび1bを連結させXba
およびBglで切断しお、Sau  および
Xba末端を経由する自己重合を防いだ関連
するSau  郚䜍はBgl 郚䜍内にあ
り、Bgl 切断はSau  粘着性末端
を残した。242b.p.断片を分離した。  (2)および1cの生成物を連結させ、ふた
たび自己重合を防ぐために、Pst および
Bgl で切断した。Sau  からPst
たでの第図玄950b.p.断片を分離し
た。この断片は、LeIF に共通しおいな
い、LeIF 遺䌝子の郚分を含有した。  LeIF のtrpプロモヌタヌ−オペレヌタ
ヌ、リボゟヌム結合郚䜍、ATG開始シグナ
ルおよびシステむンコドンを含有する玄
300b.p.断片HindからSau  たで
を、pLeIF25より分離した。  Pst からHind たでの玄3600b.p.断
片をpBR322より分離した。レプリコンおよ
びテトラサむクリン抵抗性がコヌドされおい
るが、アンピシリン抵抗性は含有しない。  段階、およびで埗られた断片をトリ
プル連結し、生ずるプラスミドでE.coli 
−12æ ª294を転換した。 転換株はミニスクリヌニングバヌンボむム
Birnboim等、ヌクレむツク アシド リサ
ヌチNucleic Acids Res.、1513−1523
〔1979〕に凊し、プラスミド詊料はEcoRで
消化した。消化物は個の断片を䞎えたが、そ
れらの特城は、(1)EcoR−EcoR trpプロ
モヌタヌ断片(2)pL4の内郚EcoR−EcoR
断片およびpL4の蛋癜質翻蚳開始シグナ
ル−EcoR断片。 りむルスの现胞倉性効果に基づく慣甚の分析
方法であるCPE分析The Interferon
System、Springer−Verlag、WienAustria、
1979、pp17および18参照で、䞊蚘のように
調補したクロヌンより现菌抜出物は、代衚的に
は、A550で玄10×106単䜍のむンタフ
゚ロン掻性を䞎えた。このように調補されたひ
ず぀の代衚的なクロヌンは、E.coli294pLeIF
 trp7である。このクロヌンはATCCに寄蚗
されおいる。  さらに別の成熟癜血球むンタプロン
LeIF 、、、、およびの盎接
発珟 他のLeIFタむプを含有する远加の完党長遺
䌝子断片は、LeIF におけるず同様に、テむ
ラヌし発珟のための発珟ビヒクル䞭におきう
る。成熟LcIF の発珟のための、䞊蚘項に
蚘茉のようなアプロヌチ、぀たり、制限切断に
より先行配列を陀去し、先行配列陀去で倱なわ
れた−末端アミノ酞コドンを合成DNA断片
の連結でおき代えるずいう、䟿利な方法がずれ
るかどうかを決めうるよう、成熟むンタプロ
ンタむプの第のアミノ酞コドンに十分に近く
制限郚䜍が存圚するかどうかは、埓来法による
完党な配列決定から分るであろう。それがうた
くいかなければ、぀ぎの操䜜を甚いうる。芁す
るに、成熟ポリペプチドの第のアミノ酞に察
するコドンの開始する点より正確に前のずころ
で先行配列含有断片を切断する。぀たり  その点をずりたく領域内においお重鎖
DNAを重鎖DNAに倉える  段階(1)で生成した重鎖の領域に目的ずす
る切断郚䜍ず結合するヌクレオチドず反察偎
にプラむマヌの5′末端が䜍眮するようにし
お、重鎖DNAの盞補的なプラむマヌをハ
むブリド化する。  プラむマヌより3′の方向にある、段階で
陀かれた第の鎖の郚分を、アデニン、チミ
ン、グアニンおよびシトシン含有デオキシヌ
クレオチドトリホスプヌトの存圚での
DNAポリメラヌれを甚いる反応で恢埩させ
る。  切断しようずする点をこえお突出しおい
る、残存する重鎖DNAを消化する。 翻蚳開始シグナルATGを、コヌド鎖の3′末
端に有する短鎖長合成DNAを、぀いで、埗ら
れた成熟むンタプロンのために仕立䞊げられ
た遺䌝子に、たずえば平滑末端連結で連結し、
そしおこの遺䌝子を発珟プラスミドに挿入し、
プロモヌタヌおよびそれに組合わされたリボゟ
ヌム結合郚䜍による調節䞋におく。 䞊蚘の項で甚いたのず同様にしお、LeIF
およびLeIF をコヌドする遺䌝子断片を、
盎接的现菌による発珟のために適圓に配列し
た。これらの远加の癜血球むンタプロンの発
珟のための戊略ずしお、それぞれの堎合に぀い
お、pLeIF A25よりのLeIF のtrpプロモヌ
タヌ−オペレヌタヌ、リボゟヌム結合郚䜍、
ATG開始シグナルおよびシステむンコドンを
含有する、玄300b.p.の断片HindからSau
 たでを甚いる。これに察しお、すべお
に共通である最初のシステむンより向うの、そ
れぞれのアミノ酞配列をコヌドするその他のむ
ンタプロン遺䌝子よりの遺䌝子断片を結合す
る。埗られたそれぞれのプラスミドを甚いおE.
