JPS62100292A - バチラス・チユリンゲンシス・アイザワイｉｐｌ株の殺虫性蛋白遺伝子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、鱗翅目昆虫であるコナガおよびハスモンヨト
ウに対し強い殺虫活性を示すバチラス・チュリンゲンシ
ス・アイザワイＩＰＬ株の殺虫性蛋白遺伝子、それを含
むプラスミドおよび該プラスミドを保持する微生物に関
する。

一般に、ハチラス・チュリンゲンシスの各種菌株は、胞
子形成期に殺虫活性蛋白からなる１〜２μｍにおよぶ結
晶を形成し、この結晶蛋白を摂取した昆虫は、摂食活動
を停止し、腸管破裂等ののち、死に至ることが知られて
いる。　へテラス・チュリンゲンシス株は、鞭毛抗原や
エステラーゼ活性などにより２９亜種に分類されており
、各々の菌株は特異的、かつそれぞれ、異なる殺虫活性
をしめす。

本発明者ら、鱗翅目昆虫のなかでも野菜の害虫であるコ
ナガおよびハスモンヨトウに対し強い殺虫活性を示す公
知の菌バチラス・チュリンゲンシス・アイザワイＩＰＬ
株の生産する殺虫活性蛋白を殺虫剤として利用すること
を目的として、研究を行い本発明を完成した。　即ち、
本発明者らは、コナガおよびハスモンヨトウに対し強い
殺虫活性を示すバチラス・チュリンゲンシス・アイザワ
イＩ　Ｐ　Ｌ株の生産する殺虫活性蛋白の遺伝子をクロ
ーン化した後、同遺伝子の構造遺伝子部分の３４６５塩
基の全配列を決定し、殺虫性蛋白の一次構造を解明した
。

本発明のバチラス・チュリンゲンシス・アイザワイＩＰ
Ｌ株の殺虫性蛋白遺伝子は、図２に記載した塩基配列お
よびアミノ酸配列で特定される。

本発明の殺虫性蛋白遺伝子を含むブ）スミ１′は、ハチ
ラス・チュリンゲンシス・ア・イザワイＩ　Ｉ）Ｌ株の
プラスミドＤＮＡから遺伝子ライブラリーを作製し、木
閏の類縁株であるハチラス・チュリンゲンシス・ＨＤ　
−１ダイベル株の殺虫性蛋白遺伝子の既知塩基配列から
作製した合成オリゴヌクレオチドをプローブとして用い
、このライブラリーをスクリーニングすることにより本
発明の殺虫性蛋白遺伝子を含むプラスミドを単離するこ
とにより得ることができる。　なお、この場合、本発明
の遺伝子を含む組換えプラスミドの作製は、ハチラス・
チュリ　ンゲンシス・アイザマノイＩＰＬ株から選抜し
た高い殺虫活性を示す了イザワ（ＩＰＬＮｏ、７株を用
いることにより有利に行うことができる。

本発明で得られた殺虫性蛋白遺伝子を大腸菌に導入し２
、それを培養することにより、殺虫性蛋白を大量生産さ
せることができる。　さらに、大腸菌の各種プロモータ
ーに同遺伝子を接続し、直接発現を行うことにより、殺
虫性蛋白を大腸菌の培養条件下で大量生産させることも
可能である。

また、大腸菌の宿主−ベクター系のみならず、枯草菌、
酵母、シュウトモナス菌あるいは放線菌等の宿主−ベク
ター系も利用可能であり、それぞれの宿主−ベクター系
の特徴を生かした殺虫性蛋白の大量生産が行える。

さらには、同遺伝子を微生物ではなく、植物体に導入す
ることにより、植物細胞内で殺虫性蛋白を発現させ、植
物体に害虫に対する抵抗性を賦与することも可能である
。

以下に実施例をを挙げ本発明を更に詳細に説明する。　
本発明は、以下の実施例のみに限定されるのもではなく
、本発明の技術分野に於ける通常＼、 実施例 ステップ１　バチラス・チュリンゲンシス・アイザワイ
ＵＰＩ、菌株の純化 アイザワイＩＰＬ株〔ユ・ニス・デパートメント　オブ
　アグリカルチャー　リサーチ　サービス（Ｕ、　Ｓ、
　Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏｆ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒ
ｅ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈＳｅｖｖｉｃｅ　）保管、本発明
者らは、東京農業工業大学工学部の姫野道夫教授より分
与された。〕をＰＹ平板培地（トリプトン（シグマ社）
１０　ｙ。