coRi −12æ ª294を転換した。それぞれの遺
䌝子を圢成するための結合は次のようである。 LeIF  pLeIF より次の断片を分離する (a) Sau  からSau 96たでの35b.p. (b) Sau 96からPst たでの900b.p. (c) 䞊蚘(4)項におけるように、pLeIF −
25より玄300b.p.の断片Hind−Sau 
を分離する。 (d) 䞊蚘(5)項の玄3600b.p.の断片を分離す
る。 構 築 (1) (a)および(c)を連結する。Bgl 、Hind
で切断し、玄335b.p.の生成物を分離する。 (2) (1)(b)(d)ずトリプル連結し、生ずるプラ
スミドでE.coliを転換する。 このように調補された代衚的なクロヌンはE.
coli −12æ ª294pLeIF Ctrp35である。こ
のクロヌンはATCCに寄蚗されおいる。 LeIF  pLeIF より぀ぎのように分離する (a) Sau  からAva たでの35b.p. (b) Ava よりBgl たでの150b.p. (c) Bgl よりPst たで玄700b.p. pLeIF A25より、぀ぎの断片を分離する (d) HindよりSau  たで300b.p. pBR322より぀ぎの断片を分離する (e) HindよりPst たで玄3600b.p. 構 築 (1) (a)(b)を連結し、Bgl で切断し、185b.
p.生成物(1)を粟補する。 (2) (1)(d)を連結し、Hind、Bgl で切断
し、そしお、玄500b.p.生成物(2)を粟補する。 (3) (2)(c)(e)を連結し、生ずるプラスミドで
E.coliを転換する。 このように調補された代衚的なクロヌンは、
E.coli −12æ ª294pLeIF  trp11である。
このクロヌンはATCCに寄蚗されおいる。 LeIF  LeIF を含有する断片は、LeIF および
LeIF のから13たでのアミノ酞が完党に盞
同であるこずを利甚する再構成で盎接的に発珟
するよう仕立䞊げるこずができる。䞊蚘の
pHGH207より、Pst およびXba 消化
を経由し、぀いで玄1050b.p.の断片を分離する
こずにより、適圓な配列末端を有するtrpプロ
モヌタヌ含有断片(a)をうる。第の断片(b)は、
プラスミドpHKY10のPst およびBgl
消化より生ずる断片の倧きい方ずしおうる。
このPst−Bgl断片はアンピシリン抵抗性
遺䌝子の䞀郚および組合されたプロモヌタ以倖
のテトラサむクリン抵抗性遺䌝子のすべおを含
有しおいる。埓぀お、プラスミドpHKY10を
甚いなくずも、その他の入手可胜なプラスミ
ド、たずえば、プラスミドpBR322ATCC
31344からもこの断片を調補するこずができ
る。断片(a)はアンピシリン抵抗性をコヌドす
る遺䌝子の玄半分を含有し断片(b)は、その遺
䌝子の残りを含有し、たた、組合わされたプロ
モヌタヌ以倖のテトラサむクリン抵抗性遺䌝子
のすべおを含有する。断片(a)および(b)はT4リ
ガヌれにより結合し、生成物を、Xba およ
びBgl で凊理しお、二量化がおこらぬよう
にし、trpプロモヌタヌ−オペレヌタヌおよび
テトラサむクリンおよびアンピシリン抵抗性の
遺䌝子を含有する断片(c)ずする。 箄580b.p.の断片(d)はpLeIF のAva お
よびBgl の消化で埗られる。これは、LeIF
の14から166たでのアミノ酞に察するコドン
を含有する。 断片(e)49b.p.は、pLeIF のXba お
よびAva 消化で埗られる。断片(e)はLeIF
のアミノ酞から13をコヌドする。 断片(c)、(d)および(e)は、T4リガヌれの存圚
で、トリプル連結する。それぞれ断片の接着末
端は、耇合プラスミドが正しく環状ずなり、テ
トラサむクリン抵抗性遺䌝子が成熟LeIF の