ＮａＣ１（牛丼化学）５ｆ、イーストエキストラクト（
シグマ社）５ｆ、および寒天（シグマ社）１２ｆを加え
１１とし、作製した　寒天培地。）上で純化し、得られ
た純化菌株８２＠につき、プラスミド解析を行った。各
々の菌株を１０ｇ／のＰＹ液体培地（ＰＹ平板培地より
寒天を除いた培地）で２４時間培養後、菌を遠心操作（
２０，０００ｆ、８０分間）により集菌し、Ｂ　ｉｒｎ
ｂｏｉｍ　とＤｏｌｙ　（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ
　Ｒｅｓ、　７．１５１８−１５２８．）らの方！天に
従い、プラスミドＤＮＡを調製し、０゜８５６アガロー
スゲル電気泳動（こよりプラスミド解析を行った。その
結果、解析した８２個の純化菌株は同一のプラスミドパ
ターンを示さず、少なくとも９つの異なるプラスミドパ
ターンに分類でき、４．０回行、　４．８回行、　５．
４回行、　８．５回行、１２回行、１５回行、１７回行
、２１回行、８７回行、４０回行。

５０回行、５２回行の１２本のプラスミドＤＮＡバンド
が観察された菌株をアイザワイＩＰＬＮ１７株と名付け
た。

ステップ２　殺虫試験によるパテラス・チニリンゲンシ
ス・アイザワイＩＰＬｆｆｉ７菌株の選抜分類した９つ
の純化アイザワイＩＰＬ株をそれぞれ、２枚のＰＹ平板
培地（１５ｃ１１直径）で８０’０７日間培養し、胞子
形成および結晶形成を位相差顕微鏡で確認した後、集菌
し、凍結−融解をス回くり返した後、２　ｍｌの蒸留水
に懸濁し、超音波破砕処理を行うことにより、結晶懸濁
液を調製した。ＰｊＪられた調製液の、原液１０倍希釈
液、１００倍希釈液をそれぞれ１　ｍｌづつ、人工飼料
に浸み込ませた後、４令のハスモンヨトウ１０匹に摂食
させ、８日後の死去数を観察した。コナガについても８
令の幼虫を用い、同様の試験を行った。純化菌株アイザ
ワイＩＰＬＩ’ｌｈ７の結晶懸濁液（１μｌ当たり２．
２Ｘ１０　　胞子を含む）を１　ｄコナガに与えたとき
、１０匹中１０匹が死亡し、また、結晶懸濁液（１μｌ
当たり２．６Ｘ１０’胞子を含む）をハスモンヨトウに
与えたとき、１０匹中１０匹が死亡した。