遺䌝子ずあわせお、trpプロモヌタヌ−オペレ
ヌタヌの調節䞋に入るようにな぀おおり、それ
で、望むプラスミドで転換した现菌は、テトラ
サむクリン含有プレヌト䞊で遞択しうる。この
ように調補された代衚的クロヌンは、E.coli
−12æ ª294pLeIF  trp1である。このク
ロヌンはATCCに寄蚗されおいる。 LeIF  完党LeIF 遺䌝子を、成熟癜血球むンタフ
゚ロンずしお発珟さすために、぀ぎのように配
列しうる。  プラスミドpLeIF をHae およびRsa
消化に凊しお、シグナルペプチドアミノ
酾10から3′非コヌド領域たでに及ぶ816b.p.断
片を分離する。  この断片を倉性し、DNAポリメラヌれ
のKlenow断片クレノヌKlenow等、
プロクナトルアカドサむ米囜
Proc、Natl.Acad.Sci.U.S.A.65、168
〔1970〕により、合成デオキシリボオリゎヌ
クレオチドプラむマヌ5′−dATG TGT
AAT CTG TCTを甚いお修耇合成に凊す
る。  埗られた生成物をSau  で切断し、
から150のアミノ酞を珟わす452b.p.断片を
分離する。  Sau  およびPst でpLeIF を
消化し、埗られた500b.p.断片を分離し、150
番目のアミノ酞からコヌド配列の最埌たでを
コヌドする遺䌝子をうる。  段階(3)および(4)で分離した断片を連結し
お、断片  166 mct cys asp 停止 ATG TGT ― GAT TGA−
−Pst
Sau   をうる。これはLeIF の166個のアミノ酞
をコヌドする。  pLeIF  trp25をXba で消化し、
DNAポリメラヌれを甚いお平滑末端ずし、
生成物をPst で消化する。埗られた倧型
断片を分離し、段階(5)の生成物ず連結させお
発珟プラスミドずしうる。これは、E.coli
−12æ ª294たたは他の宿䞻现菌の転換に甚
いお、成熟LeIF を発珟しうる。 LeIF  ロヌンLawn等により構成されたヒトゲ
ノムのプヌスλ Charon 4A組換えラむブ
ラリヌセルCell、15、11571978を、
䞊蚘匕甚のロヌンLawn等の方法およびマ
ニアチスManiatis等、セルCell15、
6871978の方法により、癜血球むンタプロ
ンに関しおスクリヌニングした。cDNAクロヌ
ンLeIF に由来する攟射性LeIFプロヌブを甚
いお、玄500000個のプラヌクをスクリヌニング
した。個のLeIFゲノムクロヌンを遞び出し
た。再スクリヌニングおよびプラヌク粟補に぀
づいお、これらのクロヌンのうちのひず぀
λHLeIF を遞びさらに分析した。 䞊蚘の方法を甚いお、他のプロヌブも、ヒト
ゲノムからその他のLeIFクロヌンを分離する
のに有利に甚いうる。぀いで、これらは、本発
明によるその他の癜血球むンタプロン蛋癜質
を補造するのに甚いうる。  クロヌンλHLeIF の2000b.p.EcoR断
片を、EcoR郚䜍においお、pBR325䞭ぞ、
サブクロヌン化した。埗られたプラスミド
LeIF をEcoRで切断し、2000b.p.断片を
分離した。この2000b.p.EcoR断片にデオ
キシオリゎヌクレオチドdAATTCTGCAG
EcoR−Pst コンバヌタヌを連結し
た。埗られた生成物をPst で切断し、Pst
末端を有する2000b.p.断片ずした。これ
をSau 96で切断した。ひず぀のPst およ
びひず぀のSau 96末端を有する1100b.p.断片
を分離した。  プラスミドpLeIF  trp 35をPst お
よびXba で消化した。倧型断片を分離し
た。  pLeIF  trp 35よりの小型Xba −
Pst 断片をXba およびSau 96で消化
した。40b.p.Xba −Sau 96断片を分離し
た。  段階(1)、(2)および(3)より分離した断片を連
結しお、pLeIF  trp1発珟プラスミドず
した。このクロヌンはATCCに寄蚗されおい
る。 LeIF   プラスミドpLeIF は、LeIF 遺䌝子
配列を含有するヒトゲノムDNAの3.8キロベ
ヌスHind断片を含有する。このプラスミ
ドから760b.p.Dde −Rsa 断片を分離
した。  プラスミドpLeIF  trp をHindお
よびDde で切断し、340b.p.Hind−
Dde 断片を分離した。  プラスミドpBR322をPst で切断し、
DNAポリメラヌれずむンキナベヌトし、
平滑末端ずし、Klenow断片、぀いでHind
で消化した。倧型玄3600b.p.断片を分
離した。  段階(1)、(2)および(3)で分離した断片を連結
しお、発珟プラスミドpLeIF  trp ず
した。このクロヌンはATCCに寄蚗されおい
る。  粟補 现菌抜出物䞭の癜血球むンタプロン含有量
は、぀ぎのようにしお、増加させうる。  ポリ゚チレン−むミン沈殿。ここで、むン
タプロンを含めた现胞蛋癜質の倧郚分は䞊
枅に留たる。  硫酞アンモニりム分画。ここで、むンタフ
゚ロンは、55飜和硫酞アンモニりムの溶液
䞭から析出する。  硫酞アンモニりムペレツトを0.06Mリン酞
カリりム、10 Tris−HCl、PH7.2に懞
濁させ、25 Tris−HCl、PH7.9に察し
お透析する。むンタプロン掻性は溶液䞭に
残る。  䞊蚘の䞊枅をPH8.5に調敎しおDEAE−セ
ルロヌスカラムでクロマトグラフむヌを行う
25 Tris−HCl、PH8.5䞭から0.2M
NaClの盎線募配で溶出。  チバクロム−ブルヌ−アガロヌス
Cibachrome Blue−Agaroseたたはヒド
ロキシルアパタむトhydroxylapatiteに
吞着させ、1.5MKClたたは0.2Mリン酞塩で
溶出する必芁により実斜。  セフアデツクスSephadex −75カ
ラムで分子をサむズ分けする。  PH5.0の25酢酞アンモニりム䞭CM−セ
ルロヌズ䞊陜むオン亀換クロマトグラフむヌ
を行う。酢酞アンモニりム募配0.2M酢酞
アンモニりムたでで展開する。 䞊蚘の方法で95玔床の生成物を埗る。 この物質はたた、サむズ排斥クロマトグラフ
むヌ、逆盞RP−高圧液䜓クロマトグラ
フむヌ、たたは固定化抗むンタプロン抗䜓䞊
のアフむニテむクロマトグラフむヌで粟補しう
る。 別法ずしお、䞊蚘の段階よりの物質をミル
ステむンMilstein、サむ゚ンテむフむツク
アメリカンScientific American243、66
1980蚘茉のように調敎したモノクロカレ抗
䜓カラムに加え、0.2M酢酞、0.1トリトン
Tritonおよび0.15MNaClで溶出しうる。 別様の有利な具䜓䟋ずしお、䞊蚘操䜜で補造
した癜血球むンタプロンを぀ぎの段階で粟補
しうる。  発珟された癜血球むンタプロンを含有す
る凍結现胞塊を、手䜜業たたは適圓な粉砕装
眮で砕く。郚分的にずけた现胞を、PH7.5−
8.0に調敎した0.1M Tris、10
スクロヌス、0.2MNaCl、 EDTA、
0.1 PMSFおよび10−100 MgCl2
含有緩衝液の容量䞭に懞濁させる。懞濁
液は玄℃に保぀。 懞濁液は、玄6000psiでホモゞナむザヌを
通し、぀いで、1000psi以䞋で床目を通す。
䞡方の通過よりのホモゞナむザヌからの流出
液は、氷济䞭で冷华する。  ホモゞネヌトにポリ゚チレン−むミンをゆ
぀くりず添加しお、玄0.35濃床ずし、玄30
分攟眮する。固型物は遠心たたは濟過で陀去
する。この段階は、枩床を調節するかたた
は、䞊枅濟液を10℃より䜎く保぀ように
十分にすみやかに実斜する。䞊枅濟液を
限倖濟過で濃瞮しお、もずの容量の玄1/10ず
する。粒状物たたはにごりを認めたら、ミク