従って、アイザワイＩＰＬＮｕＴ株は、両害虫に対して
高い殺虫活性を示すことが明らかとなった。

ステップｌ　合成りＮＡプローブの作製バチラス・チュ
リンゲンシ不・クリスターキ、ＨＤ−Ｉ　　Ｄｉｐｅ１
株の殺虫性蛋白遺伝子の塩基配列（Ｗｈｉｔｅｌｅｙら
、Ｊ、　Ｂｉｏｌ　、　Ｃｈｅｒｒｂ　２６０　ｅ６２
６４−６２　　（１９８５））　　をり考に合成りＮＡ
プローブ（５・−ＣＡＣＡＡＡＴＣＣＡＧＣＡＣＣＧＧ
Ｇ−８’）を作製した。アプライド・バイオシステム社
のＤＮＡ合成合成デモデル３８０ＡいてＴ）ＮＡオリゴ
マーを合成した後、ＤＮＡ捕果バイアルに２７％水酸化
アンモニウムを１　ｍｌ加え、５５”Ｃで４時間加温し
、濃縮器にかけ乾固させた。乾固後、１００μｌのｏ、
ｏｘＭトリエチルアミン−酢酸（ＴＥＡＡ）（ＰＨ７，
２）に溶解し、逆相ＨＰ　Ｌ　ＣカラムＣ１８にかけ、
アセトニトリル−〇、ＩＭＴＥＡＡ（ＰＨ７，２）の溶
媒系で溶出を行った。２６０ｎｍの吸収ピーク画分を分
取し、乾固後１００μｌのアセトニトリルで調製した８
０％酢酸を加え、１５分間放置しｔ；。１５分間経過後
、淡オレンジ色を呈したら、乾固し、０．０１　Ｍ　Ｔ
ＥＡＡ（１’Ｈ７，２）を加え、さらに酢酸エチルを１
００μｌ加え、混合した。酵酸エチル相をすて、ジエチ
ルエーテル１００μｇを加え、同様の操作を２回行い、
乾固した。Ｇ、ＯＬＭ　ＴＥＡＡ　（ＰＨ７，２）で溶
解し、再びＨＰ　Ｌ　Ｃによる２６０ｎｍ吸収ピーク画
分を分取し、乾固後、ｌＯｍＭｈリス−塩酸（ＰＨ７，
５）＋１ｍＭＥＤＴＡ（ＴＥ）溶液ニ溶解した。つぎ【
こ、調製した合成りＮＡプローブの８２ｐ標識化を行っ
た。５μｌの合成りＮＡプローブ（約１００　ｐｍｏｌ
ｅ）に大腸菌ポリヌクレオチドカイネース（宝酒造）を
１５ユニツト、１００μＣｉ　　の（Ｙ−８２Ｐ）ＡＴ
Ｐ（アマーシロム・ジャパン）および１０倍濃度の反応
混液（０６５Ｍ）リス−塩酸（ＰＨ７゜６）、０．１Ｍ
ＭｇＣ４，０，１Ｍ　２−メルカプトエタノール）をｌ
Ｏμｌ加えたのち蒸留水を加えて、全容を１００μでと
し、８７°Ｃ１時間反応後、クロロホルム：フェノール
（１：１）を加え混合後、上澄を分取した。分取した上
澄を、ＴＥ緩衝液（ＰＨ７，５）で平衡化したＤＥ−５
２カラム（ワットマン社ｓＯ，５ｍｌのベッドサイズ）
にアプライし、ＢｏｗｌのＴＥ緩衝液（ＰＨ７，５）で
洗浄後、０．７ＭＮａＣ１−ＴＥ緩衝液（ＰＨ７，５）
ｔ’溶出を行い、放射活性画分を分取し、＋１２ｐ標識
合成りＮＡプローブを作製した。

ステップ２　アイザワイＩＰＬＮｎＴ株のプラスミドＤ
ＮＡライブラリーの作製 ２００　ｍｌのｐＹ液体培地で培養したアイザワイＩＰ
ＬＮ１７株の菌体を８０＋７（７）Ｇ緩衝液（１０％グ
リセロール、１　ｍＭＥＤＴＡ、　５　Ｑｒｒ＋ＭＴｒ
ｉｓ−塩酸（ＰＨ８，０））で洗浄し、８　ｍｌのりゾ
チーム　Ｃ５１１ｆ／ｍｌ　）に懸濁し、８０°Ｃで２
時間反応させた。つぎに、アルカリ溶液（０，２ＮＮａ
ＯＨ，１％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＩ）Ｓ））を１
６ｍ１加え、混合し、室温に１０分間放置したのち、中
和溶液Ｃ８Ｍ酢酸ナトリウム（ＰＨ４，８）　）を１２
ｍ１加え、４℃に１．５時間放置した。遠心操作（１４
０００ｒｐｍ、２０分間）により上澄を分取し、冷エタ
ノールを７　ｍｌ加え、−２０℃で１時間放置し、エタ
ノール沈澱により、ＤＮＡを回収した。乾固後、５ｚｌ
の０．１　Ｍ酢酸ナトリウムに懸濁し、ＴＥ緩衝液（Ｐ
Ｈ７，５）で平衡化したフェノールによる処理を二回行
ったのち、上澄を分取し、２容の冷エタノールを加え、
再度エタノール沈澱した。さらに、乾固後、６　ｍｌの
ＴＥ緩衝液（ＰＨ７，５）に懸濁し、常法に従って塩化
セシウム平衡密度勾配遠心により、プラスミドＤＮＡを
精製した。