ロポアメンブレンのような適圓なフむルタヌ
で陀去しうる。  柄明化溶液は、−cm時間たずえ
ば、盎埄2.6cmのカラムで、25−40ml時間
でモノクロナル抗䜓カラムに盎接流す。぀い
でこのカラムを玄10カラム容量の20
Tris−HCl、PH7.5−8.5NaCl0.5Mおよ
びトリトンTriton−1000.2たた
は同等の衚面掻性剀含有で掗う。掗぀たあ
ず、このカラムに0.15MNaClおよびトリト
ンTriton−1000.1たたは同等の
衚面掻性剀を含有する玄10カラム容量の溶液
を通す。このカラムをトリトンTriton
−1000.1たたは同等の衚面掻性剀を
含有する0.2M酢酞お溶出する。モノクロナ
ル抗䜓カラムよりの蛋癜質ピヌクUV吞収
たたはその他の方法で枬定を集め、1N
NaOHたたは1.0M Tris塩基でPHを玄4.5に
調敎する。  プヌルされたむンタプロンピヌクを、適
圓な緩衝液たずえば酢酞アンモニりムPH4.5
50で平衡させたホワツトマン
WhatmanCM52セルロヌスたたは同等の
陜むオン亀換䜓に加える。加えたあず、カラ
ムを平衡のための緩衝液で掗い、流出液の
UV吞収がたいらずなるに至らせ、カラムか
らはほずんど蛋癜質が溶出しない状態ずす
る。カラムを぀いで、25酢酞アンモニり
ム0.12M塩化ナトリりムたたはむンタプ
ロンの回収を最高ずする組合わせで溶出し、
満足な倖芳および溶解性を有する凍結也燥ケ
ヌキずする。 䞊蚘したこの有利な具䜓䟋におけるモノクロ
ナル抗䜓は、ストヌヘリンStaehelin等が
プロクナトルアカドサむ米囜Proc、
Natl.Acad.Sci.U.S.A.78、1848−521981
に蚘茉した方法で調補しうる。モノクロナル抗
䜓は、䞋蚘するように、粟補し、アフむゲル
Affigel−10に共有結合させる。 腹氎液よりのモノクロナル抗䜓の調補および粟
補 雌Balbマりス頭のそれぞれに、察数
増殖期の䞭間でず぀たハむブリドヌマ
hybridoma现胞の−10×106個を接皮し
た。マりスの生成する腹氎液から埗た玄×
106個の生育しうる现胞を、10たたは10頭より
倚くのマりスのそれそれに腹腔内接皮した。こ
の腹氎液を各マりスより反埩から回採
取した。ひず぀の矀のマりスから぀ぎの矀のマ
りスに、回たで、移しかえおよび採取を行な
぀た。それぞれの移しかえ毎に、採取腹氎液を
プヌルした。 䜎速遠心500−1000×で15分間凊理し、
腹氎液より现胞および残枣を陀いた。぀いで
18000rpmで90分遠心した。䞊枅を凍結させマ
むナス20℃に貯蔵した。融解させおから、
35000rpmで90分間遠心し、さらにフむブリン
および粒状物を陀いた。各移しかえごずの腹氎
液のバツチに぀いお、固䜓盞抗䜓結合詊隓ス
トヌヘリンStaehelin等、䞊蚘匕甚文献
により特異抗䜓掻性を詊隓し、満足ならばプヌ
ルした。 プヌルされた溶液䞭の蛋癜質濃床は、mgの
蛋癜質が1.0cmの厚さのキナベツトで280nで
1.2の吞光倀を瀺すずいう近䌌法で枬定した。
高濃床の抗䜓を有する腹氎液は30−35mg蛋癜
質mlを含有する。これは、−mg特異抗
䜓mlに盞圓する。この液䜓をPBS0.01Mリ
ン酞ナトリりム、PH7.3、0.15M NaClで垌釈
し、10から12mgmlの蛋癜質濃床ずした。 垌釈溶液の各100mlに、宀枩で飜和した硫酞
アンモニりム溶液90mlを、℃ではげしくかく
はんしながら添加した。懞濁液を40から60分間
氷䞭に保぀た。぀いで、℃で、10000rpmで
15分遠心した。䞊枅をけいしやしお陀き、十分
に液を切぀た。蛋癜質塊を0.02M Tris HCl
PH7.90.04M NaCl緩衝液に溶解し
た。蛋癜質溶液を、100容量の緩衝液に察し
お、宀枩で16から18時間透析した。その間、少
なくずも床緩衝液を亀換した。透析溶液を
15000rpmで10分間遠心し、䞍溶物を陀いた。
腹氎䞭の党蛋癜質の最初の量の玄30から35
が、280nの吞光倀より抂算しお採取された。 次いで、mlに぀いお30−40mgの蛋癜質を含
有する溶液をバツフアヌBufferで平衡
させたDEAE−セルロヌスカラムに加えた。添
加する蛋癜質グラムに぀いお少なくずも100
mlのカラム床容量ずした。0.02M Tris HCl
PH7.9äž­NaClを0.04Mから0.5M NaCl濃床に盎
線状にNaCl濃床を倉化させお、カラムより抗
䜓を溶出した。0.06から0.1M NaClのピヌク分
画をプヌルし、等容量の硫酞アンモニりム飜和
溶液宀枩を加え沈殿遠心し、濃瞮した。蛋
癜質塊を0.2M NaHCO3PH箄8.00.3M
NaCl緩衝液に溶解し、宀枩で、同じ緩衝
液床亀換に察しお透析した。透析した溶
液を20000×で15分遠心し、䞍溶物を陀いた。
蛋癜質濃床を緩衝液で20から25mgmlずし
た。 免疫吞着剀の調補 アフむゲルAffigel−10〔バむオ ラドラ
ボラトリむス、リツチモンド、カリホルニア
Bio Rad Laboratories、Richmond、
Californiaをグラスフむルタヌ䞊で氷冷む゜
プロパノヌルで床掗い、぀いで氷冷蒞留氎で
床掗぀た。ゲルスラリヌ冷氎䞭玄50を
プラスチツクチナヌブに移し、短時間遠心しお
沈降させた。䞊枅をアスピレヌタヌで陀き、パ
ツクされたゲルを等容量の粟補抗䜓溶液ず混合
し、℃で時間、長軞が円状に廻転するよう
に回転した。反応埌、ゲルを遠心し、緩衝液
0.1M NaHCO30.15M NaClで床掗い、
非結合抗䜓を陀いた。掗液を合䜵し蛋癜質を枬
定するず、90以䞊の抗䜓がゲルに結合しおい
た。 未反応の郚分をふさぐために、ゲルを等容量
の0.1M゚タノヌルアミン・HClPHず混合
し、長軞を円こ状に回転させお宀枩で60分凊理
した。ゲルスラリヌよりPBSで掗浄しお反応
剀を陀き、℃で0.02のアゞ化ナ
トリりムの存圚でPBSに貯蔵した。  非経口投䞎 LeIFは、抗腫瘍たたは抗りむルス治療を芁
する患者に非経口投䞎しうる。たた、免疫抑制
状態を瀺す患者にも投䞎しうる。投䞎量および
投䞎割合は、ヒト由来の物質に぀いお珟圚臚床
的に行なわれおいるのず同様にする。たずえ
ば、玄−10×106単䜍日でより倧の
玔床の堎合には、たずえば×107単䜍日に
及びうる。 非経口投䞎甚の圢態ずした本質的に均䞀な现
菌性LeIFの適圓な投䞎圢態では、たずえば、
×108単䜍mgの比掻性のLeIF3mgを25mlの
5Nヒト血枅アルブミンに溶解し、この溶液を
生物孊的フむルタヌを通し、濟過溶液を無菌的
に100本のびんに分けお、非経口投䞎に適圓な
ように、本が×106単䜍玔むンタプロン
を含有するようにする。これらのびんは、䜿甚
前は冷所−20℃に保぀のが望たしい。 本発明の化合物は、医療ずしお有甚な組成物を
調補するための既知の方法に埓぀お補剀化でき
る。その際、このポリペプチドは、医薬ずしお蚱
容されうる担䜓ビヒクルず混合する。適圓なビヒ
クルおよびそれらの補剀化に぀いおは、マヌチン
E.W.Martinによるレミントンズ フアヌマセ
りチカル サむ゚ンスRemington′s
Pharmaceutical Sciencesに蚘茉されおいるず
おりである。これを、本明现曞の参考文献ずしお
匕甚する。これらの組成物では、むンタプロン
蛋癜質の有効量ず適圓な量のビヒクルずをあわせ
お、宿䞻に察しお効果的な投䞎ずするに適圓な、
医薬ずしお蚱容されうる組成物ずする。ひず぀の
有利な投䞎圢態は非経口投䞎である。
【図面の簡単な説明】
第図は可胜性のあるLeIFプラスミドず 32p
ラベル合成デオキシオリゎヌクレオチドずのハむ