つぎに、５μノのプラスミドＤＮＡを１０ユニツトの制
限酵素ＢａｍＨ１で切断し、等容のフェノール：クロロ
ホルム（１：ｌ）を加え混合した後、上澄をとり、エタ
ノール沈澱によりＤＮＡを回収し、乾固後、２０μｌの
ＴＥ緩衝液（ＰＨ７，５）に懸濁した。また、２μｆの
ＰＵＣ８ベクタープラスミド（ファルマシア社）を５ユ
ニツトの制限酵素ＢａｍＨ１でＴ上役、同様の操作でＤ
ＮＡ　を回収し、２０μｌのＴＥ緩衝液（ＰＨ７，５）
に懸濁後、５μｌの大腸菌アルカリホスファターゼ（宝
酒造、２．０ユニツト）、５０μｌの０．１　Ｍ　トリ
ス−塩酸緩衝液（ＰＨ８，０）、１６μｌの蒸留水を加
えた後、６０℃で１時間インキュベートし、アルカリフ
ォスファターゼ処理を行った。反応後、フェノール−ク
ロロホルム処理を２回行ったのち、上澄を分取し、エタ
ノール沈澱によりＤＮＡを回収し、２０μｌのＴＥ緩衝
液（ＰＨ７，５）に懸濁した。

つぎに、１５μｌのＢａｍＨ１切断プラスミドＤＮＡ溶
液と１５μｌのジ甲Ｈ１切断ＰＵＣ８ベクターＤＮＡ溶
液を混合後、１μｌのＴ、　ＤＮＡリガーゼ（宝酒造、
０．１ユニツト）、７．５μｌの０．１　Ｍ　ジチオス
レイトール（平井化学）、７．５　ｔｉｌｌのｔｏｍＭ
アデノシン３リン酸（平井化学）、２５μ１Ｏ）８濃度
度反応混液（２００ｍＭトリス−塩酸（ＰＨ７，６）２
０　ｍＭ　ＭｇＣｌ、　）および５　ｐｇの蒸留水を加
え、全容７５μｌとし、１４℃で６時間インキュベート
した。得られたりガーゼ反応液１０μｌを、スコツトら
の方法（細胞工学、２．６１６−６２６．１９８８　）
で調製した１００μｌの大腸菌ＤＨＩ株のコンピーテン
トセルに加え、０℃で１５分間インキュベートし、４２
°Ｃで４０秒間熱処理したのち、０．９ｚｌのしブロス
液体培地（トリプトン１０ｙ１イーストエキストラクト
５ｆ％ＮａＣ１５ｙ１グルコース（平井化学）ＩＦを加
え、蒸留水で全容１１とする）を加え、８７°Ｃで１時
間インキュベートし、最終濃度５０μｆ／ｍｌのアンピ
シリンを含むＬブロス平板培地（Ｌブロス液体培地に１
．２％となるよう寒天を加えたもの）にプレートした。

ステップ３　コロニーハイブリダイゼーションによる殺
虫性蛋白遺伝子クローンの単離 プレートに広げたコロニーを２枚のニトロセルロースフ
ィルターにレプリカし、さらにアンピシリン（５０μｆ
／ｍｌ）およびクロラムフェニコール（１７０μｙ／／
Ｉｌ）を含む平板プレートに移し、−ｆｆｌインキュベ
ートした。１枚のフィルター当り、２．５　ｍｌの０．
５　Ｎ　ＮａＯＨを加え、５分間処理し、風乾後、等容
のＩＭ）リス−塩酸（ＰＨ７，５）を加え、５分間放置
した。風乾後、さらに２．５ｚｌのＩＭ）リス−塩酸（
ＰＨ７，５）　−１，５Ｍ　ＮａＣ１で５分間処理し、
風乾後、８０゛Ｃで３時間、真空下で処理した。フィル
ター４枚当り、１０ｙｔｌの０．１％５ＤＳ−４ＸＳＳ
Ｃ（ＳＳＣは０．１５ＭＮａＣｇ−０，０１５Ｍクエン
酸ナトリウム（ＰＨ７，５）を示す）を加え、６０°Ｃ
１５分処理後、フィルター上のコロニーをふきとり、６
ゴのプレハイブリＦ［（４ｘＳＳＣ，ＩＯＸデンハート
、１００μｆ／１ｐｒｌ　サーモンテスティス一本鎖Ｄ
ＮＡ（シグマ社）；但し、１０Ｘデンハートは、０．２
％フィコール、０．２％ポリビニルピロリドン、０．２
％ＢＳＡを含む溶液である。）に浸し、６０°Ｃで３時
間処理した。