ブリド化を瀺すオヌトラゞオグラムである。第
図は、LeIFクロヌン化cDNAの個の型か
らたでの制限゚ンドヌクレアヌれ地図を瀺
す。第図は、成熟LeIF の盎接的埮生物合成
をコヌドする遺䌝子の構築を瀺す。第図および
第図はLeIF 成熟癜血球むンタ−プロンを
発珟するために甚いられる぀の遺䌝子断片の制
限地図を瀺す。

Claims (1)

  1. 【特蚱請求の範囲】  ヒト癜血球由来の遺䌝子の発珟により埗るこ
    ずができる成熟ヒト癜血球むンタプロンであ぀
    お、165−166個のアミノ酞を有し、郚分アミノ酞
    配列Cys−Ala−Trp−Glu−Val−Val−Arg−
    Ala−Glu−Ile−Met−Arg−Serを含み、か぀
    114䜍にアミノ酞Asp、GluたたはValの䞀぀を有
    し、このむンタプロンの第䞀番目のアミノ酞の
    末端にメチオニンが結合しおいる堎合は、166
    −167個のアミノ酞を有し、か぀115䜍にアミノ酞
    Asp、GluたたはValの䞀぀を有する成熟ヒト癜
    血球むンタプロンの補造にあたり、 (a)(i) 該成熟ヒト癜血球むンタプロンのコヌド
    領域を含む遺䌝子を該コヌド領域内の末端近
    くに䜍眮する制限酵玠切断郚䜍で切断し、該
    コヌド領域の5′−末端偎を陀いた遺䌝子制限
    断片を埗る工皋、 (ii) ATG翻蚳開始コドンを有し、該コドンに
    連続する塩基配列が前蚘工皋(i)で陀かれた
    5′−末端偎のコヌド領域ず同じアミノ酞配列
    をコヌドするDNA断片を調補する工皋、 (iii) 該遺䌝子制限断片ず該DNA断片ずを連結
    し、ATG翻蚳開始コドンに連なる該成熟ヒ
    ト癜血球むンタプロンコヌド領域を有する
    遺䌝子を構築する工皋、及び、 (iv) 該遺䌝子ず遺䌝子発珟調節因子ず自己耇補
    に䞍可欠な領域oriずを連結する工皋 を組合せお埮生物発珟ビヒクルを構築し、 (b) 䞊蚘工皋(a)で埗た埮生物発珟ビヒクルで公知
    方法により埮生物を圢質転換し、 (c) 埗られた圢質転換埮生物を培地䞭で発育さ
    せ、 (d) この圢質転換埮生物を溶解し、成熟ヒト癜血
    球むンタプロンをその他の埮生物蛋癜質から
    分離粟補するこずにより採取する こずを特城ずする成熟ヒト癜血球むンタ゚ロンの
    補造方法。  成熟ヒト癜血球むンタプロンが成熟ヒト癜
    血球むンタプロンLeIF である特蚱請
    求の範囲第項の補造方法。  成熟ヒト癜血球むンタプロンが成熟ヒト癜
    血球むンタプロンLeIF である特蚱請
    求の範囲第項の補造方法。  成熟ヒト癜血球むンタプロンが成熟ヒト癜
    血球むンタプロンLeIF である特蚱請
    求の範囲第項の補造方法。  成熟ヒト癜血球むンタプロンが成熟ヒト癜
    血球むンタプロンLeIF である特蚱請
    求の範囲第項の補造方法。  成熟ヒト癜血球むンタプロンが成熟ヒト癜
    血球むンタプロンLeIF である特蚱請
    求の範囲第項の補造方法。  成熟ヒト癜血球むンタプロンが成熟ヒト癜
    血球むンタプロンLeIF である特蚱請
    求の範囲第項の補造方法。  成熟ヒト癜血球むンタプロンが成熟ヒト癜
    血球むンタプロンLeIF である特蚱請
    求の範囲第項の補造方法。  成熟ヒト癜血球むンタプロンが成熟ヒト癜
    血球むンタプロンLeIF である特蚱請
    求の範囲第項の補造方法。  埮生物がE.coliである特蚱請求の範囲第
    〜項のいずれか䞀぀の補造方法。
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