つぎに上記溶液に、ステップ１で作製した８２ｐ標識化
合成りＮＡプローブを加えたハイブリ溶液中にフィルタ
ーを入れ、５６°Ｃ−夜インキユベートした。ハイブリ
ダイゼーション後、５６℃の４ｘＳＣＣ−０，１％ＳＤ
Ｓ溶液で１５分間４回洗浄し、フィルターを乾燥させ、
Ｘ線フィルムにはさみ、オートラジオグラフィを行った
。ポジティブシグナルを与えるコロニーをマスタープレ
ートより拾い、再度、同様のコロニーハイブリダイゼー
ションを行い、ポジティブクローン大腸菌ＤＨＩ／ｐＡ
Ｂ６を単離した。

単離したポジティブクローン大腸１ＤＨｌ、’ｐＡＢ５
からＢｉｒｎｂｏｉ　ｍとＤｏｌｙらの方法に従ッテ、
プラスミドｐＡＢ６を単離した。プラスミドｐＡＢ５を
制限酵素、ｂ皿旧、且堕ｄ１．Ｔ’ｆ銭！、　Ｂｇｌ。

艶」■・望凹Ｒ■、卸■、墾１．臼ｌを用いて、切断し
、０．７％アガロース電気泳励で分析することにより、
インサートＤＮＡ２２．４　Ｋｂの制限酵素地図を作製
した（図１上部）。さら匿、上述の合成りＮＡプローブ
を用いたサザン・ハイブリダイゼーション法（Ｊ−Ｍｏ
ｌ、　ＢｉｏＬ−９Ｌ　５０３−５１７（１９７５））
　により、インサートＤＮＡ　中の殺虫性蛋白遺伝子領
域を特定し、その領域の詳細な制限酵素地図を作製した
（図１下部）。続いて、各種制限酵素で切断したＤＮＡ
断片をベクターｐＵＣ３にサブクローニングした後、Ｂ
ｉｒｎｂｏｉｍとＤｏｌｙらの方法によりＤＮＡ断片を
含むプラスミドＤＮＡを調製した。得られたＤＮＡを１
８μｌのＴＥ　（ＰＨ７，５’）に懸濁後、２μｌの２
ＮＮａＯＨを加え、室温で５分間放置し、８μｌ　の７
．５Ｍ酢酸アンモニアを加え、１００／Ｚｌの冷エタノ
ールを加え、エタノール沈澱を行った。

１２．０００　ｒｐｍで５分間遠心し、沈澱を回収後、
乾固し、０．５　ｐｒｎ　ａｌｌ　／　５１１１　　と
なるよう蒸留水に溶解させた。５μｌの調製したプラス
ミドＤＮＡ（５ｐｒｒ＋ｏｄ）に、Ｌ５１１ｇの１０倍
濃度クレノー緩衝液（宝酒造）、１μｌのプライマーＤ
ＮＡ（ＰＬバイオケミカル社）、４．５μｌの蒸留水を
加え、全容を１２μＥとし、６０°Ｃで１６分間加温後
、室温に２０分間放置した。この反応混液に２μｌの〔
ａ−８２Ｐ）ＡＴＰ（４０００Ｃｉ／ｍｍｏ／、　７フ
ーシヤム・ジャパン）と１μｌのクレーノ断片尋素（宝
酒造、２ユニツト）を加え、混合した。この混合液の３
．２μｅずつを４皿類の２μｌのｄＮＴＰ十ｄｄＮＴＰ
混合液（宝酒造）に加え、４２°Ｃで２０分間放置した
。各々のｌμｌのチェース溶液（宝酒造）を加え、さら
に、４２℃で２０分間放置した。最後に、６μｌの９５
％ホルムアミド色素（０，１％ブロムフェノールブルー
と０．１％のキシレンシアツールを含む）を加えた。常
法に従い、６％アクリルアミド　尿素ゲルを作製し、上
記反応液２μｌをアプライし、１７００Ｖで６時間、電
気泳動を行った。ゲルを乾燥後、Ｘ線フィルムにはさみ
、感光後、塩基配列を読み取った。解明した塩基配列を
図２に示す。バチラス・チュリンゲンシス・アイザワイ
ＩＰＬｆｆｉＴ株の殺虫性上白遺伝子は、開始コドンＡ
ＴＧから始まり、ストップコドンＴＡＡで終る８４６５
塩基のコーディング領域を持ち、１１５５のアミノ酸を
コードしていた。

塩基配列から推定したアミノ末端９個の配列は、ＳＷ製
したアイザワイＩＰＬＩＪ６．７の殺虫性云白のアミノ
酸と完全に一致した。従って、得られた遺伝子はアイザ
ワイＩＰＬＮｏ、７の殺虫性蛋白遺伝子と考えられる。

コーディング領域の１４配列を既に発表されているバチ
ラス・チュリンゲンシス・クルスターキＨＤ−１ダイペ
ル、同、クルスターキＨＤ−７８、バチラス・チュリン
ゲンシス・ソットウの殺虫性蛋白遺伝子のか１甚配列と
比較すると多くの塩基置換があるだけでなく、１２塩基
のそう人、７８塩基の欠失が存在し、際立った相異が認
められた。従って、本発明で得た、殺虫性蛋白遺伝子は
、既薯の殺虫性蛋白遺伝子とは異なる新規の遺伝子であ
る。また、本発明で解明したアイザワイＩＰＬトム７株
の殺虫性蛋白は、ハスモンヨトウに対して強い殺虫性を
示すのに対し、既報の８Ｍの殺虫性蛋白は、当該害虫に
対して弱いかまたはほとんど殺虫性を示さないことから
も、特Ｗム殺虫蛋白の遺伝子といえる。

【図面の簡単な説明】

図１は、プラスミドｐＡＢ６のインサートＤＮＡ（２２
，４に６）の制限酵素地図を示す。アイザワイＩＰＬ株
殺虫性蛋白遺伝子領域を大枠で示す。 図の下部は、殺虫性蛋白遺伝子領域の詳細な制限酵素部
位を示している。 図２は、殺虫性蛋白遺伝子の構造遺伝子部分の８４６５
塩基からなる全塩基配列を示している。上段は塩基配列
を下段はアミノ酸配列を示す。塩基配列中、塩基番号１
番目から第３４６５番目までの領域が殺虫性蛋白遺伝子
の構造遺伝子をコードする領域である。 ゝ＼ ＼、 ＼８、 ゛＼

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. （１）バチラス・チュリンゲンシス・アイザワイＩＰＬ
   株の殺虫性蛋白遺伝子およびこれを含むＤＮＡ
2. （２）図２に記載の塩基配列で特定される特許請求の範
   囲第１項記載のバチラス・チュリンゲンシス・アイザワ
   イＩＰＬ株の殺虫性蛋白遺伝子およびこれを含むＤＮＡ
3. （３）バチラス・チュリンゲンシス・アイザワイＩＰＬ
   株の殺虫性蛋白遺伝子を含む組換えプラスミド
4. （４）図２に記載の塩基配列で特定されるバチラス・チ
   ュリンゲンシス・アイザワイＩＰＬ株の殺虫性蛋白遺伝
   子ＤＮＡを含む特許請求の範囲第３項記載のプラスミド
5. （５）図１に記載の制限酵素地図で特定されるＤＮＡを
   保持する特許請求の範囲第３項記載のプラスミドｐＡＢ
   １
6. （６）バチラス・チュリンゲンシス・アイザワイＩＰＬ
   株の殺虫性蛋白遺伝子を含む組換えプラスミドを含む微
   生物
7. （７）図２に記載の塩基配列で特定されるバチラス・チ
   ュリンゲンシス・アイザワイＩＰＬ株の殺虫性蛋白遺伝
   子を含むプラスミドを含む特許請求の範囲第５項記載の
   微生物
8. （８）大腸菌ＤＨ１／ｐＡＢ６株である特許請求の範囲
   題６項記載の微生物
9. （９）図２に記載の殺虫性蛋白遺伝子のアミノ酸配列
10. （１０）図２に記載の殺虫性蛋白遺伝子の塩基配列